CN111575221B - 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法 - Google Patents

一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法，属于生物技术领域。本发明提供了可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1/pigFPNT和JNB5‑1/pigNPNT，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1/pigFPNT和JNB5‑1/pigNPNT是通过分别在粘质沙雷氏菌的灵菌红素合成基因簇pigF和pigN的3'端连接序列如SEQ ID No.11所示的核苷酸片段获得的，将粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1/pigFPNT和JNB5‑1/pigNPNT分别接种至发酵培养基中发酵96h，即可使发酵液中灵菌红素的产量分别高达7.55g/L、8.37g/L。

Description

一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法
技术领域
本发明涉及一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
灵菌红素是一类含三吡咯骨架结构的天然红色素，主要由一些微生物产生，具有抗癌、免疫抑制、抗虫等多种生物活性，可作为免疫抑制剂和抗癌药物开发，受到研究者的广泛关注。
目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。
然而，现有的微生物发酵法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Kim等人通过将Hahella chejuensis KCTC 2396接种至海生菌肉汤2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵40h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28mg/L(具体可见参考文献：Kim S J,Lee H K,Lee Y K,etal.Mutant selection ofHahella chejuensisKCTC 2396and statistical optimizationofmedium components for prodigiosin yield-up[J].Journal of Microbiology,2008,46(2):183-188.)；Martha Ingrid Gutiérrez-Román等人通过将Serratia marcescensCFFSUR-B4接种至花生基培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达40.6μg/mL(具体可见参考文献：Martha Ingrid Gutiérrez-Román,Francisco Holguín-Meléndez,Bello-Mendoza R,et al.Productionofprodigiosin and chitinases by tropical Serratia marcescens strains withpotential to control plant pathogens[J].World Journal of Microbiology andBiotechnology,2012,28(1):p.145-153.)。因此，急需找到一种产量高的利用微生物发酵生产灵菌红素的方法以解决现有微生物发酵法存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的利用微生物发酵生产灵菌红素的方法。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主，在粘质沙雷氏菌的灵菌红素合成基因簇的3'端连接序列如SEQ ID No.1～11所示的核苷酸片段。
在本发明的一种实施方式中，灵菌红素合成基因簇为pigA、pigB、pigC、pigD、pigE、pigF、pigG、pigH、pigI、pigJ、pigK、pigL、pigM或pigN。
在本发明的一种实施方式中，编码所述pigF或pigN的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.26或SEQ ID No.49所示。
在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。
本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～37℃、转速为180～220rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为200rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、牛肉膏、CaCl2、脯氨酸、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含15～25g/L蔗糖、10～20g/L牛肉膏、5～15g/L CaCl2、5～10g/L脯氨酸、0.1～0.3g/LMgSO4·7H2O和0.04～0.08g/LFeSO4·7H2O。
本发明还提供了序列如SEQ ID No.1～11所示的核苷酸片段或上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。
[有益效果]
本发明提供了可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT和JNB5-1/pigNPNT，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT和JNB5-1/pigNPNT是通过分别在粘质沙雷氏菌的灵菌红素合成基因簇pigF和pigN的3'端连接序列如SEQ ID No.11所示的核苷酸片段获得的，将粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT和JNB5-1/pigNPNT分别接种至发酵培养基中发酵96h，即可使发酵液中灵菌红素的产量分别高达7.55g/L、8.37g/L，分别较野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1提高了40.85％、56.09％。
附图说明
图1：敲除质粒pUT-km-ΔpigF-Apm的酶切验证结果；其中，1为敲除质粒pUT-km-ΔpigF-Apm，2为经酶切的敲除质粒pUT-km-ΔpigF-Apm，M为DL10000 DNA Marker。
图2：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔpigF的PCR验证结果；其中，1为pigF U-Apm，即pigF上游同源臂pigF U和Apm的重组基因(大小约1909bp)，2为对照，即粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1经PCR所得基因，M为DL10000 DNA Marker。
图3：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT的PCR验证结果；其中，1为对照，即粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT经PCR所得基因，2-5为pigF U-pigF-Apm基因，即pigF上游同源臂pigF U、pigF和Apm的重组基因(大小约2926bp)，M为DL10000 DNA Marker。
图4：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigNPNT的PCR验证结果；其中，1为对照，即粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigNPNT经PCR所得基因，2-5为pigNU-pigN-Apm基因，即pigN上游同源臂pigN U、pigN和Apm的重组基因(大小约2638bp)，M为DL10000 DNA Marker。
图5：粘质沙雷氏菌JNB5-1、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigNPNT发酵生产灵菌红素的产量。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1λpir购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的pET-28a质粒购自Novagen公司；下述实施例中涉及的pUT-km质粒和pKK 232-8质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的同源重组试剂盒、RNA提取试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JNB5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。
下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。
发酵培养基：蔗糖20g/L、牛肉膏15g/L、CaCl210 g/L、脯氨酸7.5g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.06g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(pH3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后3000r·min-1离心10min，取上清；测定上清的A535的值，根据标准曲线Y＝1.1936X-0.001计算得到发酵液中灵菌红素的含量；标准曲线Y＝1.1936X-0.001中，Y代表A535值，X代表灵菌红素产量，单位mg/100mL。
实施例1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT、JNB5-1/pigNPNT的构建
具体步骤如下：
(1)pETC-28a质粒的构建
以pET-28a质粒为模板，通过反向PCR扩增pET-28a质粒骨架(除去卡那霉素抗性基因)；以pKK 232-8质粒为模板，通过PCR扩增氯霉素抗性基因；利用同源重组试剂盒将质粒骨架和氯霉素抗性基因同源重组，得到重组产物；将重组产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有12.5μg·mL-1氯霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行PCR验证，验证正确即获得pETC-28a质粒；
其中，扩增引物如下：
28a F：agtggcagggcggggcgtaaGAATTAATTCATGAGCGGATACATA(SEQ ID No.13)；
28a R：ccagtgatttttttctccatAACACCCCTTGTATTACTGT(SEQ ID No.14)；
cm F：acagtaatacaaggggtgttATGGAGAAAAAAATCACTGGATATA(SEQ ID No.15)；
cm R：atccgctcatgaattaattcTTACGCCCCGCCCTG(SEQ ID No.16)。
(2)粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔpigF的构建
以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，通过PCR扩增分别获得pigF基因的上游片段pigFU(SEQ ID NO:17)和下游片段pigFD(SEQ ID NO:18)；化学合成安普霉素抗性基因片段Apm(pigF)(SEQ ID NO:19)；通过同源重组试剂盒将上游片段pigFU、安普霉素抗性基因片段Apm(pigF)、下游片段pigFD连接与经Kpn I/Sac I双酶切的pUT-km质粒依次相连，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌S17-1λpir，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-ΔpigF-Apm和敲除质粒pUT-km-ΔpigF-Apm；将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-ΔpigF-Apm和粘质沙雷氏菌JNB5-1分别接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-ΔpigF-Apm和粘质沙雷氏菌JNB5-1共同接种至LB固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-ΔpigF-Apm中的敲除质粒pUT-km-ΔpigF-Apm转化至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素和50μg·mL-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；用接种环蘸取培养液在LB固体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素和50μg·mL-1克林霉素)上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到单菌落；通过PCR扩增(pigFU F/Apm(pigF)R)单菌落中pigFU-Apm基因(扩增结果见图2)，扩增成功即获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔpigF；
其中，扩增引物如下：
pigFU F：acagccggatccccgggtaccCTGCGCAACAGTTACCACGG(SEQ ID NO:20)；
pigFU R：aaataggggttccgcgCATTGCTGGCTCCCTAGTCTAAA(SEQ ID NO:21)；
pigFD F：gtcgattggctgaTAACCAGTTAGCAACGGGAGCT(SEQ ID NO:22)；
pigFD R：gcctaggccgaattcgagctcTTTATGGAACAAATCCGGGTG(SEQ ID NO:23)。
(3)PNTs的选择
以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，通过PCR扩增粘质沙雷氏菌JNB5-1的灵菌红素合成基因簇pigF(核苷酸序列如SEQ ID No.24所示)，并且，以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，通过PCR扩增分别获得3'端连接有序列如SEQ ID No.1～12所示的PNTs的粘质沙雷氏菌JNB5-1灵菌红素合成基因簇pigF1～pigF12；将pigF、pigF1～pigF12分别与pETC-28a质粒经BamHI/Sac I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有12.5μg·mL-1氯霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(BamHI/Sac I)，验证正确的质粒送上海生工测序，确认PNTs连接到pigF基因，测序正确即获得大肠杆菌工程菌BL21/pETC-28a-pigF、BL21/pETC-28a-pigF1～BL21/pETC-28a-pigF12和重组质粒pETC-28a-pigF、pETC-28a-pigF1～pETC-28a-pigF12；
其中，扩增引物如下：
pigF F：atgggtcgcggatccgaattcATGCCTTTAACCAAGCAAGATGC(SEQ ID NO:25)；
pigF R：ctcgagtgcggccgcaagcttTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ ID NO:26)；
pigF R1：ctcgagtgcggccgcaagcttATTATTTTTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:27)；
pigF R2：ctcgagtgcggccgcaagcttATATTTTTTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:28)；
pigF R3：ctcgagtgcggccgcaagcttAAATTTTTTATTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:29)；
pigF R4：ctcgagtgcggccgcaagcttATTTTTTTTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:30)；
pigF R5：ctcgagtgcggccgcaagcttATTTTTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:31)；
pigF R6：ctcgagtgcggccgcaagcttAATTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ ID NO:32)；
pigF R7：ctcgagtgcggccgcaagcttAAATTTTTTTTTATTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQID NO:33)；
pigF R8：ctcgagtgcggccgcaagcttATTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ ID NO:34)；
pigF R9：ctcgagtgcggccgcaagcttAAATTTTTTTTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ IDNO:35)；
pigF R10：ctcgagtgcggccgcaagcttTTTTTTAAATTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQID NO:36)；
pigF R11：ctcgagtgcggccgcaagcttAAATTTTTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQ ID NO:37)；
pigF R12：ctcgagtgcggccgcaagcttAATAAAAAAAAATTATTTTTCGCCGACGATCAG(SEQID NO:38)。
将重组质粒pETC-28a-pigF、pETC-28a-pigF1～pETC-28a-pigF12热激转化粘质沙雷氏菌JNB5-1和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔpigF，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有12.5μg·mL-1氯霉素)上，37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代后提取质粒进行PCR验证，验证正确获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs12、ΔpigF/pigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs12，以及，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs12、ΔpigFPigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs12的培养液。
用接种环分别蘸取粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs12、ΔpigFPigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs12的培养液在LB固体培养基(含有12.5μg·mL-1氯霉素)上划线后于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到单菌落；挑取单菌落接种含有LB液体培养基中，分别于30℃、180rpm或37℃、180rpm的条件下摇瓶培养12h后，通过RNA提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs12、ΔpigFPigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs12的总RNA，并对提取得到总RNA进行qPCR以检测粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs12、ΔpigFPigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs12在30℃、37℃培养时的PNTs相对转录水平(检测结果见表1-2)；
其中，qPCR引物如下：
16sRNA F：GCCCAGGTAAGGTTCTTC(SEQ ID NO:39)；
16sRNA R：GGTGTAGCGGTGAAATGC(SEQ ID NO:40)；
pigF(q)F：TTTCTGTTGAGCGACGAA(SEQ ID NO:41)；
pigF(q)R：CCATAGCGGATACAGGAAG(SEQ ID NO:42)。
由表1-2可知，在30℃和37℃培养时，除PFPNTs12外，粘质沙雷氏菌工程菌PFPNTs1～PFPNTs11和ΔpigPFPNTs1～ΔpigPFPNTs11的转录水平均分别较粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF和ΔpigF/pigF有所提升，其中，PFPNTS11表现出最高的PNTs相对转录水平，其对应的PNTs的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
表1粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigF、PFPNTs1～PFPNTs11在30℃、37℃培养时的PNTs相对转录水平
Figure BDA0002509707300000071
表2粘质沙雷氏菌工程菌ΔpigF/pigF、ΔpigFPFPNTs1～ΔpigFPFPNTs11在30℃、37℃培养时的PNTs相对转录水平
Figure BDA0002509707300000081
(4)粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT、JNB5-1/pigNPNT的构建
以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，通过PCR扩增分别获得pigF基因的上游片段pigFU(SEQ ID NO:17)和下游片段pigFD(SEQ ID NO:18)以及3'端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的PNTs的灵菌红素合成基因簇pigF；化学合成安普霉素抗性基因片段Apm(pigF)(SEQ ID NO:19)；通过同源重组试剂盒将上游片段pigFU、3'端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的PNTs的灵菌红素合成基因簇pigF、安普霉素抗性基因片段Apm(pigF)、下游片段pigFD与与经Kpn I/Sac I双酶切的pUT-km质粒依次相连，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌S17-1λpir，得到转化产物1，即大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-pigFPNT-Apm和敲入质粒pUT-km-ΔpigFPNT-Apm；将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-pigFPNT-Apm和粘质沙雷氏菌JNB5-1分别接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-pigFPNT-Apm和粘质沙雷氏菌JNB5-1共同接种至LB固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌S17-1λpir/pUT-km-pigFPNT-Apm中的敲入质粒pUT-km-ΔpigFPNT-Apm转化至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素和50μg·mL-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；用接种环蘸取培养液在LB固体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素和50μg·mL-1克林霉素)上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到单菌落；通过PCR扩增单菌落中pigFU-pigF-Apm(pigF)重组基因(约2926bp，结果见图3)，扩增成功即获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT；
其中，PCR所用引物如下：
pigFU F：acagccggatccccgggtaccTATCTGCGCAACAGTTACCACG(SEQ ID NO:43)；
pigFU R：taatgtcatTGCTGGCTCCCTAGTCTAAAAAG(SEQ ID NO:44)；
pigF(PNTs)F：gggagccagcaATGACATTAACCAAGCAAGACGC(SEQ ID NO:45)；
pigF(PNTs)R：caaataggggttccgcgAAATTTTTATTTTTCGCCGACG(SEQ ID NO:46)；
pigFD F：gattggctgaCCAGTTAGCAACGGGAGCTCG(SEQ ID NO:47)；
pigFD R：gcctaggccgaattcgagctcCGTTTTATGGAACAAATCCGGG(SEQ ID NO:48)。
参考粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT的构建方法，构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigNPNT(验证结果见图4)；
其中，粘质沙雷氏菌JNB5-1的灵菌红素合成基因簇pigN(核苷酸序列如SEQ IDNo.49所示)的上游片段pigNU的核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示、下游片段pigND的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示、安普霉素抗性基因片段Apm(pigN)核苷酸序列如SEQ ID NO:52所示；
PCR所用引物如下：
pigNU F：acagccggatccccgggtaccACCCTGGTCTCTCCACTATGACG(SEQ ID NO:53)；
pigNU R：tcatCATTGTGTTCTCCTCAGCGGATTAGG(SEQ ID NO:54)；
pigN(PNTs)F：cgctgaggagaacacaATGAATGTATGGATTGCTTTGGC(SEQ ID NO:55)；
pigN(PNTs)R：caaataggggttccgcgAAATTTTTACAGCACGAAAGGAATG(SEQ ID NO:56)；
pigND F：tcgattggctgaTAACCCCAATGCGGCAGC(SEQ ID NO:57)；
pigND R：gcctaggccgaattcgagctcCATCAGCGGGATACCCAACG(SEQ ID NO:58)。
实施例2：灵菌红素的生产
具体步骤如下：
以粘质沙雷氏菌JNB5-1为对照，分别挑取实施例1获得的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT、JNB5-1/pigNPNT的单菌落接种至LB液体培养基(含有50μg·mL-1安普霉素和50μg·mL-1克林霉素)中，于37℃、200rpm的条件下振荡培养12h，得到种子液；将种子液以6％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，于30℃、200rpm的条件下发酵96h，获得发酵液。
检测发酵液中灵菌红素的含量(结果见图5)，结果表明：发酵96h时，粘质沙雷氏菌JNB5-1发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为5.36g/L，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1/pigFPNT、JNB5-1/pigNPNT发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量分别为7.55g/L、8.37g/L，分别较野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1提高了40.85％、56.09％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaaaaaata at 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaaaaaaat at 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aataaaaaat tt 12
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaaaaaaa at 12
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaaaaat 9
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<212> DNA
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aaaatt 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aataaaaaaa aattt 15
<210> 8
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaaaat 6
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<211> 12
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<213> 人工序列
<400> 9
aaaaaaaaat tt 12
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaatttaaaa aa 12
<210> 11
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aaattt 6
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttttttttta tt 12
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agtggcaggg cggggcgtaa gaattaattc atgagcggat acata 45
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccagtgattt ttttctccat aacacccctt gtattactgt 40
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acagtaatac aaggggtgtt atggagaaaa aaatcactgg atata 45
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atccgctcat gaattaattc ttacgccccg ccctg 35
<210> 17
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctgcgcaaca gttaccacgg taaaacgctg ggcgcgttgt ccatcaccgg acgagacaaa 60
caccgccgct attttacacc gctgctggac gcgatggtgg aagtgccgtt cggcgatctc 120
gccgcgctgc gggaagcgct gaaccgtgaa gacgtcggcg cgctgatgat cgaaccgatc 180
cagggtgaag gcggcgtgca tatcccgccc gccggttacc tgcaggcggt gcagcagctc 240
tgccgcgaga ccggcgtgct gctgatggtg gacgaagtgc aaaccgggct tgggcgcacc 300
ggcaaacttt tcgcctgcga atgggacggt atcgagccgg acgtgctgat gctgtcgaaa 360
tccctgtccg gcggcctgat ccccatcggc gccacgctgt gccgaaccga tctttggcaa 420
aaagcctatg gcacggcgga ccgcttcctg gtgcacagct ccacctacgg cggcggcaac 480
ctcgcctcgg tcgtcgccct cagcgcgctg cgcgagatcc tggcgcagga tttggtcggc 540
catgccgaac ggatgggcgc ctactttaag caggcactga gcgagattgc cgcccgctat 600
ccgttcgtca gcgaagtgcg cggccgcggc ctgatgctgg ggatccaatt cgatcaggcg 660
ttcaccggcg cggtcaacgc ctccgcccgc gaattcgcca cccggctgcc gggcgattgg 720
cacaccacct ggaaattctt gcccgatccg gtgcaagccc atctgcgggc ggcgatggat 780
cgcatggaac aggcgctcgg cgaaatgttc tgcatgaaat tcgtcaccaa gctgtgccag 840
gaccacaaga tcctgacctt cattaccgcc aacagctcga cggtgatccg tattcaaccc 900
ccgctcatca tcagcaaagc cgagatcgac cgtttcgtcg gcgcctttgc cacggtgtgc 960
gaggaactct ccaccttttt agactaggga gccagcaatg 1000
<210> 18
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
taaccagtta gcaacgggag ctcgcaatgt tagaaagcaa attgatccag catatcgcca 60
cccagtatct ggatggcgat cacgacggcc tgaatgctca aaccccgctg tttgaactga 120
acgtcgtcga ttccgcctcc attttcgatc tggtggattt tctgcgtcag gagtctcatg 180
tcgccatcgg catgcatgag atccatccgg cgaacttcgc ctcggtgcag gcgatggttg 240
cgctggtgca acggttgcaa gcgcaagtcg ccgcaggggg tgtcgcatga gcgttcacgc 300
cgtcgatagc gccgcaaacg cgcatgaagc cgtccggcag tcggtgctac acaccttcgc 360
ccggctgacc gagtatgaac cgtcggcact ggccctgacc agccatctgg aaaacgattt 420
gggcgtcgac tccatcgcgc tggcggaaat tgccatggtg ctgaaccgtc agttccaatt 480
aaatacgccg ctggcgatcc aggagatcaa aaccattcag gatgcgctcg acggtatttt 540
gcagcgcggt ttcacgctgc cgacgccgaa cgccgccgcg caacctgccc cccagacgcc 600
tcaggcctgg ttgagcgctc tcgtgcgcca ggtgttcgcc acccacagcg gatatgaagt 660
gcgtgatctg tcccccgacg ccgccatcga aggcgacctg ggcatcgact ccgtagcggt 720
ggtgatggcg cgcaacgagt tgctcaaaac gctgggcctg gacgataacg cagcgctggc 780
ggagtgccgc acgctggctg agctggagca caacctggcg gcgcggctgg ttcaggaaca 840
gggcgaagcg tggttcagcc gctttggcca gcacaccgcc gcgtccgccg cgccgcagcc 900
caccaaggcg cccgcatcgc cggacgcgcg cgatgagctc ggcgatccgc gcaccatgcg 960
ggacttcgtc ggcatcgagc acccggattt gttccataaa 1000
<210> 19
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgtc atcagcggtg 120
gagtgcaatg tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac 180
cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc 240
ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg 300
acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg 360
cccgttacac cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag 420
cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct 480
gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc 540
gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc 600
gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc 660
aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg 720
gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct 780
cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg 840
ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg 900
attggctga 909
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acagccggat ccccgggtac cctgcgcaac agttaccacg g 41
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aaataggggt tccgcgcatt gctggctccc tagtctaaa 39
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtcgattggc tgataaccag ttagcaacgg gagct 35
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcctaggccg aattcgagct ctttatggaa caaatccggg tg 42
<210> 24
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atgacattaa ccaagcaaga cgccgtcaat cagatgatgg gctttttcca ggccaaggcg 60
ctgaccgccg cgctggcgct gaagctgttc gatcagctgc acgatcggga cgccgacgcg 120
gcgcacatcg ccgcgcggct tgactgcccg gcgcgttcca ccgagcagtt gctcatcgcg 180
ctgcgggcca tggggtatct cgaccaacga gacggccttt atcatttgcc cgccgcccac 240
cgggcttttc tgttgagcga cgaaccccag tggctgggat ggctgggccg ccacatcgat 300
accttcctgt atccgctatg gggcgagctg aaaacggcgg tgcgaaacga tgcccaccag 360
cgccgcacgg tattcggcga tgaccgcagt tggttcgaca tcctgtacca aaatccggac 420
gacgtggcgg acttccagga atttctcggt aaattcgccg cgccctttat cgccggcttt 480
gttcgcgatt acgacttctc gcaacaccgt gcgtttttgg acatcggcag cgggatcggc 540
agcctgccga tggcgatcgc cgacgcttat ccggggatcg cactcgcgat ctgcgaactg 600
ccgcaggcct cggcgttctt gcgcgacaag ctgacgctgc aaggctatgg cgaacgcatt 660
gacgtcgtgg agggcgatgt catcagcggc gatctgccga tcggcggcta tgacctgatc 720
cacctgggat ggatgctgca cgactacgcc ccggaaaccc aactgaccat cctgcgcaac 780
atctatcggg cgatgccggc cggcggccgc ttcatcgctt ccgaaacgcc gctgaacgaa 840
gacaaatcag ggccggaatt taccgccctg ctgtcgctga acatgctggt ctccaccgac 900
ggcggcatag agagcagcgc gcaggaatac ctggacagat tccgtctggc gggattcagc 960
aacgcgcgca tcatgaaaat agccggccca cgcaccctga tcgtcggcga aaaataa 1017
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
atgggtcgcg gatccgaatt catgccttta accaagcaag atgc 44
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctcgagtgcg gccgcaagct tttatttttc gccgacgatc ag 42
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctcgagtgcg gccgcaagct tattattttt tttttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctcgagtgcg gccgcaagct tatatttttt tttttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ctcgagtgcg gccgcaagct taaatttttt attttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctcgagtgcg gccgcaagct tatttttttt tttttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctcgagtgcg gccgcaagct tatttttttt ttatttttcg ccgacgatca g 51
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctcgagtgcg gccgcaagct taatttttta tttttcgccg acgatcag 48
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctcgagtgcg gccgcaagct taaatttttt tttattttat ttttcgccga cgatcag 57
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctcgagtgcg gccgcaagct tattttttta tttttcgccg acgatcag 48
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctcgagtgcg gccgcaagct taaatttttt tttttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ctcgagtgcg gccgcaagct tttttttaaa tttttatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctcgagtgcg gccgcaagct taaattttta tttttcgccg acgatcag 48
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ctcgagtgcg gccgcaagct taataaaaaa aaattatttt tcgccgacga tcag 54
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gcccaggtaa ggttcttc 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggtgtagcgg tgaaatgc 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tttctgttga gcgacgaa 18
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ccatagcgga tacaggaag 19
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
acagccggat ccccgggtac ctatctgcgc aacagttacc acg 43
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
taatgtcatt gctggctccc tagtctaaaa ag 32
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gggagccagc aatgacatta accaagcaag acgc 34
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
caaatagggg ttccgcgaaa tttttatttt tcgccgacg 39
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gattggctga ccagttagca acgggagctc g 31
<210> 48
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gcctaggccg aattcgagct ccgttttatg gaacaaatcc ggg 43
<210> 49
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atgaatgtat ggattgcttt ggccgttgtt ttgttgatcc ttgccctgct ggcgtttatt 60
accagccgcg gcgcccagga cactcgcccg atgttcctgt gggggttcaa cgccatgggg 120
ccggttaccc tggtctattg ctatttcggc gagggcgatc tgagccacaa agccctgatc 180
cttctcatgg tcggcctgta cctgctgcgc atgaacatcg tgctgacacg ttggtacggc 240
aacaccgccg cggccaaact caaggacgtg atgcccacgc agcaggtgcc ctggctggcg 300
gtgatgatgg tcatgatctt cggcggcctg tactgcctgc ccttttactg ggccagccaa 360
ctgcagggga cgtggggcgc gctgcaatgg ctggccattg gggtctacct gataggcacg 420
ctgttccact tcggcagcga ttatcaaaaa cggcgcttca aacaggatcc gaacaataaa 480
ggccggttgc tgaacagcgg cttttgggga ttggcgcgcc atccgaatta tttcggcgac 540
tttcttattt tcgtcagctt cgggctgctt gccggcaacc tgtttggcct gatagcaccg 600
ctgactaacc tggtgcagta tttcgccgac gccattccca aaagcgagaa aatggccgag 660
aagcgctacg gcgaggtctg gcgcaactat aaacgtcagg ttaagtgttt cattcctttc 720
gtgctgtaa 729
<210> 50
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
accctggtct ctccactatg acgccgacgc ccgatgtggc cggttggcta tcgaccgccg 60
tcgcgccttg cagagcctgc cttcgctgga acgcgagatg ctgatgagct gcgggatttt 120
cttcgagtac ctcagcgcgc tgctcaactg tgcaggctcg cctctcgcct ggcgttggga 180
gcatggcccc acgcatttac tgagctttgc ccccgccgcg cctgccgcgc ccgatcgcgc 240
cgcccatcgc caattggcgc agctgatcgg cgagcggcat accgcacggg cggcctatca 300
gcctacgcca atcaatgaag cgcagcggat gcagctgcag accttgttcg acggaacggc 360
gagttcactc agtatcgcag gtgacgaacg cgctcgcagt cgggtcgcgc agctcaccgc 420
tcgtcacgcc gcgctcgatt tctcggatcg ccaagcctgg cgggaaacct atcaatacat 480
ccgcttcaac gaacggcagc ctaccgacga cggttttcac ctgcaccacc tgtttggccc 540
ggtatcccca gcattcaagc gcttctttca agtggcgttt catcctcgct taagccggct 600
ggcgaccggg ctgcgcctgc cggcttatat ggcgcaaggg ctggcgcaac gcgtcgcgga 660
aggcccgcaa tacctggcgc tgtgtctgaa cgacgaaagt gccgagcacc tgttcgccac 720
cggcatgcgg cttgggcgtc tgtggctcac gctgcaacac tggggttggg gattgcatcc 780
gatcagcgtt ctggtgcaac acgccgaggc gcgtcgcgag ctcgcagcaa ccctggcgct 840
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gcccagacgc agttggcaaa gcattttgac cgcgccgcca tccggcgaat gcgcgcactc 960
ggggaacgat tccccctaat ccgctgagga gaacacaatg 1000
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<211> 1016
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
taaccccaac gcggcagcgc ggttcgggta agccgaccgc gctgccgccg ataaaacgcc 60
ttgtcataca acacaaaacg accgtcacgc ccgcgcaagt aaaaaccgcc ttgaccttac 120
ccttgctgga aggtttaagc tcccttctta gtgaaaacag gtcaggcggt caacctttaa 180
acaccgcctt ctaagcaagg agtccaatca tgtcacacac cactatgctg gcattgcagg 240
ggctgtcctg catgaactgc gcgcagcggg tgaaaaaagc cctggaaagc cgcagcgatg 300
tcgaacaggc ggaggttaac gtccattacg ccaaagtgac cggcgacgca ccggacagcg 360
cgctgatcga cagcgtgatc gccgccggtt atcaggccga agtcgcgccg cacgccgata 420
ccgaactgca gctgagcggc ctgagctgca tgcactgcgt cggcaccacc cgcaaggcgc 480
tggaggcggt gccgggcgta ttcgccgccg acgtcgctat cgacagcgcg aaagtgtatg 540
gcgatgccga tccgcaaacg ctgatcgccg cggtggaaga tgccggttat cacgccagcg 600
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agctgctgct cagcggcatg acctgcgcca gctgcgtcaa taaagtgcag ttggcgctgc 780
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ccggcgccgc cgatgcgcaa gcgctggtgg cggcggtgga aaaagccggc tacggcgccg 900
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tgaagcgctt tagctggcag gcggcgctcg gtctggcgtt gggtatcccg ctgatg 1016
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<213> 人工序列
<400> 52
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgtc atcagcggtg 120
gagtgcaatg tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac 180
cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc 240
ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg 300
acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg 360
cccgttacac cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag 420
cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct 480
gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc 540
gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc 600
gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc 660
aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg 720
gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct 780
cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg 840
ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg 900
attggctga 909
<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
acagccggat ccccgggtac caccctggtc tctccactat gacg 44
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tcatcattgt gttctcctca gcggattagg 30
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
cgctgaggag aacacaatga atgtatggat tgctttggc 39
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
caaatagggg ttccgcgaaa tttttacagc acgaaaggaa tg 42
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tcgattggct gataacccca atgcggcagc 30
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gcctaggccg aattcgagct ccatcagcgg gatacccaac g 41

Claims (13)

1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）为宿主，在粘质沙雷氏菌的灵菌红素合成基因簇的3'端连接序列如SEQ ID No.11所示的核苷酸片段，灵菌红素合成基因簇为pigF或pigN。
2.如权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，编码所述pigF或pigN的核苷酸序列分别如SEQ ID No.26或SEQ ID No.49所示。
3.如权利要求1或2所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。
4.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1~3任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。
5.如权利要求4所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28~37℃、转速为180~220 rpm。
6.如权利要求4或5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃、转速为200 rpm。
7.如权利要求4或5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、牛肉膏、CaCl2、脯氨酸、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O。
8.如权利要求6所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、牛肉膏、CaCl2、脯氨酸、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O。
9.如权利要求4或5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含15~25 g/L蔗糖、10~20 g/L牛肉膏、5~15 g/LCaCl2、5~10 g/L脯氨酸、0.1~0.3 g/LMgSO4·7H2O和0.04~0.08 g/LFeSO4·7H2O。
10.如权利要求6所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含15~25 g/L蔗糖、10~20 g/L牛肉膏、5~15 g/LCaCl2、5~10 g/L脯氨酸、0.1~0.3 g/LMgSO4·7H2O和0.04~0.08 g/LFeSO4·7H2O。
11.如权利要求7所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含15~25 g/L蔗糖、10~20 g/L牛肉膏、5~15 g/LCaCl2、5~10 g/L脯氨酸、0.1~0.3 g/LMgSO4·7H2O和0.04~0.08 g/LFeSO4·7H2O。
12.如权利要求8所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含15~25 g/L蔗糖、10~20 g/L牛肉膏、5~15 g/LCaCl2、5~10 g/L脯氨酸、0.1~0.3 g/LMgSO4·7H2O和0.04~0.08 g/LFeSO4·7H2O。
13.权利要求1~3任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌或权利要求4-12任一所述的方法在生产灵菌红素中的应用。
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