CN101864373A - 一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 - Google Patents
一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101864373A CN101864373A CN200910266649A CN200910266649A CN101864373A CN 101864373 A CN101864373 A CN 101864373A CN 200910266649 A CN200910266649 A CN 200910266649A CN 200910266649 A CN200910266649 A CN 200910266649A CN 101864373 A CN101864373 A CN 101864373A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- prodigiosin
- strain
- query
- sbjct
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用，该菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescensZSG)。该菌株与以往的同属菌株相比在酸性环境中也能产具有抗肿瘤作用的灵菌红素，菌株稳定，因此，该菌株为在医药方面尤其是制备抗肿瘤药物的应用方面提供了广阔前景；为相关疾病的治疗开拓了新的途径。
Description
(一)技术领域：本发明涉及一种生物材料，具体是一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用。经检测，本菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ZSG)，并于2009-9-17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 209195。
(二)现有技术：灵菌红素(Prodigiosins)是一类然红色素家族的总称，是由多种放线菌(streptomyces)和细菌(serratia，pseudomonas)产生的次级代谢产物。自从1929年Amako等人在研究Serraria生长时发现，并由HarashimaK等人在1960年首次分离得到此类物质以来，对该物质性质及生物活性的研究一直倍受相关研究人员的关注，随着研究的不断深入，它的许多生物学活性被人们所认识，包括抗细菌(antibaeterial)，抗疟疾(antimalarial)，抗真菌(antifungal和抗原生动物(antiprotozoal)的活性。但人们最感兴趣的是此物质所具有的免疫抑制活性和引起的肿瘤细胞凋亡作用。
灵菌红素的生产现状有生物合成与化学合成，主要以生物合成为主。灵菌红素是微生物的次级代谢产物，可由多种细菌和放线菌产生，包括链霉菌属(StrePtomyce、)、沙雷氏菌属(serratia)和假单胞菌属(Pseudomonas)，其中关于沙雷氏菌属(Serratia)的研究最多。对灵菌红素的研究始于美国，而后在欧美一些发达国家有了长足的发展。1973年，WilliamS以粘质沙雷氏菌(S.marcescen，)Nima株为出发菌株，摇瓶发酵培养96h后得到灵菌红素的最高产量为0.0235g/L。
灵菌红素的生产在化学合成上也取得了进展如：1961年RapoportH与HoldenKo首次通过全合成得到了灵菌红素，开创了灵菌红素全合成的先河。1987年Dale等人利用杂环的Diels一Alder反应，以二甲基一1，2，3，4一四嗦一3，6一联苯双酷为起始物成功合成出了灵菌红素。1996年意大利的AlessioRD和RossiA报道了一条新的途径合成十烷灵菌红素，其中关键的步骤是合成二毗咯环的杂环交叉偶联。
灵菌红素生理学作用：美国国立癌症研究所(NSI)MelvinMS(2000)等发现灵菌红素在平均IC50为2.1微摩尔时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞系中的57种不同的人癌细胞均有抗性作用。为了阐明其活性机理，近年来，研究人员们展开了深入的研究，发现这与其诱导细胞凋亡的活性密切相关。尽管灵菌红素诱导细胞凋亡的详细机理尚有待进一步的研究证明，但医学界目前就其机理提出了四种可能：作为pH调节器；作为细胞分裂周期抑制剂；作为DNA裂解因子；作为胞外信号调节激酶调节器。
近年，国内也有研究人员涉足灵菌红素的研究，但注意力大多集中在灵菌红素潜在的临床应用上面，而对灵菌红素的生产研究较少。沈亚领、刘建文、魏东芝等人在灵菌红素对人胰腺癌细胞增殖抑制的实验做了大量研究。研究表明灵菌红素是一种很有潜力的抗肿瘤药物，灵菌红素对人结肠腺癌细胞DLD与SW一620及人胃癌细胞株HGT-1的实验均证实其对这些肿瘤细胞有诱凋亡作用。类似的研究还有张靖的灵菌红素抗癌细胞浸润转移作用及MMps活性的影响。
微生物资源极其丰富，从自然资源中筛选得到具有高产灵菌红素的微生物仍然是一条非常有应用前景的途径。本发明人从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选得到一株具有生产红色素能力的红色短杆菌，这种菌长期生活在此酸性土壤中，已适应酸性环境，由生理生化实验和16S rRNA的序列分析表明该短杆菌为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，但是该菌种生理生化实验中的几种次级产物酶如赖氨酸脱羧酶等与报道的粘质沙雷氏菌的结果不一致，并且该菌株与所有报道的粘质沙雷氏菌的生长环境和筛选方法(在SM培养基加入梯度浓度柠檬酸酸钠进行富集分离)有很大的区别，且一般粘质沙雷氏菌在酸性的环境中产红色素的量少，或者基本不产红色素，而本菌株在pH5.0-6.0的酸性环境下能产生大量的红色素，推断此红色素可能是灵菌红素，由此我们可能得到一株新的能在酸性环境下产灵菌红素的粘质沙雷氏菌种Serratiamarcescens.zsg，并且将这株菌种用于工业上。
(三)发明内容：本发明的目的就是提供一种在酸性环境中能高产灵菌红素的菌株，以及该菌株在制备抗肿瘤药物方面的应用。
菌种筛选：
(一)、材料准备：
1.实验土壤样品取自湖北省黄石市兴华生化有限公司糖化车间
2、培养基：SM培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl2 15.6g/L，调pH至5.0-6.5。
(二)、菌株的筛选分离与纯化：
1)初筛：制备初筛菌悬液：称取土壤样品1g。接种于高压灭菌的SM培养基中，30-37℃连续培养30天进行富集，得初筛菌悬液；取初筛菌悬液20μl涂布于固体SM培养基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经多次纯化、分离，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养基中，30℃恒温培养过夜，得分离菌悬液；
2)二次筛选：制备复筛菌悬液，在一定浓度氯化铵SM培养基内，加入初筛分离菌的分离菌悬液50μl，30℃恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20μl涂于固体SM培养基，30℃恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；然后挑取单菌落在SM培养基中逐级加入一定梯次浓度的柠檬酸三钠，分离得到纯的此菌株。
观察菌落的形态为：菌落呈红色、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，红色菌落周围是乳白色的菌株，推测红色是菌株的次级代谢产物，可能为灵菌红素；最适生长温度25～37℃。
对上述菌株及红色代谢物的鉴定
首先，将上述所分离的微生物菌株送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，并分别进行生理生化特性、全细胞脂肪酸组分、16S rDNA基因序列的测定分析，最终确定此菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，其菌株生理生化特性及16S rDNA基因序列的分析报告如下：
菌株生理生化特性
16S rDNA序列分析主要按照以下步骤进行：
1)提取细菌核DNA
a)集菌：用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养18小时，取其菌悬液1ml于1.5ml的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。
b)加STE 1ml洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。
c)加600μl TE，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d)加等体积酚氯仿抽提三次。
e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min。彻底弃上清。
f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μl TE备用。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，
STE缓冲液：0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)，
2)16S rDNA基因的PCR扩增，
PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。
P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’
P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’
在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μL dNTP(每种NTP 0.2mM)，0.5μL Taq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。
3)PCR产物的回收
将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
4)16S rDNA的全序列测定和分析
PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。
P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；
P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
二、16S rDNA序列测定：
本发明采用对16S rRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1484bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，PCR产物经纯化后，测定其全序列。
1)16S rRNA基因序列
GTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAA
CTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACTGTCGCMGAGRYCAAAGAG
GGGAGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTAATGGCTCA
CCTAGGCGACGATYCCTAGCCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGAACTGAGACMCGGTCCAGACT
CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGSCGCGTGTGTGG
AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATCAATTG
ACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTT
AATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAAC
CTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA
AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCG
AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTG
TGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA
AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA
CCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGCATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGGAGACAG
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTGTAAGTYCCGCAACGAGCGCAACCCTTA
TYCTTTGKTGCCAGCGRTTCGGCCGGGAACCTCAAAGGAGACTGCMAGTGATAAMCTGRAGGAAGGTGGGG
ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGATAGGGCTACACACGTGCTACAATGCGCGTATACAWAGAKA
AGCGACYTCGCKAGAGCAAGCGGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACT
CCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCA
CTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGT
2)16S rRNA基因测序BLAST结果
gb|FJ360759.1|Serratia marcescens strain PSB19 16S ribosomal RNA
gene，partial sequence
Length＝1457
Score＝2534bits(1372)，Expect＝0.0
Identities＝1422/1453(97％)，Gaps＝12/1453(0％)
Strand＝Plus/Plus
Query 1 CATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 8 CATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGG 67
Query 61 TGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAAT 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 68 TGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAAT 127
Query 121 ACCGCATAACTGTCGCMGAGRYCAAAGAGGGGAGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATG 180
|||||||||| ||||| || |||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 128 ACCGCATAAC-GTCGC-AAGACCAAAGAGGGG-GACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATG 184
Query 181 TGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATYCCTAGC 240
||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct 185 TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAG- 243
Query 241 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGAACTGAGACMCGGTCCAGACTCCTACGGGA 300
|||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
Sbjct 244 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGA 303
Query 301 GGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGSCGCGTGTGT 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||
Sbjct 304 GGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGT 363
Query 361 GGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 364 -GAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATA 422
Query 421 CGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 423 CGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC 482
Query 481 GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 483 GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG 542
Query 541 TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCA 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 543 TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCA 602
Query 601 AGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 603 AGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 662
Query 661 TGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA 720
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 663 TGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA 722
Query 721 GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTT 780
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 723 GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTT 782
Query 781 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGG 840
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 783 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGG 842
Query 841 AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC 900
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 843 AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC 902
Query 901 ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTT 960
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 903 ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTT 962
Query 961 TCCAGAGATGGCATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC 1020
||||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct 963 TCCAGAGATGG-ATTGGTGCCTTCGGGAACTCTG-AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC 1020
Query 1021 AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTGTAAGTYCCGCAACGAGCGCAACCCTTATYCTTTGK 1080
|||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct 1021 AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGT-TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGT 1079
Query 1081 TGCCAGCGRTTCGGCCGGGAACCTCAAAGGAGACTGCMAGTGATAAMCTGRAGGAAGGTG 1140
|||||||| ||||||||||||| |||||||||||||| |||||||| ||| |||||||||
Sbjct 1080 TGCCAGCGGTTCGGCCGGGAAC-TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTG 1138
Query 1141 GGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGATAGGGCTACACACGTGCTACAATGCG 1200
||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| |
Sbjct 1139 GGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAG-TAGGGCTACACACGTGCTACAATG-G 1196
Query 1201 CGTATACAWAGAKAAGCGACYTCGCKAGAGCAAGCGGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGT 1260
|||||||| ||| ||||||| |||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct 1197 CGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGG-ACCTCATAAAGTACGTCGTAGT 1255
Query 1261 CCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAG 1320
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1256 CCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAG 1315
Query 1321 AATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTG 1380
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1316 AATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTG 1375
Query 1381 GGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCAT 1440
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1376 GGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCAT 1435
Query 1441 GACTGGGGTGAAG 1453
|||||||||||||
根据S rRNA基因测序BLAST结果，此菌株为粘质沙雷氏菌种Serratia marcescens。
其次，对上述菌株的红色代谢物进行鉴定：
1、购买灵菌红素标准品，将灵菌红素标准品溶解于酸性甲醇，此溶液做全波长扫描，由扫描结果可知在该条件下灵菌红素的最大吸收波长为540nm。
2、将所得到的菌体应用基本培养基(SM培养基)摇瓶培养，发酵液离心得到上清液和菌体，上清液经过乙酸乙酯萃取，菌体经过酸性甲醇萃取，两者萃取液经过浓缩去溶剂，用乙酸乙酯溶解，低温静置，沉淀后得到了大量红色素及其它杂质，此混合物经过高效液相色谱和红外色谱作全波段扫描，得到在波长540nm处波峰面积很大，而其它物质的吸收波长的波峰面积都比这小很多，全波段波长与灵菌红素标准样品所测的波长范围一致，证明了混合物中有灵菌红素的存在，同时也证明灵菌红素在混合物中的含量比其它物质要多。
沉淀后得到的混合物用硅胶柱层析，层析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脱，最后去溶剂得到了灵菌红素粗产品。再利用薄层色谱和柱色谱法对其进行再分，得到灵菌红素纯品。
选540nm作为检测波长，由自制的灵菌红素标准品作浓度OD540的标准曲线，即可由吸收值OD540，计算出灵菌红素的含量。此含量比在菌体没有做任何变异诱导和培养基的选择的情况下都要高。
通过赖氨酸脱羧酶普适测定方法，对发酵液中赖氨酸脱羧酶测定分析得到，此酶在发酵液中存在，而已有的报道中该菌属不产赖氨酸脱羧酶，由此可推测此菌株是一株沙雷氏菌新菌株。
本发明的菌株与以往的同属菌株相比在酸性环境中也能产具有抗肿瘤作用的灵菌红素，菌株稳定。因此，本菌株为在医药方面尤其是制备抗肿瘤药物方面提供了广阔前景。为相关疾病的治疗开拓了新的途径。
(四)具体实施方式：
实施例1
1、菌株的筛选分离与纯化实施例
①初筛：制备初筛菌悬液：称取湖北省黄石市兴华生化有限公司糖化车间土壤样品1g。接种于高压灭菌的SM培养基(蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl2 15.6g/L，调pH至5.0-6.5)中，30-37℃连续培养30天进行富集，得初筛菌悬液；取初筛菌悬液20μl涂布于固体SM培养基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经多次纯化、分离，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养基中，30℃恒温培养过夜，得分离菌悬液；
②二次筛选：制备复筛菌悬液，备一定浓度氯化铵SM培养基内，加入初筛分离菌的分离菌悬液50μl，30℃恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20μl涂于固体SM培养基，30℃恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；然后挑取单菌落在SM培养基中逐级加入一定梯次浓度的柠檬酸三钠，分离得到纯的此菌株。
③观察菌落的形态为：菌落呈红色、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，红色菌落周围是乳白色的菌株。
实施例2
灵菌红素的制备与纯化实施例
取实施例1中培养筛选分离的菌体应用基本培养基(SM培养基)摇瓶培养，发酵液离心得到上清液和菌体，上清液经过乙酸乙酯萃取，菌体经过酸性甲醇萃取，两者萃取液经过浓缩去溶剂，用乙酸乙酯溶解，低温静置，沉淀后得到了大量红色素及其它杂质的混合物，将此混合物用硅胶柱层析，层析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脱，最后去溶剂得到了灵菌红素粗产品。再利用薄层色谱和柱色谱法对其进行再分，即得到灵菌红素纯品。
实施例3
将灵菌红素纯品与药剂学上可接受的赋形剂、辅料一起制备成各种剂型的抗肿瘤药物。
Claims (2)
1.一种产灵菌红素的微生物菌株，为粘质沙雷氏菌(Serra tiamarcescensZSG)，CCTCC NO：M 209195。
2.如权利要求1所述的一种产灵菌红素的微生物菌株在制备抗肿瘤药物方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910266649A CN101864373A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910266649A CN101864373A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101864373A true CN101864373A (zh) | 2010-10-20 |
Family
ID=42956300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910266649A Pending CN101864373A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101864373A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181382A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-14 | 黑龙江大学 | 粘质沙雷氏菌 |
| CN102311981A (zh) * | 2011-07-19 | 2012-01-11 | 东南大学 | 制备提纯灵菌红素的方法 |
| CN102337234A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-02-01 | 东南大学 | 粘质沙雷氏菌lth-2及其筛选方法和应用 |
| CN105695365A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-06-22 | 蔡剑前 | 一株粘质沙雷氏菌及其在抑制肿瘤中的应用 |
| CN105969691A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-09-28 | 浙江工业大学 | 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 |
| CN111154673A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-15 | 江苏师范大学 | 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用 |
| CN111575221A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-25 | 江南大学 | 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法 |
| CN111778298A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-16 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种粘质沙雷氏菌itbb b5-1在生产灵菌红素中的应用 |
| CN116555369A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-08 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种利用废弃玉米浆发酵生产灵菌红素的方法 |
-
2009
- 2009-12-31 CN CN200910266649A patent/CN101864373A/zh active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181382A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-14 | 黑龙江大学 | 粘质沙雷氏菌 |
| CN102181382B (zh) * | 2011-01-27 | 2016-03-30 | 黑龙江大学 | 粘质沙雷氏菌 |
| CN102311981A (zh) * | 2011-07-19 | 2012-01-11 | 东南大学 | 制备提纯灵菌红素的方法 |
| CN102337234A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-02-01 | 东南大学 | 粘质沙雷氏菌lth-2及其筛选方法和应用 |
| CN105695365A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-06-22 | 蔡剑前 | 一株粘质沙雷氏菌及其在抑制肿瘤中的应用 |
| CN105969691B (zh) * | 2016-06-08 | 2019-06-14 | 浙江工业大学 | 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 |
| CN105969691A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-09-28 | 浙江工业大学 | 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 |
| CN111154673A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-15 | 江苏师范大学 | 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用 |
| CN111575221A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-25 | 江南大学 | 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法 |
| CN111575221B (zh) * | 2020-05-26 | 2021-12-28 | 江南大学 | 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法 |
| CN111778298A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-16 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种粘质沙雷氏菌itbb b5-1在生产灵菌红素中的应用 |
| CN111778298B (zh) * | 2020-07-27 | 2023-06-27 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种粘质沙雷氏菌itbb b5-1在生产灵菌红素中的应用 |
| CN116555369A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-08 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种利用废弃玉米浆发酵生产灵菌红素的方法 |
| CN116555369B (zh) * | 2023-05-10 | 2024-02-09 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种利用废弃玉米浆发酵生产灵菌红素的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101864373A (zh) | 一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用 | |
| CN102242069B (zh) | 一种蝉拟青霉菌株及其应用 | |
| CN101933460B (zh) | 一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法 | |
| CN103416223B (zh) | 一种提高北冬虫夏草发酵液中虫草素产量的方法 | |
| Kammerer et al. | Identification of a new Waitea circinata variety causing basal leaf blight of seashore paspalum | |
| CN102533600B (zh) | 海洋链霉菌、吡喃型倍半萜类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN106010980B (zh) | 一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株及其应用 | |
| CN106916861A (zh) | 一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法 | |
| CN107400653A (zh) | 一种含α‑糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN101914586B (zh) | Don毒素的制备纯化方法 | |
| US9322040B2 (en) | Pseudonocardia sp. and method for preparing deoxynyboquinone by utilizing same | |
| CN100554404C (zh) | 一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其培养方法 | |
| CN106995789B (zh) | 一株白藜芦醇发酵菌及其应用 | |
| CN102417883A (zh) | 产喜树碱的新菌种筛选及制备喜树碱的方法 | |
| CN116103161A (zh) | 一种产泽兰素的植物内生真菌及其应用 | |
| CN110551636A (zh) | 一种紫色红曲菌my-21菌株及其应用 | |
| CN105192592A (zh) | 一种具降血糖功能的腊八豆及其加工方法 | |
| CN107513502A (zh) | 一种产小柱孢酮的灰霉菌突变株Δbcscd1及其构建方法 | |
| CN103865804B (zh) | β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用 | |
| CN102206588B (zh) | 一株产抗氧化剂的菌株 | |
| CN111961693A (zh) | 一种线虫草菌的新用途及采用线虫草生产亚油酸和γ-亚麻酸的新方法 | |
| KR101865292B1 (ko) | 버섯 추출물을 함유하는 펠리누스 린테우스 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 펠리누스 린테우스의 배양방법 | |
| CN102114013B (zh) | 抑制血管生成的化合物及其制备方法和应用 | |
| CN108660169A (zh) | 一种发酵制备棘孢菌素类抗生素的方法 | |
| CN114540376B (zh) | 一种抗肿瘤聚酮类化合物及其制备方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20101020 |