CN111778298B - 一种粘质沙雷氏菌itbb b5-1在生产灵菌红素中的应用 - Google Patents

一种粘质沙雷氏菌itbb b5-1在生产灵菌红素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种粘质沙雷氏菌ITBB B5‑1在生产灵菌红素中的应用。该粘质沙雷氏菌的保藏编号为CGMCC No.7416。采用本发明所述菌株生产灵菌红素，其产量在每升培养基中达9.8～15.5g，显著高于所报道的菌株。本发明克服了粘质沙雷氏菌菌株低灵菌红素产量的制约，在医药市场中具有广阔的应用前景。

Description

一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用。
背景技术
灵菌红素类色素(Prodigiosins)是一类具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构的天然红色素，包括灵菌红素(Prodigiosin)、环烷基灵菌红素(Cycloprodigiosin)、十一烷基灵菌红素(Undecylprodigiosin)、间环丙菌素(Metacycloprodigiosin)、链玉红菌素B(Streptorubin B)等(尤忠毓，王玉洁，孙诗清，刘晓侠。微生物发酵法生产灵菌红素研究进展。生物工程学报，2016，32(10)：1332-1347)。其中灵菌红素(Prodigiosin)在医药界中具有巨大的潜在应用价值。灵菌红素是一种高效低毒的抗癌药物。有关研究表明，灵菌红素在平均半抑制浓度(IC50)为2.1umol/L时对60种癌细胞系具有较强抗性，且对正常细胞不产生毒害。灵菌红素具有免疫抑制功能，可作为免疫抑制剂应用于临床器官移植。此外，它还可以作为效果良好的抗疟疾药物。
灵菌红素是一种微生物合成的次生代谢物，主要来源于一些粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)或放线菌。但目前所报道的能产灵菌红素的粘质沙雷氏菌菌株其灵菌红素的产量较低。如公开号CN 101392227A中保藏编号为CGMCC.No.2593的粘质沙雷氏菌发酵2d后灵菌红素产量为7.85g/L；公开号CN 102277323A中保藏编号为CCTCC NO:M2010347的粘质沙雷氏菌发酵2.8d后灵菌红素产量为3～5g/L；公开号CN 1059697029中保藏编号为CGMCC No.12714的粘质沙雷氏菌48h发酵结束时灵菌红素最大浓度为5.29g/L。粘质沙雷氏菌菌株的低灵菌红素产量特性制约了灵菌红素的生产及其在医药市场的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用。利用该菌株生产灵菌红素，其灵菌红素产量可达9.8～15.5g/L，显著高于所报道的菌株。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用，该粘质沙雷氏菌的保藏编号为CGMCC No.7416。
本发明所述粘质沙雷氏菌ITBB B5-1已于2013年04月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7416。且该菌株已在公开号为CN103333810A专利中公开，该菌株从橡胶树的胶乳中分离获得，经形态学和分子生物学鉴定属于粘质沙雷氏菌。
本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，包括如下步骤：
将保藏编号为CGMCCNo.7416的粘质沙雷氏菌活化，然后接种于液体培养基中进行扩大培养，得到种子液；
将所得种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，经纯化得到灵菌红素。
作为优选，活化所用培养基为LB培养基。
作为优选，活化为在24～26℃黑暗条件下活化1～3d。
优选地，活化为在25℃黑暗条件下活化2d。
作为优选，液体培养基的配方为：胰蛋白胨15～25g/L、酵母提取物10～15g/L、氯化钠4～6g/L，pH值6.8～7.2。
优选地，液体培养基的配方为：胰蛋白胨15～25g/L、酵母提取物10～15g/L、氯化钠5g/L，pH值7.0。
作为优选，扩大培养的条件为：接种量为1～2CFU/100mL，24～26℃黑暗条件下200～300rpm振荡培养12～18h。
优选地，扩大培养的条件为：接种量为1CFU/100mL，25℃黑暗条件下250rpm振荡培养12～18h。
作为优选，发酵培养基的配方为：胰蛋白胨15～25g/L、酵母提取物10～15g/L、氯化钠4～6g/L，pH值6.8～7.2。
优选地，发酵培养基的配方为：胰蛋白胨15～25g/L、酵母提取物10～15g/L、氯化钠5g/L，pH值7.0。
作为优选，发酵培养的条件为：种子液与发酵培养基的接种比例为3vt％～5vt％，装液量为200～400mL/1000mL，22～28℃黑暗条件下200～300rpm振荡培养48～96h。
优选地，发酵培养的条件为：种子液与发酵培养基的接种比例为3vt％～5vt％，装液量为300mL/1000mL，22～28℃黑暗条件下250rpm振荡培养48～96h。
作为优选，纯化为：将发酵液离心收集菌体，用无水乙醇重悬菌体，激烈振荡后离心收集乙醇上清和沉淀；
将沉淀采用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯上清；
将乙醇上清、乙酸乙酯上清浓缩干燥，再加入甲醇复溶，得到粗提物；
以丙酮：乙酸乙酯＝95：5为洗脱剂，用200目的硅胶柱对粗提物进行层析，将获得的红色组分用甲醇洗脱，洗脱液经干燥后，得到纯化的灵菌红素。
作为优选，无水乙醇的体积为菌体体积的4～6倍，激烈振荡的时间为50～100s，乙酸乙酯的体积为沉淀体积的4～6倍，离心的转速为10000～15000g。
优选地，无水乙醇的体积为菌体体积的5倍，激烈振荡的时间为60s，乙酸乙酯的体积为沉淀体积的5倍，离心的转速为12000g。
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用，该粘质沙雷氏菌的保藏编号为CGMCC No.7416。本发明具有的技术效果为：
采用本发明所述菌株生产灵菌红素，其产量在每升培养基中达9.8～15.5g，显著高于所报道的菌株。本发明克服了粘质沙雷氏菌菌株低灵菌红素产量的制约，在医药市场中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明公开了一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述的粘质沙雷氏菌ITBB B5-1高效生产灵菌红素的步骤如下：
1.种子液的准备：将粘质沙雷氏菌ITBB B5-1于LB培养固体基中黑暗条件下25℃活化2d，取单菌落接种于含100mL胰蛋白胨15-25g/L、酵母提取物10-15g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的液体培养基中25℃黑暗条件下250rpm振荡培养，培养12-18h至菌液OD600＝0.8-1.0作为种子液。
2.发酵条件：将种子液按3％-5％的比例接种于含胰蛋白胨15-25g/L、酵母提取物10-15g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的培养基中，装液量为300mL/1000mL，黑暗条件下250rpm摇瓶培养，发酵温度为22-28℃，发酵时间为48－96h。
3.发酵液灵菌红素产量的检测：取1mL发酵液于1.5mL离心管中12000g离心5min，弃上清，加入1mL酸化乙醇(4％(v/v)1M盐酸于95％乙醇)重悬菌体沉淀来提取菌体灵菌红素，激烈振荡30s，12000g离心5min，收集上清于新的离心管中，于波长536nm测定吸光值。以灵菌红素标准品制成标准液，稀释成不同的浓度梯度，于波长536nm测定吸光值，制备出标准曲线。通过标准曲线计算出发酵液中的灵菌红素产量。
本发明所述的灵菌红素的提取纯化方法，将发酵液于12000g离心5min收集菌体，加入5倍体积无水乙醇重悬菌体，激烈震荡60s，12000g离心收集上清，再用加入5倍体积的乙酸乙酯于沉淀中进行浸提，12000g离心收集上清；分别将上清干燥，再加入甲醇复溶，以丙酮：乙酸乙酯＝95：5为洗脱剂用200目的硅胶柱进行层析，得到一红色的组分，收集该组分并用甲醇洗脱、干燥，最终获得纯化的灵菌红素。将纯化好的灵菌红素进行LC-ESI-MS/MS和Q-TOF MS分析，发现为纯化的灵菌红素(Prodigiosin)。
本发明提供的粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所述的粘质沙雷氏菌ITBB B5-1生产灵菌红素
1.将粘质沙雷氏菌ITBB B5-1于LB培养固体基中黑暗条件下25℃活化2d，取单菌落接种于含100mL胰蛋白胨15g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的液体培养基中25℃黑暗条件下250rpm振荡培养，培养12h，波长600nm条件下测量出菌液的OD值为0.8，该菌液作为种子液。
2.将种子液按3％的比例接种于含胰蛋白胨15g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的液体培养基中，装液量为300mL/1000mL，黑暗条件下250rpm摇瓶培养，发酵温度为22℃，发酵时间为48h。
3.取1mL发酵液于1.5mL离心管中12000g离心5min，弃上清，加入1mL酸化乙醇(4％(v/v)1M盐酸于95％乙醇)重悬菌体沉淀来提取菌体灵菌红素，激烈振荡30s，12000g离心5min，收集上清于新的离心管中，于波长536nm测出其吸光值。以灵菌红素标准品(购自Sigma公司)用酸化乙醇制成标准液，稀释成不同的浓度梯度，于波长536nm测定吸光值，制备出标准曲线。通过标准曲线计算出发酵液中的灵菌红素产量为9.8g/L。
实施例2：本发明所述的粘质沙雷氏菌ITBB B5-1生产灵菌红素
1.将粘质沙雷氏菌ITBB B5-1于LB培养固体基中黑暗条件下25℃活化2d，取单菌落接种于含100mL胰蛋白胨20g/L、酵母提取物12g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的液体培养基中25℃黑暗条件下250rpm振荡培养，培养15h，测量菌液OD600为0.9作为种子液。
2.将种子液按4％的比例接种于含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物12g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的培养基中，装液量为300mL/1000mL，黑暗条件下250rpm摇瓶培养，发酵温度为28℃，发酵时间为72h。
3.取1mL发酵液于1.5mL离心管中12000g离心5min，弃上清，加入1mL酸化乙醇重悬菌体沉淀来提取菌体灵菌红素，激烈振荡30s，12000g离心5min，收集上清于新的离心管中，于波长536nm测出吸光值。以灵菌红素标准品(购自Sigma公司)用酸化乙醇制成标准液，稀释成不同的浓度梯度，于波长536nm测定吸光值，制备出标准曲线。通过标准曲线计算出发酵液中的灵菌红素产量为11.8g/L。
实施例3：本发明所述的粘质沙雷氏菌ITBB B5-1生产灵菌红素
1.将粘质沙雷氏菌ITBB B5-1于LB培养固体基中黑暗条件下25℃活化2d，取单菌落接种于含100mL胰蛋白胨25g/L、酵母提取物15g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的液体培养基中25℃黑暗条件下250rpm振荡培养，培养至18h，菌液OD600测量为1.0，用该菌液作为种子液。
2.将种子液按5％的比例接种于含胰蛋白胨25g/L、酵母提取物15g/L、氯化钠5g/L、pH值7.0的培养基中，装液量为300mL/1000mL，黑暗条件下250rpm摇瓶培养，发酵温度为25℃，发酵时间为96h。
3.取1mL发酵液于1.5mL离心管中12000g离心5min，弃上清，加入1mL酸化乙醇重悬菌体沉淀来提取菌体灵菌红素，激烈振荡30s，12000g离心5min，收集上清于新的离心管中，于波长536nm测出其吸光值。以灵菌红素标准品(购自Sigma公司)用酸化乙醇制成标准液，稀释成不同的浓度梯度，于波长536nm测定吸光值，制备出标准曲线。通过标准曲线计算出发酵液中的灵菌红素产量为15.5g/L。
实施例4：本发明所述的灵菌红素的提取纯化方法
将发酵液于12000g离心5min收集菌体，加入5倍体积无水乙醇重悬菌体，激烈震荡60s，12000g离心收集上清，再用加入5倍体积的乙酸乙酯于沉淀中进行浸提，12000g离心收集上清。将乙醇和乙酸乙酯上清分别用用旋转蒸发仪浓缩干燥，再加入甲醇复溶，以丙酮：乙酸乙酯＝95：5为洗脱剂用200目的硅胶柱进行层析，获得一红色的组分，收集该组分并用甲醇洗脱、干燥，得到纯化的灵菌红素。将纯化好的灵菌红素进行LC-ESI-MS/MS和Q-TOF MS分析，发现为纯化的灵菌红素(Prodigiosin)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种粘质沙雷氏菌ITBB B5-1在生产灵菌红素中的应用，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌的保藏编号为CGMCC No.7416。
2.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌活化，然后接种于液体培养基中进行扩大培养，得到种子液；
将所得种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，经纯化得到灵菌红素；
所述活化所用培养基为LB培养基；
所述活化为在24~26℃黑暗条件下活化1~3d；
所述液体培养基的配方为：胰蛋白胨15~25 g/L、酵母提取物10~15 g/L、氯化钠4~6 g/L，pH值6.8~7.2；
所述发酵培养基的配方为：胰蛋白胨15~25 g/L、酵母提取物10~15 g/L、氯化钠4~6 g/L，pH值6.8~7.2；
所述发酵培养的条件为：种子液与发酵培养基的接种比例为3vt%~5vt%，装液量为200~400 mL/1000 mL，22~28 ℃黑暗条件下200~300 rpm振荡培养48~96 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩大培养的条件为：接种量为1~2CFU/100 mL，24~26℃黑暗条件下200~300 rpm振荡培养12~18 h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纯化为：将发酵液离心收集菌体，用无水乙醇重悬菌体，激烈振荡后离心收集乙醇上清和沉淀；
将所述沉淀采用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯上清；
将乙醇上清、乙酸乙酯上清浓缩干燥，再加入甲醇复溶，得到粗提物；
以丙酮：乙酸乙酯＝95：5为洗脱剂，用200目的硅胶柱对粗提物进行层析，将获得的红色组分用甲醇洗脱，洗脱液经干燥后，得到纯化的灵菌红素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇的体积为菌体体积的4~6倍，所述激烈振荡的时间为50~100s，所述乙酸乙酯的体积为沉淀体积的4~6倍，所述离心的转速为10000~15000g。
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