CN112175845A

CN112175845A - 一株适用于茶酒酿造的酿酒酵母及其应用

Info

Publication number: CN112175845A
Application number: CN202011117960.8A
Authority: CN
Inventors: 邹纯; 尹军峰; 李如意; 许勇泉; 陈建新; 余新美; 汪芳
Original assignee: Guangxi Sanjiangyuan Tea Industry Co ltd; Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Sanjiangyuan Tea Industry Co ltd; Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112175845B

Abstract

本发明公开了一株适用于茶酒酿造的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GXSJ77已于2019年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191049，保藏地址是湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学保藏中心。本发明还提供了一种酿酒酵母GXSJ77的培养方法及其应用，一种利用酿酒酵母GXSJ77生产茶酒的方法及其制备得到的茶酒。本发明的酿酒酵母GXSJ77用于茶酒的酿造，能够适应茶汁的发酵环境，酒精转化率高、发酵程度彻底，生产的茶酒口感协调且风味宜人，对茶酒的工业化生产具有重要意义。

Description

一株适用于茶酒酿造的酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及一株适用于茶酒酿造的酿酒酵母及其应用。

背景技术

茶酒是以茶叶为主要原料，采用浸泡、勾兑或微生物发酵制备而成的各种饮用酒的统称。茶酒不但兼具酒与茶的独特风味，而且富含茶多酚、咖啡碱和氨基酸等营养成分，具有十分广阔的市场前景。

目前，应用于茶酒生产的菌株大部分是适用于葡萄酒或其它果酒酿造的商业活性干酵母，由于这些菌株难以适应富含抑菌物质的茶汁体系，在茶酒生产中容易出现的菌种生长缓慢、酒精转化率低、酒体风味不佳等问题。因此，筛选适用于茶酒发酵的专用酵母具有重要意义。

针对该问题，公开号为CN107699506A的发明专利公开了一株在红茶菌中筛选出的酿酒酵母T3，对茶汁环境具有很好的适应性。然而，该专利中的酿酒酵母是从酸性的红茶菌中筛选获得，在发酵中容易产酸，导致酿造茶酒过程中需精细调控，以避免酸涩味偏重。此外，该专利中没有针对酿酒酵母的产挥发性成分能力进行筛选，酿造的茶酒香气稍显不足。本专利从自然发酵至具有酒味的茶叶中分离能够适应茶汁体系的酵母，并对产酒精能力强、发酵香气好的菌株进行多级筛选，获得了一株具有发酵速度快、产酒精能力强、产酸适中、产香协调且浓郁等特征的酿酒酵母。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一株适用于茶酒酿造的酿酒酵母及其应用。本发明从自然发酵至酒味明显且香气宜人的红茶发酵叶中分离能够适应茶汁体系的酵母，并对产酒精能力强、发酵香气好的菌株进行多级筛选，获得了一株具有发酵速度快、产酒精能力强、风味优良等特征的适用于茶酒发酵的酿酒酵母。

本发明菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GXSJ77，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日：2019年12月16日，保藏编号：CCTCCNO: M20191049。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株酿酒酵母，其特征在于所述酿酒酵母命名为：Saccharomyces cerevisiae GXSJ77，保藏编号为：CCTCC M 20191049。

一株酿酒酵母GXSJ77的培养方法，其特征在于将酿酒酵母GXSJ77接种至YPD液体培养基中培养，所述YPD液体培养基包括酵母粉8-12 g/L，蛋白胨15-25 g/L，葡萄糖16-24g/L，pH6-7。

所述的一种酿酒酵母GXSJ77在制备食品中的应用。

所述的应用，其特征在于包括制备以茶叶为原料的酒精饮品中的应用。

一种包含酿酒酵母GXSJ77的微生物菌剂。

所述的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

一种利用酿酒酵母GXSJ77生产茶酒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将低温保存的酿酒酵母GXSJ77 50μL接种至100mLYPD培养基中，在30℃、150 rpm条件下培养24h得到种子液；

（2）将种子液接种至茶叶培养基中进行发酵培养，得到茶酒。

所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中YPD培养基包括酵母粉8-12 g/L，蛋白胨15-25 g/L，葡萄糖16-24 g/L，pH6-7。

所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中种子液的接种量为6-8%，培养条件为：28℃下静置培养12-14d，茶叶培养基为：蔗糖1.8kg溶解于10L水中，加入80g茶叶，90℃浸提40min，过滤后取滤液冷却得茶叶培养基。

一种采用任一所述方法制备得到的茶酒。

本发明提供的酿酒酵母GXSJ77用于茶酒的酿造，能够适应于茶汁的发酵环境，酒精转化率高、发酵程度彻底，所生产的茶酒口感协调并保持茶叶典型风味特性，对茶酒的工业化生产具有重要意义。

附图说明

图1为筛选过程中的酵母菌落图；

图2为TTC染色的菌落，其中a：浅粉色，b：粉红色，c：深红色；

图3为酵母在杜氏小管中的产气情况图，其中a：产气很少，b：产气较少，c：产气较多；

图4为PCR扩增ITS片段的琼脂糖电泳检测图；

图5为酿酒酵母GXSJ77和商业活性干酵母的发酵过程比较图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1：筛选获得酿酒酵母GXSJ77

1.取种：采集一芽二、三叶的鲜叶，于室温摊放一夜后，置于32℃萎凋槽中进行萎凋，并通过快速水分测定仪检测萎凋叶中含水量，直至萎调叶水分为60 ~ 64%。萎调完成后，用揉捻机对萎凋叶按轻揉-重揉-轻揉各15 min进行揉捻。将揉捻叶置于30℃、相对湿度90%的恒温恒湿箱中进行发酵2~3 天，直至发酵叶有明显的酒味产生。挑选酒味明显且香气宜人的红茶发酵叶，用无菌水冲洗上述发酵叶，获得含酵母的菌液。

2.纯种分离：取上述菌液10 mL，加入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀。然后梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5，取0.2 mL涂布于含有2 g/L茶多酚的YPD培养基平板上，置于30℃培养箱中培养2天。挑取平板上具有酵母典型特征的菌落，划线分离3次以上，获得184株菌。

YPD培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，固体培养基添加15 g/L琼脂。

3.一级筛选：将划线分离的菌株在显微镜下进行观察，筛选出一端或多端出芽的酵母菌株，获得106株菌。将镜检筛选出来的菌株接种于WL营养琼脂培养基上，置于30℃培养箱中培养4~5天。筛选出菌落颜色为奶油色（乳白色），表面光滑，球形凸起，不透明，奶油状的菌株（见图1），获得82株菌。

WL营养琼脂培养基：酵母粉4 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，KH₂PO₄ 0.55 g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl₂ 0.125 g/L，MgSO₄ 0.125 g/L，FeCl₃0.0025 g/L，MnSO₄ 0.0025g/L，琼脂20 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L。

4.二级筛选：TTC显色剂能与酵母的脱氢酶反应呈红色，红色深浅反应酵母体内呼吸酶活力，进而反应了酵母产酒精的能力。将纯化的单菌落按三点接种法点接于YPD琼脂培养基上，于25℃培养24 h。待长出菌落后往其倒入TTC上层培养基，25℃下培养3 h，将菌落按照颜色深浅进行分类并记录（见图2）。挑选出菌落较大、颜色深红的菌36株。

TTC。 20，待冷却至55℃左右时，加入0.05g TTC上层培养基：葡萄糖0.5g，琼脂粉1.5g，加水至100mL，115℃灭菌min

5.三级筛选：在培养酵母的试管中加入杜氏小管，可以通过杜氏小管中的产气泡情况初步分析菌种在该培养基中的产酒精性能。将二级筛选获得的酵母在含有3 g/L茶多酚的YPD培养基进行培养，通过观察杜氏小管中的产气速度（见图3），筛选出耐茶多酚的菌种27株；进一步将上述菌种在含有18%乙醇的YPD培养基进行培养，通过观察杜氏小管中的产气速度，筛选出既耐茶多酚又耐乙醇的菌种4株。

6.四级筛选：将三级筛选出的菌种接种于茶糖水培养基中，在25℃下静置发酵，至发酵结束后进行感官审评（审评标准见表1）、酒精度和香气物质测定（见表2）。挑选出酒体协调、香气浓郁的菌种1株，命名为GXSJ77。

表1茶酒香气感官评价标准（总分100分）

表2不同菌种发酵茶酒酒精度、挥发性物质含量和感官评价

实施例2：

应用Ezup 柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取出实施例1中筛选出菌株GXSJ77的基因组DNA，并以此为模板，应用通用引物PCR扩增ITS片段，PCR产物采用1.7%琼脂糖电泳检测（见图4），并委托上海生工生物有限公司进行测序。通过BLAST方式将测定的序列与GenBank中的序列进行比对分析，鉴定为Saccharomyces cerevisiae。将其在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日：2019年12月16日，保藏号：CCTCC M 20191049。

实施例3：

以商业活性干酵母（命名为SY）为对照，将实施例1筛选出的菌株GXSJ77与对照菌SY分别接种于红茶培养基中发酵制备红茶酒。

首先进行种子液培养：取低温保存的菌种50 μL接种至100 mL YPD培养基中，在30℃、150 rpm下培养24 h。然后进行发酵培养：将培养好的种子液接种于10 L红茶培养基中，于28℃下静置培养。每隔两日取样测定菌体量（波长为600nm下的吸光度）和酒精度，直至发酵结束（见图5）。菌株GXSJ77的最高菌体量是商业活性干酵母的9.2倍，说明相比商业活性干酵母，菌株GXSJ77能够很好地适应茶汁体系。菌株GXSJ77的最高酒精度是商业活性干酵母的3.16倍，说明相比商业活性干酵母，菌株GXSJ77在茶汁体系下具有更强的酒精生产能力。此外，用菌株GXSJ77酿制的茶酒口感更协调，且茶香、茶味明显。

红茶培养基：首先将蔗糖1.8 kg蔗糖溶解于10 L水中，然后加入80 g茶叶，在90℃浸提40 min，浸提后将茶叶过滤，冷却备用。茶叶为祁门红茶，购于祁门茶厂。

实施例4：

以现有技术公开号为CN107699506A的发明专利公开的酿酒酵母T3作对照，将实施例1筛选出的菌株GXSJ77与对照菌T3分别接种于红茶培养基中发酵制备红茶酒。培养基与方法参考实施例3。

将两个菌制备的红茶酒分别进行感官审评（审评标准见表1）、酒精度、香气物质和总酸（以乙酸计）测定（见表3）。与酿酒酵母T3相比较，本发明酿酒酵母GXSJ77生产的茶酒中挥发性物质含量、香气感官评价分显著提升，总酸含量明显下降，香气更丰富浓郁，口感上酸甜度更协调。

表3菌株GXSJ77与对照菌T3发酵茶酒酒精度、挥发性物质含量和感官评价

Claims

1. 一株酿酒酵母，其特征在于所述酿酒酵母命名为：Saccharomyces cerevisiae GXSJ77，保藏编号为：CCTCC M 20191049。

2. 一种如权利要求1所述酿酒酵母GXSJ77的培养方法，其特征在于将酿酒酵母GXSJ77接种至YPD液体培养基中培养，所述YPD液体培养基包括酵母粉8-12 g/L，蛋白胨15-25 g/L，葡萄糖16-24 g/L，pH6-7。

3.如权利要求1所述的一种酿酒酵母GXSJ77在制备食品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于包括制备以茶叶为原料的酒精饮品中的应用。

5.一种包含权利要求1所述酿酒酵母GXSJ77的微生物菌剂。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

7.一种利用权利要求1所述酿酒酵母GXSJ77生产茶酒的方法，其特征在于包括以下步骤：

8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中YPD培养基包括酵母粉8-12g/L，蛋白胨15-25 g/L，葡萄糖16-24 g/L，pH6-7。

9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中种子液的接种量为6-8%，培养条件为：28℃下静置培养12-14d，茶叶培养基为：蔗糖1.8kg溶解于10L水中，加入80g茶叶，90℃浸提40 min，过滤后取滤液冷却得茶叶培养基。

10.一种采用权利要求7-9任一所述方法制备得到的茶酒。