CN109182156A - 一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae已于2018年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株能够适应火龙果汁的发酵环境、起酵速度快，发酵彻底，且在保障产酒精能力较强的基础上所产火龙果酒口感协调且火龙果典型性明显。

Description

一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
火龙果(Pitaya)又名青龙果、红龙果、仙蜜果等，属仙人掌科，量天尺(三角柱)属的果用栽培品种，原产于中美洲热带雨林地区，后来传入越南、东南亚国家和我国台湾、福建、广西等地。这种热带水果含有丰富的营养成分，它除含有碳水化合物、有机酸、蛋白质外，还有丰富的膳食纤维、维生素及多酚类物质，其中红芯火龙果中还含有甜菜红素、花青素等具有抗氧化作用的物质。
目前火龙果主要以鲜食为主，深加工产品较少，以火龙果为原料进行果酒发酵，不仅可以保留火龙果本身的营养成分，而且发酵过程中酵母会产生很多对人体有益的代谢产物，且更容易被人体吸收。
果酒行业中，发酵所用酵母对果酒的品质起着至关重要的作用，相同水果不同酵母发酵其产品品质及风格也会存在很大的差异。目前我国各种果酒生产无相应的专用酵母，大多采用适于葡萄酒酿造的商业活性干酵母，但往往出现发酵迟缓，发酵不彻底等问题，影响酒体风味，因此筛选出一株适用于红芯火龙果酒发酵的专用酿酒酵母就显得非常重要。
发明内容
为了解决目前存在的采用适于葡萄酒酿造的商业活性干酵母进行果酒生产时出现的发酵迟缓、发酵不彻底、影响酒体风味等问题，本发明提供了一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用，所述技术方案如下：
本发明的第一个目的在于提供一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母，所述酿酒酵母已于2018年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的在于提供一种生产火龙果酒的方法，所述方法是接种权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.16245生产火龙果酒。
可选的，所述接种是在生产火龙果酒的主发酵阶段进行接种。
可选的，所述接种是以4～6％的接种量进行接种。
本发明的第三个目的在于提供一种火龙果酒，所述火龙果酒是采用上述方法制备的火龙果酒。
本发明的第四个目的在于提供一种上述酿酒酵母CGMCC No.16245在食品中的应用。
可选的，所述应用包括制备以红芯火龙果为发酵原料的果汁或酒精饮品。
本发明的第五个目的在于提供一种微生物菌剂，所述菌剂为包含上述酿酒酵母CGMCC No.16245的微生物菌剂。
可选的，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
本发明的第六个目的在于提供一种酿酒酵母的培养方法，所述方法是将酿酒酵母CGMCC No.16245接种至YPD液体培养基中培养，所述YPD液体培养基为：酵母粉5～15g/L，蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，pH自然。
本发明有益效果是：
本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.16245用于红芯火龙果酒的酿造，能够适应火龙果汁的发酵环境、起酵速度快，发酵彻底，且在保障产酒精能力较强的基础上所产火龙果酒口感协调且火龙果典型性明显。
生物材料保藏信息：
一株酵母194，其分类学命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2018年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1TTC初筛平板；
图2菌株产气情况分类图；
图3菌株筛选结果维恩图；
图4筛选菌株发酵失重图；
图5酵母18S rDNA PCR产物琼脂糖电泳图；
图6基于18S rDNA测序构建酵母菌株系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例中菌株筛选和性能测定中所用培养基：
TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖50.5，蛋白胨10.0，酵母浸膏7.5，酸性磷酸钾5.0，硫酸镁2.0，柠檬酸1.35，氨苄青霉素1.0，调整pH在4.0以上，琼脂30.0。
TTC上层培养基(g/L)：葡萄糖0.5，琼脂15.0；灭菌后冷却后加入TTC 0.5。
YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。
YPD培养基平板、斜面(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，琼脂粉20。
发酵培养基：红芯火龙果浆(一般可溶性固形物含量为14°Bx)，加蔗糖调可溶性固形物含量为22°Bx，于恒温振荡水浴锅中70℃灭菌30min。
菌株：SY、RW、D254(均为商业酵母)。
实施例1：酿酒酵母的筛选及鉴定
本实施例中菌株筛选，具体步骤如下：
1、源菌的收集：将多汁水果表面菌种利用无菌水洗下，备用。
表1实施例1中挑选出的200株菌株的来源
2、接种TTC初筛平板：TTC是一种显色剂，能与酵母中的脱氢酶反应而呈现红色，且红色的深浅和酵母体内呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力高低密切相关。将在特定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层含有TTC的固体培养基，TTC会附着在菌落表面，产酒精能力强的酵母会呈深红色，次之显粉红色。将收集的菌体稀释涂布于含有氨苄青霉素的TTC下层平板上，28℃倒置培养2d。将10～200个左右菌落的平板挑出，倒入TTC上层平板，28℃避光培养2～3h，挑选菌落较大、红色较深的菌落200株(结果见图1)，备用。
3、纯种分离：将TTC挑出的菌株接种于YPD液体培养基中，活化24～48h，在YPD固体平板中划线分离，挑选典型酵母形态单菌落(表面光滑、湿润、粘稠，质地柔软，易挑起多为乳白色或奶油色)在YPD试管斜面划线28℃培养48h，编号，4℃保藏。
4、菌株复筛：将斜面中保藏的菌株接种于YPD液体试管中28℃活化2d，接种于带有杜氏小管的无菌的22°Bx火龙果汁试管中，在25℃恒温培养箱中培养，观察各菌株的产气速度和产气量，挑选出发酵能力强且发酵香气宜人的菌株，保留70株备用。
菌株发酵产气量的多少与其发酵能力的大小有关。本研究采用杜氏小管进行菌株的复筛。将从TTC显色平板挑出的菌株在YPD培养基中培养到稳定期后，以5％的接种量接种于无菌火龙果果汁中，25℃培养48h，根据产气量和发酵液的香气特征，选出产气量较多(产气量为+++，菌株产气情况见表2)且发酵液香气较好(无异杂味，具有酒香、果香或发酵香)的菌株70株进行后续的研究，结果如图2、3所示。
表2菌株杜氏小管产气结果
5、菌株发酵试验：将试管斜面保藏的菌株接种至YPD液体培养基中28℃活化2d，转接入调整糖度为22°Bx的火龙果汁中，25℃发酵，通过检测发酵过程失重，发酵液的酒精含量及感官品评，挑选出最终发酵能力、酒精产量、香气俱佳的酵母菌株。保留15株备用。
菌株的起酵速度与发酵周期是考察该菌株优劣的指标之一。生产过程中菌株起酵速度快，可快速形成生长优势，发酵周期短，可增加生产批次，提高设备利用率。结合图4各菌株发酵过程失重曲线分析可知，曲线的斜率可以判断菌株发酵速率，斜率越大发酵速度越快。结果表明，菌株发酵到第2天，有9株菌的二氧化碳失重大于对照菌株，其中194号菌的起酵速度最大，两天的失重为9.34g，是D254的1.67倍。
6、菌株风味比较筛选：将挑选出的15株菌株接种于22°Bx无菌火龙果汁中，25℃发酵，每株菌做三个平行。发酵过程中每天监测其失重，发酵结束测酒精含量、风味物质并做感官品评。火龙果酒香气感官评价标准如表3所示。
表3火龙果酒香气感官评价标准(总分10分)
火龙果酒香气物质测定采用GC-MS分析方法，分析不同菌株发酵的火龙果酒的香气物质得到表4，这里需要说明的是，由图4A可知商业酵母SY和RW相对于商业酵母D254来说发酵已经较为缓慢，在11天还在发酵，且发酵不彻底，产酒精能力较弱，所以下述分析以D254为对照，而没有对商业酵母SY和RW再做进一步对照分析。
GC-MS分析方法：将上述保留菌株活化后按1×107cfu/mL的接种量接入含糖22°Bx的火龙果汁中，25℃发酵，每天监测二氧化碳失重，发酵结束测定果酒酒精度及利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析火龙果酒酒的香气成分，并对其进行感官品评。
样品前处理萃取条件：20mL顶空瓶中，加入8mL火龙果酒样品，3.0g NaCl，在45℃预热5min，萃取60min。萃取完成后，将萃取头插入进样口，解吸附5min，进行GC-MS分析，实验以2-辛醇为内标作半定量分析。
分析条件为：GC条件：PEG.20m弹性石英毛细管柱，30ITI X0.25in x0.25Ixm；载气为高纯氦气，恒定流量为0.8mL·min-1；升温程序：从180℃开始，保持2min，以3℃·min-1升温到230℃，保持10min；进样口温度250℃，出样口温度200℃；检测电压350V。MS条件：EI离子源，发射电流200μA，电子能量70eV，扫描范围20～550U。
分析表4可知：构成果酒主要香气成分物质主要有醇类、酯类、酸类、酮醛类及萜烯类化合物，其中酯类、醇类和酸类，占总挥发物质的92％以上；
酯类物质对果酒的香味起着积极作用，会给果酒带来类似水果及鲜花等香气；
醇类物质是酒精饮料中另一类重要的挥发性香气物质，适量的高级醇会给果酒带来浓郁芬芳的感官，若含量过高会使酒体产生不愉快的味道，并且还容易引起饮后“上头”；
适量的酸类物质会使果酒具有爽口感，不足则会使得果酒显得粘稠、不爽口，但是过高会使酒体口感粗糙、有锐利感、不协调。
结合感官评价及采用GC-MS分析测定的火龙果酒香气物质可知，15株菌中酯类含量较高的有19、33、44、194；其中19与33号菌株的高级醇类含量较高，带有肉味，整体评价得分不高；而44号菌株的酸类含量较高，感官评价酸味较重；
综合得出，194号菌株醇类、酸类含量适中，感官评价酒体协调，发酵香气浓郁，同时带有火龙果的清香。
表4不同菌株发酵的火龙果酒酒精度、风味物质含量及香气品评
7、菌种鉴定：挑取斜面保藏的菌株于10mL YPD培养基中，28℃150r/min培养24h。取适量培养液离心1min(12000rpm)，弃上清，采用酵母DNA提取试剂盒提取菌体DNA，用酵母18S通用引物扩增基因组DNA，PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。采用BLAST方式将测定的18S rDNA序列与GenBank中酵母菌的序列进行比对，结果如图5、6所示，确定为酿酒酵母，并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)194。该菌株已于2018年08月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2：酿酒酵母194在火龙果酒发酵中的应用效果
以一般可溶性固形物含量为14°Bx的红芯火龙果浆为原料，加蔗糖调可溶性固形物含量为22°Bx，发酵规模为500mL，装液量为60％，于恒温振荡水浴锅中70℃灭菌30min，接种5％的酿酒酵母194，25℃发酵7天，每天测定其失重，发酵结束后测其酒精度及感官品评。结合图4D可知，该菌株在第一天有5g左右的失重，说明其起酵速度较快，两天的失重为9.34g，是D254的1.67倍；最终失重为14～15g，说明其发酵较彻底；测得火龙果酒的酒精度在11～12％，采用商业酵母D254发酵得到的酒精度在11％左右，虽然该菌株与商业酵母D254的产酒精能力相差不多，但是结合表4中火龙果酒感官品评结果可知这株酵母较商业酵母D254酿造的火龙果酒香气优雅，口感协调且火龙果典型性明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母已于2018年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种生产火龙果酒的方法，其特征在于，所述方法是接种权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.16245生产火龙果酒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种是在生产火龙果酒的主发酵阶段进行接种。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述接种是以4～6％的接种量进行接种。
5.一种火龙果酒，其特征在于，所述火龙果酒是采用权利要求2-4任一方法制备的火龙果酒。
6.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.16245在食品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备以红芯火龙果为发酵原料的果汁或酒精饮品。
8.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂为包含权利要求1所述的酿酒酵母CGMCCNo.16245的微生物菌剂。
9.根据权利要求8所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
10.一种酿酒酵母的培养方法，其特征在于，所述方法是将酿酒酵母CGMCC No.16245接种至YPD液体培养基中培养，所述YPD液体培养基为：酵母粉5～15g/L，蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，pH自然。
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