CN116574621A - 一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母及其培养方法，酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae菌株M‑FW‑LT 1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26749。该酿酒酵母可于低温12～14℃环境下对桑葚果汁进行果酒发酵，发酵温度低，极大的保留了桑葚的营养物质，保留其风味，同时保持桑葚本身的香气和气味，使得最终得到的桑葚果酒质量稳定；通过该酿酒酵母进行果酒生产，可降低桑椹酒生产温度至14～16℃；菌株生产耐受较好，包括耐低温能力，耐高糖能力(SSC>27％)，耐酒精能力(乙醇>15％)，确保了果酒的正常低温生产。

Description

一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母及其培养方法
技术领域
本发明属于酿酒酵母技术领域，尤其是涉及一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母。
背景技术
桑葚果营养丰富，富含黄酮类、萜类物质、维生素、有机酸和微量元素等，为我国现行规定的药食同源水果之一，具有极高的保健价值和药用价值。但桑葚果成熟季节性强，果实不易贮藏，极易造成桑葚资源的大量浪费。随着食品产业的发展及消费水平的提升，为了提高桑葚资源的利用率，减少资源浪费，桑葚深加工产品也越来越多。果酒作为水果主要深加工产品之一，以其独特的风味、高营养价值和低酒精度等特点，深受消费者青睐。但果酒发酵过程中，因发酵温度等因素制约，常温下生产极易导致产品风味发生变化，极大的影响产品的香气、香味，如申请号为201811490817.6公开的一种桑葚果酒酿酒酵母及其用途，其中桑葚果汁是在28℃环境下进行发酵，直到产生大量气泡，此时，桑葚汁内的营养物质发生变化，使得风味发生变化；然后再在28℃环境下进行培养，即在常温或高于常温环境下培养，使得得到的菌株为常温或者高于常温环境下生长的菌株，发酵后得到的果酒香气和气味发生较大变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够解决上述问题中的至少一个的一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母。
根据本发明的一个方面，提供了一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株M-FW-LT 1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26749。
本发明的有益效果是：该酿酒酵母适于桑葚果酒酿制的耐低温型酿酒酵母菌株，适用低温12～14℃，在低温酿酒过程中，能够极大的保留桑葚的营养物质，并最大限度保持果酒发酵过程中形成的大量挥发性风味物质。
根据本发明的另一方面，公开了一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母的培养方法，包括如下步骤：
S1、将新鲜桑葚果实在无菌环境下破碎，得到果浆，并将得到的果浆在12-14℃环境下进行发酵；
S2、在发酵过程中，每3天取1mL发酵液稀释至10-4-10-6，将上述浓度梯度的稀释液涂布于WL营养琼脂培养基平板培养基上培养；
S3、对上述得到的菌株进行挑选，挑选出菌落形态及颜色疑似酿酒酵母菌的单菌落，于12～14℃下在YPD固体平板培养基上划线纯化培养3-4天；
S4、挑取低温12～14℃条件下生长良好的疑似酿酒酵母菌纯培养物加入YPD液体培养基中，得到菌体；
S5、将收集到的不同菌体分别加入200mL经200目尼龙滤布过滤后的桑葚汁中，在12～14℃下发酵9～12天，通过风味及酒精生成情况最终挑选出1株适于桑葚低温发酵的疑似酿酒酵母菌株，保存并命名为M-FW-LT 1；
S6、通过对上述得到的菌株进行形态学观察以及18S rDNA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为酿酒酵母。
在一些实施方式中，步骤S2中培养基于28℃下恒温倒置培养48小时。
在一些实施方式中，步骤S4中是在28℃、180rpm/min的条件下富集培养36小时，然后在7000rpm/min的条件下离心收集菌体。
本发明的桑葚果酒用耐低温酿酒酵母的培养方法的有益效果是：该酿酒酵母可于低温12～14℃环境下对桑葚果汁进行果酒发酵，发酵温度低，极大的保留了桑葚的营养物质，保留其风味，同时利于保持桑葚本身的香气和气味，使得最终得到的桑葚果酒质量稳定；通过该酿酒酵母进行果酒生产，可降低桑椹酒生产温度至12～14℃；菌株生产耐受较好，包括耐低温能力，耐高糖能力(SSC>27％)，耐酒精能力(乙醇>15％)，确保果酒的正常低温生产。
附图说明
图1是本发明的酿酒酵母的菌落形态图。
图2是本发明的酿酒酵母进一步放大的菌落形态图。
图3是本发明的酿酒酵母在显微镜下放大图。
图4是本发明的酿酒酵母在YPD液体培养基中的生长曲线图。
图5是本发明的酿酒酵母ITS电泳胶图。
图6是对照组的商业菌株的生长曲线图。
图7是本发明的菌株与商业菌株在发酵过程中桑椹汁发酵液失重情况的对照图。
图8是本发明的菌株与商业菌株在发酵过程中桑椹汁发酵液可溶性固形物(SSC))消耗状况的对照图。
图9是本发明的菌株与商业菌株在发酵完成后发酵液的PH状况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
参照图1-图4。一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母，酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株M-FW-LT 1，已于2023年3月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26749。该酿酒酵母的菌落形态呈球形突起、奶油状、边缘整齐、表面光滑不透明(如图2所示)；在WL培养基上呈现奶油色偏绿色；显微镜下菌株呈卵圆形，为多端出芽的无性繁殖，无假菌丝出现，细胞直径约6μm(如图1-图3)。
该酿酒酵母的ITS核苷酸序列
ITS1
GGGTAATTTTCGACATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGATACAAAAAAAAGGGAAGGAAATTTCC
ITS4
CCTGATTTGTGGTCAACTTTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGTATAAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCAAGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGAAAAAAAACATCCAATGAAAAGGCCAGCAATTTCAAGTTAACTCCAAAGAGTATCACTCACTACCAAACAGAATGTTTGAGAAGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAATATTTTAAAATTTCCAGTTACGAAAATTCTTGTTTTTGACAAAAATTTAATGAATAGATAAAATTGTTTGTGTTTGTTACCTCTGGGCCCCGATTGCTCGAATGCCCAAAGAAAAAGTTGCAAAGATATGAAAACTCCACAGTGTGTTGTATTGAAACGGTTTTAATTGTCCTATAACAAAAGCACAGAAATCTCTCACCGTTTGGAATAGCAAGAAAGAAACTTACAAGCCTAGCAAGACCGCGCACTTAAGCGCAGGCCCGGCTGGACTCTCCATCTCTTGTCTTCTTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTTGCCAAAACAAAAAAATCCATTTTCAAAATTATTAAATTTCTTTAATGATCCTTCCCAGCCCCCCCCCCAGGGAAGGGTCCTT
本发明的一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母的培养方法，包括如下步骤：
S1、桑葚可以采摘八成熟的新鲜桑葚果实，然后将果实装入到无菌塑料袋中手动破碎，得到果浆；并将果浆转入到发酵容器中，在低温12-14℃环境下进行自然发酵；
S2、在果浆自然发酵过程中，每3天取1mL发酵液稀释至10-4-10-6，将上述浓度梯度的稀释液涂布于WL营养琼脂培养基平板培养基(WL Nutrient Agar)上培养；
S3、对照《酵母菌的特征及鉴定手册》对上述培养得到的菌株进行初步分类鉴定挑选出菌落形态及颜色疑似酿酒酵母菌的单菌落，于12～14℃下在YPD(Yeast ExtractPeptone Dextrose Medium)固体平板培养基上划线纯化培养3-4天；
其中，YPD固体平板培养基：1％ Yeast Extract(酵母膏)、2％ Peptone(蛋白胨)、2％ Dextrose(glucose)(葡萄糖)和2％琼脂粉；
S4、挑取低温12～14℃条件下生长良好的疑似酿酒酵母菌纯培养物加入YPD液体培养基中，在28℃、180rpm/min的条件下富集培养36小时，然后在7000rpm/min的条件下离心收集菌体；
其中，YPD液体培养基：1％ Yeast Extract(酵母膏)，2％ Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)；
S5、将收集到的不同菌体分别加入200mL经200目尼龙滤布过滤后的桑葚汁中，在12～14℃下发酵9～12天，通过风味及酒精生成情况最终挑选出1株适于桑葚低温发酵的疑似酿酒酵母菌株，保存并命名为M-FW-LT 1；
S6、通过对上述得到的菌株进行形态学观察以及18S rDNA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为酿酒酵母。
其中，步骤S2中培养基于28℃下恒温倒置培养48小时。
在YPD液体培养基中接入2％的菌体，每隔3h在无菌环境下取样，以未接种的YPD做空白对照，采用紫外分光光度计法在600nm波长下测定M-FW-LT 1的生长曲线生长曲线如附图4所示。
对通过该培养方法得到的菌株采用TSINGKE(北京擎科生物科技有限公司)植物DNA提取试剂盒(通用型)进行DNA提取；
PCR扩增：
设计真菌菌种鉴定通用引物：ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’为引物。
提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系为：1×TSE101金牌mix，45ul；ITS1(10P)，2ul；ITS4(10P)，2ul；DNA模板，1ul。
以上扩增体系按以下扩增程序扩增：
利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，扩增片段约为750bp左右，将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对(如图5)，选择同源度最高的物种，比对结果显示M-FW-LT 1可确定为酿酒酵母为Saccharomyces cerevisia或同属。
为了更好的体现本发明得到的酿酒酵母的性能，现设置参照组进行比对，参照组的酿酒酵母的培养过程如下：
挑选无腐烂，无坏果的新鲜桑葚果实，在16℃的状态下进行低温压榨；按0.05g/L的添加量将果胶酶加入果浆中，在16℃的环境中酶解、静置24小时，进行澄清及香气平衡；同时加入偏重亚硫酸钾，添加量为0.08g/L。酵母培养液：在100mL无菌YPD液体培养基中，接入1环活化后的酵母菌株，于28℃、170r/min摇床培养40h。后将酵母培养液在离心力为6000g条件下，离心10min进行离心收集菌体；菌体收集后弃上清液，并用无菌水洗涤一次，后在离心力为6000g条件下，离心10min进行二次离心收集菌体。洗涤完成后将菌体重悬于无菌水中，调整酵母培养液浓度为107个/35mL。
将调整浓度后的酵母培养液加入处理后的桑葚汁混装入发酵罐中，设置发酵温度16℃进行发酵18天。
依上述条件，购买市售商用果酒发酵菌株重复制备设置对照组，并命名该菌株为商业菌株，该菌株的生长状况如图6所示。
本发明培养方法培养得到的酿酒酵母与商业菌株在发酵过程中桑葚汁发酵液失重情况比对如图7所示，以及两者在发酵过程中桑葚汁发酵液可溶性固形物(SSC)消耗状况(如图8所示)，及发酵完成后发酵液PH状况(如图9所示)。
综上可知，本发明通过低温培养的方法，筛选出能在较低温度下、适于桑葚果酒酿制的耐低温型酿酒酵母菌株，以较好的解决桑葚果酒生产面临的问题，为桑葚果酒的低温酿造生产及开发提供新的发酵菌源。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株M-FW-LT 1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26749。
2.权利要求1所述的一种桑葚果酒用耐低温酿酒酵母的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将新鲜桑葚果实在无菌环境下破碎，得到果浆，并将得到的果浆在12-14℃环境下进行发酵；
S2、在发酵过程中，每3天取1mL发酵液稀释至10-4-10-6，将上述浓度梯度的稀释液涂布于WL营养琼脂培养基平板培养基上培养；
S3、对上述得到的菌株进行挑选，挑选出菌落形态及颜色疑似酿酒酵母菌的单菌落，于12～14℃下在YPD固体平板培养基上划线纯化培养3-4天；
S4、挑取低温12～14℃条件下生长良好的疑似酿酒酵母菌纯培养物加入YPD液体培养基中，得到菌体；
S5、将收集到的不同菌体分别加入200mL经200目尼龙滤布过滤后的桑葚汁中，在12～14℃下发酵9～12天，通过风味及酒精生成情况最终挑选出1株适于桑葚低温发酵的疑似酿酒酵母菌株，保存并命名为M-FW-LT 1；
S6、通过对上述得到的菌株进行形态学观察以及18S rDNA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为酿酒酵母。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中培养基于28℃下恒温倒置培养48小时。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S4中是在28℃、180rpm/min的条件下富集培养36小时，然后在7000rpm/min的条件下离心收集菌体。
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