CN109439556A - 桑葚果酒酿酒酵母及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于酿酒酵母提取技术领域，具体涉及一种桑葚果酒酿酒酵母及其在制备桑葚果酒中的用途。针对现有市场上缺乏一种发酵性能良好、风味独特、功能性物质保留多的桑葚果酒酿酒酵母的问题，本发明提供了一种桑葚果酒酿酒酵母，其于2018年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16452。本发明的酿酒酵母菌株具有较好的酒精发酵能力和良好的风味，可以用于桑葚果酒及相关酒精饮料的生产。

Description

桑葚果酒酿酒酵母及其用途

技术领域

本发明属于酿酒酵母提取技术领域，具体涉及一种桑葚果酒酿酒酵母及其在制备桑葚果酒中的用途。

背景技术

我国拥有丰富的桑葚资源，但桑葚的深加工发展相对缓慢。目前桑葚主要供消费者鲜食，且上市时间较集中，导致大量桑葚腐烂变质。通过将桑葚加工为桑葚果酒可以减少桑葚资源的浪费，同时提高其经济价值。然而，水果深加工的设备和工艺不齐全不完善、缺乏规范的相关质量标准和管理章程、缺乏特定品种水果专用酵母等因素严重影响了果酒行业的发展。在上述因素中，果酒酵母的缺乏是主要阻碍果酒行业发展的主要障碍。葡萄酒酵母的大量使用导致果酒同质化现象严重。对于酿造产业而言，菌种是企业的命脉，选用葡萄酒酿酒酵母或者直接将野生型酵母菌投入生产会导致成品酒的质量和产量均存在一定的不足。

酿酒酵母菌在分类学上属于真核生物界，真菌界，子囊菌门，酵母亚门，半子囊菌纲，酵母目，酵母科，酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在麦芽汁中培养细胞呈小圆形或者卵圆形。适宜生长温度为28-30℃,最适pH值为4-5。酿酒酵母是与人类关系最密切的一种酵母，可用于酒精饮料，面包，馒头等食物的制作。

桑葚除了良好的口感外，还具备了丰富的营养物质和保健物质，是药食同源的食物之一。现有市场上缺乏一种发酵性能良好、风味独特、功能性物质保留多的桑葚果酒酿酒酵母。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有市场上缺乏一种发酵性能良好、风味独特、功能性物质保留多的桑葚果酒酿酒酵母的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种桑葚果酒酿酒酵母，其保藏编号为CGMCC No.16452。该桑葚果酒酿酒酵母的保藏时间为2018年9月10日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述桑葚果酒酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1桑葚果酒酿酒酵母的ITS核苷酸序列

ttcctccgcttattgatatgcttaagttcagcgggtactcctacctgatttgaggtcaaactttaagaacattgttcgcctagacgctctcttcttatcgataacgttccaatacgctcagtataaaaaagattagccgcagttggtaaaacctaaaacgaccgtacttgcattatacctcaagcacgcagagaaacctctctttggaaaaaaaacatccaatgaaaaggccagcaatttcaagttaactccaaagagtatcactcactaccaaacagaatgtttgagaaggaaatgacgctcaaacaggcatgccccctggaataccaaggggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcacggaattctgcaattcacattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgcgagaaccaagagatccgttgttgaaagtttttaatattttaaaatttccagttacgaaaattcttgtttttgacaaaaatttaatgaataaataaaattgtttgtgtttgttacctctgggccccgattgctcgaatgcccaaagaaaaagttgcaaagatatgaaaactccacagtgtgttgtattgaaacggttttaattgtcctataacaaaagcacagaaatctctcaccgtttggaatagcaagaaagaaacttacaagcctagcaagaccgcgcacttaagcgcaggcccggctggactctccatctcttgtcttcttgcccagtaaaagctctcatgctcttgccaaaacaaaaaaatccattttcaaaattattaaatttctttaatgatccttccgcagttcacctacggaa。

其中，上述桑葚果酒酿酒酵母的形态学特征为：菌落呈大小不一的乳白色凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，挑起粘连；显微镜观察细胞形态呈卵圆形，一端或两端出芽。

其中，上述桑葚果酒酿酒酵母的生物学特征为：能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖或麦芽糖；氮源同化阴性；产酯阳性；产酸阳性。

本发明所述的桑葚果酒酿酒酵母可利用桑葚果汁、含桑葚成分液体进行发酵。

其中，上述桑葚果酒酿酒酵母的SO₂耐受浓度为40-160mg·L^-1。

本发明还提供了一种上述桑葚果酒酿酒酵母的培养方法，包括以下步骤：将桑葚果酒酿酒酵母接种至YPD液体培养基中培养；所述YPD培养基的组成包括：蛋白胨20g·L^-1，酵母粉10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1。

本发明还提供了一种上述桑葚果酒酿酒酵母在制备桑葚果酒中的用途。

进一步的，上述用途中，具体使用方法为：在桑葚果酒主发酵阶段接种5-10％的桑葚果酒酿酒酵母。

本发明的有益效果为：

本发明首次从桑葚果实中分离得到了一种新型桑葚果酒酿酒酵母，具有发酵速度快、且可以耐受一定浓度SO₂的特点，酿造的桑葚果酒具有典型的桑葚香气、香味馥郁、风味优良、独特的醇香口味和适量的酒精度，与此同时桑葚果酒保留了较高浓度的功能性物质，如花色苷和黄酮类化合物，且其DPPH清除率达到44.08％，赋予酒体更高的保健能力，为果酒酿造业提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。

本发明提供的桑葚果酒酿酒酵母，已于2018年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其生物学分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。

附图说明

图1所示为实施例2的酿酒酵母新菌株单菌落形态图。

具体实施方式

本发明提供了一种桑葚果酒酿酒酵母，其保藏编号为CGMCC No.16452。该桑葚果酒酿酒酵母的保藏时间为2018年9月10日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述桑葚果酒酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的桑葚果酒酿酒酵母具有发酵速度快、且可以耐受一定浓度SO₂的特点，酿造的桑葚果酒具有典型的桑葚香气、香味馥郁、风味优良、独特的醇香口味和适量的酒精度，与此同时桑葚果酒保留了较高浓度的功能性物质。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1酿酒酵母的筛选及鉴定

富集培养基：葡萄糖20g·L^-1，蛋白胨20g·L^-1，酵母粉10g·L^-1，青霉素1g·L^-1。

YPD培养基：葡萄糖20g·L^-1，蛋白胨20g·L^-1，酵母粉10g·L^-1，琼脂粉20g·L^-1，固体培养基添加20g·L^-1琼脂粉。

(1)将成熟的市售桑葚果榨汁，放入灭菌三角瓶中于28℃自然发酵，待三角瓶中有大量气泡产生时，取10mL发酵醪液接入富集培养基，28℃恒温培养2-3d，将富集好的菌悬液采用YPD培养基平板涂布分离，28℃倒置培养2d。挑取具有典型的酵母菌菌落形态(质地柔软、表面湿润、光滑、粘调、易挑起、大多呈现乳白色或者奶油色、酒香味明显)的菌落，分别在YPD培养基平板上划线分离，将所得单菌落转接到YPD固体培养基于4℃保存。

(2)以酿酒酵母的产酒精能力和感官品评为指标进行筛选，选取发酵桑葚果酒酒精度较高且风味良好的酿酒酵母菌株12株，编号分别为JNB-2、JNB-9、JNB-10、JNB-12、JNB-13、JNB-14、JNB-17、JNB-19、JNB-22、JNB-24、JNB-25和JNB-29。

将活化好的酵母以5％的接种量接入无菌的桑葚汁中，通过杜氏管发酵法对分离得到的酵母菌株产气速度和产气量进行观察。根据实验结果初步筛选出发酵能力强、发酵香气宜人的菌株(24℃发酵48小时杜氏小管内充满空气、酒精度大于9.5％且感官品评得分超过75分)。之后，将初筛所得的发酵力强且发酵气味较好的菌株活化后按5％的接种量接入含糖22oBx的桑葚汁中，24℃发酵7d后测定桑葚酒的酒精度，并对其进行感官品评。

(3)以具有一定浓度SO₂抗性和较高OAV值为指标进行筛选，获得一株发酵性能良好、发酵香气馥郁、OAV高、具备SO₂抗性的酿酒酵母。

二氧化硫耐受性实验采用杜氏管发酵法，调整桑葚汁SO₂浓度为40、80、120、160mg·L^-1，24℃下发酵2天，观察杜氏管中起泡情况。将步骤(2)筛选所得菌株活化后按5％接种量接入含糖22oBx的桑葚汁中，24℃发酵7d。采用气相色谱-质谱(GC-MS)分析桑葚酒的香气成分，并对其进行感官品评。样品前处理萃取条件如下：20mL顶空瓶中，加入8mL桑葚酒样品，3.0g NaCl，在45℃条件下预热5min，萃取60min。萃取完成后，将75μmCar/PDMS萃取头插入进样口，250℃解吸附5min，进行GC-MS分析。实验以2-辛醇为内标作半定量分析。分析条件为：GC条件：PEG-20M弹性石英毛细管柱，30m×0.25m×0.25μm；载气为高纯氦气，恒定流量为0.8mL·min^-1；升温程序：从180℃开始，保持2min，以3℃·min^-1升温到230℃，保持10min；进样口温度250℃，出样口温度200℃；检测电压350V。MS条件：EI离子源，发射电流200μA，电子能量70eV，扫描范围20～550u。

以2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于YPD培养基中，28℃、150r·min^-1培养24h。取适量培养液离心1min(12000r·min^-1，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DNA Kit，天根生化科技)提取基因组DNA。用酵母ITS通用引物对正向引物ITS1(SEQ ID NO:2；tccgtaggtgaacctgcgg)、反向引物ITS4(SEQ ID NO:3；tcctccgcttattgatatgc)扩增基因组DNA，反应条件如下：94℃预变性5min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳仪检测并将产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。通过BLAST序列比对，确认为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为JNB-9。

SEQ ID NO:2正向引物ITS1的核苷酸序列

tccgtaggtgaacctgcgg。

SEQ ID NO:3反向引物ITS4的核苷酸序列

tcctccgcttattgatatgc。

实施例2利用酿酒酵母JNB-9制备桑葚果酒

以桑葚汁为原料，调节初始糖浓度为260g·L^-1，SO²浓度60mg·L^-1,，接种总体积5％的酿酒酵母JNB-9，在24℃静置发酵，直至残糖含量低于20g·L^-1发酵结束。酿酒酵母JNB-9发酵的桑葚果酒起酵快，接种1d即有气泡。发酵过程中，体系减重迅速，说明酒精产生旺盛。发酵结束后，测定得到的桑葚果酒的OAV值、功能性物质含量及DPPH清除率，结果见表1。从表1可以看出，酿酒酵母JNB-9发酵得到桑葚果酒其酒精度为13.98％，其OAV总值达到321，感官品评得分为89.7分，其花色苷含量和总酚含量分别为75.40mg·L^-1和1265.60mg·L^-1，DPPH值为44.08％。从上述结果可以看出，酿酒JNB-9菌株发酵得到的桑葚果酒其酒精度、OAV总值、感官评分、花色苷含量、总酚含量和DPPH清除率均优于一株商用葡萄酒酵母D254发酵所得桑葚果酒对应参数，说明该菌株可以赋予酒体更丰满馥郁的风味和更高的营养价值。

表1JNB-9发酵桑葚果酒结果表

由实施例可见，本发明分离鉴定的酿酒酵母JNB-9能很好的利用桑葚果汁或含桑葚成分液体进行发酵制备桑葚果酒，并且可以耐受一定浓度SO₂，制备得到的桑葚果酒保留了较高浓度的功能性物质花色苷，DPPH清除率达到44.08％，赋予酒体更高的保健能力，为果酒酿造业提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 泸州品创科技有限公司

江南大学

<120> 桑葚果酒酿酒酵母及其用途

<130> A181401K

<141> 2018-12-06

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtactc ctacctgatt tgaggtcaaa 60

ctttaagaac attgttcgcc tagacgctct cttcttatcg ataacgttcc aatacgctca 120

gtataaaaaa gattagccgc agttggtaaa acctaaaacg accgtacttg cattatacct 180

caagcacgca gagaaacctc tctttggaaa aaaaacatcc aatgaaaagg ccagcaattt 240

caagttaact ccaaagagta tcactcacta ccaaacagaa tgtttgagaa ggaaatgacg 300

ctcaaacagg catgccccct ggaataccaa ggggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg 360

attcacggaa ttctgcaatt cacattacgt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc 420

gagaaccaag agatccgttg ttgaaagttt ttaatatttt aaaatttcca gttacgaaaa 480

ttcttgtttt tgacaaaaat ttaatgaata aataaaattg tttgtgtttg ttacctctgg 540

gccccgattg ctcgaatgcc caaagaaaaa gttgcaaaga tatgaaaact ccacagtgtg 600

ttgtattgaa acggttttaa ttgtcctata acaaaagcac agaaatctct caccgtttgg 660

aatagcaaga aagaaactta caagcctagc aagaccgcgc acttaagcgc aggcccggct 720

ggactctcca tctcttgtct tcttgcccag taaaagctct catgctcttg ccaaaacaaa 780

aaaatccatt ttcaaaatta ttaaatttct ttaatgatcc ttccgcagtt cacctacgga 840

a 841

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (8)

1.桑葚果酒酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.16452。

2.根据权利要求1所述的桑葚果酒酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的桑葚果酒酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母的形态学特征为：菌落呈大小不一的乳白色凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，挑起粘连；显微镜观察细胞形态呈卵圆形，一端或两端出芽。

4.根据权利要求1所述的桑葚果酒酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母的生物学特征为：能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖或麦芽糖；氮源同化阴性；产酯阳性；产酸阳性。

5.根据权利要求1所述的桑葚果酒酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母的SO₂耐受浓度为40-160mg·L^-1。

6.权利要求1-5任一项所述的桑葚果酒酿酒酵母的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将桑葚果酒酿酒酵母接种至YPD液体培养基中培养；所述YPD培养基的组成包括：蛋白胨20g·L^-1，酵母粉10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1。

7.权利要求1-5任一项所述的桑葚果酒酿酒酵母在制备桑葚果酒中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，具体使用方法为：在桑葚果酒主发酵阶段接种5-10％的桑葚果酒酿酒酵母。