CN113416674B - 一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株及其应用，它涉及食品领域，本发明目的是解决在寒地环境下生长的桑葚资源的充分利用，从产业链的角度解决因桑葚果耐藏性能差，口味单一带来的产品滞销的问题。本发明所选育的菌株分别为融合魏斯式乳酸菌，毕赤酵母菌。桑葚发酵饮料是由接种量8％，菌株复配比例1：1，桑葚质量30％，加糖量10％，发酵时间72h加水制成。本发明方法为：一、菌株筛选及鉴定；二、选育菌株特性研究；三、桑葚发酵饮料制备；四、饮料活性成分测定。本发明应用于功能饮料开发领域。

Description

一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株及其应用
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株及其应用。
背景技术
桑葚又称桑果，桑枣等，是一种药食同源水果，原卫生部发布的药食同源物品目录(2002版—2019版)将桑葚收录其中。桑葚果汁色泽艳丽，且富含维生素、黄酮醇、花青素、酚酸等多种生物活性物质，具有良好的保健功能。
桑葚产品主要有桑葚饮料，桑葚酒，桑葚果干等。桑葚果汁未经发酵口感单一，消费者接受度不高。利用微生物发酵技术改善果蔬汁的营养风味，开发新型果蔬汁产品，已经成为21世纪饮料市场的发展主流方向，发酵型的果蔬饮料在市场上的占有份额逐年提高。优良的发酵菌种是提升桑葚饮料发酵品质的决定性因素，以酵母菌、乳酸菌为代表的益生菌能有效地改善发酵饮料的风味、营养，延长饮料的保质期，与桑葚自身的活性成分协同作用将能够促进肠道消化，具有延缓衰老、抗肿瘤等生理功能。因此，桑葚发酵饮料的研发具有重要的理论意义和广泛的市场前景。
但是，目前对于桑葚，尤其是寒地桑葚品种制备饮料，桑葚活性物质转化率低，口感不佳，耐藏性能差。
发明内容
本发明目的是解决在寒地环境下生长的桑葚资源的充分利用，从产业链的角度解决因桑葚果耐藏性能差，口味单一带来的产品滞销的问题。而提供一种适于寒地桑葚发酵饮料菌株及其应用。
本发明的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，所述的菌株是由融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1混合而成，
所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22028；
所述的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22027。
进一步地，所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1的质量比为1:1～3。
进一步地，筛选融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)S1所使用的酵素体系由桑葚、柠檬、苹果、白砂糖和水复配而成。
进一步地，所述的酵素体系中桑葚为160～170g，柠檬为10～12g，苹果为30～35g，白砂糖为120～125g，水为1000mL。
本发明的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株应用，它用于制备寒地桑葚发酵饮料，所述的寒地桑葚为龙桑一号。
进一步地，它是按照以下方式制备寒地桑葚发酵饮料：
将融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1分别活化培养，并对菌液中活菌数进行测定，将桑葚和糖加水混合后，将上述菌液接入，室温进行发酵24～120h，制得寒地桑葚发酵饮料；其中，融合魏斯式菌(Weissellaconfusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1的质量比为1:1～3。
进一步地，所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1活化培养过程为：将纯化培养的魏斯式乳酸菌菌种接种至50mL液体培养基中，于30℃静置培养2～4d；所述活化培养基的配方为每1L培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g和碳酸钙20.0g。
进一步地，所述的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1活化培养过程为：将纯化培养的酵母菌菌种接种至50mL的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28～30℃，摇瓶静置培养2～4d。所述活化培养基的配方为每1L培养基中含有酵母浸粉10g、蛋白胨20g和葡萄糖20g。
本发明包含以下有益效果：
(1)本发明从北桑-苹果-柠檬-白砂糖酵素体系中筛选到优势菌种——乳酸菌和酵母菌，丰富了桑葚发酵菌种的资源；
(2)本发明的一种以寒地桑葚为主要原料生产桑葚发酵饮料的方法，通过设置不同配比的桑葚、白砂糖，及复合菌种，以感官评价得分为指标，确定了最佳的发酵桑葚饮料制备方案，为企业产品更新换代提供了技术支持。而且，桑葚发酵饮料是以桑葚为原料的非酒精发酵饮料。饮料中添加糖、酸通过发酵而得，而非后来人为添加。本发明通过利用筛选的菌种制备发酵剂，并将所述桑葚，白糖共同发酵制备发酵饮料，其桑葚利用率高，水解速度快，适于推广与应用。
(3)本发明以桑葚主要原料，开发寒桑发酵饮料，并测定了发酵后的花青素、黄酮、总多酚物质含量。证明了发酵过程促进了桑葚活性物质的转化，为发酵型桑葚功能饮料的开发提供了数据支持，从而带动黑龙江省林副产业的发展。
(4)本发明极具地域特色，充分利用了寒地桑葚的功能物质，体现了地域特色、营养健康功能互补的双重优势。
(5)本发明以寒地桑葚“龙桑一号(Morus abla L.cv.longsang 1)”、柠檬、苹果为原料配制桑葚酵素体系，同时对该体系的菌株进行分离纯化。得到一株融合魏斯式乳酸菌和毕赤酵母菌，经发酵验证试验可得到一种口感较好的桑葚发酵饮料，本发明对该配方进行优化得到一款感官评价高的桑葚发酵饮料。
(6)本发明提供了一种方便、快捷的桑葚发酵饮料制备工艺，其特色在于：一是基于桑葚酵素体系优选产香菌株，再将其作为发酵剂直投到桑葚发酵体系中，使其成为优势菌株，实现定向发酵；二是充分利用寒地特色桑葚资源，提高了桑蚕行业的附加值。
附图说明
图1为融合魏斯氏乳酸菌(a,b)和毕赤酵母菌(c,d)图片；
图2为菌株L1、S1系统进化树分析图；
图3为融合魏斯氏乳酸菌和毕赤酵母菌生长曲线图；
图4为菌株耐受性结果图；
图5为菌株产酸试验结果图；
图6为菌株接种量单因素试验结果图；
图7为单因素试验结果图；
图8为响应面图；其中，图中上排左图为菌株复配比例与加糖量交互作用结果图，右图为菌株复配比例与桑葚质量交互作用结果图；中排左图为菌株复配比例与发酵时间交互作用结果图，右图为桑葚质量与加糖量交互作用结果图；下排左图为发酵时间与加糖量交互作用结果图，右图为桑葚质量与发酵时间交互作用结果图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
具体实施方式一：本实施方式的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，所述的菌株是由融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1混合而成，
所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22028；
所述的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22027。
本实施方式的菌株筛选如下：
一、菌株筛选及鉴定
1.1桑葚发酵饮料的菌株筛选、分离纯化：
桑葚酵素体系配制：桑葚解冻清洗干净，取164g桑葚10.4g柠檬，33.7g苹果，125g糖，1000mL水配制桑葚酵素体系，于室温下进行发酵。
分离纯化：在发酵第0、2、4、6、8、10天，吸取1mL发酵液经生理盐水梯度稀释，制备成菌悬液，选用MRS和YPD培养基进行平板涂布，MRS培养基37℃下培养24h，YPD培养基28℃培养24h后计数。挑取长势好的单一菌落，反复进行三区划线得到纯化菌株。每个梯度做3个平行。部分菌株筛选图片如图1所示：图1ab为MRS培养基，经过肉眼已经显微镜下观察筛选得到菌株L1，该菌落为光滑湿润圆点，边缘圆润。经鉴定融合魏斯式乳酸菌。图1cd为YPD培养基，经过肉眼以及显微镜下观察上筛选的到两株菌S1、S2，其中S1的菌落较大，白色圆状，表面褶皱，边缘多缺刻。经鉴定为毕赤酵母菌。S2菌落大、乳白色、边缘缺刻、菌落粘稠，经鉴定为白色念珠菌，不能用于使用，为杂菌。经上述试验选取菌株L1和S1作为桑葚酵素体系选育菌株。
1.2菌株鉴定：
将菌株接种与琼脂平板上30℃恒温培养，观察菌落形态、颜色、质地，革兰氏染色后观察菌体形态。通过过氧化氢，吲哚试验，糖酵解试验，葡聚糖产生试验，精氨酸水解试验，明胶液化试验生理生化试验对菌株进行初步鉴定(附图1)。
形态学观察及生理生化验鉴定：将纯化的菌株L1、S1进行革兰氏染色进行形态学观察，生理生化试验进行鉴定。生理生化试验结果如表1所示，菌株L1为革兰氏阳性菌；过氧化氢阴性；吲哚反应阳性；能发酵葡萄糖和蔗糖乳糖麦芽糖产酸产气；葡聚糖产生试验阳性；精氨酸水解试验阳性，明胶液化试验阴性。菌株S1为真菌，过氧化氢阳性；吲哚反应阳性；能发酵葡萄糖和蔗糖麦芽糖产酸不产气，不能发酵乳糖；葡聚糖产生试验阳性；精氨酸水解试验阴性；明胶液化试验阴性。
表1为菌株生理生化试验结果表
Figure GDA0003772285310000051
1.3分子生物学鉴定：
将纯化菌体送至生物公司进行测序，并进行进化树分析。
分子生物学鉴定结果：菌株系统进化树如图2所示，株L1为融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1，约1501bp(NCBI序列号为MT299236)。菌株S1为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1，约521bp(NCBI序列号为MT781361)。
选育菌株特性研究
二、选育菌株特性研究：包括生长曲线(附图3)、生长最适碳源氮源选择(附表2)、菌株耐受性包括耐乙醇(附图4a)温度耐受性(附图4b)、耐糖(附图4c)、耐酸(附图4d)、产酸试验(附图5)。
2.1生长动力学曲线
取活化的菌株接种于灭菌的MRS/YPD液体培养基中，放置在30℃的条件下培养，每隔2h使用紫外分光光度计在600nm波长下测定其OD值。绘制菌株生长曲线。两株菌的生长曲线如图3所示。
2.2碳源、氮源选择
以MRS/YPD为基础培养基，用蔗糖、乳糖、麦芽糖替换葡萄糖作为不同碳源。用蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸钠、硝酸钠作为氮源。将活化菌种的菌液涂布于含有不同碳源/氮源的MRS/YPD固体培养基中，倒置在30℃的培养箱中培养18h后，观察培养基中菌落生长情况。结果如表2所示。以葡萄糖为碳源是两株菌长势良好；蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉为氮源时两株菌均长势良好。
表2为菌株碳源氮源选择结果表
Figure GDA0003772285310000052
Figure GDA0003772285310000061
2.3菌株耐受性试验
(1)乙醇耐受性
制备5mL YPD/MRS液体培养基，分别制成2％，4％，6％，8％，10％的YPD/MRS-乙醇溶液，接种100μL准备好的菌悬液，接种量为107cfu/mL，28℃下培养72h后测OD560值，并在稳定期后观察生长情况。结果如图4a所示，其中不加乙醇对照组，魏斯式乳酸菌的OD560为1.772；毕赤酵母菌OD560为0.842。两株菌的乙醇耐受性均较差，随着乙醇浓度的升高，菌株活力下降，在10％的乙醇浓度的条件下魏斯式乳酸菌的活力高于毕赤酵母菌，其乙醇耐受性较强。
(2)温度耐受性
准确吸取100μL准备好的菌悬液接种于制备好的5mL YPD/MRS液体培养基中，分别放置于10，15，30，37和48℃培养箱中静态培养，接种量为107cfu/mL。培养72h后测OD560值，并在稳定期后观察生长情况。结果如图4b所示，随着温度的变化，菌株活力先增加后下降，两株菌的最适生长温度为30℃。
(3)糖度耐受性
配制葡萄糖浓度分别为5％，10％，15％，20％和25％的YPD/MRS培养基，接种100μL准备好的菌悬液，28℃下培养72h后测OD560值，并在稳定期后观察生长情况。结果如图4c所示，菌株L1、S1在糖浓度5-25％之间，菌株活力下降，糖浓度达到25％时菌株活力较低，与毕赤酵母菌相比，融合魏斯式乳酸菌有较好的糖度耐受性。
(4)酸度耐受性
配制pH分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0的YPD/MRS培养基，接种100μL准备好的菌悬液。培养72h后测OD560值，并在稳定期后观察生长情况。结果如图4d所示，在pH＜3的条件下，魏斯式乳酸菌的活力为0，毕赤酵母菌活力较小。随着pH值的升高，菌株活力增强，由图中可以看出毕赤酵母菌能够在偏酸性的条件下更好的生长。
2.4乳酸菌产酸试验
按3％(v/v)接种量接种至MRS液体培养基中，在30℃的培养条件下培养18h，每隔2h取样测其发酵液pH值，每组试验做三次平行取平均值。结果如图5所示，在培养的0-24h内，魏斯式乳酸菌培养液pH值从初始的6.13±0.31下降到4.19±0.35；毕赤酵母菌培养液的pH值从初始的5.40±0.02下降到3.72±0.04，其中两株菌均在4-10h下降速率较快，由此证明在生长过程中，菌株处于生长旺盛阶段。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例
桑葚发酵饮料制备
3.1菌株活化
(1)所述活化乳酸菌L1菌种，将纯化培养的乳酸菌菌种接种至装有体积比为30％～60％的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃，摇瓶静置培养2～4d；所述活化培养基的配方蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、加蒸馏水至1000mL；
(2)所述活化酵母菌S1菌种，将纯化培养的酵母菌菌种接种至装有体积比为30～60％的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃，摇瓶静置培养2～4d所述活化培养基的配方酵母浸粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、加蒸馏水至1000mL。
3.2发酵条件优化
预试验确定菌株最佳接种量：通过单因素试验确定乳酸菌和酵母菌最佳接种量，将乳酸菌和酵母菌分别接种至MRS和YPD培养基活化三代，待其活菌数达到108cfu/mL，将接种量设置为2％、4％、6％、8％和10％进行单因素试验。计算接种的活菌数，魏斯式乳酸菌活菌数为7.63±0.59log cfu/mL毕赤酵母菌的活菌数为7.53±0.08log cfu/mL。以感官评价为指标，选5男5女共10位身体健康、无任何感觉方面缺陷的食品专业人员组成感官评定小组，分别从产品的色泽、香气、组织状态、口感四个方面，以很好、好、一般、较差、差5个等级对每组样品进行评分。要求感官评定员在评价前12h禁吃辛辣刺激食物，每评价一个样品后需清水漱口，并间隔10min再评定下一个样品，且评价过程中避免讨论。选取感官评分最高的接种量，进行发酵条件优化。
预试验接种量单因素结果如图6所示，菌株L1的感官评分为66.05±1.56；70.8±1.30；73.72±0.91；76.93±1.26；64.55±2.09；菌株S1的感官评分为65.41±2.64；67.27±1.46；75.74±1.08；77.75±0.55；67.37±1.09；两株菌均在接种量8％时具有较高的感官评分，由此选择接种量为8％。
在预试验的基础上，以菌株复配比例、桑葚质量、加糖量、发酵时间为影响因子进行单因素试验，发酵饮料单因素水平表如表3所示，每个因素选取不同水平，其中菌株复配比例设定为1:1、1:2、2:1、1:3和3:1；发酵时间设定为24、48、72、96和120h；加糖量为5％，7.5％，10％，12.5％和15％(w/v)，桑葚质量分数分别为15％、20％、25％、30％和35％(w/v)；以模糊数学感官评价得分为指标，感官评价打分表如表4所示，选取感官评分高的三个水平，然后进行响应面试验得到最优发酵配方。
表3为发酵条件单因素试验水平表
Figure GDA0003772285310000081
表4为感官评价打分表
Figure GDA0003772285310000082
菌株复配比例
在绵白糖添加量为8％，桑葚质量25g，发酵时间为48h的条件下，改变两株菌的配比1：3、1：2、1：1、2：1、3：1；分析各个因素的最适添加量范围。涂布平板确定菌株的活菌数，其中魏斯式乳酸菌7.91±0.05log cfu/mL毕赤酵母菌7.51±0.06log cfu/mL以感官评价为评价指标，结果如图7a所示。菌株复配比例1：3、1：2、1：1、2：1、3：1时其感官评分分别为62.60±1.37；64.73±0.49；66.71±2.40；63.98±1.01；60.79±1.66。所以选取菌株复配比例为1：2、1：1、2：1三个水平进行响应面试验。
加糖量
在菌株复配比例1：1，桑葚质量25％，发酵时间48h的条件下，改变绵白糖添加量为5％，7.5％，10％，12.5％和15％；分析各个因素的最适添加量范围。以感官评价得分为指标，其结果如图7b所示。所以选取加糖量7.5％，10％，12.5％三个水平进行响应面实验。
桑葚添加量
菌株复配比例1：1，绵白糖添加量8％，发酵时间48h的条件下，设置桑葚质量分数15％、20％、25％、30％和35％。以感官评价得分为指标，分析桑葚的最适添加量范围。其结果如图7c所示，桑葚质量15％、20％、25％、30％、35％的条件下，其感官评分分别为70.91±2.97；72.89±1.81；76.20±2.57；84.57±1.63；72.30±0.69。所以选取桑葚质量20％、25％、30％三个水平进行响应面试验。
发酵时间
在菌株复配比例1：1，绵白糖添加量为8％，桑葚质量25％的条件下，改变发酵时间24h、48h、72h、96h、120h。分析各个因素的最适添加量范围。以感官评价为评价指标。其结果如图7d所示，发酵时间24h、48h、72h、96h、120h的条件下，其感官评分分别为78.61±1.25；82.25±1.48；84.49±1.24；77.44±2.32；72.92±1.72。所以选取发酵时间48h、72h、96h三个水平进行响应面试验。
响应面试验设计及结果
在单因素试验基础上，以菌株复配比例(A)、桑葚质量(B)、加糖量(C)、发酵时间(D)为响应因素，以感官评分为响应值，采用Design-Expert V 8.0.6.1软件设计4因素3水平响应面分析试验，其因素与水平见表5。
表5为响应面试验因素水平表
Figure GDA0003772285310000091
响应面法优化桑葚发酵饮料的试验结果见表6。对表6的试验数据进行多元回归拟合，得到感官评分对菌株复配比例(A)、桑葚质量(B)、加糖量(C)、发酵时间(D)4个因素的二次多项回归模型:
Y＝+85.77-0.52A+0.25B-7.500E-003C-0.064D+0.18AB+0.42AC-0.59AD+0.98BC-0.83BD+1.31CD-6.77A2-7.33B2-6.96C2-7.16D。对模型进行方差分析结果见表7。由方差分析结果可以看出，模型极显著(p＜0.01)，方差的失拟项不显著(p＝0.9848＞0.05)，说明回归模型对响应值拟合程度较高，模型选择合理；回归方程的决定系数R2＝0.9446，校正决定系数R2 Adj＝0.9620，表明感官评分实际值与预测值相关性较好，能解释98.48％响应值的变化，此回归方程适于分析和预测桑葚发酵饮料最优配方。得到桑葚发酵饮料最佳配方为菌株复配比例1：1、加糖量10％、桑葚质量30％、发酵时间72h的最佳发酵条件。
表6为响应面试验结果表
Figure GDA0003772285310000101
表7为响应面试验方差分析表
Figure GDA0003772285310000102
Figure GDA0003772285310000111
由回归方程可知各因素对响应值的影响并不是简单的线性关系，一次项A及交互项CD对发酵饮料的感官评分呈显著影响(p＜0.05)，F值能够反映各因素对响应值的重要性，F值越大，表明对响应值的影响越大，因此4个因素对发酵饮料感官评分影响程度的大小顺序为菌株复配比例＞桑葚质量＞发酵时间＞加糖量添加量。
响应面图是响应值对各试验因素构成的三维空间曲面图，可直观反映各因素对响应值的影响。如图8所示。
验证实验运用Design-Expert V 8.0.6.1软件对数据进行分析优化，得到桑葚发酵饮料的理论最优配方为菌株复配比例1：1、加糖量10％、桑葚质量30％、发酵时间72h，此条件下复合饮料的综合评分为79.59。为进一步验证模型的准确性和可行性，选取菌株复配比例1：1、加糖量10％、桑葚质量30％、发酵时间72h，经3次验证试验得到复合饮料的感官评分为79.72±3.9，与模型理论值相对误差0.16％，说明响应面法优化所获参数合理可信，具有实用价值。
营养成分测定
1.花青素含量测定：用pH示差法测定提取的花青素含量，取制备的样品液1mL，分别加入4mL的pH 4.5醋酸钠缓冲液和pH 1.0氯化钾缓冲液，摇匀后，避光反应30min，转入光路长1cm的比色皿后，用紫外-可见光分光光度计分别以520nm和700nm为吸收波长测定其吸光度。样品花青素含量计算公式如下：
Figure GDA0003772285310000112
式中：A—(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5；
W—分子质量＝449.2g/mol(矢车菊-3-葡萄糖苷的物质的量)；
C—稀释倍数；
V—稀释体积(L)；
1—光程的厘米数(cm)；
ε—摩尔吸光系数＝26900L/mol·cm；
m—样品质量(g/mL)。
2.黄酮含量测定：取1mL待测液于10mL容量瓶中，加60％的乙醇溶液稀释至5.0mL，加5％的NaNO2溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加10％的AL(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加4％的NaOH溶液4.0mL，使用60％乙醇溶液定容，摇匀，空白作为对照。波长415nm处测其吸光度，芦丁标准液绘制标准曲线。
3.总多酚含量：福林比色法1mL桑葚发酵饮料与3mL福林-酚试剂混合4min后加入6mL 10％Na2CO3。混合物在室温下放置。2小时后测定了760nm处的吸光度。用没食子酸绘制标准曲线。
表8活性成分测定结果
Figure GDA0003772285310000121
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

Claims (8)

1.一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，其特征在于所述的菌株是由融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1混合而成，
所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22028；
所述的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年3月18日，保藏号为CGMCC 22027。
2.根据权利要求1所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，其特征在于所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1的质量比为1:1～3。
3.根据权利要求1所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，其特征在于筛选融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1所使用的酵素体系由桑葚、柠檬、苹果、白砂糖和水复配而成。
4.根据权利要求3所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株，其特征在于所述的酵素体系中桑葚为160～170g，柠檬为10～12g，苹果为30～35g，白砂糖为120～125g，水为1000mL。
5.如权利要求1或2所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株的应用，其特征在于它用于制备寒地桑葚发酵饮料，所述的寒地桑葚为龙桑一号。
6.根据权利要求5所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株的应用，其特征在于它是按照以下方式制备寒地桑葚发酵饮料：
将融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1分别活化培养，并对菌液中活菌数进行测定，将桑葚和糖加水混合后，将上述菌液接入，室温进行发酵24～120h，制得寒地桑葚发酵饮料；其中，融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1的质量比为1:1～3。
7.根据权利要求6所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株的应用，其特征在于所述的融合魏斯式菌(Weissella confusa)L1活化培养过程为：将纯化培养的魏斯式乳酸菌菌种接种至50mL活化培养基中，于30℃静置培养2～4d；所述活化培养基的配方为每1L培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g和碳酸钙20.0g。
8.根据权利要求6所述的一种适于寒地桑葚发酵饮料混合菌株的应用，其特征在于所述的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)S1活化培养过程为：将纯化培养的酵母菌菌种接种至50mL的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28～30℃，摇瓶静置培养2～4d；所述活化培养基的配方为每1L培养基中含有酵母浸粉10g、蛋白胨20g和葡萄糖20g。
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