CN111925893B - 一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，属于果酒加工领域。该发酵方法采用同时接种方法，利用库德毕赤酵母F2‑24(保藏编号为CCTCC NO：M 2019265)与酿酒酵母混合发酵添加了复合氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸)的桑葚汁，可制备出苯衍生物、高级醇和酯含量更高的桑葚酒，同时缩短发酵周期。此外，改良桑椹酒的外观更为清亮，果香、花香更浓郁，草本味显著减弱，因而风味和品质显著提升。高品质桑椹酒的开发将极大地增加桑椹酒在市场上的竞争力，促进桑葚产业的发展，增加农民收入，也减少桑葚鲜果腐烂而带来的环境问题。

Description

一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法

技术领域

本发明属于果酒加工领域，尤其涉及一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法。

背景技术

桑葚作为药食两用的浆果，极具营养价值，但易腐烂变质。且我国桑葚资源丰富，仅将桑葚作为鲜果食用将导致资源的大量浪费。同时桑葚含糖量高适用于果酒加工，将其酿制成果酒不仅能保留其营养及保健功效，也能避免桑葚资源的浪费，并创造更高的经济价值(胡永正2018)。然而，市售桑椹酒多存在风味单一的问题，影响了桑葚酒产业的发展(李希2017；温健辉2017)。目前，改善桑葚酒风味与品质的方法主要包括选育专用酿酒酵母及优化发酵工艺，但都不能显著提高桑葚酒的风味。

越来越多的研究表明，造成桑葚酒风味单一的可能原因之一为采用纯种酿酒酵母发酵。因商业化的酿酒酵母虽活性高、发酵速度快、产酒精能力强，但产生风味物质的能力弱。而非酿酒酵母虽发酵能力差，但可产生较多的风味物质。前人研究表明利用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵可改善果酒风味(Sadineni et al 2012；Langen et al 2016)。

同时，桑椹汁中风味物质的前体物质——氨基酸(Trinh et al 2010)，尤其是与产香密切相关的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的含量较低(Jiang et al 2015；林小娟等2017)，从而影响了风味物质的形成。因为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及苯丙氨酸分别是异丁醇、异戊醇、活性戊醇及苯乙醇的前体物质，而这些高级醇又可与乙酸反应生成具有果香与花香的乙酸酯类物质。前人研究发现在发酵基质中添加适量复合氨基酸，能有效地增加果酒风味的复杂性。Wang等(2016)在单发酵葡萄酒中复合添加3种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)与苯丙氨酸，改善了葡萄酒风味。刘沛通等(2018)在赤霞珠葡萄汁中添加复合氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，提高了酒中脂肪酸乙酯含量，降低乙酸酯的含量，有效改善了葡萄酒的风味与品质。然而，对于在桑葚中添加复合氨基酸是否能改善桑葚酒风味与品质未见研究报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法。为了改善桑椹酒的风味，本发明首次采用复合氨基酸添加(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸)和酵母混合联用的方式提高桑椹酒的风味和品质，研究结果为桑椹酒的风味与品质改良提供了方法，也为其它果酒风味改良提供了借鉴。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明采用同时接种方法，利用库德毕赤酵母F2-24(CCTCC NO:M 2019265)与酿酒酵母(购于LAFFORT公司)混合发酵添加了复合氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸)的桑葚汁，建立了可提高桑葚酒的风味与品质的生产方法，具体步骤如下：

(1)原料处理和复合氨基酸添加：新鲜桑葚除梗、破碎后装入发酵瓶中，装液量为80％，在桑葚醪中加入复合氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)；

(2)巴氏杀菌：在水浴锅中孵育桑葚醪(80℃，45min)；

(3)浸渍：桑葚醪冷却后添加SO₂，混匀后进行浸渍；

(4)酵母种子液制备：利用活化培养基活化库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母，离心并取酵母沉淀，用无菌水重悬制取酵母菌液；

(5)桑葚酒发酵：在桑葚醪中同时接入库德毕赤酵母F2-24与酿酒酵母，混匀后静置发酵；

(6)桑葚酒过滤、陈酿：当桑葚酒中还原糖含量<4g/L时，进行渣汁分离、过滤和离心，上清液中调整SO₂后装入无菌瓶中贮藏，即得桑椹酒(后称为改良桑椹酒)；

(7)改良桑葚酒的分析评价：利用酸碱滴定法测定桑葚酒有机酸的含量，采用气相色谱-质谱联用仪分析成品酒中的香气成分，并对成品酒进行感官评价。

进一步的，所述步骤(1)中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸的含量分别为116mg/L、94mg/L、102mg/L及120mg/L。

进一步的，所述步骤(4)中库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母的菌量比例为1:1。

进一步的，所述步骤(4)中库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母添加后的终浓度都为10⁶CFU/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用自主分离和保藏的库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F2-24与酿酒酵母混合发酵桑葚酒，显著提高了其中萜烯类、C₁₃-降异戊二烯类、苯衍生物、高级醇、脂肪酸和酯等风味物质的含量，从而改善了桑葚酒风味与品质。

所述库德毕赤酵母F2-24于2019年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2019265，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；分类学命名为：Pichiakudriavzevii F2-24。

附图说明

图1为本发明桑葚酒发酵的工艺流程图。

图2为实施例1中桑葚酒中主要香气物质类型的含量图。

图3为实施例1中桑葚酒的感官评价图。

具体实施方式

实施例1

本实施例使用的酿酒酵母购于LAFFORT公司。

本实施例提供了一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，具体步骤如下：

(1)添加复合氨基酸的桑葚醪(以下称为“改良桑葚醪”)的制备

桑葚除梗、破碎后装入200mL发酵瓶中(80％装液量)。在桑葚醪中加入复合氨基酸，使其亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸含量分别达116mg/L、94mg/L、102mg/L及120mg/L，混匀后在80℃水浴中杀菌45min，后利用亚硫酸调整SO₂浓度至50mg/L并混匀，4℃浸渍12h后得改良的桑葚醪。

(2)库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母的活化

分别取100μL保藏于25％-30％甘油管中库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母的菌液，并分别接入50mL活化培养基中(葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％)，28℃，120rpm的恒温摇床中培养24-36h，4℃离心(4000rpm，5min)取菌体，加入无菌水洗涤并离心后(4000rpm，5min)洗去菌体表面附着的活化培养基，后利用无菌水重悬菌体得到活化的酵母菌种子液。

(3)同时接种混合发酵添加氨基酸的桑葚醪

同时将两种酵母分别按10⁶CFU/mL的终浓度接入改良的桑葚醪中，20℃下静置发酵，每天取样分析酒样中的还原糖含量，当桑葚酒中得还原糖<4g/L时，即结束发酵。

注：酒样中还原糖的具体测定方法如下：①葡萄糖标准液：准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用；②3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂配制：将6.3gDNS、20.96g NaOH及185g酒石酸钾钠加到500mL热水溶液，搅拌溶解后再加入5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用；③标准曲线的制作：分别取葡萄糖标准液(1mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于25mL具塞试管中，加蒸馏水至2mL，然后加入DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，冷却后加水补充至25mL，振荡混匀后于540nm下测定吸光度值，并绘制标准曲线；④样品测定：取2mL酒样，加1.5mL DNS于具塞试管中，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，振荡混匀后于540nm下测吸光度值，用蒸馏水做对照，与葡萄糖标准曲线对比换算出样品中还原糖的浓度，重复三次。

(4)改良桑葚酒过滤、陈酿

当桑葚醪中还原糖含量<4g/L时即判断发酵结束，利用无菌的纱布过滤改良后的桑葚醪，并离心(8000rpm，15min)滤液去除残渣及菌体，即得酒液。利用亚硫酸溶液调整酒液中的总SO₂浓度为50mg/L的后装入无菌瓶(注意满瓶)，4℃贮藏。

(5)改良桑葚酒的分析评价

酒液总酸测定方法：取0.2mL桑葚汁或酒，加入100mL蒸馏水稀释，再滴加2滴酚酞指示剂，用0.05mol/L NaOH液，当酒样稀释液变为红色且30s内不褪色，即为滴定终点，记录滴定消耗的NaOH溶液体积。平行滴定3次。按下式计算桑葚酒中总酸的含量：

式中：X—样品中总酸的含量(以酒石酸计)，单位为g/L。

V₁—滴定用NaOH标准溶液的体积，mL。

V₀—空白试验消耗NaOH标准溶液的体积，mL。

V₂—取样体积，mL。

c—NaOH标准溶液的浓度，mol/L。

75—酒石酸的摩尔质量的数值，单位为g/mol。

酒液挥发性成份分析方法：利用气相色谱-质谱联用仪分析成品酒中的香气成分。

分析方法具体如下：样品处理：取8mL酒样移入20mL顶空瓶中，加入2.00g NaCl，促进挥发性成分的挥发，加入10μL10％环己酮作为内标物，摇匀后通过隔垫插入活化好的萃取针(250℃活化30min)并于恒温磁力搅拌器中加热平衡15min(40℃)，而后推出纤维头，顶空吸附30min，后插入GC进样口解析5min。萃取头为50/30μm DVB/CAR/PDMS(Supelco，Bellefonte PA，USA)。

分析条件：采用Agilent 6890N-5975inert气相色谱-质谱联用仪，石英毛细管柱DB-5(30m×320μm，0.25μm)，程序升温：起始温度40℃，保持5min，以3℃/min升至130℃，然后以43℃/min升至250℃保持5min，进样口温度250℃，检测器温度260℃。

质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，灯丝发热电流0.25mA，离子源温度250℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描速度全程(30～350)u/s。

定性定量分析：通过质谱计算机的Wiley、Nistdemo质谱库定性，各香气物质组分的质谱经计算机谱库检索，结合解析谱图，确定香气物质。采用内标法进行定量，内标选用环己酮，其桑葚酒中主要香气物质类型的含量如图2所示。

酒液的感官分析：10名接受过培训的小组成员(6名女性，4名男性)对不同桑葚酒进行感官分析，评价指标包含：外观评价(颜色、澄清度及光泽)、香气评价(花香、果香及草本)、口感评价(酸甜度、柔和度及典型性)，并对每个指标进行评价，从0到9的打分，其中“0”表示无此特征，“9”表示此特性非常强烈，结果如图3所示。

本实施例提供的发酵方法与酿酒酵母单发酵的桑葚酒相比，改良桑葚酒的发酵周期(4d)明显缩短，总酸降低(12.45g/L，以酒石酸计)，苯衍生物(23.31mg/L)、高级醇(32.18mg/L)和酯的含量(22.74mg/L)显著提高。同时，改良桑椹酒的外观更为清亮，果香、花香更浓郁，草本味显著减弱，因而风味和品质显著提升。高品质桑椹酒的开发将极大地增加桑椹酒在市场上的竞争力，促进桑葚产业的发展，增加农民收入，也减少桑葚鲜果腐烂而带来的环境问题。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)原料处理和复合氨基酸添加：桑葚除梗、破碎后装入发酵瓶中，在桑葚醪中加入复合氨基酸；

(2)巴氏杀菌：在水浴锅中孵育桑葚醪；

(3)浸渍：桑葚醪冷却后添加SO₂，混匀后进行浸渍；

(4)酵母种子液制备：活化库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母，分别离心并收集酵母沉淀，用无菌水重悬制取酵母菌液；

(5)桑葚酒发酵：在桑葚醪中同时接入库德毕赤酵母F2-24与酿酒酵母，混匀后静置发酵；

(6)桑葚酒过滤、陈酿：当桑葚酒中还原糖含量<4g/L时，进行渣汁分离、过滤和离心，上清液中调整SO₂后装入无菌瓶中贮藏，即得桑椹酒；

所述库德毕赤酵母F2-24的保藏编号为CCTCC NO：M 2019265；

所述步骤(1)中复合氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸的混合物；

所述亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸与苯丙氨酸的含量分别为116mg/L、94mg/L、102mg/L及120mg/L。

2.根据权利要求1所述的提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中孵育条件为80℃，45min。

3.根据权利要求1所述的提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)中库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母的菌量比例为1:1。

4.根据权利要求1所述的提高桑葚酒风味与品质的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)中库德毕赤酵母F2-24和酿酒酵母添加后的终浓度都为10⁶CFU/mL。

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