CN111154593A

CN111154593A - 一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法

Info

Publication number: CN111154593A
Application number: CN202010042438.1A
Authority: CN
Inventors: 刘晓柱; 李银凤; 黄名正; 刘晓辉; 于志海; 龚勋; 许存宾
Original assignee: Guizhou Institute of Technology
Current assignee: Guizhou Institute of Technology
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明公开了一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母来混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株F119、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30中的一种或一种以上，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨上分离的野生非酿酒酵母。本发明采用非酿酒酵母和酿酒酵母来混合发酵，酿酒酵母消耗糖分，产生酒精；非酿酒酵母低产酒精，高产香气物质，二者相结合，既保证果酒酒精度，又改善果酒的香气物质种类、含量以及香气特征。

Description

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法

技术领域

本发明属于酿酒技术领域，尤其涉及一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法。

背景技术

刺梨(Rosaroxburghii)，蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，多年生落叶丛生灌木，其果实具有极高的营养价值和药用价值。研究表明，刺梨果实中Vc含量居各类水果之冠，每100g可食部分中含量为1700～2900mg，是猕猴桃的10倍；Vp的含量极高，每100g含量高达6000mg。刺梨果实中还富含钙质和维生素B、E、K1等16种营养素。然而，刺梨果实中单宁和有机酸含量较高，生食酸涩，口感较差，因此比较适宜进行二次开发，如刺梨果酒就是一种比较好的选择。目前，关于刺梨果酒酿造的公开文献有一些，例如：

1、专利申请CN201811276505.5，公开了一种高品质刺梨果酒的制备方法，先将刺梨鲜果采用特制的酵素液和清水的混合液进行浸泡预处理，然后制成刺梨果干作为酿酒原料，该刺梨果干依次经过粉碎、澄清处理、酶解步骤后，调整至初始糖浓度230～250g/L和pH3.8～4.2，在此条件下采用最适宜的安琪活性干酵母进行发酵，并严格控制发酵条件，最后采用交联聚乙烯吡咯烷酮、明胶和壳聚糖复配而成的复合澄清剂进行处理，最终酿制的刺梨果酒口感好，没有苦涩味，而且酒体色泽呈浅棕色，澄清透亮，稳定性好，大大提升了刺梨果酒的品质。

2、专利申请CN201810673630.3，公开了一种刺梨果酒及其制备方法，所述果酒包括以下重量份计的原料发酵组成，刺梨800～1200份、纯净水500～1000份、白砂糖30～70份、酵母0.05～0.1份、皂土0.02～0.05份、蛋清0.008～0.012份和焦亚硫酸钾0.13～0.18份。采用本发明所述的方法制备的果酒，不仅保存了刺梨独有的风味物质及各种营养成分，克服了刺梨果酒易氧化褐变并产生氧化味，易出现浑浊，产生沉淀，保质期短等问题；发酵结束后经过陈酿后再进行澄清过滤、稳定处理和精滤处理，使成品刺梨果酒色泽稳定、酒体澄清及透明、口感柔和，醇和爽口，诸香协调，口感细腻，回味绵长，具有刺梨的独特风味，又有果酒的醇香厚重感，同时还具有消食健脾，收敛止泄、清热解暑、增强体质等多种保健功效。

3、专利申请CN201810850141.0，公开了一种苦荞刺梨果酒的酿造方法，属于果酒加工领域。其特征在于，所述的苦荞刺梨果酒，以绿色保健的苦荞、刺梨为原料，经苦荞预处理、冷冻干燥、浸提、刺梨预处理、接种发酵、陈酿、萃取、增香后熟、灌装的加工工序，有效保留了原料的营养成分，提高了原料的利用率，同时也改善了成品果酒的口感，使制得的苦荞刺梨果酒色、香、味俱佳，还具有润肺化痰、健胃消食等疗效。

但是，上述专利申请以及公开的文献中，刺梨果酒酿造菌种均来自于葡萄酒酿造活性干酵母，菌种品种有限、适应性较差，导致市面上的刺梨果酒的品种较为单一，竞争特性不强，刺梨果酒的品质与特异性还有待于进一步改善，限制了刺梨果酒的发展。

果酒的自然发酵过程本质上是各种微生物相互作用的结果。不同属的酵母共同参与完成了果酒的自然发酵，包括酿酒酵母和非酿酒酵母。非酿酒酵母是一大类酵母的总称，包括葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)以及美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)等。这些非酿酒酵母存在于果园土壤、水果表皮以及果酒酿造环境中，能够通过代谢果汁中的糖和自溶以提高果酒的香气成分，参与果酒复杂的风味物质形成。在果酒发酵过程中，非酿酒酵母可以产生多种胞外酶，如果胶酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶等，这些酶作用于果汁中的相关底物，进而影响果酒的组成成分以及风味。因此，采用优质酵母菌种发酵是改善果酒品质与特异性的有效途径之一，通过添加刺梨非酿酒酵母，进行非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵刺梨果酒，是一种有效改善刺梨果酒香气特性的方法。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)菌株F119(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图1、图2所示)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图3、图4所示)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图5、图6所示)中的一种或一种以上，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨上分离的野生非酿酒酵母。

进一步地，所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：取超低温保存的非酿酒酵母接种到YPD固体培养基上，同时取超低温保存的酿酒酵母接种到另一个YPD固体培养基上，在温度为26℃～29℃下培养47h～50h，备用；

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为26℃～30℃，转速为120rpm～180rpm，培养20h～28h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

(3)制备刺梨汁：选取成熟的贵龙5号刺梨果实，清洗干净后，用榨汁机榨汁破碎，加入果胶酶、山梨酸钾、二氧化硫调整糖度和总酸，室温浸渍过夜，然后装入无菌瓶中，装样量小于瓶子体积的70％；

(4)接种：将步骤(2)制得的非酿酒酵母种子液和酿酒酵母种子液接种至步骤(3)的刺梨汁中；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为24～26℃下静止培养14～18d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒。

进一步地，在步骤(1)，所述YPD固体培养基是将酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L混合均匀，然后在温度为121℃下灭菌20～30min，使用前加入氯霉素，氯霉素终浓度为100mg/L。

进一步地，在步骤(1)，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株X16。

进一步地，在步骤(2)，所述血细球计数板测定方法为：先用自来水冲洗计数板，然后用95％乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，再用吸水纸擦干，在超净工作台上用无菌生理盐水将菌液依次稀释到计数板中，每一格里含有15～20细胞，吸取少量菌液滴加到盖玻片计数板的边缘缝隙处，让菌液沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，待菌体自然沉降和稳定后，在显微镜下选择中格区并逐格计数，并按下列公式进行计算：1mL菌液中的总菌数＝A/5×25×10⁴×B＝50000A·B(cfu)，式中：A—5个方格中的总菌数(cfu)、B—菌液稀释倍数。

进一步地，在步骤(3)，所述果胶酶质量分数为0.25～0.35％、山梨酸钾浓度为145～155mg/L、二氧化硫浓度为45～55mg/L。

进一步地，在步骤(3)，所述糖度调整为240～260g/L，总酸调整为5.5～5.8g/L。

进一步地，在步骤(4)，所述非酿酒酵母种子液和酿酒酵母种子液按照1:1的比例接种，接种量均为5％～10％V/V，接种后，刺梨汁中非酿酒酵母终浓度为10⁸cfu/mL，酿酒酵母终浓度为10⁷cfu/mL。

进一步地，在步骤(5)，所述二氧化硫的浓度为48～52mg/L。

进一步地，在步骤(5)，所述离心的转速为3000～5000rpm，时间为10～30min。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)本发明通过非酿酒酵母与酿酒酵母进行混合发酵，其中，酿酒酵母消耗糖分，产生酒精；非酿酒酵母低产酒精，高产香气物质，二者相结合，既保证了果酒中酒精度，也有助于改善刺梨果酒的香气特征。

(2)本发明通过工艺的摸索，将高产香气物质的非酿酒酵母与高产酒精的酿酒酵母进行了很好的结合，共培养时采用厌氧发酵，非酿酒酵母利用原料中的糖类进行发酵，产生多种香气物质，同时酿酒酵母进行酒精发酵，产生酒精，使得所得到的果酒具有一定的酒精度，实现了刺梨果酒产酒精与产香协同发酵的作用。

(3)本发明将非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵以改善刺梨果酒中香气物质特性。非酿酒酵母本身天然存在于刺梨果实上，优选非酿酒酵母来自刺梨果实本身，因此具有较好的适应性。本发明所述方法，简单易行，可以获得多种香气特性的果酒，有效的增加了刺梨果酒的种类，满足不同消费者的需求，同时也避免了市场上刺梨果酒的同质性恶性竞争。

(4)由于所用非酿酒酵母对酒精较为敏感，随着发酵液中酒精度浓度不断增加，非酿酒酵母逐渐死亡，但在发酵初期，非酿酒酵母可分解相关香气前体底物，释放香气物质，有助于改善果酒香气特性，所以本申请在接种时调整其浓度为10⁸cfu/mL，其最终浓度为酿酒酵母浓度的10倍，使非酿酒酵母在发酵初期占据主导地位。

(5)本发明通过利用非酿酒酵母与酿酒酵母进行混合发酵，酿酒酵母产生酒精，非酿酒酵母产生香气物质，从而有助于改善刺梨果酒香气物质种类与含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为本申请葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株F119在WL培养基上的菌落形态；

图2为本申请葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株F119的细胞形态；

图3为本申请异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11在WL培养基上的菌落形态；

图4为本申请异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11的细胞形态；

图5为本申请伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30在WL培养基上的菌落形态；

图6为本申请伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30的细胞形态；

图7为本申请制得的刺梨果酒的香气物质含量对比图；

图8为本申请制得的刺梨果酒的香气物质种类对比图；

图9为本申请所用贵农5号刺梨果实外观图；

图10为本申请所用贵农5号刺梨果实内部结构。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)菌株F119(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图1、图2所示)，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨(如图9、图10所示)上分离的野生非酿酒酵母，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：取超低温保存的非酿酒酵母接种到YPD固体培养基上，同时取超低温保存的酿酒酵母接种到另一个YPD固体培养基上，在温度为26℃下培养47h，备用；

所述YPD固体培养基是将酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L混合均匀，然后在温度为121℃下灭菌20～30min，使用前加入氯霉素，氯霉素终浓度为100mg/L；所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株X16；

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为26℃，转速为120rpm，培养28h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

所述血细球计数板测定方法为：先用自来水冲洗计数板，然后用95％乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，再用吸水纸擦干，在超净工作台上用无菌生理盐水将菌液依次稀释到计数板中，每一格里含有15～20细胞，吸取少量菌液滴加到盖玻片计数板的边缘缝隙处，让菌液沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，待菌体自然沉降和稳定后，在显微镜下选择中格区并逐格计数，并按下列公式进行计算：1mL菌液中的总菌数＝A/5×25×10⁴×B＝50000A·B(cfu)，式中：A—5个方格中的总菌数(cfu)、B—菌液稀释倍数；

所述果胶酶质量分数为0.25％、山梨酸钾浓度为145mg/L、二氧化硫浓度为45mg/L，所述糖度调整为250g/L，总酸调整为5.5g/L；

所述非酿酒酵母种子液和酿酒酵母种子液按照1:1的比例接种，接种量均为5％V/V，接种后，刺梨汁中非酿酒酵母终浓度为10⁸cfu/mL，酿酒酵母终浓度为10⁷cfu/mL；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为24℃下静止培养14d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒；所述二氧化硫的浓度为48mg/L；所述离心的转速为3000rpm，时间为30min。

实施例2

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)菌株C11(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图3、图4所示)，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨(如图9、图10所示)上分离的野生非酿酒酵母，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：取超低温保存的非酿酒酵母接种到YPD固体培养基上，同时取超低温保存的酿酒酵母接种到另一个YPD固体培养基上，在温度为28℃下培养48h，备用；

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为29℃，转速为180rpm，培养20h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

所述果胶酶质量分数为0.35％、山梨酸钾浓度为155mg/L、二氧化硫浓度为55mg/L；所述糖度调整为260g/L，总酸调整为6.5g/L；

所述非酿酒酵母种子液和酿酒酵母种子液按照1:1的比例接种，接种量均为10％V/V，接种后，刺梨汁中非酿酒酵母终浓度为10⁸cfu/mL，酿酒酵母终浓度为10⁷cfu/mL；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为26℃下静止培养16d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒；所述二氧化硫的浓度为52mg/L；所述离心的转速为5000rpm，时间为10min。

实施例3

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichiaburtonii)菌株C30(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图5、图6所示)中的一种或一种以上，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨(如图9、图10所示)上分离的野生非酿酒酵母，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：取超低温保存的非酿酒酵母接种到YPD固体培养基上，同时取超低温保存的酿酒酵母接种到另一个YPD固体培养基上，在温度为27℃下培养48h，备用；

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为28℃，转速为140rpm，培养26h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

所述果胶酶质量分数为0.28％、山梨酸钾浓度为147mg/L、二氧化硫浓度为48mg/L；所述糖度调整为245g/L，总酸调整为5.8g/L；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为24.5℃下静止培养14.5d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒；所述二氧化硫的浓度为49mg/L；所述离心的转速为3500rpm，时间为15min。

实施例4

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)菌株F119(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图1、图2所示)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图3、图4所示)，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨(如图9、图10所示)上分离的野生非酿酒酵母，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：取超低温保存的非酿酒酵母接种到YPD固体培养基上，同时取超低温保存的酿酒酵母接种到另一个YPD固体培养基上，在温度为28℃下培养49h，备用；

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为28℃，转速为160rpm，培养22h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

所述果胶酶质量分数为0.33％、山梨酸钾浓度为152mg/L、二氧化硫浓度为53mg/L；所述糖度调整为255g/L，总酸调整为6.3g/L；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为25.5℃下静止培养15.5d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒；所述二氧化硫的浓度为51mg/L；所述离心的转速为4500rpm，时间为25min。

实施例5

一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)菌株F119(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图1、图2所示)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30(在WL培养基上的菌落形态和细胞形态如图5、图6所示)，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨(如图9、图10所示)上分离的野生非酿酒酵母，具体包括以下步骤：

(2)制备种子液：将步骤(1)活化的非酿酒酵母与酿酒酵母分别转接到YPD液体菌培养基中，进行种子液的制备，种子培养条件为：温度为28℃，转速为150rpm，培养24h至对数生长期，用血细球计数板法测种子液中活菌数，调整非酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹¹cfu/mL，酿酒酵母种子液中活菌数为2.8×10¹⁰cfu/mL；

所述果胶酶质量分数为0.30％、山梨酸钾浓度为150mg/L、二氧化硫浓度为50mg/L；所述糖度调整为250g/L，总酸调整为6.0g/L；

(5)混和发酵：将步骤(4)接种好的刺梨汁置于温度为25℃下静止培养15d，每天监测糖度及酒精度，当糖度不再变化时，加入二氧化硫并终止发酵，后测定刺梨果酒中残糖、总酸、pH值以及酒精度，离心过滤，收集上清液，得到所述刺梨果酒；所述二氧化硫的浓度为50mg/L；所述离心的转速为4000rpm，时间为15min。

对比例1

与实施例5不同之处在于：仅仅采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株X16作为发酵菌种进行发酵，其他条件不变。

为了进一步说明本发明能够达到所述技术效果，做以下实验：

对实施例1～3和对比例1方法制得的刺梨果酒进行理化指标检测，具体检测方法如下：

1、刺梨果酒中总酸与酒精度分析参照GB/15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。

2、刺梨果酒中总糖的测定采用蒽酮比色法，首先绘制标准曲线：采用乙酸乙酯配置15mg/mL蒽酮溶液，0.2mg/mL葡萄糖标准液；分别取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，稀释至2mL，蒽酮试剂0.5mL，冷水浴中加入浓硫酸5mL，摇匀；迅速放入水浴锅中，80℃下水浴15min，取出后流动水冷却至室温，在620nm处测定其吸光度。以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品测定：样品采用GB/15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行酸水解，然后进行适当浓度的稀释，620nm处测定其吸光度，带入标准曲线供试，即可计算出样品中总糖的含量。

3、刺梨果酒pH值采用精密pH仪进行测定。

4、刺梨果酒香气成份的分析：

采用顶空固相微萃取法萃取刺梨果酒中的香气物质，然后进样GC-MS，测定挥发性香气物质的种类及含量，与对照组比较，分析本申请混合发酵刺梨果酒中香气物质的特性。

顶空固相微萃取法萃取条件为：15mL顶空瓶中，加入8mL刺梨果酒样品，2.0g的NaCl，在温度为40℃的水浴中预热20min，然后用2cm～50/30μmDVB/CAR/PDMSStableFlex萃取纤维头萃取30min，萃取完成后，将萃取头插入进样口，180℃解吸附2min，进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件为：PEG.20m弹性石英毛细管柱，30m×250μm×0.25μm；载气为高纯(99.999％)氦气，恒定流量为1mL/min；升温程序：从40℃开始，保持2min，以2℃/min升温到150℃/min，保持3min，再以5℃/min升温到230℃，保持3min；进样口温度：250℃，出样口温度235℃；柱前压7.0699psi，载气流速1.0mL/min，检测电压350V；不分流进样；溶剂不延迟。

EI离子源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；发射电流μA；电子能量70eV；调谐EMV947V；质量范围30.00-500.00amu。

实验结果如下表1所示，分析结果表明，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵增加了刺梨果酒的酒精度，降低了总糖、总酸和挥发酸的含量，如下表1所示。

表1刺梨果酒的理化指标

刺梨果酒	酒精体积分数/％	pH	总酸(g/L)	总糖(g/L)	挥发酸(g/L)
						对比例1	11.3±0.50	3.41±0.01	4.22±0.06	7.71±0.39	0.72±0.02
实施例1	12.0±0.30	3.45±0.01	3.87±0.07	5.51±0.48	0.69±0.05
						实施例2	11.9±0.24	3.42±0.01	4.01±0.00	7.26±0.09	0.64±0.02
实施例3	12.2±0.35	3.43±0.03	4.31±0.05	6.12±0.03	0.60±0.06

葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株F119与酿酒酵母混合发酵的刺梨果酒香气中其它类物质(醚类、酚类、烯类、烷烃类)含量比单独采用酿酒酵母发酵刺梨果酒(对照组)显著增加(如图7所示)，而且酸类物质、醛酮类物质和其它类物质的种类也比对照组增加(如图8所示)。OAV＞1的香气物质中，丁酸乙酯、乙酸异戊酯、2-糠酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯的值均大于对照组；OAV＜1的香气物质中，苯甲酸乙酯的值大于对照组，结果如下表2所示。

表2刺梨果酒香气成份OAV值

由以上实验数据可知，酿酒酵母X16纯种发酵刺梨酒中，酒精度为11.30±0.50，pH为3.41±0.01，总酸含量为4.22±0.06g/L，总糖为7.71±0.39g/L，挥发酸为0.72±0.02g/L；香气物质中酸类1种，含量为2.47±0.34mg/L；醇类物质12种，含量为44.76±3.29mg/L；酯类物质20种，含量为55±6.06mg/L；醛酮类物质7.03±0.54mg/L；其它类物质3种，含量为1.65±0.35mg/L。

通过实施例1和对比例1进行比较可知，本发明利用非酿酒酵母葡萄汁汉逊有孢酵母F119与酿酒酵母X16进行混合发酵刺梨汁，发酵刺梨酒中其它类香气物质含量提高了46.06％；酸类物质种类增加了300％，醛酮类物质种类增加了25％，其它类物质种类增加了100％。

通过实施例2和对比例1进行比较可知，本发明利用非酿酒酵母异常威克汉姆酵母C11与酿酒酵母X16进行混合发酵刺梨汁，发酵刺梨酒中酸类物质含量提高了93.12％，醇类物质含量提高了47.99％，酯类物质提高了11.00％，醛酮类物质提高了90.47％，其它类物质提高了57.58％。酸类物质种类增加了200％，醇类物质种类增加了8.33％，醛酮类物质含量增加了25％。

通过实施例3和对比例1进行比较可知，本发明利用非酿酒酵母伯顿丝孢毕赤酵母菌株C30与酿酒酵母X16进行混合发酵刺梨汁，发酵刺梨酒中酯类物质提高了8.42％。酸类物质种类增加了200％，醇类物质种类增加了8.33％，醛酮类物质含量增加了25％。

实验结果表明，本发明通过利用非酿酒酵母与酿酒酵母进行混合发酵，酿酒酵母产生酒精，非酿酒酵母产生香气物质，从而有助于改善刺梨果酒香气物质种类与含量。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：采用非酿酒酵母和酿酒酵母作为发酵菌种进行混合发酵，所述非酿酒酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株F119、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株C11、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)菌株C30中的一种或一种以上，且该非酿酒酵母是从贵农5号刺梨上分离的野生非酿酒酵母。

2.根据权利要求1所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(1)，所述YPD固体培养基是将酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L混合均匀，然后在温度为121℃下灭菌20～30min，使用前加入氯霉素，氯霉素终浓度为100mg/L。

4.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(1)，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株X16。

5.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(2)，所述血细球计数板测定方法为：先用自来水冲洗计数板，然后用95％乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，再用吸水纸擦干，在超净工作台上用无菌生理盐水将菌液依次稀释到计数板中，每一格里含有15～20细胞，吸取少量菌液滴加到盖玻片计数板的边缘缝隙处，让菌液沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，待菌体自然沉降和稳定后，在显微镜下选择中格区并逐格计数，并按下列公式进行计算：1mL菌液中的总菌数＝A/5×25×10⁴×B＝50000A·B(cfu)，式中：A—5个方格中的总菌数(cfu)、B—菌液稀释倍数。

6.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(3)，所述果胶酶质量分数为0.25～0.35％、山梨酸钾浓度为145～155mg/L、二氧化硫浓度为45～55mg/L。

7.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(3)，所述糖度调整为240～260g/L，总酸调整为5.5～5.8g/L。

8.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(4)，所述非酿酒酵母种子液和酿酒酵母种子液按照1:1的比例接种，接种量均为5％～10％V/V，接种后，刺梨汁中非酿酒酵母终浓度为10⁸cfu/mL，酿酒酵母终浓度为10⁷cfu/mL。

9.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(5)，所述二氧化硫的浓度为48～52mg/L。

10.根据权利要求2所述的一种利用非酿酒酵母改善刺梨果酒香气特性的酿造方法，其特征在于：在步骤(5)，所述离心的转速为3000～5000rpm，时间为10～30min。