CN113773975A - 两株产香酵母及其在干白葡萄酒酿造过程中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两株产香酵母及其在干白葡萄酒酿造中的应用。所述酵母其中一株为非酿酒酵母葡萄汁有孢汉逊酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22754，名称为H30；一株为酿酒酵母，保藏编号为CGMCCNO.22752，名称为YT13。两株酵母以顺序接种发酵方式酿造的葡萄酒，具有更浓郁的橙花、玫瑰的花香和菠萝、苹果的果香，干白葡萄酒中的高级醇、酯类和萜烯类化合物都有显著增加，特别是促进了梨醇酯、丁内酯、橙花叔醇和肉桂酸乙酯的产生，有利于酿造出具有橙花和热带水果香气的干白葡萄酒。

Description

两株产香酵母及其在干白葡萄酒酿造过程中的应用

技术领域

本发明属于食品发酵领域，具体涉及两株产香酵母及其在干白葡萄酒酿造过程中的应用。

背景技术

葡萄酒的香气是评价干白葡萄酒的重要指标之一，香气复杂平衡且风味独特的葡萄酒更受到消费者的喜爱。葡萄酒中的挥发性香气成分可以增强葡萄酒的感官特性，提升葡萄酒的感官品质。而由于碳代谢、转运、分解代谢和能量代谢等活动，使酿酒酵母产生的挥发性代谢产物决定了许多不同风味物质的种类和含量。其次，非酿酒酵母虽然发酵性能弱，无法独立完成发酵，但在其参与发酵的前期，产生的代谢物可以增加葡萄酒的香气和生物稳定性。在发酵过程中产生的甘油浓度较高，且乙醇、乙酸和乙醛的浓度更低，增强了葡萄酒的柔和感。因此，目前各国逐渐开始利用酿酒酵母和非酿酒酵母混菌发酵等方式来增加葡萄酒等果酒的香气、口感等感官特征。

葡萄中大部分的品种香气以糖苷结合态的形式存在，需要通过水解来释放活性香气成分，非酿酒酵母中富含的β-葡萄糖苷酶能够进行酶促水解促进萜烯类香气物质的释放，这可能是一种具有应用潜力的提高葡萄酒香气质量的方法。另外，优质的本土菌株能够赋予产区葡萄酒典型的香气特征。苏玳产区由贵腐菌参与酿造而成的贵腐酒因带有独特的“指甲油味”而被世人皆知。南非帕尔地区筛选的本土酵母NI6高产3-巯基-1-己醇，从而给西拉葡萄酒带来了“果酱”、“烟熏”和“辛辣”的典型香气。外源添加德尔布有孢圆酵母进行顺序接种发酵的葡萄酒中检测到1-戊醇和2-苯乙醇，增加了葡萄酒的花香和香料风味。

因此，酵母资源的开发和利用对葡萄酒行业的发展尤为重要，利用酵母酿造优质的具有优良香气风味的葡萄酒对于提升我国葡萄酒的国际竞争力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供两株发酵性能良好的酵母，该酵母具有应用到葡萄酒发酵中，提升葡萄酒特征香气表达的能力。

本发明的另一目的是提供一款香气风味独特的干白葡萄酒，其口感良好，具有良好的香气轮廓。

针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，名称为YT13，从山东蓬莱产区筛选出来的。除非特别指明，酿酒酵母在本文中简称YT13。

本发明提供的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)，名称为H30，从山东蓬莱产区葡萄园采摘成熟的红色酿酒葡萄品种——“马瑟兰”葡萄果实分离筛选出来的。除非特别指明，葡萄汁有孢汉逊酵母在本文中简称H30。

本发明提供的YT13和H30可参与到葡萄酒的酿造过程中。利用YT13和H30参与酿造葡萄酒的优点在于：在筛选过程中，YT13表现出了良好的耗糖速率和产酒精速率，能够完成整个发酵进程。H30表现出了优秀的β-葡萄糖苷酶活性和代谢活性。这两株能够促进葡萄酒中香气种类的增加，且显著增加了酯类化合物的香气浓度，尤其是苯乙酸乙酯、己酸苯乙酯、癸酸甲酯、肉桂酸乙酯和梨醇酯等，为干白葡萄酒提供了更加浓郁的花香和果香，对于酿造具有本土特色的葡萄酒具有重要意义，有利于促进整个产区干白葡萄酒产业发展。

生物保藏说明

生物材料H30，分类命名:葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.22754；

生物材料YT13，分类命名:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.22752。

附图说明

图1菌株YT13和H30酿酒试验贵人香葡萄酒香气雷达图；

图2菌株YT13和H30酿酒试验小芒森葡萄酒香气雷达图；

注：图1和图2中各组酵母接种方式为：对照组：商业酿酒酵母EC1118单菌发酵；YT13组：酿酒酵母YT13单菌发酵；H30+商业酿酒酵母组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与商业酿酒酵母EC1118顺序接种发酵；H30+YT13组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与酿酒酵母YT13顺序接种发酵。

具体实施方式

为了更好地理解与实施，下面结合实施例和附图详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取统计平均值。

实施例中涉及的培养基配方如下：

YPD液体培养基(每1L)：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g。实施例1酵母H30和YT13顺序接种发酵贵人香干白葡萄酒的小型试验

将成熟贵人香品种酿酒葡萄除梗破碎压榨，以10L玻璃发酵罐作为葡萄酒发酵容器，利用一株商业酿酒酵母EC1118单菌发酵、酿酒酵母YT13单菌发酵、H30与商业酿酒酵母顺序接种发酵、H30与YT13顺序接种发酵，共四组分别设置3个平行。酵母经活化后，接种于YPD液体培养基中，于120rpm/min条件下28℃恒温振荡培养18h。酵母按1％的接种量接入澄清葡萄汁中，置于16℃下发酵。开始发酵后每天进行温度、糖度和比重的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当贵人香葡萄酒的残糖含量降至4g/L时，取上层清液灌装，密封置于4℃冰箱中保存。

为更加直观地表现葡萄酒的风味特点，对不同酵母发酵的葡萄酒进行感官评价分析，评价小组由7名成员组成，采用五点强度法对发酵产物香气(参照国际WSET葡萄酒品鉴指南选取酒精气味、花香、柑橘类水果、热带水果、温带水果、发酵香气、不良气味共7项香气特征)进行闻香评价，香气雷达图如图1所示。

通过顶空固相微萃取(HS-SPME)对葡萄酒中挥发性物质进行吸附萃取，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的方法对化合物的含量进行测定，取3mL酒样置于10mL的顶空瓶中，加入0.5g NaCl粉末(使香气被充分萃取)、0.3g交联聚乙烯吡咯烷(PVPP)、3μL浓度为0.822g/L2-辛醇内标物和磁力转子，用带有橡胶垫片的瓶盖密封。在50℃、350rpm加热搅拌条件下，吸附50min，然后取出萃取头插入气相色谱进样口250℃，热解析5min，每个样品平行测定三次。气相色谱条件：所用色谱柱为TG-5SILMS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；载气为高纯氦气，流速为1.2mL/min。固相微萃取手动进样，采用不分流模式。进样口温度250℃。柱温升温程序：初始40℃，保持2min，以5℃/min的速度升温到230℃，保持5min。质谱条件：接口温度250℃，离子源温度230℃，电离方式EI，全扫描模式采集信号，扫描范围(m/z)：30～450amu。香气定性分析方法：将各香气成分质谱图结果与NIST2011标准谱库进行比较确定成分。定量分析：以2-辛醇为内标，采用内标半定量法进行相对定量，测定结果如表1所示。并根据GB/T 15038-2006对葡萄酒基本理化指标进行检测。

表1不同酵母发酵后贵人香葡萄酒中部分挥发性化合物的含量

注：表中字母表示不同样品所测得的数据之间存在显著差异性，p<0.05。“-”表示未检测出该化合物。各组酵母接种方式为：对照组：商业酿酒酵母EC1118单菌发酵；YT13组：酿酒酵母YT13单菌发酵；H30+商业酿酒酵母组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与商业酿酒酵母EC1118顺序接种发酵；H30+YT13组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与酿酒酵母YT13顺序接种发酵

小型酿酒试验结果显示，酿酒酵母YT13和非酿酒酵母H30两个菌株都会增加挥发性化合物中酯类化合物的含量，尤其是增加了肉桂酸乙酯、丁酸乙酯、己酸苯乙酯、异戊酸香叶酯、癸酸甲酯和月桂酸甲酯的浓度。而在所有挥发性化合物的总相对含量检测结果中，H30+YT13顺序接种发酵组的葡萄酒增加效果更为显著。

在贵人香干白葡萄酒的感官评价中，四个处理组在“酒精气味”、“花香”、“柑橘类水果”、“温带水果”、“发酵香气”属性强度存在显著差异。H30+YT13处理组的酯类化合物含量最高，其中丁酸乙酯、异戊酸香叶酯、癸酸甲酯和月桂酸甲酯表现出了显著差异，苹果、梨、柑橘和清新的花香风味突出，因此在闻香评价中该组花香和果香的得分最高。YT13处理组的发酵香气(面包、黄油)得分最高，而该组高浓度的肉桂酸乙酯丰富了甜橙和葡萄的果香，使这一组的闻香评价得分仅次于H30+YT13处理组。

实施例2酵母H30和YT13顺序接种发酵小芒森干白葡萄酒的小型试验

将成熟小芒森品种酿酒葡萄除梗破碎压榨，以10L玻璃发酵罐作为葡萄酒发酵容器，利用一株商业酿酒酵母EC1118单菌发酵、酿酒酵母YT13单菌发酵、H30与商业酿酒酵母顺序接种发酵、H30与YT13顺序接种发酵，共四组分别设置3个平行。酵母经活化后，接种于YPD液体培养基中，于28℃恒温振荡培养18h。酵母单菌液按1％的接种量接入澄清葡萄汁中，顺序接种发酵的处理组先接种H30，发酵第4天分别接种商业酿酒酵母和YT13，置于16℃下发酵。开始发酵后每天进行温度和糖度的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当小芒森葡萄酒的残糖含量降至4g/L时，取上层清液灌装密封置于4℃冰箱中保存。

对不同酵母发酵的葡萄酒进行感官评价分析，评价小组由7名成员组成，采用五点强度法对发酵产物香气进行闻香评价，香气雷达图如图2所示。

通过顶空固相微萃取对葡萄酒中挥发性物质进行吸附萃取，采用气相色谱-质谱联用的方法对化合物的含量进行测定，以2-辛醇为内标，采用内标半定量法进行相对定量，测定结果如表2所示。

表2不同酵母发酵后小芒森葡萄酒中部分挥发性化合物的含量

部分挥发性组分相对含量(μg/L)	对照组	YT13	H30+商业酿酒酵母	H30+YT13
					梨醇酯	-	-	43.87±3.91<sup>b</sup>	95.79±4.65<sup>a</sup>
丁内酯	-	-	15.6±2.01<sup>b</sup>	23.83±1.66<sup>a</sup>
					苯乙酸乙酯	226.25±8.52<sup>a</sup>	186.99±56.33<sup>a</sup>	271.54±70.51<sup>a</sup>	248.33±25.13<sup>a</sup>
亚油酸乙酯	-	28.22±16.49<sup>a</sup>	-	14.46±1.75<sup>ab</sup>
					丙酸橙花酯	-	-	16.83±3.92<sup>a</sup>	19.81±2.58<sup>a</sup>
岩芹酸甲酯	12.67±2.67<sup>a</sup>	12.88±2.85<sup>a</sup>	11.17±2.73<sup>a</sup>	15.94±0.96<sup>a</sup>
					橙花叔醇	-	-	8.93±1.21<sup>a</sup>	9.37±0.96<sup>a</sup>
芳樟醇	-	37.22±2.88<sup>b</sup>	38.96±2.49<sup>ab</sup>	45.63±6.57<sup>a</sup>
					白藜芦醇	25.35±1.00<sup>a</sup>	-	16.95±0.65<sup>b</sup>	-
法尼醇	-	-	10.58±1.85<sup>a</sup>	-

注：表中字母表示不同样品所测得的数据之间存在显著差异性，p<0.05。“-”表示未检测出该化合物。各组酵母接种方式为：对照组：商业酿酒酵母EC1118单菌发酵；YT13组：酿酒酵母YT13单菌发酵；H30+商业酿酒酵母组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与商业酿酒酵母EC1118顺序接种发酵；H30+YT13组：葡萄汁有孢汉逊酵母H30与酿酒酵母YT13顺序接种发酵

小型酿酒试验结果显示，酿酒酵母YT13和非酿酒酵母H30两个菌株能够增加挥发性香气化合物的种类与含量，提升酯类化合物的浓度，检测中的典型香气化合物梨醇酯、丁内酯、苯乙酸乙酯、芳樟醇、丙酸橙花酯和橙花叔醇的浓度与对照组表现出了显著性差异。而H30+YT13顺序接种发酵组的葡萄酒增加效果更为显著。

在小芒森干白葡萄酒的闻香评价中，小芒森本身葡萄品种的特性，使得小芒森葡萄酒在柑橘类水果(柠檬、柑橘、金桔)和温带水果(杏、桃)的香气风味的得分普遍高于其他风味特征。YT13处理组具有最高的花香(橙花、金银花)，其醇类和酸类化合物的总含量占据优势，高级醇的复合香气使得YT13处理组获得了最高的花香得分。由于芳樟醇表现出显著性差异，H30+YT13处理组的甜橙、清凉的柠檬香气更加浓郁。

Claims (4)

1.一株葡萄汁有孢汉逊酵母，其特征在于，所述非酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为H30，保藏编号：CGMCCNO.22754。

2.一株酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为YT13，保藏编号：CGMCCNO.22752。

3.如权利要求1、2所述的两株酵母在生产干白葡萄酒中的应用；利用如权利要求1所述的葡萄汁有孢汉逊酵母以1％～3％的比例接种到澄清的葡萄汁中，发酵第4天再接种权利要求2所述的酿酒酵母，以1％～3％的比例接种到葡萄汁中；利用两株酵母通过顺序混合接种发酵白葡萄果实原料，得到具有果香和花香风味特征的干白葡萄酒。

4.一款利用如权利要求1、2所述酵母酿造的干白葡萄酒，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取出保藏在-80℃甘油的菌株，解冻后室温下回温，以10％～15％(v/v)的比例接种到YPD液体培养基中，置于恒温振荡培养箱扩增培养，待菌株生长至菌株密度在10⁷～10⁸CFU/mL，得到单菌液；

(2)采摘后的贵人香葡萄经过穗选、粒选和除梗破碎，经过压榨将葡萄自流汁导入恒温发酵罐，加入澄清剂得到澄清葡萄汁；

(3)利用如权利要求3所述的接种方法，将酵母接种到澄清的白葡萄汁中；

(4)发酵过程的温度控制在16～18℃，直至残糖含量低于4g/L时，加入偏重亚硫酸钾终止发酵。

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