CN109797112B - 酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酿酒酵母菌株，其保藏编号为CGMCC NO:16756。本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐冰葡萄汁15℃自然发酵过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵活力高，其酿造的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。

Description

酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用

技术领域

本发明属于冰酒酵母技术领域，尤其涉及一株低产挥发酸、产香特性突出 的冰酒酿酒酵母及其在冰酒中的应用。

背景技术

冰酒是一种低产量、高档次的浓甜型葡萄酒，其巨大的经济效益近年来引 起了人们广泛的关注。当环境温度≤8℃时，葡萄藤上的葡萄会自然冰冻，在压 榨过程中，大部分水分会以冰的形式保留在葡萄皮中，得到含有高浓度的糖、 酸和芳香化合物的葡萄汁，由此葡萄汁酿造而成的葡萄酒就是冰酒。酿造冰酒 的原料要求其可溶性固形物在38°Brix～42°Brix之间，最低不能低于35°Brix。

酿酒酵母在冰酒酿造中起着关键性的作用，负责在这种高浓度的环境中把 糖转化成酒精(目标酒度11％v/v左右)，最后得到一款浓甜的葡萄酒(残糖可 高达214.7g/L)。酿酒酵母为了应对冰酒原料的高渗透环境，往往会代谢糖产生 过多的甘油和挥发酸，其中高水平的挥发酸会严重影响葡萄酒的香气质量，使 葡萄酒闻起来有醋酸味，有时还会有猫尿味，大大影响葡萄酒口感。OIV标准 规定冰酒的挥发酸不能高于2.1g/L。即使OIV对冰酒的挥发酸的限制范围较宽， 但是在生产过程中仍有挥发酸超标的现象。因此，要降低冰酒发酵过程中的不 良代谢物挥发酸，提高冰酒的香气质量，选择产挥发酸少的酿酒酵母非常重要。

葡萄酒的风味在很大程度上取决于葡萄酒中的香气成分，而葡萄酒香气是 葡萄酒品质的重要体现。香气物质的种类、含量、感觉阈值以及物质间的相互 作用，都会影响最终呈现的风味和典型性。由于冰酒是由自然冷冻的葡萄汁酿 造而成，所以其香气物质的含量也要明显高于相同品种酿造的餐酒。目前在冰 酒中已经检测到360多种挥发性物质，包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯 类、呋喃类、内酯类等。但并不是这些物质都会对冰酒的香气组成有贡献，只 有少部分化合物(仅几十种)会对冰酒的香气有一定贡献。其中酯类化合物和 高级醇是其香气构成的关键成分，其种类和含量具有菌株的多样性。乙酸酯和 乙醇酯是冰酒中水果香气的重要呈味物质，主要包括有乙酸异戊酯、乙酸苯乙 酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等物质。产酯高的 酵母会赋予冰酒果香浓郁的发酵香味。高级醇对冰酒香气具有双重影响。含量 过低会使葡萄酒香气淡薄，酒体寡淡；含量过高会给葡萄酒带来异味，给人以 辛辣、腐臭感和不愉快的苦涩味。醇类化合物中，β-苯乙醇具有玫瑰花香和蜂蜜 香气，赋予了冰酒的典型香气。萜烯、内酯、酮、酚类等化合物也是冰酒香气 构成的重要组成部分，其中β-大马酮、1-辛烯-3-醇、乙烯基愈创木酚会带给冰酒香甜的果香、蘑菇、丁香等风味，增加了冰酒香气的复杂性。研究发现，微 生物所产香气物质的含量和种类具有菌株多样性。选择能够酿造具有典型品种 香气，且香气复杂性高的冰酒酵母将会对冰酒质量的提升具有重大贡献。中国 是世界上重要的冰酒生产国之一。但是到目前为止，中国冰酒都是用国际商业 酿酒酵母菌株发酵完成。虽然利用国际上商业化的酿酒酵母菌株，可以有效控 制其发酵过程，避免一些风险，但是其酿制的冰酒通常缺乏典型的地域感官特 征。本土酿酒酵母对当地环境条件、酿酒厂条件和葡萄品种的适应性更好，因 此具有更强的竞争力，也更容易保持我国冰酒典型的地域特色。开发与利用本 土的酿酒酵母资源对提高我国冰酒的国际竞争力具有重要作用，已经迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一株低产挥发酸、产香突出的野生型酿酒酵母及其 在冰酒中的应用。

为实现上述目的，本发明提供一种酵母菌株，其保藏编号为CGMCC NO: 16756，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酵母菌株CEC A10， 保藏日期为2018年11月21日，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。

具体地：该酿酒酵母菌株26s rDNA D1/D2区具有如SEQ ID:1所示的核苷 酸序列。

本发明还提供一种上述所述的酿酒酵母菌株在冰酒中应用。

具体地，以冰葡萄汁为原料，接种所述酿酒酵母菌株进行发酵，发酵温度为14～16℃。

具体地，所述冰葡萄汁为威代尔冰葡萄汁。

具体地，所述酿酒酵母菌株酿造的冰酒的挥发酸含量小于1g/L。

本发明还提供一种提高冰酒香气复杂度的方法，采用上述所述的酿酒酵母 菌株发酵冰葡萄汁。

本发明还提供一种活性干酵母，由上述所述的酿酒酵母菌株制得。

本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10，具有以下优点：

(1)酿酒酵母菌株CEC A10具有良好的耐受性，能够耐受300mg/L的SO₂， 16％(v/v)的酒精，较高的酸度(pH＝2.0)，45％的高糖，10℃的低温，而且 其低产硫化氢，发酵活力高。

(2)酿酒酵母菌株CEC A10与商业活性干酵母EC1118(法国LALVIN公 司生产，常用于冰酒的酿造)相比，其在15℃发酵温度下发酵速度较快，发酵 周期较短。而且其在高达412g/L糖的环境下，仍能产较低的挥发酸，含量仅有 0.87g/L，提高了冰酒的质量。

(3)酿酒酵母菌株CEC A10产香能力突出，其产生的乙酸异戊酯、丁酸乙 酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸乙酯、β-乙酸苯乙酯的含量均高于商业酵母，不仅赋 予了冰酒典型的玫瑰花香、蜂蜜香，还赋予了其浓郁的果香。与此同时，菌株 CEC A10产生的萜烯类、降异戊二烯类和酚类含量较高，有2099.02μg/L，大大 增加了冰酒的香气复杂性，赋予冰酒浓郁的坚果、蘑菇等复杂香气。

(4)酿酒酵母菌株CEC A10酿造的冰酒，酒体呈金黄色，澄清有光泽；具 有浓郁纯正协调的花香、果香，有丰富的干果、香料等香气，品种香气突出； 口感成熟和谐，层次感强。

本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐冰葡萄汁15℃ 自然发酵过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵 活力高，其酿造的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰 酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。

本发明的酿酒酵母菌株CEC A10，保藏日期为2018年11月21日，保藏编 号为CGMCCNO:16756，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保 藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为酿酒酵母菌株CEC A10在YEPD固体培养基上的菌落形态；

图2为酿酒酵母菌株CEC A10在WLN固体培养基上的菌落形态；

图3为酿酒酵母菌株CEC A10菌株和商业菌株EC1118的糖消耗曲线。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具 体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明 做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的 材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

本发明中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10分离自甘肃祁连酒 厂美乐冰葡萄汁15℃自然发酵过程中，属于我国本土酵母。菌株CEC A10的 26s rDNA D1/D2区具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。另外，菌株CEC A10 在YEPD固体培养基上的生长形态如图1所示，在WLN培养基上的生长形态如 图2所示。

实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10菌株的基本特性 研究

在本实施例中，测定酿酒酵母CEC A10的基本生长特性，包括SO₂耐受性、 酒精耐受性、耐酸性、高糖耐受性、低温耐受性、产H₂S特性和发酵活力。具 体方法如下：

1.1SO₂耐受性

在试管中添加YEPD培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L， 自然pH值，固体培养基中加入20g/L琼脂)并加入杜氏管，灭菌之后加入H₂SO₃溶液，调整初始SO₂浓度为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L。 将活化后的菌株按接种量1×10⁶cells/mL接种，28℃培养3d。每4h记录其产气 情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液浓度了 解酵母SO₂耐受性。

1.2酒精耐受性

在试管中添加YEPD液体培养基并加入杜氏管，灭菌之后分别加入无水乙 醇调整初始酒精浓度为10％、12％、14％和16％(v/v)。将活化好的菌株按接 种量1×10⁶cells/mL接种，28℃培养3d。每4h记录其产气情况，3d后测定菌 液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液浓度了解酵母酒精耐受性。

1.3耐酸性

将菌株活化后，接种于不同pH值(1.5、2.0、2.5、3.5)的带有杜氏管的 YEPD液体培养基中，接种量为1×10⁶cells/mL。28℃培养3d，每4h记录其产 气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值，根据产气情况及菌液浓度 了解酵母耐酸性。

1.4高糖耐受性

酵母菌株活化后，接种于含有不同糖浓度(30、35、40、45％，葡萄糖：果 糖＝1：1)的YEPD培养基中，接种量为1×10⁶cells/mL。28℃培养3d，每4h 记录其产气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值，根据产气情况及 菌液浓度了解酵母耐受性。

1.5低温耐受性

将酵母菌株活化后，接种于带有杜氏管的YEPD液体培养基中，接种量为 1×10⁶cells/mL。然后分别置于10℃、12℃、15℃条件下培养3d，每4h记录 其产气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液 浓度了解酵母的低温耐受性。

1.6产H₂S特性

酵母菌株接种于YEPD液体培养基中，28℃下培养24h。然后将菌液划线 于BIGGY固体培养基上，在28℃下培养5d，观察菌落颜色。根据菌落颜色 可分为以下六个等级：1-白色、2-浅棕褐色、3-棕褐色、4-浅褐色、5-褐色和6- 黑色，对应H₂S产量从低产到高产。

1.7发酵活力

酵母菌株接种于YEPD液体培养基中，28℃下培养24h。然后接种于100 mL含有20％葡萄糖的YNB培养基(葡萄糖20g/L，酵母基础氮源6.70g/L， pH6.8，固体培养基中加入20g/L琼脂。)中，接种量为1×10⁶cells/mL。在25℃ 下培养，发酵过程中每24h测定发酵体系重量，计算失重(即CO₂的释放量)。 发酵活力表示为发酵24h-72h小时内CO₂释放的速率(gCO₂/L h)。

结果显示，冰酒发酵过程中，酵母会受到很多严苛的环境，如原料的高糖、 高酸环境，起始较高的二氧化硫浓度，逐渐增高的酒精含量，以及要求的较低 的发酵温度等。研究酿酒酵母菌株CECA 10的基本特性(如表1所示)，发现该 酵母菌株在300mg/L的SO₂，16％(v/v)的酒精，较高的酸度(pH＝2.0)，45％ 的高糖，10℃的低温下均能正常生长，说明该酵母具有良好的耐受性，能够应 对冰酒发酵过程中的各种不利条件。除此之外，该酵母低产硫化氢，发酵活力 高，具备良好的发酵性能。综上所述，酿酒酵母菌株CECA 10具备发酵冰酒的 基本性能。

表1酿酒酵母菌株CEC A10的基本特性

^a：根据菌落颜色可分为以下六个等级：1-白色、2-浅棕褐色、3-棕褐色、4-浅褐色、5-褐色和 6-黑色，对应H₂S产量从低产到高产。

实施例2、酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10与商业酵母EC1118酿酒效果对比实验

在本实施例中，将酿酒酵母菌株CEC A10和EC1118分别接种于1.5L的威 代尔冰葡萄汁(412.76±2.15g/L糖、总酸11.07±0.14g/L,pH值3.26±0.01)中， 14～16℃下静置发酵。酵母菌株接种于YEPD培养基中培养24小时，然后转接 于100mL的葡萄汁中培养，作为种子液。最终，酵母细胞按照6×10⁶cells/mL 的接种量接种于装有1.5L威代尔冰葡萄汁的2L玻璃罐中，SO₂的浓度为60 mg/L，用多层纱布封口覆盖，置14～16℃下发酵。发酵过程中，每24h监测葡 萄汁的糖浓度和酒精含量，待酒精含量达到11％(v/v)之后终止发酵。冰酒样品放置在2℃下进行冷稳定，然后沉淀、过滤、装瓶。

发酵结束后，参照国标(GB/T 15038-2006)的方法，测定冰酒的残糖、乙 醇、总酸、挥发酸和pH值等基本理化指标。采用气质联用色谱仪测定冰酒香气 物质含量并组织专业品酒小组进行感官品尝。

香气物质含量测定方法：

香气物质的提取：采用搅拌子吸附萃取方法提取酒样中的香气物质。取10 mL酒样置于15mL样品瓶中，加入2g NaCl，放入搅拌子，密闭样品瓶，置 于磁力搅拌器上，室温下进行萃取，转子转速1100rpm，萃取时间60min。萃 取结束后，用镊子取出搅拌棒，用蒸馏水冲洗直至搅拌棒上无残留样品，然后 用滤纸将水分吸干，最后放入热解析玻璃管，供气相色谱分析用。

香气成分的GC/MS分析：用Agilent 6890气相色谱和Agilent 5975质谱联 用仪(Agilent，美国)检测，并配备有热解吸系统。热解吸程序为：不分流模式， 初始温度为30℃，然后按照60℃/s的速率升温到250℃，保留3min。然后采 用CIS4系统用液氮(-70℃)进行冷却，最后从-70℃以12℃/s的速率升到280℃， 保留5min。色谱柱为DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)，以He为载气，流 速设为1mL/min。升温程序为：40℃保持3min，随后以4℃/min的速率升至 160℃，然后在以7℃/min的速率升温至230℃并保持8min。连接杆温度设为 230℃。质谱条件：EI离子源，离子源温度为230℃，电子能量为70eV，全扫 描范围为30～400amu。标准品为HPLC或GC级别，纯度＞99％，购自Aldrich (美国)和Fluka(瑞士)。所有挥发性化合物均通过质谱比较、标准品保留时间和 NIST05库中的质谱谱图进行定性鉴别。根据各标准品的标准曲线对所有挥发性 化合物进行定量。

感官评价：

组织11名专业品评员分别对两个酵母菌株发酵的冰酒进行感官品尝。这11 名品评员来自西北农林科技大学葡萄酒学院的专业品酒小组(Wine Tasting Panel)。感官品尝按照GB/T 15038-2006进行，感官得分以平均值计。

两个菌株的糖消耗曲线如图3所示。菌株CEC A10的耗糖速率明显快于商 业菌株EC1118，其发酵能力较强。CEC A10发酵周期也较短，接种24天后达 到目标酒度，但是商业菌株EC1118在发酵了26天后才达到目标酒度。两个菌 株发酵的威代尔冰酒的理化指标见表2。可以看出菌株CEC A10和商业菌株 EC1118都可以将威代尔冰葡萄汁发酵到理想的酒度，所得冰酒的各种指标含量 均符合相关国际标准，其中酒度，总酸的含量没有显著性差异。在冰酒中，由 于酵母对高渗透胁迫的应激反应，会代谢产生高含量的乙酸，高浓度的乙酸会 给冰酒的香气带来负面影响，严重影响冰酒的感官质量。因此选择产乙酸少的 酵母对于生产高质量的冰酒非常重要。本实施例中，菌株CEC A10产的挥发酸 含量非常低，只有0.87g/L，显著低于商业菌株EC1118，具有较高的应用价值。

表2酵母菌株酒精发酵后冰酒的理化指标

*表示同一列数据之间具有显著性差异(p＜0.05)。

酿酒酵母的产香能力是影响葡萄酒香气质量的重要因素。分析二者所发酵 的冰酒中主要的33种香气物质的含量(表3)，发现菌株CEC A10所酿造的冰 酒中，有17种物质的含量都显著高于商业菌株酿造的冰酒，说明CEC A10产香 能力较强。其中，酯类物质中，乙酸异戊酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸 乙酯与苹果、香蕉等香气有关，说明CEC A10所酿造的冰酒具有浓郁的果香。β- 乙酸苯乙酯会赋予冰酒优雅的玫瑰花香和蜂蜜香味。高级醇是影响葡萄酒感官 品质的重要代谢物。在本实施例中，菌株CEC A10所产生的异戊醇、1-辛烯-3- 醇、1-庚醇和2-苯乙醇均远远高于商业对照，会赋予冰酒令人愉悦的坚果、蘑菇和玫瑰等香味。CEC A10发酵酒样中萜烯类、降异戊二烯类和酚类含量较高， 有2099.02μg/L，增加了冰酒的香气复杂性。其中，β-大马酮的含量显著高于 商业菌株发酵的酒样，给冰酒带来浓郁的花香。由此可以看出酿酒酵母CEC A10 所酿造的冰酒不仅具有威代尔葡萄品种典型的香气，还具有浓郁的坚果、蘑菇 等复杂香气。

表3酵母菌株酒精发酵后冰酒的香气物质含量

*表示同一行数据之间具有显著性差异(p＜0.05)。

两个菌株发酵的威代尔冰酒的感官评定结果如表4所示。可以看出，两个 菌株发酵的冰酒在外观上没有显著差异，但在香气、口感和典型性上却大有不 同。CEC A10发酵的威代尔冰酒感官品质要显著优于商业菌株EC1118发酵的冰 酒。CEC A10具有发酵优质冰酒的潜力。

表4不同酵母发酵的冰酒的感官品尝结果

本发明提供的酿酒酵母菌株，可制作成活性干酵母，具体制备方法采用现 有工艺即可，例如真空冷冻干燥法。

本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐冰葡萄汁15℃ 自然发酵过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵 活力高，其酿造的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰 酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 575

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

tcacggcatt gcttagtacg gcgagtgagc ggcaaaagct caaatttgaa atctggtacc 60

ttcggtgccc gagttgtaat ttggagaggg caactttggg gccgttcctt gtctatgttc 120

cttggaacag gacgtcatag agggtgagaa tcccgtgtgg cgaggagtgc ggttctttgt 180

aaagtgcctt cgaagagtcg agttgtttgg gaatgcagct ctaagtgggt ggtaaattcc 240

atctaaagct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa gtacagtgat ggaaagatga 300

aaagaacttt gaaaagagag tgaaaaagta cgtgaaattg ttgaaaggga agggcatttg 360

atcagacatg gtgttttgtg ccctctgctc cttgtgggta ggggaatctc gcatttcact 420

gggccagcat cagttttggt ggcaggataa atccatagga atgtagcttg cctcggtaag 480

tattatagcc tgtgggaata ctgccagctg ggactgagga ctgcgacgta agtcaaggat 540

gctggcataa tggttatatg ccgcccgtct tgacc 575

Claims (7)

1.一种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO:16756。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株在冰酒中的应用。

3.如权利要求2所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株在冰酒中的应用，其特征在于：以冰葡萄汁为原料，接种所述酿酒酵母菌株进行发酵，发酵温度为14~16℃。

4.如权利要求3所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株在冰酒中的应用，其特征在于：所述冰葡萄汁为威代尔冰葡萄汁。

5.如权利要求2所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株在冰酒中的应用，其特征在于：所述酿酒酵母菌株酿造的冰酒的挥发酸含量小于1 g/L。

6.一种提高冰酒香气复杂度的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株发酵冰葡萄汁。

7.一种活性干酵母，其特征在于，由如权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC A10菌株制得。

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