CN106916758A - 一种汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄酒生产技术领域，尤其涉及一种汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用，该菌种与酿酒酵母共同用于葡萄酒的发酵，能够使所得葡萄酒中，香气物质的含量却得到大幅增加，葡萄酒的香气品质得到提升，改善了酿酒酵母纯种发酵香气单一的现象，使葡萄酒香气更为复杂，有层次感。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄酒生产技术领域，尤其涉及一种汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。
背景技术
香气是决定葡萄酒品质的关键因素，其产生是多种化合物相互作用的结果，主要来源有三个：葡萄果实的品种香气，发酵微生物代谢产生的发酵香气以及在陈酿期间所产生的陈酿香气。其中发酵香气是一个极为重要的过程，有多种酵母菌株(包括酿酒酵母和非酿酒酵母)的参与，它们不仅仅将葡萄果实中的葡萄糖转化为酒精，同时还产生了许多对葡萄酒最终的口感和香气有重大贡献的复杂代谢产物，决定了葡萄酒的最终品质。因此，越来越多的学者开始着眼于菌种资源的开发，以期找到优良的酵母来提升葡萄酒的品质。
近些年，澳大利亚、南非、美国等葡萄酒生产国开始利用筛选出的本土酿酒酵母菌进行纯种发酵，这样不但可以提高生产效率，更为重要的是这些本土酵母菌株能够产生一些凸显产地葡萄酒独特感官特征的风味物质，从而赋予当地葡萄酒独特的质量和风格。而随着研究的深入，人们发现除了代谢特性迥异的酿酒酵母，非酿酒酵母在葡萄酒发酵过程中也表现出来很好的酿造潜力。
非酿酒酵母菌存在于葡萄园土壤、葡萄表皮以及葡萄酒酿造环境中，包括葡萄酒酿造厂房、容器等，它能够产生大量的甘油、酯类等代谢产物，并且能够产生一些酶将葡萄酒中的香气前体物质分解从而释放出香气物质，对葡萄酒的风味产生积极影响。在葡萄酒发酵过程中，非酿酒酵母可以产生果胶酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶等，使其具有一定的胞外酶活性，这些酶作用于葡萄汁中的相关底物中，进而影响葡萄酒的组成成分及风味物质。
虽然非酿酒酵母对葡萄酒风味的影响已经引起了广泛的关注，但是其在葡萄酒酿造中的应用尚处于起步阶段，具体的混合发酵使用菌株和发酵工艺条件仍亟待开发。因此深入了解冰酒酿造过程中非酿酒酵母菌株数量和种类的变化趋势、代谢模式及其与酿酒酵母的相互作用，量身制定出适宜的发酵条件，充分利用混合菌种或顺序发酵等多种方式，最大限度地发挥其优势，减小潜在缺点，酿造出优质葡萄酒已成为目前行业发展的趋势。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的仙人掌有孢汉逊酵母适用于冰葡萄酒的酿造，其与酿酒酵母配合能够提高葡萄酒中脂类和萜烯类香气物质的含量。
本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母。
本发明从威代尔冰葡萄汁自然发酵过程中筛选得到了一株非酿酒酵母，经种质鉴定其属于仙人掌有孢汉逊酵母(Hanseniasporaopuntiae)，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.13712。经检测，该菌种能够具有良好的高渗耐受性，和低温耐受性，糖苷酶产量也较高。
本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母以YPD基质进行保藏，保藏于-80℃。
本发明还提供了一种复合菌种，包括酿酒酵母和保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母。
本发明中，酿酒酵母为保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母。
一些实施例中，酿酒酵母与保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母的数量比为1：(9～10)。
一些具体实施例中，酿酒酵母与保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母的数量比为1：10。
本发明筛选得到的汉逊酵母并非酿酒酵母，其自身难以单独完成发酵任务，但实验表明，其与酿酒酵母共同用于葡萄酒的发酵时，并不会影响酿酒酵母的生长变化趋势，但所得葡萄酒中，香气物质的含量却得到大幅增加，葡萄酒的的香气品质得到提升，改善了酿酒酵母纯种发酵香气单一的现象，使葡萄酒香气更为复杂，有层次感。
本发明所述的复合菌种在葡萄酒酿造中的应用。
一些实施例中，葡萄酒为冰葡萄酒。
一些具体实施例中，冰葡萄酒为威代尔冰葡萄酒。
冰葡萄酒(又称冰酒)是以葡萄树上自然结冰的葡萄为原料，采用特殊工艺酿造而成的一种甜型葡萄酒。由于经历了生理后熟和自然冷冻过程，达到葡萄自然脱水且葡萄汁得到浓缩，因此酿制而成的冰葡萄酒具有不同于一般葡萄酒的特殊、浓郁的香气。
本发明提供了一种葡萄酒的酿造方法为：以酿酒酵母和保藏编号为CGMCCNO.13712的汉逊酵母为菌种，对葡萄汁进行酒精发酵；所述酒精发酵的温度为16℃，发酵至比重不高于1.1。
具体的，本发明提供的葡萄酒的酿造方法为：
以葡萄汁分别活化酿酒酵母与保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母；
将活化后的酿酒酵母和保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母接种于葡萄汁，16℃发酵至比重不高于1.1。
所述活化包括一级活化和二级活化。
所述一级活化采用Brix为19°～20°的经巴氏灭菌(90℃，15min)的葡萄汁。28℃活化至菌体生长进入对数期进行二级活化。
所述二级活化采用糖浓度为413g/L的含有20ppm SO2的葡萄汁。28℃活化至菌体生长进入对数期进行发酵。
本发明中，酿酒酵母先于保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母2天接种。
本发明实验表明，将酿酒酵母与保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母混合发酵能够改善葡萄酒的香气品质，而其他理化指标则不受影响。相对两菌同时接种或间隔4天接种而言，先接种酿酒酵母，而后间隔2天在接种保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母所得葡萄酒中香气物质更加丰富，使冰葡萄酒香气更为复杂，有层次感。该效果具有统计学意义(p<0.05)。
本发明中，酿酒酵母的接种密度为106cfu/mL；所述保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母的接种密度为107cfu/mL。
本发明中，酿酒酵母为保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母；所述葡萄汁为冰葡萄汁。所述冰葡萄汁为威代尔冰葡萄汁。
一些实施例中，待发酵液初始数据为初糖浓度420g/L，二氧化硫浓度60mg/L，比重1.174。
静置发酵至比重为1.085，时间共28天，发酵后，糖含量为66.37g/L～69.58g/L。
以本发明提供酿造方法酿得的葡萄酒。
以本发明提供酿造方法酿造得到的葡萄酒基本理化指标均在国标控制范围内，酒精度≥11％v/v，挥发酸约为1.65g/L≦2.1g/L，且符合GB/T 25504-2010对冰葡萄酒酿酒微生物相关的各项指标要求。
从挥发性香气成分角度来看，保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母参与的混合发酵方式酿得的葡萄酒中共检测得到OAV值>1的香气物质16种，有效的改善冰酒香气，增加冰酒的香气的强度和复杂性，其酿得的葡萄酒中乙酸苯乙酯和辛酸乙酯的含量得到显著提高，增强了酒中甜水果气味；除此之外，混合发酵所得葡萄酒中萜烯类物质的总量显著高于酿酒酵母发酵的葡萄酒(p<0.05)，是商业酿酒酵母XR纯种发酵的2.36倍，其中β-大马士酮增产最为显著，高达2034.88(OAV值)，为商业酿酒酵母XR产量的2.54倍，而β-大马士酮作为威代尔冰酒中重要的香气化合物，可以带来愉悦的甜木香、果香以及蜂蜜味，进一步改善了冰酒香气品质。
本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用，该菌种与酿酒酵母共同用于葡萄酒的发酵，能够使所得葡萄酒中，香气物质的含量却得到大幅增加，葡萄酒的的香气品质得到提升，改善了酿酒酵母纯种发酵香气单一的现象，使葡萄酒香气更为复杂，有层次感。
附图说明
图1示发酵过程中两菌的生物量变化；其中，图1-a示保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母菌(N)单独发酵的生物量变化，和商业酿酒酵母XR(XR)单独发酵的生物量变化；图1-b示保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母菌株(N)与保藏编号为CGMCC No.13712的汉逊酵母(Y)同时接种共同发酵的生物量变化；图1-c示保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母菌株(N)与保藏编号为CGMCC No.13712的汉逊酵母(Y)间隔2天接种共同发酵的生物量变化；图1-d示保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母菌株(N)与保藏编号为CGMCCNo.13712的汉逊酵母(Y)间隔4天接种共同发酵的生物量变化；
图2示不同发酵方式发酵过程中比重的变化。
生物保藏说明
生物材料CVE-HO11，分类命名：仙人掌有孢汉逊酵母Hanseniaspora opuntiae，于2017年2月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.13712。
具体实施方式
本发明提供了一种汉逊酵母及其在葡萄酒酿造中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
对筛选得到的保藏编号为CGMCC NO.13712汉逊酵母的特性进行检测，以保藏编号为CGMCC NO.12349的酿酒酵母为对照，具体检测方法如下。
(1)高渗耐受性筛选：通过含糖量的差异来造成渗透压的差异。通过加入葡萄糖将葡萄汁含糖量调整到400g\L。含糖量的测定通过菲林试剂的方法。每株菌种需要葡萄汁10-20ml。测OD600值来检测酵母的生长情况。葡萄汁在使用前必须灭菌，从而保证单菌种发酵。葡萄汁灭菌需要72摄氏度，10分钟。
(2)硫化氢产量筛选：使用BIGGY agar培养基，从已经培养好分离好的单菌落中挑取少许到BIGGY培养基中，经过30℃，5天的培养，观察培养基的颜色来判断菌种产生硫化氢的情况。
(3)SO2耐受性筛选：通过亚硫酸钾的分解从而在葡萄汁中加入二氧化硫。每克亚硫酸钾的分解产生0.56g二氧化硫。设定的葡萄汁中二氧化硫的浓度分别为0，25，50，100，150ppm。每株菌种大约需要葡萄汁10ml。葡萄汁在使用前必须灭菌。每隔24h要通过OD600值来测定生长情况。一共测定5天。培养温度25摄氏度。
(4)糖苷酶活性筛选：1.将待筛菌株活化：从保藏管中吸取约1mL的菌液，放入约7mL的YPD培养基中，30℃摇床活化1d左右。2.消耗多余的糖：从活化后的菌液中吸取1mL加入到无碳源的YNB培养基中，在30℃的条件下摇床培养约6h，直至将残糖消耗完。3.转接到YNB培养基(0.67％YNB,0.5％纤维二糖,2％琼脂)：菌液5μL加入到YNB培养基中，置于30℃下，培养24-48h。4.观察：观察平板看菌的生长状况，评判标准是：生长状况越好代表其糖苷酶活性越强。
(5)低温耐受性筛选：将菌种培养在葡萄汁中，然后至于10℃的培养箱中培养，通过测定OD值来检测菌种的生长情况。每株菌种需要葡萄汁10～20ml。葡萄汁在使用前必须灭菌。每24h测定一次OD值。培养5天。
表1酵母基本特性的研究
实施例2
首先，取适量威代尔冰葡萄汁稀释至Brix约为19°～20°后进行巴氏灭菌(90℃，15min)。将保存于-80℃的保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母、商业酿酒酵母XR以及保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母接种于上述已灭菌葡萄汁中进行一级扩大培养，待菌体进入对数生长期后转接至二级扩培葡萄汁(不经稀释，糖浓度413g/L，未巴氏灭菌，预先加入20ppm SO2)中，待菌体生长至对数期后留作种子液备用。
然后按照酿酒酵母106cfu/mL，非酿酒酵母107cfu/mL的接种量分别接种于装有45L威代尔冰葡萄汁的小型发酵罐(50L)，共设5个实验组，每组重复两次，分别为：
保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母单独发酵；
商业酿酒酵母XR单独发酵；
保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母与保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母同时接种发酵(Y/N(0d))；
保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母与保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母间隔2d接种发酵(Y/N(2d))；
保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母与保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母间隔4d接种发酵(Y/N(4d))。
记录待发酵液初始数据为初糖浓度420g/L，二氧化硫浓度60mg/L，比重1.174。各发酵罐以液封栓封口，16℃条件下静置培养28d，至比重降至1.085左右终止发酵，酿造得到冰酒。
按照下述方法分析不同菌株以及不同发酵方式下的威代尔冰葡萄酒的酿造特性：
(1)发酵速率：比重计法，测定比重下降速率
(2)乙醇：试剂盒法，乙醇测定试剂盒(Megazyme公司，爱尔兰)
(3)果糖：试剂盒法，果糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)
(4)乙酸、甘油：液相色谱法(GB/T 15038-2006)酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent 5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60m×0.25mm×0.25μm(J&W scientific，美国)载气为高纯氦气，流速1mL/min；顶空固相微萃取自动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70ev，质量扫描范围20-450amu(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)
不同菌株以及不同发酵方式下的威代尔冰葡萄汁中酿造特性比较结果见图1～2、表1及表2。
(1)不同发酵方式下细胞生长和发酵速率曲线如图1～2所示。
本发明选用比重变化来描述冰葡萄酒的发酵进程，从比重下降曲线可以看出，发酵前16d商业酿酒酵母XR的发酵速率最快，直至16d后Y/N(4d)实验组呈现出更快的比重下降趋势，并在发酵进行到第23d时比重下降至1.085，提前结束了酒精发酵；保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母、Y/N(0d)及Y/N(2d)三者比重下降曲线呈现相同的变化趋势，发酵速率虽然不及商业酿酒酵母，但均在28d内完成了酒精发酵任务。由菌群变化图可知，保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母与商业酿酒酵母呈现相同的菌群变化趋势，虽然达到的生物最大量上略有差异，但结合比重下降曲线仍证明了保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母的强发酵活力；而与纯种发酵相比，混合发酵方式下保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母仅在菌数最大值上存在差异，其生长变化趋势并未受到不同接种方式的影响，均在接入后的第12d结束对数生长期，菌数达到最大；除此之外，不管采取同时接种或者顺序接种方式的混合发酵中，保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母均在第8d时达到生物最大量，在13d后开始直线下降至酒精发酵结束。其中值得注意的是，Y/N(4d)的混合发酵方式下，保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母达到的菌数最大值为3.58×107cfu/mL高于其他实验组。上述结果表明，与商业酿酒酵母相比，保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母及保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母参与的混合发酵方式均表现出很好的酿造潜力。
(2)酒精发酵结束后各冰葡萄酒样的理化指标比较，见表2所示：
表2各实验组酒精发酵后葡萄酒样的理化指标
注：表中同行肩标不同字母代表存在显著性差异，p<0.05
(3)酒精发酵结束后各冰葡萄酒样主要挥发性香气成分种类和OAV值的比较，如表3所示。
表3各实验组酒精发酵后葡萄酒样的香气物质(OAV值>1)
注：表中同行肩标不同字母代表存在显著性差异，p<0.05
为进一步分析采用不同菌株和不同混合发酵方式对冰葡萄酒品质的影响，我们对发酵得到的成品酒样进行了各项理化指标的检测以及挥发性香气物质种类和含量的测定。由表1数据可知，各发酵实验组的基本理化指标均在国标控制范围内，酒精度≥11％v/v，挥发酸约为1.65g/L≦2.1g/L，且符合GB/T 25504-2010对冰葡萄酒酿酒微生物相关的各项指标要求，其中Y/N(2d)发酵方式下甘油的生成量最大，为10.16g/L。从挥发性香气成分角度来看，保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母参与的混合发酵方式能够有效的改善冰酒香气，增加冰酒的香气的强度和复杂性，如表2所示，与商业酿酒酵母XR(OAV值为766.06)相比，保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母纯种发酵及Y/N(2d)混合发酵的总酯OAV值最高，依次为910.47、838.61，显著提高了冰酒中乙酸苯乙酯和辛酸乙酯的含量，增强了酒中甜水果气味；除此之外，Y/N(2d)顺序接种混合发酵方式具有高产萜烯类物质的特性，其萜烯类物质的总量远高于其他实验组，是商业酿酒酵母XR纯种发酵的2.36倍，保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母纯种发酵的2.01倍，其中β-大马士酮增产最为显著，高达2034.88(OAV值)，为商业酿酒酵母XR产量的2.54倍，而β-大马士酮作为威代尔冰酒中重要的香气化合物，可以带来愉悦的甜木香、果香以及蜂蜜味，进一步改善了冰酒香气品质。
综上所述，保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母具有良好的冰酒酿造应用前景，将其与保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母进行的混合发酵应用于冰酒发酵生产，不仅可以代替商业酿酒酵母顺利完成酒精发酵任务使之符合国家标准，同时又能够提升冰酒的香气品质，改善了酿酒酵母纯种发酵香气单一的现象，使冰葡萄酒香气更为复杂，有层次感，尤其以保藏编号为CGMCC No.13712汉逊酵母与保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母间隔2d接种的混合发酵方式作用最为显著。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母。
2.一种复合菌种，其特征在于，包括酿酒酵母和保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母。
3.根据权利要求2所述的复合菌种，其特征在于，所述酿酒酵母为保藏编号为CGMCCNo.12349的酿酒酵母；所述酿酒酵母与保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母的数量比为1：(9～10)。
4.权利要求2所述的复合菌种在葡萄酒酿造中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述葡萄酒为冰葡萄酒。
6.一种葡萄酒的酿造方法，其特征在于，以酿酒酵母和保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母为菌种，对葡萄汁进行酒精发酵；所述酒精发酵的温度为16℃，发酵至比重不高于1.1。
7.根据权利要求6所述的酿造方法，其特征在于，所述酿酒酵母先于保藏编号为CGMCCNO.13712的汉逊酵母2天接种。
8.根据权利要求6所述的酿造方法，其特征在于，所述酿酒酵母的接种密度为106cfu/mL；所述保藏编号为CGMCC NO.13712的汉逊酵母的接种密度为107cfu/mL。
9.根据权利要求6～8任一项所述的酿造方法，其特征在于，所述酿酒酵母为保藏编号为CGMCC No.12349的酿酒酵母；所述葡萄汁为冰葡萄汁。
10.权利要求6～9任一项所述酿造方法酿得的葡萄酒。
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| CN114854609B (zh) * | 2022-05-13 | 2023-08-25 | 江南大学 | 一株能增加红枣乳酸菌饮料发酵香气的葡萄汁有孢汉逊酵母及其应用 |
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