CN103045487B

CN103045487B - 一株生产柠檬酸的菌株及其发酵生产柠檬酸的方法

Info

Publication number: CN103045487B
Application number: CN201210510660.5A
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 穆晓玲; 李维理; 常珠侠
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN103045487A

Abstract

本发明涉及一种高温液体发酵生产柠檬酸的黑曲霉菌株FYCA8561，其保藏编号为CGMCC No.6466，本发明还提供了利用该菌株发酵生产柠檬酸的方法，利用该方法生产的柠檬酸在发酵高峰期降温水需求量低、节约能源，尤其在夏季高温季节优势特别突出，能够显著降低降温水的使用量。

Description

一株生产柠檬酸的菌株及其发酵生产柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体地说，涉及一株高温发酵生产柠檬酸的菌株以及利用该菌株发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术

黑曲霉属半知菌亚门、丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中一个常见种，广泛分布于世界各地，是传统的制酱、酿酒、制醋的主要菌种，也是现代发酵工业中重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等产品。

天然柠檬酸在自然界中分布很广。在植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中都含有柠檬酸。1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸，通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。柠檬酸的生产方法有水果提取法、化学合成法和生物发酵法等。水果提取法是指从柠檬、桔子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取，成本较高，不利于工业化生产，而化学合成法主要利用丙酮、二氯丙酮或乙烯酮，工艺复杂、成本高，安全性低。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年C.韦默尔发现青霉(属)菌能积累柠檬酸。1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。现在柠檬酸工业中普遍采用的发酵温度为37℃，由于在发酵过程中产生大量的发酵热，使得夏季尤其是南方地区，发酵温度控制较为困难，降温水用量大，能耗高。迫切需要一种能够有效降低降温水用量的生产柠檬酸的方法，以节约能耗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高温环境下发酵生产柠檬酸的菌株。

本发明的另一目的在于提供利用该菌株高温发酵生产柠檬酸的方法。

本发明提供了一株能够发酵生产柠檬酸的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株FYCA8561，其保藏编号为CGMCC No.6466。

该菌株已于2012年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为黑曲霉，拉丁文名Aspergillus niger，保藏号为CGMCC No.6466。

本发明提供了含有黑曲霉菌株FYCA8561的菌剂。

本发明还提供了黑曲霉菌株FYCA8561在利用淀粉质原料发酵生产柠檬酸中的应用。

本发明提供一种高温发酵生产柠檬酸的方法，含有以下步骤：

(1)将菌株FYCA8561经平板或斜面扩大培养；

(2)FYCA8561孢子接入麸曲种子培养基中，培养得到麸曲孢子；

(3)将麸曲孢子接种于种子培养基中，培养种子；

(4)将培养好的种子接入发酵培养基中进行高温发酵培养，发酵生产出柠檬酸发酵液，发酵液经过分离提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸结晶。

其中，步骤(1)所述的平板或斜面为麦芽汁琼脂平板或麦芽汁斜面培养基。其中，步骤(2)所述的麸曲种子培养基为将麸皮按35％～45％的质量百分比用自来水配制，培养条件为36～40℃。

进一步地，步骤(2)的培养条件为36～38℃。

更进一步地，步骤(2)的培养条件为37℃。

其中，步骤(3)所述的种子培养基为：玉米粉按10％～15％的质量百分比用自来水配制，1L种子培养基中加α-淀粉酶0.1～0.5mL进行液化后，使含糖量达到8％～12％，进入种子罐中灭菌。

优选地，所述种子培养基中含糖为10％。

其中，步骤(3)培养条件为36～40℃，通风培养20～30h。

进一步地，步骤(3)培养条件为36～38℃，通风培养22～26h。

更进一步地，步骤(3)培养条件为37℃，通风培养24h。

其中，步骤(4)所述的发酵培养基为玉米粉按15％～20％的质量百分比用自来水配制；1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.1～0.5mL进行液化后，使含糖量达到13％～17％，在发酵培养基中添加质量百分比0.05％～0.2％硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵条件为36～40℃，通风比为1∶0.3～0.5，搅拌转速为200～450r/min，培养时间60～90h。

优选地，所述发酵培养基中含糖15％。

进一步地，步骤(4)的发酵条件为38～41℃，通风比为1∶0.3～0.5，搅拌转速为250～350r/min，培养时间65～80h。

更进一步地，步骤(4)的发酵条件为40℃，通风比为1∶0.3，搅拌转速为300r/min，培养时间72h。

其中，步骤(4)的发酵液可以经过提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸结晶。

本发明提供了一种高温发酵生产柠檬酸的菌株，其为黑曲霉FYCA8561，此菌株已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.6466。并提供了采用该株黑曲霉为生产菌株高温液体发酵生产柠檬酸的方法。使用本发明中保藏的菌株及公开的发酵培养方法发酵生产柠檬酸时，菌株性能稳定。300m³发酵罐64小时发酵产酸达到14.7％，转化率95％，粮耗为1.75T/T，与现有技术的发酵产酸率、转化率和生产周期相比，在上述各方面均取得了预料不到的技术效果，可望大规模用于生产，进一步降低生产成本和周期、提高产率，并大幅度降低了降温用水量，节约能源，尤其在夏季高温季节优势特别突出，因而有重要的市场前景。

附图说明

图1为黑曲霉FYCA8561菌株发酵温度为40℃时醪液HPLC色谱图。

图2为黑曲霉菌株FYCA2358发酵温度为40℃时醪液HPLC色谱图。

图3为发酵罐发酵温度为37℃、40℃时降温水用量比较。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例包括说明书中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比。

实施例1菌株诱变和分离

1、菌株驯化

以黑曲霉FYCA2358(来自丰原发酵技术工程研究有限公司)为出发菌，经进行⁶⁰Co^γ射线及亚硝基胍复合诱变获得一株柠檬酸高温液体发酵菌株。其诱变过程如下：

1)菌悬液的制备

将出发菌株的孢子转接与麦芽汁斜面上于37℃培养7～8d，长好孢子后，用生理盐水将孢子洗下，转入小三角瓶中，用玻璃珠震荡打散，然后通过脱脂棉过滤，滤液即为单孢子悬浮液。

2)⁶⁰Coγ射线诱变处理

将黑曲霉的菌悬液10ml置于50ml比色管中，将该比色管置于⁶⁰Coγ射线下照射，剂量为1200Gy，照射后的孢子悬浮液梯度稀释，取0.05ml涂平板。

3)亚硝基胍诱变处理

将亚硝基胍配制成0.1mg/ml的丙酮溶液，将孢子悬浮液0.9ml于37℃恒温水浴中预热5min，加入0.1ml浓度的2mg/ml的亚硝基胍溶液，在水浴中保温处理30min，取出后以3000r/min离心分离，弃去上清液，用预先冷却的无菌生理盐水进行洗涤离心15次，用生理盐水定容至1ml后，进行平板分离。

4)挑出目的菌落。成熟时菌落中央稍微隆起，出现绒毛状覆盖物；分生孢子梗短分生孢子头大，圆形黑色，老熟时开花状；次生小梗少，大部分不分枝，同时，对该菌株进行了生理生化鉴定，确定为黑曲霉。

最终得到一株产柠檬酸的黑曲霉突变株FYCA8561，它能利用淀粉质原料在40℃发酵生产柠檬酸。该菌株已于2012年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为黑曲霉，拉丁文名Aspergillusniger，保藏号为CGMCC No.6466。

另保藏菌株FYCA8561于斜面试管中备用。

实施例2麸曲瓶、种子罐、发酵罐不同的培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸影响

利用黑曲霉FYCA8561进行发酵生产柠檬酸的步骤如下：

1.平板或斜面培养：将柠檬酸产酸菌黑曲霉FYCA8561接种到麦芽汁琼脂平板上培养；

2.麸曲培养：将培养后的柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561斜面上钩一环孢子接入麸曲种子培养基中(配方为将麸皮按35％质量百分比用自来水配制，并灭菌)；在麸曲瓶中进行培养。

3.种子培养：种子培养基的配制：玉米粉按10％的质量百分比用自来水配制。

1L种子培养基中加α-淀粉酶0.2mL进行液化后，使含糖量达10％，置于种子罐中灭菌后。再于灭菌后的种子培养基中接入麸曲孢子，在种子罐中进行种子培养；

4.50L发酵罐发酵培养：最后将培养好的种子罐液体种子接入发酵培养基中。本实施例的发酵培养基配方为：玉米粉按15％的质量百分比用自来水配制；1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.3mL进行液化后，使含糖量达到15％，在发酵培养基中添加质量百分比0.1％硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵通风比为1∶0.3，搅拌转速为300r/min。

将柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561进行上述操作后，不同的培养温度对产酸影响见表1。

表1不同的培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸的影响

实施例3不同发酵罐培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸的影响

利用黑曲霉FYCA8561进行发酵生产柠檬酸的步骤如下：

1.平板或斜面培养：将柠檬酸产酸菌黑曲霉FYCA8561接种到麦芽汁琼脂斜面培养基上培养；

2.麸曲培养：将培养后的柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561斜面上钩一环孢子接入麸曲种子培养基中(配方为将麸皮按45％质量百分比用自来水配制，并灭菌)；在麸曲瓶中进行培养。

3.种子培养：种子培养基的配制：玉米粉按15％的质量百分比用自来水配制。

1L种子培养基中加α-淀粉酶0.2mL进行液化，液化后，使含糖量达12％，置于种子罐中灭菌后。再于灭菌后的种子培养基中接入麸曲孢子，在种子罐中进行种子培养；

4.发酵罐发酵培养：将培养好的种子罐液体种子接入发酵培养基中。本实施例的发酵培养基配方为：玉米粉按20％的质量百分比用自来水配制；1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.2mL进行液化，液化后，使含糖量达到17％，在发酵培养基中添加0.2％硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵通风比为1∶0.5，搅拌转速为450r/min。

将柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561进行上述操作。麸曲瓶、种子罐均采用37℃培养，发酵罐采用不同的培养温度，其对黑曲霉FYCA8561产酸影响见表2。

表2不同的发酵罐培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸的影响

实施例4不同的发酵罐培养温度对两种黑曲霉产酸的影响

将柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561、黑曲霉FYCA2358(为现有技术中使用的发酵生产柠檬酸的出发菌株，由安徽丰原集团分离并保存。)进行上述操作。黑曲霉FYCA8561采用优化后的培养条件，即麸曲瓶培养温度为37℃，种子罐37℃，发酵罐温度40℃。黑曲霉FYCA2358麸曲瓶、种子罐均采用37℃培养，发酵罐采用不同的培养温度对产酸影响见表3。

表3不同的发酵罐培养温度对两种黑曲霉产酸的影响

实施例5发酵液组分检测

HPLC检测发酵液组份

1、发酵液样品处理：取适量发酵液于离心管中，1000rpm室温离心5分钟去细胞及沉淀，取上清稀释至合适浓度，超声波除泡，过滤膜过滤除杂质后，做高效液相色谱测定各组分含量。

2、发酵液组分测定：采用高效液相色谱测量发酵液中各组分含量。色谱条件按以下条件，色谱仪：Agilent 1200HPLC高效液相色谱；色谱柱：87H3型离子交换色谱柱；色谱柱温：60℃；流动相：4mmol/L H2SO4；流速：0.3mL/min；检测器：示差折光检测器；进样量：25μL/次。

3、外标测各组份含量：黑曲霉FYCA8561菌株发酵温度为40℃时醪液HPLC色谱图见图1；黑曲霉FYCA2358菌株发酵温度为40℃时醪液HPLC色谱图见图2。

实施例6300立方生产罐扩大培养

将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA8561孢子在无菌状态下接种到麸皮培养基(将麸皮按质量百分比为40％用自来水配制，灭菌)中。将麸皮培养基在37℃培养，待三角瓶中长满黑色孢子即为培养结束。将麸曲孢子接入灭菌后的种子培养基(配方见实施例3)中。待液体种子培养结束后，接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配方为：玉米粉按17％的质量百分比用自来水配制；1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.2mL进行液化，液化后，使含糖量达到15％，在发酵培养基中添加质量百分比0.05％硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加0.1％硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为40℃，通风比为1∶0.5，搅拌转速为300r/min，培养60小时，pH值不控制。可发酵性还原糖基本耗完(即还原糖≈0)后放罐。同时设黑曲霉FYCA2358按照相同方法发酵生产柠檬酸作为对照。

在扩大培养情况下，黑曲霉FYCA8561在300m³发酵罐64小时发酵产酸达到14.7％，转化率95％，粮耗为1.75T/T。与使用黑曲霉FYCA2358发酵生产柠檬酸相比，降温水用量下降20％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详细的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种高温发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于，含有以下步骤：

(1)将保藏编号为CGMCC No.6466的黑曲霉菌株FYCA8561经平板或斜面扩大培养；所述黑曲霉菌株能够在高温环境下发酵生产柠檬酸，所述黑曲霉菌株成熟时菌落中央稍微隆起，出现绒毛状覆盖物；分生孢子梗短分生孢子头大，圆形黑色，老熟时开花状；次生小梗少，大部分不分枝；

(2)将FYCA8561孢子接入麸曲种子培养基中，培养得到麸曲孢子，培养温度为37℃；

(3)将麸曲孢子接种于种子培养基中，培养种子，培养温度为37℃；

(4)将培养好的种子接入发酵培养基中进行高温发酵培养，发酵生产出柠檬酸发酵液，发酵液经过分离提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸结晶，培养温度为40℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的平板或斜面为麦芽汁琼脂平板或麦芽汁斜面培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的麸曲种子培养基为麸皮按35％～45％的质量百分比用自来水配制，培养条件为37℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的种子培养基为：玉米粉按10％～15％的质量百分比用自来水配制，1L种子培养基中加α-淀粉酶0.1～0.5mL进行液化后，使含糖量达到8％～12％，进入种子罐中灭菌。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)培养条件为37℃通风培养20～30h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的发酵培养基为玉米粉按15％-20％的质量百分比用自来水配制，1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.1～0.5mL进行液化后，使含糖量达到13％～17％，在发酵培养基中添加质量百分比0.05％～0.2％硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵条件为40℃，通风比为1:0.3～0.5，搅拌转速为200～450r/min，培养时间60～90h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中通风比为1:0.3，搅拌转速为300r/min，培养时间72h。