CN103695319B - 一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产柠檬酸的菌株，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus？niger），已于2013年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CGMCC？No.8368。本发明还提供该菌株的获取方法及其生产柠檬酸的方法。通过对黑曲霉进行选育驯化，筛选出具有较强的中和废水耐受力，且不影响正常发酵产酸能力的菌株，并利用其特性在柠檬酸发酵生产过程中使用中和废水替换自来水，在保证其产酸水平的前提下，达到降低生产成本，减少环境污染的目的。

Description

一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。
现有技术中，柠檬酸普遍采用钙盐提取法从柠檬酸发酵液中获得。然而，由于柠檬酸生产工艺固有的特点，生产过程中产生的高浓度废水巳成为该行业发展的制约因素。柠檬酸生产过程排放的高浓度废水主要来自中和、洗糖以及离子交换剂再生工段，其中中和废水排放量最大。行业统计数据表明，每生产1吨柠檬酸，中和废水的排放量达10-15m3，这给环境带来污染，并提高了环保费用。因此，如何利用这些中和废水，成为目前柠檬酸生产企业急需解决问题之一。
目前，柠檬酸中和废水的回收利用主要采取碱沉淀和酸中和预处理措施后，直接用于发酵配料。但其中色素物质脱除难度大，成本高，其结果始终不是十分理想，因此，寻找一种简单方便，成本低廉的柠檬酸中和废水利用方法，对柠檬酸企业具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的是通过对现有黑曲霉进行驯化，获得一种更耐柠檬酸中和废水的新的菌株，并利用该菌株发酵生产柠檬酸。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种生产柠檬酸的菌株，其分类命名为黑曲霉（Aspergillusniger），已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.8368。
本发明还提供了上述生产柠檬酸的菌株的筛选方法，具体步骤如下：
（1）菌种分离纯化：以黑曲霉（Aspergillusniger,保藏号CGMCCNO.6465）作为出发菌株，将其稀释分离，涂布到平板培养基上，于36℃±1℃培养36～48h；
（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）分离纯化后的单菌落分别接种于试管斜面培养基，于36℃±1℃培养4～6d；
（3）菌种发酵培养：将步骤（2）中试管斜面培养好的单菌落用接种环勾取1～2环成熟孢子接入发酵摇瓶，于36℃±1℃，摇床转速300～350rpm/min，培养80～100h;
（4）初筛：将步骤（3）摇瓶发酵液过滤，用0.1429mol/l的NaOH对滤液进行滴定，通过测得发酵液产酸水平，初筛柠檬酸产量高的菌株进行复筛;
（5）复筛：将步骤（4）筛选出的菌株重复步骤（1）～（4）的过程，直至筛选得到产酸量达到14%的菌株。
在上述筛选方法中，步骤（1）所述平板培养基和步骤（2）所述斜面培养基均为PDA土豆培养基，其质量百分数组分为：土豆汁10%～15%、葡萄糖1%～5%、琼脂1.5%～2.5%，且使用未经任何处理过的中和废水配制。
本发明所述中和废水为钙盐法提取柠檬酸发酵工艺中，柠檬酸发酵液经过板框压滤进入中和工段进行中和反应后所产生的中和废水，其中含有：Ca离子200～500ppm、K离子600～1000ppm、Mg离子100～200ppm、Fe离子10～30ppm、Na离子30～60ppm、Zn离子10～30ppm、硫酸根离子200～500ppm、氯离子30～60ppm、NH4离子10～40ppm；以及少量的柠檬酸和无机氮源，pH为4.5～5.5。
在步骤（3）中，所述发酵培养基是由淀粉质原料调浆至粉浆比15-30%，加入α-淀粉酶，经液化，过滤，以滤液为基料，利用柠檬酸中和废水配制总糖含量为0.13g/ml～0.18g/ml的培养基；
其中，所述淀粉质原料包括玉米、木薯或高粱中一种或两种以上。为了获得更好的菌株，还可以在发酵培养基中添加常规氮源，所述氮源优选为无机氮源，如硫酸铵和或尿素等。
经过上述方法获取的菌株能够对中和废水产生足够的耐受力而不影响柠檬酸产量。
本发明还提供了上述生产柠檬酸的菌株生产柠檬酸的方法，具体步骤如下：
（1）扩大培养：将上述方法获得的菌株接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间4～6d；将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间5～8d；
（2）孢子悬液的制备：将步骤（1）培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为2×1010～5×1010，无菌条件下将孢子悬液倒入钢瓶备用；
（3）种子罐培养：将步骤（2）中所得到的孢子悬液接入柠檬酸种子罐进行培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速100～400rpm/min，培养周期为18～30h；
（4）发酵罐培养：将步骤（3）种子液按接种量5-10%接入发酵罐进行发酵培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速80～500rpm/min，培养周期为72～96h。
上述生产柠檬酸方法中，所述种子罐培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15%～30%，加入α-淀粉酶液化，再利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基；
所述发酵罐培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15%～30%，加入α-淀粉酶液化，经液化，过滤，再以所得滤液为基料，利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基。
其中，所述淀粉质原料选自玉米、木薯或高粱中一种或两种以上；种子罐培养基中总糖含量为0.05～0.1g/mL；发酵罐培养基中总糖含量为0.12～0.20g/mL。
本发明通过对柠檬酸生产菌种进行选育驯化，筛选出具有较强的中和废水耐受力，且不影响正常发酵产酸能力的菌株，并利用其特性在柠檬酸发酵生产过程中使用中和废水替换自来水，在保证其产酸水平的前提下，达到降低生产成本，减少环境污染的目的。
附图说明
图1实施例1所得菌株在50L发酵罐中发酵液液相图谱。
图2黑曲霉在50L发酵罐中发酵液液相图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中涉及到的百分号“%”，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
实施例1菌株的筛选
（1）菌种分离纯化：以黑曲霉（Aspergillusniger,保藏号CGMCCNO.6465）为出发菌种，在无菌操作条件下，将其稀释分离，涂布到平板培养基上，于36℃±1℃培养40h；
所述平板培养基为PDA土豆培养基，其中土豆汁12%、葡萄糖3%、琼脂2%，使用中和废水替代自来水配制；
（2）菌种的扩大培养：待平板单菌落培养好，再从培养好的平板中挑选生长好的几组单菌落分别接种于试管斜面培养基，于36℃±1℃培养5d；
所述平板培养基为PDA土豆培养基，其中土豆汁13%、葡萄糖2%、琼脂2%，使用中和废水替代自来水配制；
（3）菌种发酵培养：使用接种针将试管斜面所培养好的单菌落用接种环勾取1～2环成熟孢子接入发酵摇瓶，于36℃±1℃，摇床转速320rpm/min，培养90h；
所述发酵摇瓶培养基为玉米粉原料经过液化处理后所得到液化滤液，液化过程加入α-淀粉酶；培养基使用中和废水配制，其中总糖含量为0.15g/ml；
（4）初筛：使用滤纸过滤步骤（3）摇瓶发酵液，除去菌丝体和培养基等杂质，用0.1429mol/l的NaOH对滤液进行滴定，通过测得发酵液产酸水平，初筛柠檬酸产量高的菌株进行复筛;
（5）复筛：将步骤（4）筛选出的菌株重复步骤（1）～（4）的过程，直至筛选得到产酸量达到14%的菌株。
实验例1在不同摇瓶发酵培养中产酸水平的考察
1）不同溶液配制的摇瓶发酵培养基对菌株产酸水平的影响
黑曲霉（Aspergillusniger,保藏号CGMCCNO.6465）与实施例1所得菌株分别在摇瓶发酵培养基1、2中进行摇瓶发酵产酸试验，具体结果见表1。
其中，摇瓶发酵条件：36℃±1℃，摇床转速320rpm/min，培养96h；
所述摇瓶发酵培养基1：玉米粉原料调浆至粉浆比20%，加入α-淀粉酶，经液化，过滤，以所得滤液为基料，使用自来水配制而成，其中灭菌前pH6.02，灭菌后pH5.59,总糖0.1585g/ml。
所述摇瓶发酵培养基2：与培养基1的制备方法相同，区别在于使用中和废水配制，其中灭菌前pH4.77,灭菌后pH4.72,总糖0.1585g/ml。
表1黑曲霉与实施例1菌株在不同溶液配制的培养基中产酸水平
实施例1 黑曲霉
培养基1 14.466% 14.495%
培养基2 14.233% 12.763%
由表1可以看出，黑曲霉菌株的产酸水平在自来水配制的培养基中，产酸水平正常，但在中和废水配制的培养基中发酵产酸率明显下降；相比之下，实施例1的菌株产酸水平无论在自来水配制的培养基中还是中和废水配制的培养基中相差无几，基本不受影响，适用性更广。
2）不同培养基成分对菌株产酸水平的影响
配制不同成分的培养基，将实施例1筛选得到的菌株进行摇瓶发酵试验，以考察不同培养基成分对菌株产酸水平的影响。具体结果见表2。
表2不同发酵培养基成分条件下摇瓶发酵产酸结果
由表2可以看出，菌株在中和废水配制的以玉米、木薯、高粱或其混合为原料的发酵培养基中与在对照组培养基中产酸水平基本相当，说明淀粉质原料与中和废水配制的培养基完全可以取代自来水配制的培养基。
实施例2实施例1所得菌株在50L发酵罐中生产柠檬酸的方法
（1）扩大培养：以实施例1中所得到的菌株为出发菌株，接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间5d；然后将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间7d；
（2）孢子悬液的制备：将步骤（1）培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为3×1010，无菌条件下倒入孢子悬液钢瓶备用；
（3）种子罐培养：将步骤（2）中所得到的孢子悬液接入柠檬酸种子罐进行培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:1、罐压0.5MPa、搅拌转速350rpm/min，培养周期为25h；
（4）发酵罐培养：将步骤（3）种子液接入发酵罐进行发酵培养：36℃±1℃、通风比为1:1、罐压0.5MPa、搅拌转速400rpm/min，培养周期为85h；发酵液液相图谱如图1所示。
所述种子罐培养基是先将玉米粉原料调浆至粉浆比20%，加入α-淀粉酶，经液化作为培养基基料，利用柠檬酸中和废水配制而成的培养基；其总糖含量为0.08g/mL；
所述发酵罐培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为20%，加入α-淀粉酶液化，经液化，过滤，再以所得滤液为基料，利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基，其总糖含量为0.16g/mL。
实验例250L发酵罐产柠檬酸效果考察
按照实施例2中所述发酵产酸方法，接种黑曲霉进行发酵产酸试验，由于，黑曲霉不适用中和配制的培养基，因而替换用自来水配制而成的培养基。最终所得发酵液液相图谱如图2所示。
对比图1、图2可知，在50L发酵罐中，实施例1所得菌株在中和废水替代配制的玉米培养基中产酸情况与对比例2常规菌株产酸水平基本一致，可见利用实施例1所得菌株在中和废水配制培养基中发酵产酸是可行的。
实施例3实施例1所得菌株在300m3发酵罐中生产柠檬酸的方法
（1）以实施例1所得菌株为出发菌株，接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃培养5d；然后将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃培养7d。
（2）孢子悬液的制备：将步骤（1）培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为4×1010，无菌条件下将孢子悬液倒入钢瓶备用；
（3）种子罐培养：将步骤（2）中所得到的孢子悬液接入柠檬酸种子罐进行培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:1、罐压0.5MPa、搅拌转速110rpm/min，培养周期为25h。
（4）发酵罐培养：将步骤（3）种子液接入发酵罐进行发酵培养：36℃±1℃、通风比为1:1、罐压0.5MPa、搅拌转速90rpm/min，培养周期为80h。
所述种子罐培养基是将玉米粉原料经过液化，调浆至粉浆比18%，加入α-淀粉酶，经液化，所得到的液化液；种子罐培养基总糖含量为0.08g/mL；
所述发酵罐培养基为以木薯粉：玉米粉质量比1:4配成的淀粉质原料调浆至粉浆比15%，加入α-淀粉酶，经液化，过滤，再以所得滤液为基料，利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制而成的培养基；。发酵罐培养基总糖含量为0.16g/mL。
对发酵罐中的发酵液中各项指标进行分析，结果见表3。
表3发酵液分析结果
实验例3现有黑曲霉300m3发酵罐产柠檬酸测试
按照实施例3中所述发酵产酸方法，接种黑曲霉（Aspergillusniger，保藏号CGMCCNO.6465）进行发酵产酸试验，其中，所述发酵罐培养基使用自来水配制。
对发酵罐中的发酵液中各项指标进行分析，结果见表4。
表4对比例3的发酵液分析结果
对比表3、表4可知，采用实施例1所得菌种在中和废水培养基中进行柠檬酸的发酵产酸，其产酸率、发酵周期以及糖酸转化率等指标与常规黑曲霉发酵柠檬酸的各项指标基本一致，可以实现用中和废水替代自来水配制培养基，从而达到降低生产成本，节约水资源的目的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种生产柠檬酸的菌株，其特征在于，其分类命名为黑曲霉(Aspergillusniger)，已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCCNo.8368。
2.一种权利要求1所述菌株生产柠檬酸的方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)扩大培养：将上述权利要求1所述菌株接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间4～6d；将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间5～8d；
(2)孢子悬液的制备：将步骤(1)培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为2×1010～5×1010，无菌条件下将孢子悬液倒入钢瓶备用；
(3)种子罐培养：将步骤(2)中所得到的孢子悬液接入柠檬酸种子罐进行培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速100～400rpm/min，培养周期为18～30h；
(4)发酵罐培养：将步骤(3)种子液按接种量5-10％接入发酵罐进行发酵培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速80～500rpm/min，培养周期为72～96h。
3.根据权利要求2上述方法，其特征在于，所述种子罐内的培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15％～30％，加入α-淀粉酶液化，再利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基；
所述发酵罐内的培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15％～30％，加入α-淀粉酶液化，经液化，过滤，再以所得滤液为基料，利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基。
4.根据权利要求3上述方法，其特征在于，所述淀粉质原料选自玉米、木薯或高粱中一种或两种以上。
5.根据权利要求2上述方法，其特征在于，所述种子罐内的培养基中总糖含量为0.05～0.1g/mL；发酵罐内的培养基中总糖含量为0.12～0.20g/mL。
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