CN109929892A

CN109929892A - 一种发酵产高品质黄原胶的工艺

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Publication number: CN109929892A
Application number: CN201910235479.XA
Authority: CN
Inventors: 李德衡; 卢松; 王文强; 梁晓娟; 高雷; 王斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2019-06-25

Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种发酵产高品质黄原胶的工艺，其包括如下步骤：按照黄单胞菌种子液按照8％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养，温度30℃，发酵培养时间72小时，得到发酵液；发酵培养过程中，通过调节搅拌转速与通气量保持溶氧水平为15‑20％，通过自动流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于2％。本发明发酵工艺可控性好，操作建议，成本低廉，提升了黄原胶的产量和品质。

Description

一种发酵产高品质黄原胶的工艺

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵产高品质黄原胶的工艺。

背景技术

黄原胶(Xanthan gum)，又称黄单胞多糖或汉生胶，是由甘蓝黑腐病黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)或其他黄单胞杆菌属的菌株以碳水化合物为主要原料经发酵产生的高分子酸性胞外杂多糖，其生物合成机制为“非模板合成机制”。黄原胶分子是由“五糖重复单元”结构聚合体，黄原胶分子彼此间靠氢键形成双股的二级螺旋立体结构，双股螺旋结构间靠微弱的非共价键结合，排列成整齐的“超级接合带状”的三级螺旋聚合结构；在极稀的水溶液中，不加热时黄原胶呈现典型的四级菊花状聚集结构。

黄原胶水溶性好，充分水合后形成高粘度溶液，是当前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体、性能最优越的生物胶；可作为乳化剂、稳定剂、凝胶增稠剂、浸润剂、膜成型剂等；被广泛应用于食品、医药、化工、石油等领域。

目前，黄原胶的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产黄原胶的主流方法，如何对发酵培养基以及培养条件进行优化，以提高黄原胶的产率和品质是我们需要解决的技术问题。

据研究发现，碳源的选择以及C/N比对发酵速度、发酵周期有重要的影响，从对数生长期开始，采用较高的 C/N比能够促进黄原胶的合成。同一批黄原胶发酵周期的延长，丙酮酸含量不断的增加。因此，C/N比通过控制生长速度将其作用传递给丙酮酸的合成。申请人阜丰集团也对发酵培养基和培养参数步骤进行了大量的研究，专利技术“CN103074408A，一种速溶黄原胶的生产方法”公开了一种采用黄单胞菌发酵制备黄原胶的方法，其中种子罐培养基：葡萄糖2.5％、牛肉膏3％、K2HPO4·3H2O0.2％、Na2HPO40.2％、生物素0.5％、MgSO4·7H2O0.2％、尿素0.025％，115℃灭菌15min；发酵罐培养基组分：葡萄糖10％、玉米浆0.5％、牛肉膏3％、MgSO4·7H2O 0.2％、K2HPO4·3H2O 0.2％、 FeSO4 0.0001％、VB10.00001％，pH7.0～7.2。上述培养过程中，主要采用牛肉膏作为氮源，成本较高，也有其他研究中选用酵母膏等作为氮源，同样存在成本高的缺陷。专利技术“一种制备黄原胶的工艺”公开了发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：按照重量百分比取葡萄糖9％、大豆蛋白0.8%、玉米浆2.5%、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾 0.3％、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁 0.001％、VB₁ 0.00001％，其余为水，搅拌均匀，调pH6.5；该发酵培养基降低了成本，但是发酵产黄原胶的产率和品质仍有待提升。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中黄原胶发酵培养基成本较高以及产率较低的缺陷，提供了一种发酵产高品质黄原胶的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵产高品质黄原胶的工艺，其包括如下步骤：

按照黄单胞菌种子液按照8％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养，温度30℃，发酵培养时间72小时，得到发酵液；发酵培养过程中，通过调节搅拌转速与通气量保持溶氧水平为15-20％，通过自动流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于2％。

优选地，所述溶氧水平为20%。

进一步地，

所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖、玉米淀粉、菌体蛋白酶解液、油酸、碳酸钙、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、黄腐酸、VB₁。

进一步地，

所述培养基由如下组分组成：葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、油酸10g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、黄腐酸20mg/L、VB₁ 20mg/L，pH7.0-7.2。

进一步地，

所述菌体酶解液的制备方法为：收集黄原胶发酵液中的菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为1mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液，灭酶，然后浓缩成干物质含量为40%的膏状物，即得菌体酶解液。

优选地，

所述胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h。

优选地，

所述胰蛋白酶的酶活力为4000U/g。

优选地，

所述陶瓷膜的截留分子量为10000Da。

本发明还要求保护按照上述工艺制备的黄原胶。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

碳源一部分用来构成细胞成分，一部分维持正常的新陈代谢，另外一部分用于目的产物的合成。本发明采用葡萄糖和玉米淀粉混合碳源，节省了原料成本，菌株优先用葡萄糖，随着菌株浓度的增加，分泌的淀粉酶等酶类增加，能够酶解玉米淀粉作为碳源；本方法以黄原胶发酵的废弃菌体蛋白为原料，经胰蛋白酶水解后作为有机氮源制成发酵培养基，原料来自发酵后遗留菌体，成本低廉，与用做饲料相比，蛋白效价更高，效益更好，可以直接降低工业成本，提高产品效益。通过添加菌体酶解液来替代酵母膏等氮源，可以大大节约发酵成本。

在培养基中添加谷氨酸可增加黄原胶的产量，本发明菌体蛋白酶解液含有大量谷氨酸（占总氨基酸的10%以上），可以增加黄原胶的产量。钙和镁无机离子也能对菌体生长和产物合成产生影响，镁元素对菌体生长有刺激作用，碳酸钙是影响黄原胶产量和质量的重要因子，在适量的条件下可减少胞外蛋白质的合成，提高黄原胶的产量，此外，碳酸钙还具有缓冲发酵液pH的作用。

黄腐酸中含有大量酚羟基、羰基等基团，电解程度较高，能够促进黄原胶合成过程中对O₂的利用，进一步提高产胶量和黄原胶品质。油酸可以减少气液传氧阻力，提高氧气传质速率，增强系统供氧能力，提高黄原胶产率，且无需额外提供能量。

溶氧浓度高使得黄原胶的生物合成开始的越早，而黄原胶生成的停止通常是由于培养基中碳源的耗尽造成的，从某种意义上讲，高浓度黄原胶发酵液的得到必须有较高的溶氧浓度为前提的，但是过高浓度的溶氧量也会导致碳源消耗过快，产生较多的副产物，从而使得转化率降低，提高发酵成本，因此，合适浓度的溶氧是提高发酵效率的重要因素。

附图说明

图1：培养基中油酸添加量对黄原胶产量的影响；

图2：培养基中黄腐酸添加量对黄原胶产量的影响；

图3：溶氧量对黄原胶产量影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

用于黄原胶发酵的培养基，其包括如下组分：

葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、油酸10g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、黄腐酸20mg/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

所述培养基的制备方法为：

取各原料，依次添加到水中，搅拌均匀，调pH，即得；

所述菌体酶解液的制备方法为：收集黄原胶发酵液中的菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为1mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液,90℃灭酶10min，然后浓缩成干物质含量为40%（重量比）的膏状物，即得；陶瓷膜的截留分子量为10000Da；过滤去除难以被菌株利用的大分子物质，包括细胞壁组分、大分子蛋白等。

所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h；所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，添加量为：酶与底物干质量比为1:30。

实施例2

一种发酵产高品质黄原胶的工艺，其包括如下步骤：

按照黄单胞菌ATCC 17915种子液（1×10⁸CFU/mL）按照8％(体积比)的接种量接入培养基中进行发酵培养，温度30℃，发酵培养时间72小时，得到发酵液；发酵培养过程中，通过调节搅拌转速与通气量保持溶氧水平为20％，通过自动流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于2％。

对比例1

用于黄原胶发酵的培养基，其包括如下组分：

葡萄糖100g/L、酵母膏20g/L、油酸10g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、黄腐酸20mg/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

对比例2

用于黄原胶发酵的培养基，其包括如下组分：

葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、黄腐酸20mg/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

对比例3

用于黄原胶发酵的培养基，其包括如下组分：

葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、油酸10g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

对比例4

用于黄原胶发酵的培养基，其包括如下组分：

葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

实施例3

一、实施例1以及对比例1-4的培养基对黄原胶的影响。

分析各培养基对黄原胶发酵的影响，发酵工艺参考实施例2。具体数据指标见表1：

表1

指标	实施例1	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
						黄原胶产量g/L	31.3	30.5	26.4	27.2	25.5
粘度mPa/s	6647	6598	5854	6130	5812
						平均分子量g/mol	1.43×10<sup>7</sup>	1.46×10<sup>7</sup>	1.31×10<sup>7</sup>	1.23×10<sup>7</sup>	1.15×10<sup>7</sup>
丙酮酸功能基团含量%	5.13	5.09	4.76	4.87	4.65

结论：与对比例1相比，本发明采用菌体蛋白酶解液来取代常用的酵母膏，采用玉米淀粉替代部分葡萄糖，对发酵产胶的品质没有大的影响，而且本发明的产胶量较对比例1还一定的提高；与对比例2-4相比，本发明在黄原胶产量以及品质方面均优于对比例2-4，可见，油酸和黄腐酸对发酵产胶以及黄原胶的品质有促进作用，二者协同使用，效果更好。

二、培养基中油酸和黄腐酸添加量对黄原胶产量的影响。

油酸的添加量设置为0，2.5，5,10,20,40（g/L），发酵工艺参照实施例2；如图1所示，随着油酸添加量的增加，黄原胶产量逐渐增加，待增加到10g/L时，黄原胶产量达到峰值，继续增加油酸的添加量，黄原胶的产量并没有增加，反而有小幅下降。

黄腐酸的添加量设置为0，5,10,20,40，80（mg/L），发酵工艺参照实施例2；如图2所示，随着黄腐酸添加量的增加，菌株对氧的利用率提升，相应地，黄原胶产量随之增加，待增加到20mg/L时，黄原胶产量达到峰值，继续增加油酸的添加量，黄原胶的产量并没有明显改变，选择20mg/L的添加量较为合适。

3、溶氧量对黄原胶产量影响。

设置溶氧量为5%，10%，15%，20%，25%，30%六个梯度浓度，如图3所示，溶氧量增加，黄原胶的产量随之增加，当溶氧量增加到20%时，黄原胶的产量接近最大值，继续增大溶氧量，黄原胶的增幅并不明显，但是碳源消耗率明显提高（流加葡萄糖的速率增加），提高了发酵成本，因此，选择20%左右的溶氧量最为合适。

实施例3

本发明水解工艺对菌体蛋白酶解中氨基酸含量的影响：

设置对照组，

对照组1：不采用高速剪切机处理，其余同实施例1；

对照组2：采用浓度为5mol/L的盐酸进行水解6h的方式。

破壁率、蛋白质含量以及总游离氨基酸含量见表2：

表2

组别	实施例1	对照组1	对照组2
				破壁率%	96.5	82.9	69.1
总游离氨基酸含量mg/g（干菌体）	357.5	261.4	193.6

结论：通过表2可见，利用高速剪切机剪切处理120s，能够大幅提高菌体破壁率，从而提高水解效率；本发明采用稀盐酸进行预处理，所用酸浓度较小，则酸对氨基酸破坏程度很小，继而采用温和的酶解方式，从而能保留水解产物的营养价值；本发明实施例1菌体酶解液中的总游离氨基酸含量最高，更容易被菌株利用，而且总游离氨基酸中谷氨酸的含量较高，可达到12%左右，对黄原胶产率有较好的促进作用，无需在培养基中额外添加谷氨酸，降低了成本。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵产高品质黄原胶的工艺，其包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述溶氧水平为20%。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖、玉米淀粉、菌体蛋白酶解液、油酸、碳酸钙、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、黄腐酸、VB₁。

4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：葡萄糖40g/L、玉米淀粉60g/L、菌体蛋白酶解液50g/L、油酸10g/L、碳酸钙3g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、黄腐酸20mg/L、VB₁ 20mg/L，pH 7.0-7.2。

5.根据权利要求3-4所述的工艺，其特征在于，所述菌体酶解液的制备方法为：收集黄原胶发酵液中的菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为1mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液，灭酶，最后浓缩成干物质含量为40%的膏状物，即得菌体酶解液。

6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h。

7.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述胰蛋白酶的酶活力为4000U/g。

8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为10000Da。

9.按照权利要求1-8任其一所述的工艺制备的黄原胶。