CN101215592B - 生产普鲁兰多糖的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，其特征在于实施步骤如下：(1)制备种子培养基；(2)制备发酵初始培养基；(3)将液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3-8％，发酵搅拌速度为200-500rpm，发酵温度为29℃±1℃，通气量为0.5-10V/V，罐压为0.01-0.02MPa；(4)在发酵24小时后进行补加另一种碳源，流加量为40-80g/L，流加液为蔗糖溶液、葡萄糖溶液或者是DE值为40-60的淀粉水解物；流加碳源后，再继续发酵60-72小时；(5)将上述发酵液按常规絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量20-60万道尔顿之间的普鲁兰多糖。本发明工艺简单，效果显著，与以往单纯用糖发酵工艺相比，发酵时间明显缩短，发酵时间80-100小时，有效提高生产效率并节省能源，产物得率有很大提高，产率可达50％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的发酵方法，特别涉及一种生产普鲁兰多糖的发酵方法。
背景技术
早在1936年人们就发现了普鲁兰多糖(pullulan)，后来用液体培养出芽短梗霉并分离普鲁兰多糖。一直到六十年代，人们才开始对其发酵、提取和应用等方面的研究，1978年日本林原公司实现工业化生产普鲁兰多糖。普鲁兰多糖(Pullulan)是由出芽短梗霉(Aurebasidium pullulans)利用糖质化合物为基质进行好气发酵生产的一种粘性胞外多糖。普鲁兰多糖是一种以麦芽三糖为单元、以α-1.6键重复连接而成的线状高分子多糖。分子量4.8×104-2.2×106，商品普鲁兰多糖平均分子量2×105。普鲁兰多糖是一种非离子性、非还原性的稳定多糖，因而在水中容易溶解，可作粘性、中性、非离子性的不胶化水溶液。普鲁兰多糖无色、无味、无毒，在农产品保鲜，海产品保鲜，食品加工工业，环境保护领域，包装、化妆品、医药、保健品行业中应用极其广泛。目前，国内外用于普鲁兰多糖生产的菌种均为出芽短梗霉，以葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉水解物等为碳源；以酵母膏，玉米浆为有机氮源，进行发酵。发酵过程中由于发酵液的粘度很高，影响了底物与氧气的传输，使得细胞形态发生变化，酵母状的细胞变成了菌丝体和含色素的厚垣孢子，从而导致了多糖产量下降同时妨碍后提取工艺。发酵时间一般在120-156小时左右，产物得率20％以下，普鲁兰多糖平均分子量2-20万道尔顿之间。发酵时间较长，得率较低，分子量分布范围较广是国内发酵生产普鲁兰多糖的现状。
因此，提供一种节能高效的生产普鲁兰多糖的发酵方法是该领域科研人员当前急待解决的难题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种生产普鲁兰多糖的发酵方法。
为实现上述目的本发明所采用的实施步骤如下：
(1)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：植物油20.0-30.0，KH2PO42.0-6.0，(NH4)2SO4 0.4-0.8，MgSO4.7H2O 0.1-0.4，NaCl 0.5-2.0，酵母膏0.2-0.4，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；摇瓶于29℃±1℃，转速为240-280rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液；摇瓶于29℃±1℃，转速为240-280rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液；
(2)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L)：植物油20.0-40.0，KH2PO4 3.0-8.0，(NH4)2SO4 0.4-0.8，MgSO4.7H2O 0.1-0.4，NaCl 0.5-2.0，FeSO4.7H2O 0.01-0.02，酵母膏0.2-0.6，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；
(3)将液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3-8％，发酵搅拌速度为200-500rpm，发酵温度为29℃±1℃，通气量为0.5-10(V/V)，罐压为0.01-0.02Mpa；
(4)在发酵24小时后进行补加另一种碳源，流加量为40-80g/L，流加液为40-60％浓度的蔗糖溶液、葡萄糖溶液或者是DE值为40-60的淀粉水解物；流加碳源后，pH值调控在4.0，通气量0.8-1.0V/V，发酵搅拌速度提高到300-350rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵60-72小时；
(5)将上述发酵液按常规絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量20-60万道尔顿之间的普鲁兰多糖。
本发明的有益效果是：实施本发明主要分为两个阶段，一是菌体细胞生长阶段；二是普鲁兰多糖合成阶段，两阶段分工明显不同。这样做的优势就是在最适培养条件下，用两种完全不同的碳源激活细胞更好地完成每个阶段的发酵过程，以达到生产最优化。与以往单纯用糖发酵工艺相比，此工艺发酵时间明显缩短，发酵时间80-100小时，提高了生产效率并节省了能源，产物得率也有很大提高，产率可达50％以上。由于不受氧气的限制，所以菌体细胞充分吸收营养成分并且在发酵过程中没有生成色素，便于普鲁兰多糖的提纯。发酵后分子量范围较小，没有发生降解现象。
本发明在于采用上述双阶段发酵工艺，通过调换碳源来解决常规用糖发酵产生的一些问题，如高粘度发酵过程中氧气传输问题，细胞形态变化问题和产色素问题等。双阶段发酵工艺先是利用油类中的甘油三酯使菌体细胞快速生长，第一阶段中只合成少量多糖，发酵液粘度很低，降低了发酵过程中所需的能耗，利于氧气的传输而不影响细胞形态，使菌体细胞在最适宜条件下充分生长；然后在生长阶段末期氮源缺陷的情况下进行第二阶段，即在各种指标调控下，细胞利用糖类合成普鲁兰多糖。采用双阶段发酵过程比起单一底物发酵来说，发酵周期更短，菌体量更能快速生长，多糖产量更高。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：大豆油30.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值6.0，121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液。
(2)取5毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同步骤1。121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液。
(3)按5％的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升种子培养基并接入二级种子液1升，其水溶液组成为(g/L)：大豆油30.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5；pH值6.0，121℃灭菌20min，于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01Mpa，搅拌速度300rpm条件下发酵24小时；
(4)在300升发酵罐内加入200升发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：大豆油30.0，KH2PO45.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.3，pH值6.0，121℃灭菌20min。按8％的接种量将16升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为250rpm，温度为29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，在发酵24小时后补加40％的葡萄糖溶液20升，pH值调控在4.0，通气量1.0(V/V)，发酵搅拌速度提高到300rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵60小时；
(5)将上述发酵液按常规絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量25万道尔顿的普鲁兰多糖，产物得率53.2％。
实施例2
(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：花生油40.0，KH2PO45.0，(NH4)2SO40.6，MgSO4.7H2O0.2，NaCl0.8，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.4，pH值5.5，121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液。
(2)取5毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同1。121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液。
(3)按5％的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升种子培养基并接入二级种子液1升，其水溶液组成为(g/L)：花生油40.0，KH2PO45.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.4，pH值5.5，121℃灭菌20min，于29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，搅拌速度300rpm条件下发酵24小时。
(4)在300升发酵罐内加入200升发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：花生油40.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.6，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值5.5，121℃灭菌20min。按8％的接种量将16升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为300rpm，温度为29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，在发酵24小时后补加50％的蔗糖溶液24升，pH值调控在4.0，通气量1.0(V/V)，发酵搅拌速度提高到350rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵65小时。
(5)将上述发酵液絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量35万道尔顿的普鲁兰多糖，产物得率51.4％。
实施例3
(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：大豆油40.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.6，pH值5.5，121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液。
(2)取5毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同1。121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液。
(3)按5％的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升种子培养基并接入二级种子液1升，其水溶液组成为(g/L)：大豆油40.0，KH2PO45.0，(NH4)2SO40.6，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值5.5，121℃灭菌20min，于29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，搅拌速度300rpm条件下发酵24小时。
(4)在300升发酵罐内加入200升发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：大豆油40.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.6，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.0，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值5.5，121℃灭菌20min。按8％的接种量将16升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为250rpm，温度为29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，在发酵24小时后补加50％的蔗糖溶液32升，pH值调控在4.0，通气量1.0(V/V)，发酵搅拌速度提高到300rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵68小时。
(5)将上述发酵液絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量30万道尔顿的普鲁兰多糖，产物得率54.6％。
实施例4
(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：花生油30.0，KH2PO45.O，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl0.9，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值6.0，121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液。
(2)取5毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同1。121℃灭菌20min，摇瓶于28℃，转速为240rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液。
(3)按5％的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升种子培养基并接入二级种子液1升，其水溶液组成为(g/L)：花生油30.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.O，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值6.0，121℃灭菌20min，于29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，搅拌速度300rpm条件下发酵24小时。
(4)在300升发酵罐内加入200升发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：花生油30.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO40.6，MgSO4.7H2O0.2，NaCl1.O，FeSO4.7H2O0.01，酵母膏0.5，pH值5.5，121℃灭菌20min。按8％的接种量将16升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为300rpm，温度为29℃±1℃，通气量0.8(V/V)，罐压0.01Mpa，在发酵24小时后补加60％的DE值为40-60的淀粉水解物28升，pH值调控在4.0，通气量1.0(V/V)，发酵搅拌速度提高到350rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵72小时。
(5)将上述发酵液絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量40万道尔顿的普鲁兰多糖，产物得率53.9％。
上述参照实施例对生产普鲁兰多糖的发酵方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1. 一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，其特征在于实施步骤如下：
(1)制备种子培养基，其水溶液组成为g/L：植物油20.0-30.0，KH2PO42.0-6.0，(NH4)2SO4 0.4-0.8，MgSO4.7H2O 0.1-0.4，NaCl 0.5-2.0，酵母膏0.2-0.4，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；摇瓶于29℃±1℃，转速为240-280rpm的摇床上培养48小时，作为一级种子液；摇瓶于29℃±1℃，转速为240-280rpm的摇床上培养24小时，作为二级种子液；
(2)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为g/L：植物油20.0-40.0，KH2PO4 3.0-8.0，(NH4)2SO4 0.4-0.8，MgSO4.7H2O 0.1-0.4，NaCl 0.5-2.0，FeSO4.7H2O 0.01-0.02，酵母膏0.2-0.6，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；
(3)将液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3-8％，发酵搅拌速度为200-500rpm，发酵温度为29℃±1℃，通气量为0.5-10V/V，罐压为0.01-0.02Mpa；
(4)在发酵24小时后进行补加另一种碳源，流加量为40-80g/L，流加液为40-60％浓度的蔗糖溶液、葡萄糖溶液或者是DE值为40-60的淀粉水解物；流加碳源后，pH值调控在4.0，通气量0.8-1.0V/V，发酵搅拌速度提高到300-350rpm，罐压0.02Mpa，再继续发酵60-72小时；
(5)将上述发酵液按常规絮凝，超滤，膜分离，浓缩，干燥得到分子量20-60万道尔顿之间的普鲁兰多糖。
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