CN116676200B - 一株黑曲霉及其在制备柠檬酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株黑曲霉及其在制备柠檬酸中的应用，所述黑曲霉为（Aspergillus niger）angzh1010，该黑曲霉angzh1010保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。本发明中的黑曲霉angzh1010，在发酵法生产柠檬酸的应用过程中，产酸和转化率相比出发菌有明显提高，经过多次传代该菌种仍具有良好的稳定性，该菌种不仅可以利用葡萄糖发酵，而且可以利用淀粉液化液进行发酵，在实际生产过程中减少了淀粉糖化的工序，可以大大降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一株黑曲霉及其在制备柠檬酸中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
柠檬酸（citric acid），又名枸橼酸，是一种非常重要的有机酸，被广泛应用于食品、环保、化工、纺织和制药等行业中。柠檬酸的生产方法主要有提取法、化学合成法和生物发酵法。其中提取法和化学合成法因为成本、安全性等原因，几乎很少应用于大规模工业生产，而生物发酵法因其具有成本低、安全性好、工艺简单等优点，已成为柠檬酸的主要生产方法。目前，柠檬酸国际市场的竞争异常激烈，因此提高我国生产菌株的产酸水平和转化率、选育高产柠檬酸优良菌株具有重要意义。
目前生产柠檬酸主要使用菌种是黑曲霉，国内很多研究人员和学者对黑曲霉生产柠檬酸进行了不断研究，并通过诱变育种、基因重组改造等手段提高黑曲霉生产柠檬酸的技术水平。目前，通过基因重组等手段改造的黑曲霉虽然可以在实验室获得较高的产酸水平，但是在放大生产过程中经常出现菌株基因逆向突变、关键基因丢失、遗传代谢不稳定等问题，造成生产技术水平不稳定，尤其是基因多拷贝的菌株，严重时会造成倒罐等生产异常事故。人们对生产柠檬酸菌种的诱变育种研究也积累了几十年的经验，但是在发酵技术水平提高上也仍还具有较大空间。
发明内容
本发明的目的是为了提高柠檬酸发酵生产技术水平，解决柠檬酸生产中存在的问题，通过紫外诱变结合ARTP诱变，经过大量诱变育种和定向筛选，获得一株黑曲霉，将该黑曲霉菌株应用于发酵生产柠檬酸，相比出发菌具有更高的产酸和转化率，并且具有良好的传代稳定性，以及在放大生产中同样具有更高的生产技术水平。
本发明提供一株黑曲霉，所述黑曲霉为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，该黑曲霉angzh1010保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。
本发明还提供了一株黑曲霉的应用，采用黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010制备柠檬酸。
采用黑曲霉angzh1010为菌种发酵制备柠檬酸，包括如下步骤：
（1）发酵培养：将黑曲霉angzh1010接种于发酵培养基中培养60~65h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制；
（2）发酵液提取纯化。
发酵培养前还包含如下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉angzh1010保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天；
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水清洗后，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h；
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养。
上述发酵制备柠檬酸的步骤中发酵培养基包含总糖含量150~250g/L的淀粉液化液或葡萄糖、尿素5~9g/L、磷酸二氢钾0.5~1g/L、硫酸镁0.5~5g/L。
种子培养基包含总糖含量150~250g/L的淀粉液化液或葡萄糖、硫酸铵1~5 g/L。
发酵液提取纯化的步骤如下：
将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
本发明的有益效果是：
本发明提供一株黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40449。该菌株具有独特的生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用。
本发明中的黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，在发酵法生产柠檬酸的应用过程中，该菌种产酸和转化率相比出发菌有了明显提高，经过多次传代该菌种仍具有良好的稳定性，该菌种不仅可以利用葡萄糖发酵，而且可以利用淀粉液化液进行发酵，在实际生产过程中减少了淀粉糖化的工序，可以大大降低生产成本，该菌种培养基成分简单，培养条件粗放，易于规模化生产，具有较好的工业应用前景。
生物材料的保藏
一株黑曲霉angzh1010，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一株黑曲霉，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。
一株黑曲霉的应用，采用黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010发酵制备柠檬酸。
所述发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天。
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水洗下，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h。
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养，种子培养基包含总糖含量150g/L的淀粉液化液、硫酸铵1 g/L。
（4）发酵培养：将种子培养完成的菌种接种于发酵培养基中培养60h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制，发酵培养基包含总糖含量150g/L的淀粉液化液、尿素5g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸镁0.5 g/L。
（5）提取纯化：将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离获得晶体，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
通过该种方式培养，采用30L发酵罐培养，发酵培养至60h，产柠檬酸265.50g/L，转化率102.78%（转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产酸含量g/L）/发酵淀粉液化液用量g×100%）。经过提取纯化，得到一水柠檬酸晶体5592.4g。
实施例2
一株黑曲霉，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。
一株黑曲霉的应用，采用黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010发酵制备柠檬酸。
所述发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天。
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水洗下，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h。
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养，种子培养基包含葡萄糖200g/L、硫酸铵4 g/L。
（4）发酵培养：将种子培养完成的菌种接种于发酵培养基中培养65h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制，发酵培养基包含葡萄糖170g/L、尿素7 g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁2 g/L。
（5）提取纯化：将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离获得晶体，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
通过该种方式培养，采用30 L发酵罐培养，发酵培养至65 h，产柠檬酸262.5g/L，转化率100.81%（转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产酸含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%）。经过提取纯化，得到一水柠檬酸晶体5813.9g。
实施例3
一株黑曲霉，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。
一株黑曲霉的应用，采用黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010发酵制备柠檬酸。
所述发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天。
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水洗下，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h。
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养，种子培养基包含总糖含量180g/L的淀粉液化液、硫酸铵3 g/L。
（4）发酵培养：将种子培养完成的菌种接种于发酵培养基中培养60h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制，发酵培养基包含总糖含量200g/L的淀粉液化液、尿素8 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁3 g/L。
（5）提取纯化：将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
所述的发酵液过滤设备为板框过滤机，中和反应使用碳酸钙中和，酸解液使用洗酸滤机进行过滤和洗酸，脱色使用脱色柱进行脱色，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，柠檬酸晶体干燥设备为流化床干燥机。
通过该种方式培养，采用500吨发酵罐培养，发酵培养至60 h，产柠檬酸258.56 g/L，转化率99.24%（转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产酸含量g/L）/发酵淀粉液化液用量g×100%）。经过提取纯化，得到一水柠檬酸晶体82.22吨。
实施例4
一株黑曲霉，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449。
一株黑曲霉的应用，采用黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010发酵制备柠檬酸。
所述发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天。
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水洗下，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h。
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养，种子培养基包含总糖含量250g/L的葡萄糖、硫酸铵5 g/L。
（4）发酵培养：将种子培养完成的菌种接种于发酵培养基中培养65h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制，发酵培养基包含总糖含量250g/L的葡萄糖、尿素9 g/L、磷酸二氢钾0.7 g/L、硫酸镁5 g/L。
（5）提取纯化：将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
所述的发酵液过滤设备为板框过滤机，中和反应使用碳酸钙中和，酸解液使用洗酸滤机进行过滤和洗酸，脱色使用脱色柱进行脱色，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，柠檬酸晶体干燥设备为流化床干燥机。
通过该种方式培养，采用500吨发酵罐培养，发酵培养至65h，产柠檬酸261.32g/L，转化率101.21%（转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产酸含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%）。经过提取纯化，得到一水柠檬酸晶体85.46吨。
实施例5
黑曲霉的诱变筛选方法
以黑曲霉CICC40550变种为出发菌，经过多次紫外线（UV）诱变和常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP ）复合诱变处理，再经过定向筛选，获得高产和高转化率的柠檬酸菌株。紫外线诱变处理方法：将出发菌活化培养至斜面培养基，选取孢子生长较好的活化斜面，加入5mL无菌水，将孢子洗下，转移至装有45mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡三角瓶使孢子分散，然后使用无菌水进行稀释，制成106~108个/mL的单孢子悬浮液；取制备好的单孢子悬浮液5mL加入到无菌培养皿中，在无菌培养皿中加入无菌转子，并放置于暗室中的磁力搅拌器上进行搅拌，开启紫外灯垂直照射，紫外灯功率为20W，照射距离为30cm，照射时间为20min，照射后取100μL涂布选择平板，用黑布包裹后置于恒温培养箱中培养3~5d。ARTP诱变处理方法：取制备好的106~108个/mL的单孢子悬浮液10 µL 稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，ARTP 诱变条件为射频功率60 W、处理距离2 mm、载气流量12 SLM (Standard liters per minute)、处理温度为室温（20~40℃）、处理时间选择致死率达到90%以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1 mL 无菌生理盐水的EP管中，震荡混匀，然后稀释到10-1、10-2倍，取100 µL均匀涂布到选择平板上，每个梯度做两个平行，置于恒温培养箱中进行培养3~5d。黑曲霉CICC40550变种是天津科技大学微生物菌种保藏管理中心以中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的黑曲霉CICC40550突变获得。
菌种初筛方法：使用变色圈法，将诱变后的孢子悬浮液涂布于选择平板上培养3~5天，选择变色圈与菌落直径之比较大的菌株接种于装有0.1mL发酵培养基的96孔板中发酵培养，并同时接种到另一块平板上置于恒温培养箱中培养，96孔板发酵培养结束后检测产酸，挑取发酵产酸较高的菌种，将平板上对应序号的菌种进行保藏。
菌种复筛方法：将初筛甘油管保藏的菌种活化培养，并连续传代，接种至摇瓶中进行摇瓶发酵培养，测发酵摇瓶产酸，挑取产酸较高的菌种保存。
遗传稳定性试验：
将上述筛选获得的柠檬酸高产菌株活化后，进行稀释分离制成单孢子悬浮液，进行连续摇瓶传代10代，每一代菌株先进行种子培养，选择遗传稳定和产酸高的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把柠檬酸高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。
将最终获得的一株柠檬酸高产菌株angzh1010再连续传种十次，使用30L发酵罐培养考察其柠檬酸的产量。结果如下：
表1 菌株angzh1010的遗传稳定性
从表1中可以看出，突变菌株angzh1010的遗传稳定性良好，连续传代10次在30L发酵罐培养结束的柠檬酸产量基本稳定在265g/L左右，菌株angzh1010的遗传稳定性良好。
对比实验：
使用本发明中的黑曲霉angzh1010和原菌株CICC40550变种，按照本发明中的实施例2的方法以葡萄糖为原料分别进行30L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：
表2 突变菌株和出发菌发酵生产柠檬酸的性能比较
从表2中可以看出，本发明中的菌株angzh1010相比出发菌产酸、转化率都有了较大改善，菌株angzh1010生产柠檬酸的能力得到了较大提升，并且产酸稳定，应用于柠檬酸工业化生产，可以显著提高发酵产酸率和转化率，降低生产成本，具有较好的工业化应用潜力。
对该菌株进行传代保藏，命名为黑曲霉angzh1010，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger），保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.40449，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
中国科学院微生物研究所对黑曲霉angzh1010的细胞形态、生理生化特征、ITS基因序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）等项目进行了检测鉴定，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号angzh1010的鉴定结果为黑曲霉（Aspergillus niger）。
本发明中的黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，在发酵法生产柠檬酸的应用过程中，该菌种产酸和转化率相比出发菌有了明显提高，经过多次传代该菌种仍具有良好的稳定性，该菌种不仅可以利用葡萄糖发酵，而且可以利用淀粉液化液进行发酵，在实际生产过程中减少了淀粉糖化的工序，可以大大降低生产成本，该菌种培养基成分简单，培养条件粗放，易于规模化生产，具有较好的工业应用前景。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (7)
1.一株黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉为黑曲霉（Aspergillus niger）angzh1010，该黑曲霉angzh1010保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCCNo.40449。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉的应用，其特征在于，采用黑曲霉angzh1010发酵制备柠檬酸。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉的应用，其特征在于，采用黑曲霉angzh1010发酵制备柠檬酸，包含如下步骤：
（1）发酵培养：将黑曲霉angzh1010接种于发酵培养基中培养60~65h，发酵过程中控制温度38~40℃、搅拌转速200~600rpm、每分钟空气流量按发酵液体积的40~60%控制；
（2）发酵液提取纯化。
4.根据权利要求3所述的黑曲霉的应用，其特征在于，发酵培养前还包含如下步骤：
（1）菌种活化：将黑曲霉angzh1010保藏菌种接种于平板或斜面上，置于35~36℃的恒温培养箱中培养3~5天；
（2）摇瓶培养：将斜面培养基上的孢子用无菌水清洗后，接种于摇瓶液体培养基内，35~36℃培养20~24h；
（3）种子培养：将培养成熟的摇瓶菌种接种于无菌种子培养基内，控制温度35~36℃，通入无菌空气进行培养。
5. 根据权利要求3~4任一项所述的黑曲霉的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含总糖含量150~250g/L的淀粉液化液或葡萄糖、尿素5~9g/L、磷酸二氢钾0.5~1 g/L、硫酸镁0.5~5 g/L。
6. 根据权利要求4所述的黑曲霉的应用，其特征在于，所述的种子培养基包含总糖含量150~250g/L的淀粉液化液或葡萄糖、硫酸铵1~5 g/L。
7.根据权利要求3所述的黑曲霉的应用，其特征在于，将发酵培养结束的发酵液加热灭活处理，然后经过过滤去除菌体，过滤清液进行中和反应，反应后的沉淀进入调浆工序，调浆后的料液加入硫酸进行酸解反应，将反应生成的酸解液进行过滤、洗酸，滤液进入脱色工序进行脱色，脱色液依次进入阳离子交换柱和阴离子交换柱，对离子交换收集液进行浓缩、结晶，获得晶浆，晶浆进入离心机对母液进行分离获得晶体，晶体进行烘干得到柠檬酸成品。
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