CN103952318A - 高产柠檬酸黑曲霉菌fy2013及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株高产柠檬酸黑曲霉菌（Aspergillus niger）FY2013，其保藏编号为CGMCC No.8832。本发明还提供高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因组序列（SEQ ID No.59），可用于柠檬酸高效合成功能基因组学、酶学、工程菌株构建、合成其它有机酸（如苹果酸、丁二酸、富马酸等）等研究。本发明为进一步明晰产柠檬酸黑曲霉遗传特征、基因组背景，掌握柠檬酸合成代谢途径提供了客观依据，为进一步构建更为优越的产柠檬酸菌种提供了可靠数据资料。

Description

高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。

背景技术

柠檬酸是一种非常重要的有机酸，广泛应用于食品工业和日化行业等。目前工业上使用发酵法生产柠檬酸。高产柠檬酸菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，几十年来柠檬酸生产菌种黑曲霉的选育研究一直是研究人员关注的焦点。

1940年美国科学家克雷伯斯提出三羧循环（TCA循环）学说，柠檬酸的发酵机理逐渐得到认识。含糖类原料生成柠檬酸的生化转化过程中，葡萄糖通过糖酵解途径（EMP途径）生成丙酮酸，丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和草酰乙酸（由丙酮酸羧化所生成）缩合成为柠檬酸。

柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，柠檬酸合成酶活性很高时，有利于柠檬酸的大量合成和积累。

黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶首先将含有淀粉的原料转变为葡萄糖，葡萄糖经过EMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸由丙酮酸氧化酶生成乙酰辅酶A和CO₂，继而乙酰辅酶A与草酰乙酸在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用合成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子、同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，三羧酸循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸大量合成和积累并排出菌体外，其理论反应式为：

C₆H₁₂O₆+1.5O₂→C₆H₈O₇+2H₂O

柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。

柠檬酸菌种的优劣对于柠檬酸产量和生产成本起到重要作用，要实现高产柠檬酸发酵，降低生产成本，柠檬酸菌种的驯化和选育是关键。一株优良的柠檬酸菌种应具备耐高酸和产高酸的性能。本发明以黑曲霉菌株FY2010为出发菌种（ACCC30161），从发酵良好产酸高的薯干醪柠檬酸发酵液中分离菌株，通过一系列物理和化学诱变、酸度驯化得到58株耐酸菌株，再复筛得到9株既耐酸又产酸高的菌株，进一步优筛得到1株耐酸、产酸高、高糖酸转化率的优良菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一株高产柠檬酸黑曲霉（Aspergillusniger）FY2013，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.8832，保藏日期2014年2月20日。

本发明还提供所述黑曲霉FY2013的部分基因组序列，见SEQ ID No.59。

其全基因组序列共含34853277个核苷酸。GC含量28.18%，包括313个预测的开放阅读框（ORF）。

本发明还提供所述黑曲霉FY2013在发酵生产柠檬酸中的应用，包括以下步骤：

1）种曲制备：

取5mL无菌水至黑曲霉菌株FY2013的培养平板上，用接种环刮下孢子至200mL无菌水中，制成孢子悬液，用于柠檬酸种子罐培养；

2）种子罐培养：

种子罐中加入20L水，然后称取8kg玉米粉加入种子罐中混匀，加入5mL淀粉酶（90000u/ml），加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，然后将液化液进行固液分离，再将液化后分离的糖液重新装入种子罐中，总糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2mL消泡剂，121℃加热灭菌20min，然后冷却至37℃，保温，接入制备好的菌株FY2013孢子悬液，37℃进行种子扩大培养，22h后，取少量种子液镜检并测定其pH值，镜检无污染且菌球生长良好，当种子液pH降至3.0时，将种子液接入发酵罐中，进行柠檬酸发酵产酸；

3）利用黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸：

称取9kg玉米粉、22kg水、6mL淀粉酶，混匀后加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，液化后对液化液进行固液分离，将糖液装入发酵罐中，加入20g/L大豆粉，用柠檬酸调pH为4.8，并加入消泡剂2mL，110℃加热灭菌15min，冷却至37℃，保温，接入上述培养好的种子液，进行柠檬酸发酵，接种量为10%，接种后总糖控制在19.8%，发酵温度为37±1℃，罐压控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，发酵时间60h；

其中，步骤1）中使用的培养基配方为：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1L，pH自然。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的苹果酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的乌头酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-酮戊二酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.25所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因组序列（SEQ IDNo.59），可用于柠檬酸高效合成功能基因组学、酶学、工程菌株构建、合成其它有机酸（如苹果酸、丁二酸、富马酸等）等研究。本发明为进一步明晰产柠檬酸黑曲霉遗传特征、全基因组背景，掌握柠檬酸合成代谢途径提供了客观依据，为进一步构建更为优越的产柠檬酸菌种提供了可靠数据资料，并为我国高产柠檬酸黑曲霉菌种可利用蔗糖作为碳源生产柠檬酸奠定了坚实基础。

附图说明

图1为本发明实施例4中PCR扩增α-淀粉酶基因的凝胶电泳检测结果。

图2为本发明实施例4中α-淀粉酶SDS-PAGE分析结果。

图3为本发明实施例5中PCR扩增葡萄糖氧化酶基因的凝胶电泳检测结果。

图4为本发明实施例6中PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。

图5为本发明实施例6中葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE分析结果。

图6为本发明实施例7中PCR扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。

图7为本发明实施例7中6-磷酸葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE分析结果。

图8为本发明实施例8中PCR扩增苹果酸脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。

图9为本发明实施例9中PCR扩增乌头酸酶基因的凝胶电泳检测结果。

图10为本发明实施例9中乌头酸酶SDS-PAGE分析结果。

图11为本发明实施例10中PCR扩增α-酮戊二酸脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。

图12为本发明实施例10中α-酮戊二酸脱氢酶SDS-PAGE分析结果。

图13为黑曲霉菌株FY2013柠檬酸合成代谢途径示意图；其中，虚线表示相关酶失活或活力减弱，②⑤酶失活，③④⑥⑦酶活性减弱。

其中，图1-12中1表示黑曲霉菌株FY2010；2表示黑曲霉菌株FY2013。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1高产柠檬酸黑曲霉菌株的构建

诱变育种是以强烈因子处理微生物细胞群体（或孢子），促使微生物细胞中遗传物质（主要是DNA）结构发生变化，引起诱变突变，进而设法从大量的变异群体中筛选出优良的突变株的过程。诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等特点，是柠檬酸生产育种常用的一种方法。

1、柠檬酸产生菌的诱变都采用活化状态的分散孢子进行处理。具体操作为：将出发菌株FY2010（购于中国农业微生物菌种保藏中心，保藏编号ACCC30161）的孢子转接于麦芽汁斜面培养基上，于37℃培养8天，长好孢子后，用生理盐水将孢子洗下，再用0.05M Tris缓冲液(pH6.0)洗涤一次，转到小三角瓶中，用玻璃珠振荡打散，然后通过一层宣纸过滤，滤去菌丝断片和没有打散的孢子团，制成单孢子悬浮液。

所述麦芽汁斜面培养基为：①取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6-12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。②将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3-4小时，糖化程度可用碘滴定之。加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。③将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。④将滤液稀释到5-6波美度，pH6.4，加入2%琼脂即成。121℃灭菌30min。其中麦芽汁主要成分是麦芽糖。

2、诱变育种

本发明采用：Co⁶⁰γ-射线处理→高温处理→亚硝基胍处理等低剂量复合处理2次，具体为：

①将上述制得的黑曲霉孢子悬浮液20ml（含量为100个/ml）置于25ml比色管中于Co⁶⁰γ射线下照射，剂量为800-1200Gy，照射后的孢子悬浮液稀释10000倍，取0.1ml涂布添加10g/L蛋白胨和酵母膏的察氏培养基中，置于37℃中培养，挑选长出的小菌落且孢子穗大而稀少者，转接于6°Bé（所述°Bé即波美度的简称，是指采用玻璃管式浮计中的一种特殊分度方式的波美计所给出的值称为波美度，符号为°Bé，用于间接地给出液体的密度）麦芽汁斜面上，37℃培养8d，长满孢子后，制成孢子悬浮液，待用。其中所述察氏培养基为：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

②上述孢子悬浮液置于高温下处理，处理强度为90℃、5min，处理后进行稀释平板分离，挑取小菌落且孢子穗大，转接于6°Bé麦芽汁斜面上，37℃培养8d，长满孢子后，制成孢子悬浮液，待用。

③称取1mg的亚硝基胍（NTG）加入到10ml丙酮溶液中，配成0.1mg/ml的溶液，再加4倍柠檬酸缓冲液（0.1M，pH5.5）制得0.02mg/ml溶液。取上述制得的孢子悬浮液0.9ml，于37℃恒温水浴中预热5min，加入0.1ml浓度为0.02mg/ml的亚硝基胍溶液，37℃水浴中保温处理30min，取出后以3000r/min离心分离，弃去上清液，用预先冷却的无菌生理盐水或缓冲液进行洗涤离心10次以上，最后用生理盐水恢复到原有体积，进行平板分离。具体方法同上，将制成的孢子悬浮液再经过γ射线、高温和亚硝基胍处理1次。

3、突变菌株的筛选

（1）浓缩过滤筛选，采用以柠檬酸钠为唯一碳源的培养基

称取柠檬酸钠2g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.05g、磷酸氢二钾0.01g、氯化钾0.05g、硝酸钠0.3g，加水溶解，pH5.0，定容至100ml，121℃灭菌20min。

将完成2次复合诱变处理后的孢子悬浮液直接涂布在察氏培养基平板上，37℃培养，挑选长出的小菌落且孢子穗大，转接于8°Bé麦芽汁斜面上，37℃培养7天，长满孢子后，制成孢子悬浮液，将此孢子悬浮移植于30ml的以柠檬酸钠为唯一碳源的合成培养基中，37℃培养36h，经两层薄宣纸过滤，滤去菌丝获得的过滤液，稀释10000倍。

（2）标记培养基筛选

酸性薯干粉水解液平板，配制方法：A液：称取薯干粉20g，加入α-淀粉酶，75℃酶解20min，过滤获得滤液，加入4g琼脂定容至100ml，于121℃下灭菌30min，冷却至室温；B液：称取20g柠檬酸定容至100ml，121℃灭菌20min。使用前，将A琼脂溶化，冷却至50℃，迅速加入B溶液，立即倒平板。

高柠檬酸高渗察氏平板，配制方法：A液：称取20g柠檬酸，加少量水溶解后，定容至35ml；B液：称取硝酸钠0.3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.05g、氯化钾0.05g、硫酸亚铁0.001g、蔗糖3g、琼脂1.5g、pH7.3，定容至65ml；将A液在121℃下灭菌15min，B液121℃灭菌30min，都冷却至45℃，将A、B液迅速混合均匀，立即倒平板。

葡萄糖为唯一碳源合成培养基平板，称取葡萄糖2g、磷酸二氢钾0.05g、硝酸铵0.2g、硫酸镁0.1g、琼脂2g，定容至100ml，121℃灭菌20min，冷却至45℃，倒平板。

高金属离子浓度平板，称取蔗糖3g、硝酸钠0.2g、硫酸镁0.05g、磷酸二氢钾0.1g、氯化钾0.05g、硫酸亚铁0.5g、硫酸锰0.01g、硫酸铜0.01g、硫酸锌0.05g、琼脂2g、pH5.0-6.0，定容至100ml，121℃灭菌20min，冷却至45℃，倒平板。

将经过浓缩筛选的过滤稀释液分别涂布在上述培养基上，37℃培养4天，再结合菌落形态，挑选出边缘整齐、光滑、隆起、菌丝色泽变浅、孢子穗大而稀少者，并具有耐高柠檬酸浓度（200g/L）、耐高糖浓度(200g/L)、耐高浓度金属离子（Mn²⁺≥0.05%、Zn²⁺≥0.03%、Cu²⁺≥0.04%、Fe²⁺≥0.2%等），不分解利用柠檬酸的突变株，共得到58株。

（3）摇瓶复筛，将前述所得到的突变株接入糖浓度为190g/L的发酵培养基中，挑选96h摇瓶产酸高于151g/L的菌株，使用麦芽汁固体培养基进行分纯，挑选单菌落再次接入上述发酵摇瓶培养基，如此重复10批次。上述发酵培养基为玉米粉培养基，具体配制方法为：称取1kg玉米粉、2kg水，1ml耐高温α-淀粉酶，混匀后，加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，液化后对液化液进行固液分离，将糖液装入锥形瓶中，糖浓度为190g/L，加入20g/L大豆粉，用柠檬酸调pH为4.8，并加入2ml消泡剂，110℃加热灭菌15min。挑选出细小菌球体，菌球体外的菌丝粗而短的高产柠檬酸突变株9株，对这9株突变株再经反复传代试验，除去回复突变株。

④进一步优筛得到1株耐酸产酸高转化率高的优良菌株。将前述所得到的菌株接入糖浓度为190g/L的发酵培养基中，挑选96h摇瓶产酸高于158g/L的菌株，使用麦芽汁固体培养基进行分纯，挑选单菌落再次接入上述发酵摇瓶培养基，如此重复10批次，得到一株高产菌株命名为FY2013（CGMCC No.8832）。

实施例2高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的全基因组序列测定

将待测序的黑曲霉菌株FY2013制成孢子悬浮液（具体方法见实施例1），送至华大基因公司进行全基因组测序。SEQ ID No.59是高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因组序列。菌株FY2013的基因组全长共34853277个核苷酸。GC含量28.18%。

实施例3黑曲霉菌株FY2010和FY2013基因组DNA提取及cDNA文库的构建

1、黑曲霉菌株FY2010基因组DNA的提取

采用十二烷基磺酸钠（SDS）法提取黑曲霉菌株FY2010基因组DNA，具体方法如下：

a.取10ml黑曲霉菌株FY2010孢子悬浮液，装入离心管中，8000g，4℃离心2min，收集菌体；

b.加入液氮迅速研磨成粉末，将细粉及时转入50ml的离心管中，加入10mlSDS提取缓冲液轻轻旋转混匀；

c.加入1ml20%SDS（pH7.2），混匀，65℃水浴保温45min，间或轻摇混匀；

d.加入5ml5mol/L醋酸钾，混匀后冰浴30min，10000rpm，4℃离心10min；

e.取上清，加入等体积的苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），混匀，10000rpm，4℃离心10min；

f.取水相，准确加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，冰上放置10min，7000rpm，4℃离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤，离心后溶于无菌ddH₂O；

g.加入30μl Dnase-free RNase（10mg/ml），37℃温育30min，异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，略风干，溶于TE溶液中，-20℃保存备用。

黑曲霉菌株FY2013基因组DNA提取方法同黑曲霉菌株FY2010。

2、黑曲霉菌株FY2010总RNA的提取

用RNAiso Plus提取试剂（购自TaKaRa公司）提取黑曲霉菌株FY2010的总RNA。具体方法为：

h.吸取10ml黑曲霉FY2010孢子悬液，装入离心管中，8000g、4℃离心2min，弃上清；

i.向沉淀中加入RNAiso Plus5ml，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置5min；

j.向上述裂解液中加入1ml氯仿，盖紧管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min；

k.12000g、4℃离心15min，从离心机中小心取出离心管，此时离心管中的裂解液分为三层：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相；

l.吸取上清转移至另一新的离心管中，切勿吸出白色中间层；

m.向上清中加入4ml异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；

n.12000g、4℃离心10min，离心后，管底出现白色沉淀，即为RNA；

o.弃去上清，切勿触及沉淀，还残留少量异丙醇，加入5ml75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤，7500g、4℃离心5min后，弃上清，再用75%乙醇清洗一次；

p.打开管盖，室温干燥沉淀至管中无乙醇的味道，加入1ml RNase-free水溶解沉淀，即为提取的总RNA。

黑曲霉菌株FY2013总RNA提取方法同黑曲霉菌株FY2010。

3、黑曲霉菌株FY2010cDNA文库的构建

用TaKaRa公司的PrimeScriot^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit，按试剂盒说明对提取的总RNA进行逆转录反应，从而获得黑曲霉FY2010菌株的cDNA文库。具体步骤为：

q.在PCR管中加入1μl Oliga dT Primer（50μM），1μl dNTP（10mM each），2μl提取的RNA，用RNase free水补齐至10μl；

r.65℃保温5min，冰上迅速冷却；

s.再向上述变性后的反应液中加入4μl5×PrimeScript Buffer，0.5μl RNase抑制剂（40U/μl），1μl PrimeScript Rtase(200U/μl)，用RNase free水补至20μl，缓慢混匀；

t.反转录反应为：30℃，10min，42℃，45min，95℃保温5min。反应结束后，反应液即为构建的黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库，可用于PCR扩增的模板。

黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库构建方法同黑曲霉菌株FY2010。

实施例4菌株FY2010与菌株FY2013的α-淀粉酶活性的比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶(alpha-amylase，Amy)基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉α-淀粉酶基因序列（GenBank：EU200666.1），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-TGAAGTTCATCCTCCTTCAC-3’，下游引物为：5’-ATAAACTTATACTCGAAAGT-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的α-淀粉酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶的编码序列见SEQ ID No.4，其氨基酸序列见SEQ ID No.3；黑曲霉菌株FY2013α-淀粉酶的编码序列见SEQ ID No.2，其氨基酸序列见SEQ ID No.1。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F1：5′-GATGGATCCATGAGACTATCGACTTCAAGTCTC-3′，反向引物R1：5′-GATGTCGACTTACTCGACGTATAATCTTCCGC-3′，其中斜体字母部分分别为酶切位点BamHⅠ和SalⅠ，以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板，进行PCR扩增。PCR反应在50μl总体系中进行，反应条件为：94℃变性5min；94℃变性60s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取3μl PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。取100μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的说明回收目的片段。

2、黑曲霉菌株FY2013α-淀粉酶基因的克隆

根据实施例4.1获得的黑曲霉菌株FY2013的α-淀粉酶基因序列，设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F1M：5′-GATGGATCCATGAGACTATTGACTTCAAGTCTC-3′，反向引物R1：5′-GATGTCGACTTACTCGACGTATAATCTTCCGC-3′，以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

3、两种α-淀粉酶氨基酸序列的同源性比较研究

黑曲霉FY2013α-淀粉酶氨基酸序列与黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶氨基酸序列相比，发生下列突变：S4L（S源于FY2010α-淀粉酶氨基酸序列，L源于FY2013α-淀粉酶氨基酸序列，以下相关内容与此一致）、I108M、K265E、V266Y、N292D、S398T。

4、黑曲霉菌株FY2010和FY2013α-淀粉酶表达载体的构建

将上述的两种α-淀粉酶PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切消化后，分别与用相同内切酶消化的pET-28b质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），挑取阳性克隆，提取质粒并酶切验证，构建好的含有黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶编码基因的载体命名为pET-Amy，含有黑曲霉菌株FY2013α-淀粉酶编码基因的载体命名为pET-AmyM。相关表达载体插入的目的基因片段进行序列测定分析并验证正确。

5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将pET-Amy质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自promega公司）感受态细胞；挑取1个阳性克隆，接种于含卡那霉素抗性（50mg/ml）的10ml LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，取2ml转接于1000mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养，待OD₆₀₀值约达2.0时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37℃诱导12h。。离心收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl（含1mmol/L咪唑）缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，取100μl上清加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，100℃沸水浴15min后，待用。

将镍离子亲和层析柱介质（Ni-NTA）填20ml层析柱中，用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后加NiSO₄溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl）洗柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni²⁺-NTA树脂柱中，反复加入2-3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液（即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑）洗涤介质以去除杂蛋白,最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的Amy蛋白，并进行SDS-PAGE分析（图2）。

黑曲霉菌株FY2013的α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化方法同黑曲霉菌株FY2010。

6、使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量

（1）试剂：用牛血清蛋白加去离子水配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液；称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%的乙醇，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1L。

（2）制作标准曲线：取7支试管，编号为0、1、2、3、4、5、6，按顺序加入1.0mg/ml的标准蛋白质溶液，分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用去离子水补充到0.1ml。然后再向各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，在旋涡混合器上混合。10min后，以0号试管为空白对照，在595nm处比色，测吸光值，以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

（3）样品中蛋白含量的检测：将待测样品按上述步骤加入试管中，用去离子水补充至0.1ml，再加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，在595nm处比色，测得的吸光值，对照标准曲线即可得知样品的蛋白含量。

7、α-淀粉酶的酶活测定

对纯化的α-淀粉酶进行酶活性分析，具体方法如下：在500ml柠檬酸缓冲液（pH6.0）加入可溶性淀粉0.05g，取配好的淀粉溶液0.5ml，65℃水浴保温5min，加入纯化的酶液10μl，37℃反应5min，DNS法测定生成还原糖的量。一个酶活力单位（U）定义为在上述反应条件下，每分钟转化生成等价于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量。酶比活力（U/mg）定义为在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

8、黑曲霉菌株FY2010与黑曲霉菌株FY2013α-淀粉酶酶比活比较研究

试验测得黑曲霉菌株FY2010α-淀粉酶酶比活为：267U/mg，黑曲霉FY2013菌株的α-淀粉酶的酶比活为：372U/mg。菌株FY2013的α-淀粉酶活力相较于黑曲霉菌株FY2010的提高约1.4倍，这可使柠檬酸合成代谢流增加。

实施例5菌株FY2010与菌株FY2013葡萄糖氧化酶活性的比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，God）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列（GenBank：J05242.1），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-CTTCTGATCAGCAACCAGCC-3’，下游引物为：5’-CATCTAAGTACCATCCCCTA-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的葡萄糖氧化酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶的编码序列见SEQ ID No.8，其氨基酸序列见SEQ ID No.7；黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶编码序列见SEQ ID No.6，其氨基酸序列见SEQ IDNo.5。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶编码基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F2：5’-GATGGATCCATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCG-3’，反向引物R2：5’-GATAAGCTTTCACTGCATGGAAGCATAATCT-3’。引物分别带有酶切位点BamHⅠ和HindⅢ。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增片段如图3所示。

2、黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶基因的克隆

根据实施例5.1获得的黑曲霉菌株FY2013的葡萄糖氧化酶基因序列，设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F2：5’-GATGGATCCATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCG-3’，反向引物R2：5’-GATAAGCTTTCACTGCATGGAAGCATAATCT-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

3、两种葡萄糖氧化酶氨基酸序列的同源性分析研究

与黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶氨基酸序列比对发现，黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶氨基酸序列在第254位氨基酸残基的编码序列发生突变，变成了TAG终止密码子，导致该酶基因表达过程中，多肽链合成提前终止。

4、葡萄糖氧化酶的酶活测定

分别取黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的发酵液各30ml，4℃，8000rpm，离心30min，收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl（含1mmol/L咪唑）缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，即为粗酶液。

检测方法是：将配置好的底物溶液（0.066mg/mL的邻联茴香氨溶液、10%葡萄糖溶液、过氧化氢溶液）放在25℃水浴锅中平衡5min，然后加入粗酶液，放入分光光度计中436nm下记录5min内吸光度值的增加。一个酶活力单位（U）定义为：在上述条件下，每分钟催化葡萄糖氧化生成1μmol D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯所需的酶量。

5、黑曲霉菌株FY2010与黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶酶活比较研究

在黑曲霉菌株FY2010菌体破碎上清液中检测葡萄糖氧化酶活为：1.23U/ml，而黑曲霉菌株FY2013菌体破碎后离心得到的上清液未能检测到此酶的活力，表明黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶表达被中断，导致该酶失去相应功能，使柠檬酸合成代谢流增加。

实施例6菌株FY2010与菌株FY2013葡萄糖脱氢酶活性的比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase，Gdh）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉葡萄糖脱氢酶基因序列（GenBank：AC253951.1），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-GAGTATGTATCAAGCGTAGC-3’，下游引物为：5’-TAGAGTCCTATATAGCTCGC-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的葡萄糖脱氢酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶编码序列见SEQ ID No.12，其氨基酸序列见SEQ IDNo.11；黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脱氢酶编码序列见SEQ ID No.10，其氨基酸序列见SEQ ID No.9。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F3：5’-GACGGATCCATGTCTTCCTCGTTACACGCTCC-3’；反向引物R3：5’-GACCTCGAGCTACTGCTCAGCCTTGATAATATC-3’。引物分别带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA为模板进场PCR扩增，扩增的片段如图4所示。

2、黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脱氢酶基因的克隆

根据实施例6.1获得的黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F3：5’-GACGGATCCATGTCTTCCTCGTTACACGCTCC-3’；反向引物R3：5’-GACCTCGAGCTACTGCTCAGCCTTGATAATATC-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

3、两种葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的同源性分析研究

黑曲霉FY2013葡萄糖脱氢酶氨基酸序列与黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶氨基酸序列相比，发生下列突变：A77D、N80I、N81D、K85N、E86N、P87R。

4、葡萄糖脱氢酶表达载体的构建

将上述的两种葡萄糖脱氢酶PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切消化后，分别与用相同内切酶消化的pET-28b质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），挑取阳性克隆，提取质粒并酶切验证，构建好的含有黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶编码基因的载体命名为pET-Gdh，含有黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脱氢酶编码基因的载体命名为pET-GdhM。相关表达载体插入的目的基因片段进行序列测定分析并验证正确。

5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

黑曲霉菌株FY2010和菌株FY2013葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化方法同实施例4。SDS-PAGE分析结果见图5。

6、使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量

纯化蛋白的蛋白含量测定具体方法同实施例4。

7、葡萄糖脱氢酶酶活测定

对纯化得到的葡萄糖脱氢酶蛋白进行酶活力分析。具体方法如下：纯化的酶液80μl、100μmol/L葡萄糖1ml、4μmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)1ml、0.6mmol/L Tris-HCl（pH6.8）1ml、10μmol MnSO₄1ml，充分混匀，37℃保温10min，在340nm波长下测还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的吸光度。一个酶活力单位（U）定义为在上述反应条件下，每分钟转化1μmol NADP产生NADPH所需的酶量。酶比活力（U/mg）定义为在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

8、黑曲霉菌株FY2010与菌株FY2013葡萄糖脱氢酶酶比活比较研究

试验测得黑曲霉黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脱氢酶酶比活为：64.2U/mg，FY2013葡萄糖脱氢酶的酶比活力为：33.6U/mg。菌株FY2013的葡萄糖脱氢酶活力下降，可使柠檬酸合成代谢流增加。

实施例7菌株FY2010与菌株FY2013的6-磷酸葡萄糖脱氢酶活力比较研究

1、黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶（Glucose6-phosphatedehydrogenase，G6dh）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因序列（GenBank：XM_001400305.2），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-CCGAATCTCTCACCTTTCCT-3’，下游引物为：5’-AATCAATCGCATTAACATCT-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.16，其氨基酸序列见SEQ ID No.15；黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.14，氨基酸序列见SEQ ID No.13。

再根据测得的黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F4：5’-GACGGATCCATGGCCAGCACAATAGCACGCAC-3’；反向引物R4：5’-GACGTCGACTTACAGACGGTTGGGGGTGGAAGT-3’。引物分别带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增的片段如图6所示。

2、黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

根据实施例7.1获得的黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶基因序列，设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F4：5’-GACGGATCCATGGCCAGCACAATAGCACGCAC-3’；反向引物R4：5’-GACGTCGACTTACAGACGGTTGGGGGTGGAAGT-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。

3、两种6-磷酸葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的同源性分析研究

黑曲霉FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶氨基酸序列与黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶氨基酸序列相比，发生下列突变：F40V、F135L、S476F、G478A。

4、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶表达载体的构建

将上述的两种6-磷酸葡萄糖脱氢酶PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切消化后，分别与用相同内切酶消化的pET-28b质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），挑取阳性克隆，提取质粒并酶切验证，构建好的含有黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的载体命名为pET-G6dh，含有黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的载体命名为pET-G6dhM。相关表达载体插入的目的基因片段进行序列测定分析并验证正确。

5、6-磷酸葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的表达

黑曲霉菌株FY2010和菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化方法同实施例4。SDS-PAGE分析结果见图7。

6、使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量

纯化蛋白的蛋白含量测定具体方法同实施例4。

7、6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活测定

对纯化得到的6-磷酸葡萄糖脱氢酶蛋白进行酶活力分析。具体方法如下：纯化的酶液80μl，100μmol/L葡萄糖1ml、4μmol/L NADP1ml、0.6mmol/L Tris-HCl（pH6.8）1ml、10μmol MnSO₄1ml，充分混匀，37℃保温10min，在340nm波长下测NADPH的吸光度。一个酶活力单位（U）定义为在上述反应条件下，每分钟转化1μmol NADP产生NADPH所需的酶量。酶比活力（U/mg）定义为在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

8、菌株FY2010与菌株FY20136-磷酸葡萄糖脱氢酶酶比活比较

试验测得黑曲霉黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脱氢酶比活为：43.7U/mg，菌株FY2013的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶比活力为：21.3U/mg。菌株FY2013的6-磷酸葡萄糖脱氢酶活力下降，可使柠檬酸合成代谢流增加。

实施例8菌株FY2010与菌株FY2013苹果酸脱氢酶酶活力比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase,Mdh）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉苹果酸脱氢酶基因序列（GenBank：XM_001396509.2），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-TCTTGACCACTGTCTCCTTT-3’，下游引物为：5’-TATTGGCATATCACCTATTG-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的苹果酸脱氢酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010苹果酸脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.20，其氨基酸序列见SEQ IDNo.19；黑曲霉菌株FY2013苹果酸脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.18，氨基酸序列见SEQ ID No.17。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010苹果酸脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F5：5’-GACGGATCCATGGTTAAAGCGGGTGTTCTTGGA-3’；反向引物R5：5’-GACAAGCTTCTTACTTTGGTGGGGGGTTCTT-3’。引物分别带有酶切位点BamHⅠ和HindⅢ。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增的片段如图8所示。

2、黑曲霉菌株FY2013苹果酸脱氢酶基因的克隆

根据实施例8.1获得的黑曲霉菌株FY2013的苹果酸脱氢酶基因序列，设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F5M：5’-GACGGATCCATGGTTAAAGCGGCTGTTCTTGGA-3’；反向引物R5：5’-GACAAGCTTCTTACTTTGGTGGGGGGTTCTT-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示。

3、两种苹果酸脱氢酶氨基酸序列的同源性分析研究

与黑曲霉菌株FY2010苹果酸脱氢酶氨基酸序列比对发现，黑曲霉菌株FY2013苹果酸脱氢酶氨基酸序列的第15位氨基酸残基发生终止，其编码序列改变形成终止密码子TAG，导致该酶基因表达过程中，多肽链合成提前终止。

4、苹果酸脱氢酶酶活检测

分别取黑曲霉菌株FY2010黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的发酵液各30ml，4℃，8000rpm，离心30min，收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl（含1mmol/L咪唑）缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，即为粗酶液。

测定方法为：30mmol/L丙酮酸钠溶液100μl，6mmol/L NADH100μl，15mmol/L草酰乙酸100μl，0.1mol/L pH7.5磷酸钾缓冲液2.8ml，再加入提取的粗酶液100μl，混匀，于25℃检测反应体系在340nm处吸光度的变化，根据每分钟吸光度的降低即可计算出酶活。酶活力单位定义为：25℃，pH7.5条件下，每分钟氧化1μmol的NADH所需的酶量。

5、黑曲霉菌株FY2010与突变体苹果酸脱氢酶酶活比较

在黑曲霉菌株FY2010菌体破碎上清液中检测苹果酸脱氢酶酶活为36.0U/ml，黑曲霉菌株FY2013菌体破碎上清液未检测到该酶的活力，表明FY2013的苹果酸脱氢酶表达被中断，使得苹果酸脱氢酶表达提前中断，导致该酶失去相应的功能。阻断了合成柠檬酸前体草酰乙酸的分解代谢，增加柠檬酸合成代谢流量。

实施例9菌株FY2010与菌株FY2013乌头酸酶酶活力比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶（aconitase，Aca）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉乌头酸酶基因序列（GenBank：AM270352.1），根据该酶编码基因的起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-TCGTAAGCTTGCTTGAGAAA-3’，下游引物为：5’-AGTTCGATCATGCATAACGA-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的乌头酸酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶编码序列见SEQ ID No.24，其氨基酸序列见SEQ IDNo.23；黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶的编码序列见SEQ ID No.22，氨基酸序列见SEQ ID No.21。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F6：5’-GACGAATTCATGGGTGACGCCAGCGAACCATATG-3’，反向引物R6：5’-GACGTCGACCTACCACTGCAAACCTGCATGCG-3’。引物分别带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增的片段如图9所示。

2、黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶基因的克隆

根据实施例9.1获得的黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F6：5’-GACGAATTCATGGGTGACGCCAGCGAACCATATG-3’，反向引物R6：5’-GACGTCGACCTACCACTGCAAACCTGCATGCG-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示。

3、两种乌头酸酶氨基酸序列的同源性分析研究

黑曲霉FY2013葡萄糖脱氢酶氨基酸序列与黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶氨基酸序列相比，发生下列突变，具体表现为M226V、N227Y、T376N、A377T、S529P、I530M、H580R。

4、乌头酸酶表达载体的构建

将上述的两种乌头酸酶PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切消化后，分别与用相同内切酶消化的pET-28b质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），挑取阳性克隆，提取质粒并酶切验证，构建好的含有黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶编码基因的载体命名为pET-Aca，含有黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶编码基因的载体命名为pET-AcaM。相关表达载体插入的目的基因片段进行序列测定分析并验证正确。

5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶在大肠杆菌中的表达

黑曲霉菌株FY2010和菌株FY2013乌头酸酶基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化方法同实施例4。SDS-PAGE分析结果见图10。

6、使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量

纯化蛋白的蛋白含量测定具体方法同实施例4。

7、乌头酸酶活力的测定

对纯化的乌头酸酶进行酶活性分析。具体方法如下：缓冲液46μl、纯化的酶液2μl，0.1M的柠檬酸溶液2μl，混匀，25℃反应30min，再加入显色液10μl，混匀，25℃保温10min，450nm处进行比色。一个酶活力单位定义为：在25℃条件下，每分钟转化1μmol柠檬酸形成异柠檬酸所需的酶量。酶比活力（U/mg）定义为在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

8、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶酶比活比较

试验测得黑曲霉菌株FY2010乌头酸酶酶比活为14.7U/mg，黑曲霉菌株FY2013乌头酸酶酶比活为8.1U/mg，黑曲霉菌株FY2013的乌头酸酶的酶活力下降，这表明黑曲霉菌株FY2013柠檬酸分解代谢减弱，有利于增加柠檬酸的产量。

实施例10菌株FY2010与菌株FY2013的α-酮戊二酸脱氢酶酶活力比较研究

1、黑曲霉菌株FY2010α-酮戊二酸脱氢酶（ketoglutarate dehydrogenase，Kdh）基因的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶基因序列（GenBank：XM_001401804.2），由起始密码子上游50-100个基因序列和终止密码子下游50-100个基因序列设计上、下游引物，上游引物为：5’-GTTGAGCTCATAGCATATTA-3’，下游引物为：5’-AGAACGAGCCAACGCTGACT-3’，分别以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，PCR扩增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的α-酮戊二酸脱氢酶基因序列，将扩增出的序列送至上海生工生物公司测序。测序结果为黑曲霉菌株FY2010α-酮戊二酸脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.28，其氨基酸序列见SEQ ID No.27；黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶的编码序列见SEQ ID No.26，氨基酸序列见SEQ ID No.25。

再根据测得的黑曲霉菌株FY2010α-酮戊二酸脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F7：5’-GACGCTAGCATGTTTCGTTCTACTGCCGTTAAGG-3’；反向引物R7：5’-GACGTCGACTTACTCGCCCTTGAGGCGCTCCT-3’。引物分别带有NheⅠ和SalⅠ酶切位点。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增的片段如图11所示。

2、黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶基因的克隆

根据实施例10.1获得的黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶基因序列设计带有酶切位点的引物，用于构建PET表达载体，其正向引物F7：5’-GACGCTAGCATGTTTCGTTCTACTGCCGTTAAGG-3’；反向引物R7：5’-GACGTCGACTTACTCGCCCTTGAGGCGCTCCT-3’。引物分别带有NheⅠ和SalⅠ酶切位点。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图11所示。

3、两种α-酮戊二酸脱氢酶氨基酸序列的同源性分析研究

黑曲霉FY2013α-酮戊二酸脱氢酶氨基酸序列与黑曲霉菌株FY2010α-酮戊二酸脱氢酶氨基酸序列相比，发生突变L878F。

4、α-酮戊二酸脱氢酶表达载体的构建

将上述的两种α-酮戊二酸脱氢酶PCR产物经限制性内切酶NheⅠ和SalⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切消化后，分别与用相同内切酶消化的pET-28b质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），挑取阳性克隆，提取质粒并酶切验证，构建好的含有黑曲霉菌株FY2010α-酮戊二酸脱氢酶编码基因的载体命名为pET-Kdh，含有黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶编码基因的载体命名为pET-KdhM。相关表达载体插入的目的基因片段进行序列测定分析并验证正确。

5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达

黑曲霉菌株FY2010和菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化方法同实施例4。SDS-PAGE分析结果见图12。

6、使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量

纯化蛋白的蛋白含量测定具体方法同实施例4。

7、α-酮戊二酸脱氢酶酶活力检测：

对纯化的α-酮戊二酸脱氢酶进行酶活性分析。具体方法如下：100μmol磷酸缓冲液（pH8.0）1ml，20μmol焦磷酸硫胺素20μl，20μmol MgCl₂20μl，125μmol2,4-二硝基苯酚(DPN)，13μmol辅酶A20μl，260μmol盐酸半胱氨酸20μl，260μmolα-酮戊二酸钾20μl，纯化的酶液860μl，混匀，室温放置10min，340nm比色。酶活力单位定义：每分钟催化生成1μmol琥珀酰辅酶A为一个酶活单位。酶比活力（U/mg）定义为在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

8、黑曲霉菌株FY2010与黑曲霉菌株FY2013α-酮戊二酸脱氢酶酶比活比较

试验测得黑曲霉菌株FY2010的α-酮戊二酸脱氢酶酶比活为：29.1U/mg，黑曲霉菌株FY2013的α-酮戊二酸脱氢酶酶比活为：15.3U/mg，黑曲霉菌株FY2013的酮戊二酸脱氢酶活力下降，这表明黑曲霉菌株FY2013柠檬酸分解代谢减弱，有利于增加柠檬酸的产量。

实施例11利用黑曲霉菌株FY2010与高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸试验

1、种曲制备

取5ml无菌水至黑曲霉菌株FY2010培养的平板（培养基配方为：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1L，pH自然）上，用接种环轻轻刮下孢子，至200ml无菌水中，轻轻摇晃制成孢子悬液，用于柠檬酸种子罐培养。

2、种子罐培养

种子罐中加入20L水，然后称取8kg玉米粉，加入种子罐中，混匀，加入5ml淀粉酶（90000u/ml），加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，然后将液化液进行固液分离，再将液化后分离的糖液重新装入种子罐中，总糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2ml消泡剂，121℃加热灭菌20min，然后冷却至37℃，保温，接入制备好的菌株FY2010孢子悬液，37℃进行种子扩大培养，22h后，取少量种子液镜检并测定其pH值，镜检无污染且菌球生长良好，当种子液pH降至3.0时，将种子液接入发酵罐中，进行柠檬酸发酵产酸试验。

3、利用黑曲霉菌株FY2010发酵生产柠檬酸

称取9kg玉米粉、22kg水，6ml淀粉酶，混匀后，加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，液化后对液化液进行固液分离，将糖液装入发酵罐中，加入20g/L大豆粉，用柠檬酸调pH为4.8，并加入消泡剂2ml，110℃加热灭菌15min，冷却至37℃，保温，接入上述培养好的种子液，进行柠檬酸发酵。接种量为10%，接种后总糖控制在19.8%，发酵温度为37±1℃，罐压控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，发酵时间为60h。黑曲霉菌株FY2010最终产酸为16.7%（每100ml），转化率为84.1%。

4、利用黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸

利用黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸试验具体方法同黑曲霉菌株FY2010生产柠檬酸。发酵法技术参数：发酵时间为60h。产柠檬酸达到19.5%（195g/L），转化率为98.5%。

黑曲霉菌株FY2013柠檬酸合成代谢途径如图13所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.黑曲霉（Aspergillus niger）FY2013，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.8832。

2.权利要求1所述黑曲霉FY2013的部分基因组序列如SEQ ID No.59所示。

3.权利要求1所述黑曲霉FY2013在发酵生产柠檬酸中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）种曲制备：

取5mL无菌水至黑曲霉菌株FY2013的培养平板上，用接种环刮下孢子至200mL无菌水中，制成孢子悬液，用于柠檬酸种子罐培养；

2）种子罐培养：

种子罐中加入20L水，然后称取8kg玉米粉加入种子罐中混匀，加入5mL淀粉酶（90000u/ml），加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，然后将液化液进行固液分离，再将液化后分离的糖液重新装入种子罐中，总糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2mL消泡剂，121℃加热灭菌20min，然后冷却至37℃，保温，接入制备好的菌株FY2013孢子悬液，37℃进行种子扩大培养，22h后，取少量种子液镜检并测定其pH值，镜检无污染且菌球生长良好，当种子液pH降至3.0时，将种子液接入发酵罐中，进行柠檬酸发酵产酸；

3）利用黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸：

称取9kg玉米粉、22kg水、6mL淀粉酶，混匀后加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，液化后对液化液进行固液分离，将糖液装入发酵罐中，加入20g/L大豆粉，用柠檬酸调pH为4.8，并加入消泡剂2mL，110℃加热灭菌15min，冷却至37℃，保温，接入上述培养好的种子液，进行柠檬酸发酵，接种量为10%，接种后总糖控制在19.8%，发酵温度为37±1℃，罐压控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，发酵时间60h；

其中，步骤1）中使用的培养基配方为：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1L，pH自然。

4.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

5.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

6.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

7.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

8.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的苹果酸脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

9.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的乌头酸酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

10.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-酮戊二酸脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.25所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。