CN115786140A - 一种高产赤霉素ga3的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。本发明通过增强表达藤仓赤霉菌中编码细胞色素P450还原酶CPR的基因和编码透明颤菌血红蛋白VHB的基因，增强赤霉素合成过程中的溶氧水平，增强了电子传递链的供应。本发明提供的高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌，经过改造后的重组藤仓赤霉菌相比于野生型增强了代谢后期氧化能力，提高了代谢过程的合成能力，提升了菌丝量的积累，能够更好的利用营养物质进行赤霉素GA3的生产，经过改造后性能最优的菌株在发酵产赤霉素GA3的水平相比于出发菌株从2g/L提高到3.45g/L，显著提升赤霉素GA3生产能力，并且菌丝量的提升可以增加赤霉素GA3合成的时空产率，可应用于大规模赤霉素GA3生产中。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。
(二)背景技术
赤霉素(Gibberellin Acid，GA3)是由植物、部分真菌合成的一种植物生长激素。因其特殊的刺激植物生长的能力被广泛应用于农业、园艺与酿酒生产。藤仓赤霉菌最早由日本的植物病理学家在研究水稻恶苗病发现，后续研究证实藤仓赤霉菌天然具有完整的GA3合成能力。GA3是一种四环二萜羧酸，分子式C19H22O6，分子量346.37，熔点233～235℃，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氢钠溶液以及pH为6.2的磷酸缓冲液，难溶于水和乙醚。藤仓赤霉菌中GA3的合成场所在细胞质，其生物合成由TCA循环合成的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)出发，经甲羟戊酸途径合成异戊烯焦磷酸(IPP)及其异构体二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)，后续由合成酶催化经由基焦磷酸(GPP)，法尼基焦磷酸(FPP)合成前体二基焦磷酸(GGPP)。在赤霉素合成基因簇的作用下，两分子GGPP环化合成焦磷酸古巴酯(CPP)后，产生了贝壳杉烯。在C-19上由P450单加氧酶逐步氧化产生贝壳杉烯酸，后续通过在C-7α与C-6β位置的氧化产生GA12-半醛，P450单加氧酶在C-3β与C-7的氧化产生GA14，GA14通过氧化转化为GA4，经去饱和作用生产GA7，经羟基化转化为GA3。GA3作为一种次级代谢产物，一般通过液态发酵、固态发酵与植物提取的方式获得。目前GA3的生产主要依赖液体深层发酵或固态发酵。中国发明专利(公开号CN104892554A、CN201910304928.1与CN201910438160.7)分别描述了GA3的制备方法、诱变结果与ARTP的诱变技术并且获得了具有一定工业生产能力的菌株。中国发明专利(公开号CN114517161A)已经描述，通过增强表达藤仓赤霉菌中编码氮源调控因子AreA的基因和全局调控因子Lae1的基因，可以增强其对赤霉素合成代谢路径中相关基因(cps/ks、p450-1、p450-2、des等)的正向调控作用，提高了相关基因的转录水平，以实现积累赤霉素GA3的目的。该策略通过对赤霉素合成代谢路径中GA基因簇整体转录水平，提高了代谢过程的合成能力，削弱了GA3合成相关基因的转录抑制，能够更好的利用碳源物质、氮源物质进行GA3的合成，相对于出发菌株能更高效的进行GA3的发酵生产。
溶氧作为影响菌丝体生长与产物合成后期氧化过程所需的重要因素，对微生物的代谢和生长尤为重要，适宜的氧气供应被视为实现工程微生物高效生产萜类化合物的先决条件。此外，电子传递链系统的有效性是实现高效合成的重要保障，赤霉素的代谢过程中主要以细胞色素P450单加氧酶系介导的逐步单加氧步骤为主，过低溶氧量会使菌丝体内的代谢过程发生变化，如厌氧呼吸会产生大量的乙酸、乙醇等，对细胞产生毒害。目前工业上，大规模发酵生产GA3以高转速长周期的深层发酵方式提高溶氧，极大提高生产成本与电力消耗。
(三)发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，提供一种高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。
本发明采用的技术方案是：
高产赤霉素GA3的基因工程菌，由如下方法构建获得：以藤仓赤霉为底盘菌，将其基因组中编码细胞色素P450还原酶CPR的基因和编码透明颤菌血红蛋白VHB的基因增强表达，并将编码氮源调控因子AreA的基因和编码全局调控因子Lae1的基因增强表达，获得所述高产赤霉素GA3的基因工程菌。
优选的，所述底盘菌为藤仓赤霉(Fusarium fujikuroi)CCTCC NO:M 2019378(已在在先申请CN110527630A中公开)。
本发明通过增强表达藤仓赤霉菌中表达细胞色素P450还原酶CPR的基因和编码透明颤菌血红蛋白VHB的基因，以增强其对赤霉素合成的溶氧水平与电子传递效率，提高了相关基因的氧化能力，此外，通过增强表达藤仓赤霉菌中表达氮源调控因子AreA的基因和全局调控因子Lae1的基因，增强其对赤霉素合成代谢路径中相关基因(cps/ks、p450-1、p450-2、des等)的正向调控作用，提高了相关基因的转录水平，实现了积累赤霉素GA3的目的。通过以上改造策略的组合，本发明成功获得了高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌菌株。
本发明还涉及构建所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：分别构建CPR和VHB基因的体外组装完整基因表达盒，将其导入引入底盘菌为藤仓赤霉中，得到所述基因工程菌。
优选的，所述CPR基因的完整基因表达盒，用来源于pAN7-1质粒的gpdA启动子和glaA终止子连接细胞色素P450还原酶的编码基因序列。
具体的，所述细胞色素P450还原酶的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，所述gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述glaA终止子核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
优选的，所述VHB基因的完整基因表达盒，用来源于构巢曲霉的tef1启动子和tef1终止子连接透明颤菌血红蛋白的编码基因。
具体的，所述透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID No.1所示，所述tef1启动子核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述tef1终止子核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素GA3中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25～30℃、200～300rpm条件下进行发酵培养150～200h获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得所述赤霉素GA3。
优选的，所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉70～90g/L，米粉70～90g/L，大豆粉10～30g/L，花生粉10～30g/L，硫酸钾0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30min。
通常，所述基因工程菌株发酵前，先进行斜面活化，再接种至种子培养基，在25～30℃、200～300rpm条件下培养。然后将种子液转接到发酵培养基中，在25～30℃、200～300rpm条件下培养。将培养液分离纯化，获得赤霉素GA3。
所述斜面活化方法为：将重组基因工程菌接种在种子培养基中，在25～30℃、200～300rpm条件下培养2天，涂布在PDA斜面上，在28℃培养4天，获得种子斜面。
所述种子培养基终浓度组成如下：玉米淀粉10～30g/L、蔗糖10～30g/L、花生粉10～30g/L、大豆粉10～30g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌，经过改造后的重组藤仓赤霉菌相比于野生型增强发酵过程中的溶氧水平与氧化中的电子传递效率，能够在发酵后期更高效的逐步氧化中间产物进行赤霉素GA3的生产；经过溶氧提升与电子传递链增强改造后性能最优的菌株在发酵产赤霉素GA3的水平相比于出发菌株从2g/L提高到2.61g/L，显著提升赤霉素GA3生产能力；在此基础上叠加调控模块中编码氮源调控因子AreA的基因和全局调控因子Lae1的基因的增强表达，可以进一步增强藤仓赤霉菌内GA3的合成能力，改造菌株的产量从2.61g/L提高到3.45g/L，同时具备了降低生物反应器的能源消耗的潜力，该工程菌株的生产力可应用于大规模赤霉素GA3生产中。
(三)附图说明
图1为生产菌株中GA3的合成过程；
图2为重组表达质粒结构图；
图3为工程菌株与出发菌株的发酵产量图；
图4为工程菌株经过多轮传代后的发酵结果；
图5为工程菌株与出发菌株的NADP+/NADPH浓度(A)与体积溶氧系数图(B)；图A中，左为NADPH浓度，右为NADP+浓度；
图6为工程菌株的转速优化结果。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。本发明所使用的术语“增强”指的是通过基因的过表达，增加由对应的多核苷酸编码的酶的活性。
实施例1：F.fujikuroi-OE:CPR的获得
通过PCR使用引物1和2，以pAN7-1质粒为模板扩增得到gpdA启动子片段，PCR反应条件如下：98℃5min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延续5min。按同样的方法使用引物3和4扩增得到glaA终止子片段，使用引物5和6扩增得到潮霉素hyg片段。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段(gpdA启动子片段、glaA终止子片段和潮霉素hyg1片段核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8所示)。
通过PCR使用引物7和8，以藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)CCTCC NO:M2019378(CN110527630A)基因组为模板扩增得到cpr基因片段，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
将回收的三个DNA片段(gpdA启动子，cpr基因，glaA终止子)使用引物1和4进行融合PCR，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃5min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step CloningKit(购自南京诺唯赞Vazyme)连接，构建pUC19-Hyg1-PgpdA-CPR-TglaA载体，连接产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg1-PgpdA-CPR-TglaA载体。
藤仓赤霉菌原生质体制备，外源片段转化，复苏培养方案，验证方案如CN113832041A所述。转化后的单菌落以引物1和4进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE:CPR，质粒构建与转化过程如图2所示。
表1：引物序列
| 引物1 | tagtcatatggattgaattcggtaccgcttgtatctctacacacaggct |
| 引物2 | tgtccagagtgtcgagttcagccattgtgatgtctgctcaagcgg |
| 引物3 | aggaggatgtttggtcatagacaatcaatccatttcgctatag |
| 引物4 | accggcatgcaagctgattacccttttccttgattctcgc |
| 引物5 | gagaatcaaggaaaagggtaatcagcttgcatgccggt |
| 引物6 | aagctttctagaggtaccatcatacatgagaattaaggg |
| 引物7 | ccgcttgagcagacatcacaatggctgaactcgacactctggaca |
| 引物8 | ctatagcgaaatggattgattgtctatgaccaaacatcctcct |
实施例2：F.fujikuroi-OE:VHB的获得
通过PCR使用引物9和10，以构巢曲霉(Aspergillus nidulans CCTCC M 2010275)基因组为模板扩增得到tef1启动子片段，PCR反应条件如下：98℃5min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延续5min。按同样的方法使用引物11和12扩增得到tef1终止子片段，以pAN7-1质粒为模板使用引物13和14扩增得到潮霉素hyg2片段。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段(tef1启动子片段、tef1终止子片段和潮霉素hyg2片段核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示)。
将回收的两个DNA片段(tef1启动子，tef2终止子)以及vhb基因(核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，使用引物9和12进行融合PCR，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃3min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step CloningKit(购自南京诺唯赞Vazyme)连接，构建pUC19-Hyg2-Ptef1-VHB-Ttef1载体，连接产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg2-Ptef1-VHB-Ttef1载体。
转化载体后的藤仓赤霉菌单菌落以引物9和12进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE:VHB。
表2：引物序列
| 引物9 | ccttaattctcatgtatgatcgagacagcagaatcaccgc |
| 引物10 | atggtctgctggtccagcatggtgaaggttgtgttatgtt |
| 引物11 | tgtatgctcaggccgtggaggcggacattcgatttatgcc |
| 引物12 | aagctttctagaggtaccgtattgggatgaattttgt |
| 引物13 | tatggattgaattcggtaccatcagcttgcatgccggtcg |
| 引物14 | gcggtgattctgctgtctcgatcatacatgagaattaagg |
| 引物15 | aacataacacaaccttcaccatgctggaccagcagaccat |
| 引物16 | ggcataaatcgaatgtccgcctccacggcctgagcataca |
实施例3：F.fujikuroi-OE:CPR OE:VHB的获得
通过PCR使用引物17和18，以实施例2中的pUC19-Hyg2-Ptef1-VHB-Ttef1载体为模板，扩增VHB完整表达盒。PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19-Hyg1-PgpdA-CPR-TglaA载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞vazyme)连接，构建pUC19-Hyg1-PgpdA-CPR-TglaA-Ptef1-VHB-Ttef1载体，连接产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg1-PgpdA-CPR-TglaA-Ptef1-VHB-Ttef1载体。
转化载体后的藤仓赤霉菌单菌落以引物19和20进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE:CPR OE:VHB。
表3：引物序列
| 引物17 | CGAGACAGCAGAATCACCGCCCAAGTTAAG |
| 引物18 | GTATTGGGATGAATTTTGTATGCACGCGCT |
| 引物19 | GCATGCCATTAACCTAGGTA |
| 引物20 | GCGTTGGGGTGGACGAGAAA |
实施例4：F.fujikuroi-OE:CPR OE:VHB OE:AreA OE:Lae1的获得
以专利CN114517161A中的pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞vazyme)连接，构建pUC19-G418-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体，连接产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-G418-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体。
通过PCR使用引物21和22，以pUC19-G418-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体为模板，扩增AreA和Lae1的表达框片段。PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以Fusarium fujikuroi-OE:CPR OE:VHB为出发菌株，转化片段后的藤仓赤霉菌单菌落以引物23和24进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE:CPR OE:VHB OE:AreA OE:Lae1。
表4：引物序列
| 引物21 | GCTTGTATCTCTACACACAGGCTCA |
| 引物22 | GTATTGGGATGAATTTTGTATGCACGCGC |
| 引物23 | TCTGGCGCTGTGGGTGGTAAAGGGGTTGTA |
| 引物24 | CCAGATACCTGTGCCCGTACCAATATCCATGAT |
实施例5：不同基因型产赤霉素GA3工程菌的摇瓶发酵验证
将实施例1，2，3和4中构建的改造菌株和出发菌株分别接种于25mL种子培养基中，28℃、250rpm培养用作预培养物。48h后，接种2.8mL预培养物到装有40mL发酵培养基的500mL摇瓶，然后在28℃、250rpm培养7天。按照专利CN113832041A实施例7的HPLC检测方法检测GA3含量。发酵过程中，其发酵液中GA3含量变化如图3所示。
种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，pH自然，121℃灭菌30min。
发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉20g/L，花生粉20g/L，硫酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。
不同基因型的菌株发酵产量如表5所示。
表5
实施例6：高产赤霉素GA3工程菌的传代验证
按照专利CN113832041A的斜面培养基组成与培养条件，挑取实施例3和4中构建的改造菌株，经过连续5次传代，经过与实施例4相同的培养方法和HPLC分析，传代验证结果如图4所示。结果显示，赤霉素GA3的产量稳定，过表达CPR和VHB较出发菌株提高了30％以上，生物量较出发菌株有明显提升，结合专利CN114517161A中报道的AreA和Lae1对赤霉素产量的影响，改造菌株产量最高可以达到3.45g/L。
实施例7：高产赤霉素GA3工程菌的溶氧水平与电子传递效率
在赤霉素GA3的生物合成中，途径中由P450酶系统催化的氧化步骤占据了主要过程，因此发酵过程中菌丝对氧气的需求巨大。通过对编码细胞色素P450还原酶CPR的基因和编码透明颤菌血红蛋白VHB的基因的增强表达，工程菌内氧摄取和电子传递的能力与效率得到明显提高。采用Beyotime NADP+/NADPH检测试剂盒测定NADPHTotal和NADP+/NADPH比值用于对比工程菌与出发菌株的电子传递效率，工程菌株与出发菌株的NADP+/NADPH浓度与体积溶氧系数如图5所示。
结果显示，相较于出发菌株，工程菌CVAL的NADPtotal水平提高了14％，NADP+/NADPH提高了5％。说明菌内电子传递效率有了显著的提升并被用于氧化过程。采用亚硫酸钠氧化法测定了体积氧传递系数(kla)用于对比工程菌与出发菌株的氧摄取能力。相较于出发菌株，工程菌CVAL的体积氧传递系数提高了64％，说明菌内溶氧水平明显提高。
实施例8：高产赤霉素GA3工程菌的转速优化
赤霉素GA3的生物合成过程中需要高转速与高曝气量维持菌丝生长与发酵体系内的溶氧需求，并且在工业大规模发酵应用中，生物反应器内为了维持高溶氧水平，采用长周期的高转速搅动与高通气量也会显著增加生产成本。工程菌CVAL的氧摄取和电子传递的能力与效率较出发菌株已有明显提高。因此考察不同转速下GA3的合成是否会受到影响，从而达到实际生产中降低成本的目的。采用250rpm,220rpm,200rpm,180rpm进行发酵验证，结果如图6所示。结果显示转速下调至220转，GA3产量仍保持稳定，更低的转速会影响GA3积累。
实施例9：高产赤霉素GA3工程菌的培养条件优化
表面活性剂不仅能影响到发酵液内的传质过程，还能够通过在细胞表面的吸附来调节细胞的表面性质。在发酵过程中少量添加表面活性剂可以达到消泡的目的，并且不会对细胞产生毒害。对工程菌CVAL为出发菌株进行发酵优化，尝试在发酵过程中梯度添加非离子表面活性剂吐温80(表6)。发酵结果表明少量添加吐温80(0.5g/L)可以提高发酵效率，并且菌丝生长未受到影响，添加量较多会产生细胞毒性，从而影响产物积累，最终获得赤霉素GA3产量为3.5-3.7g/L。
表6
| 吐温80添加量 | GA<sub>3</sub>产量g/L |
| 0 | 3.4-3.5 |
| 0.25 | 3.4-3.6 |
| 0.5 | 3.5-3.7 |
| 0.75 | 3.1-3.3 |
| 1.0 | 2.6-2.8 |
Claims (10)
1.高产赤霉素GA3的基因工程菌，由如下方法构建获得：以藤仓赤霉为底盘菌，将其基因组中编码细胞色素P450还原酶CPR的基因和编码透明颤菌血红蛋白VHB的基因增强表达，并将编码氮源调控因子AreA的基因和编码全局调控因子Lae1的基因增强表达，获得所述高产赤霉素GA3的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述底盘菌为藤仓赤霉(Fusariumfujikuroi)CCTCC NO:M 2019378。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于所述方法包括：分别构建CPR和VHB基因的体外组装完整基因表达盒，将其导入引入底盘菌为藤仓赤霉中，得到所述基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述CPR基因的完整基因表达盒，用来源于pAN7-1质粒的gpdA启动子和glaA终止子连接细胞色素P450还原酶的编码基因序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞色素P450还原酶的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，所述gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述glaA终止子核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述VHB基因的完整基因表达盒，用来源于构巢曲霉的tef1启动子和tef1终止子连接透明颤菌血红蛋白的编码基因序列。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQIDNo.1所示，所述tef1启动子核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述tef1终止子核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
8.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素GA3中的应用。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25～30℃、200～300rpm条件下进行发酵培养150～200h获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得所述赤霉素GA3。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉70～90g/L，米粉70～90g/L，大豆粉10～30g/L，花生粉10～30g/L，硫酸钾0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30min。
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