CN112779199B - 一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，所述的重组谷氨酸棒杆菌在谷氨酸棒杆菌中表达亚磷酸盐脱氢酶基因。所述的重组谷氨酸棒杆菌能够在不灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中发酵生产赖氨酸，解决了现有技术中赖氨酸生产菌株抗杂菌能力弱，容易受杂菌污染导致发酵失败的问题，并且简化了发酵流程，降低了发酵成本。

Description

一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及到一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸产品和其他化学品的重要工业菌种。L-赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，为人类和动物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，被广泛用于饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面，其中90％以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂。谷氨酸棒杆菌作为重要的赖氨酸生产菌株，其易受杂菌干扰，难以连续化发酵，因此我们需要对该菌株进行分子改造，使其抗杂菌能力增强，以实现后期赖氨酸的连续发酵。

亚磷酸盐脱氢酶(PtxD)是一种需氧的、NAD⁺依赖性酶，可将亚磷酸盐氧化成磷酸盐，同时将NAD⁺还原成NAD⁺H。该酶能够代谢利用低价态亚磷酸盐，同时产物伴随有还原型烟酰胺辅酶的生成，这两大特点使得亚磷酸盐脱氢酶在生物技术研究领域和工业生物催化的辅酶再生领域都有重要应用。大多数细菌只能利用磷酸盐中的+5价磷，而无法利用亚磷酸盐中的+3价磷，我们通过基因编辑技术改造谷氨酸棒杆菌，使它能够利用亚磷酸盐。我们将来自不同菌株的PtxD基因在谷氨酸棒杆菌中表达。改造后的菌株可以在只添加亚磷酸盐的发酵培养基中生长，从而在与污染菌株竞争时获得优势。最终使得重组菌可以在不灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中正常发酵而赖氨酸产量不受影响。同时，基于亚磷酸盐的代谢能够为微生物提供更多的能量与还原力，能够提高相关产品的产量和生产效率。目前尚无在谷氨酸棒杆菌中表达亚磷酸盐脱氢酶的方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种表达亚磷酸盐脱氢酶(PtxD)的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌可以在只添加亚磷酸盐的发酵培养基中正常生长，表现出更好的生存与生产性能，简化了生产流程降低生产成本。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒杆菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种重组谷氨酸棒杆菌，其是通过在所述的谷氨酸棒杆菌中表达PtxD基因构建得到的。

其中，所述的谷氨酸棒杆菌为ATCC31269、ATCC13032中的任意一种。

其中，所述的PtxD基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；其对应的来源菌株、基因命名和序列编号如表1 所示；

表1

来源菌株	基因命名	序列编号
			Pseudomonas stutzeri	PtxD<sub>Pst</sub>	SEQ ID NO.1
Pseudomonas putida	PtxD<sub>Ppu</sub>	SEQ ID NO.2
			Pseudomonas fluorescens	PtxD<sub>Pfl</sub>	SEQ ID NO.3
Pseudomonas aeruginosa	PtxD<sub>Pae</sub>	SEQ ID NO.4
			Klebsiella pneumoniae	PtxD<sub>Kpn</sub>	SEQ ID NO.5

其中，所述的表达PtxD基因是通过基因组整合表达的方式进行表达，即在谷氨酸棒杆菌基因组中的特定位置插入PtxD基因。

其中，所述谷氨酸棒杆菌基因组中的特定位置为对谷氨酸棒杆菌生产没有负面影响的DNA位点或基因，优选为ExeR基因；其中，所述ExeR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，将PtxD基因插入在谷氨酸棒杆菌基因组中ExeR基因的位点上进行表达。

其中，所述的表达PtxD基因也可以是通过质粒表达的方式进行表达，即将PtxD基因插入表达质粒进行表达。

其中，所述的质粒为谷氨酸棒杆菌常见的表达质粒，包括但不限于pXMJ19质粒。

优选地，将PtxD基因插入表达质粒pXMJ19中进行表达。

上述过程中，所述的表达由来自谷氨酸棒状杆菌的peftu启动子启动；其中，所述的peftu启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

其中，当通过基因组整合表达的方式表达PtxD基因时，在插入peftu启动子与PtxD基因后的ExeR基因，其核苷酸序列选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.12；其对应的来源菌株如表2所示；

表2

。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法。

其中，当通过基因组整合表达的方式表达PtxD基因时，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法为：pJYS3质粒用于基因敲除和基因替换，根据公开的方法在谷氨酸棒杆菌染色体中进行(Jiang Yu,Qian Fenghui,Yang Junjie,et al.CRISPR-Cpf1 assisted genomeediting of Corynebacterium glutamicum.2017,8:15179.)。

即，以谷氨酸棒杆菌的基因组作为模板，使用引物ExeR-R-F/ExeR-R-R扩增ExeR的上游同源臂ExeR-R，使用引物ExeR-L-F/ExeR-L-R扩增ExeR的下游同源臂ExeR-L；以敲除质粒pJYS3_crtYf为模板，使用引物ExeR-1-F和引物ExeR-1-R将质粒上原本存在的靶序列替换为敲除ExeR基因用的crRNA靶序列得到ExeR-1；将ExeR-R、ExeR-L、 ExeR-1与合成包含peftu启动子的PtxD基因序列克隆到限制酶ApaI/SwaI处理过的 pJYS3_crtYf质粒上，得到PtxD基因整合质粒；再导入谷氨酸棒杆菌中，即得重组谷氨酸棒杆菌。

具体地，其所对应的构建方法包括如下步骤：

(1)以谷氨酸棒杆菌的基因组作为模板，进行PCR，扩增，得到ExeR基因敲除位点的上游同源臂ExeR-R和下游同源臂ExeR-L；

(2)以敲除质粒pJYS3_crtYf为模板，进行PCR，以敲除ExeR基因用的crRNA靶序列替换质粒上原本存在的靶序列，得到ExeR-1；

(3)合成包含peftu启动子的PtxD基因序列；

(4)将步骤(1)得到的ExeR-R、ExeR-L，步骤(2)得到的ExeR-1和步骤(3) 得到的包含peftu启动子的PtxD基因序列克隆到限制酶ApaI/SwaI处理过的pJYS3_crtYf 质粒上，分别得到PtxD基因整合质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst，pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu， pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl，pJYS3_ExeR-PtxD_Pae，pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn；

(5)将步骤(4)得到的PtxD基因整合质粒分别导入谷氨酸棒杆菌中，通过测序验证基因导入是否符合预期，测序验证正确的PtxD基因整合菌株命名为Cg-Pst、Cg-Ppu、 Cg-Pfl、Cg-Pae、Cg-Kpn菌株。

步骤(1)中，所述的基因片段ExeR-R为引物1(ExeR-R-F)和引物2(ExeR-R-R) 扩增所得，所述的基因片段ExeR-L为引物3(ExeR-L-F)和引物4(ExeR-L-R)扩增所得；其中，基因片段ExeR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，基因片段ExeR-L 的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；引物1～4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18所示。

步骤(2)中，所述的ExeR-1为以敲除质粒pJYS3_crtYf为模板，使用引物5(ExeR-1-F) 和引物6(ExeR-1-R)将质粒上原本存在的靶序列替换为敲除ExeR基因用的crRNA靶序列所得；其中，所述的敲除ExeR基因用的crRNA靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；质粒上原本存在的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；ExeR-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示；引物5和引物6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22～ SEQ ID NO.23所示。

其中，当通过质粒表达的方式来表达PtxD基因时(以表达PtxD_Pst为例)，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法：将包含peftu启动子的PtxD_Pst基因克隆到表达质粒pXMJ19 上，得到重组质粒pXMJ19*PtxD_Pst；通过测序验证质粒构建是否符合预期，再导入谷氨酸棒杆菌中，即得重组谷氨酸棒杆菌。

具体地，所对应的构建方法包括如下步骤：

(I)构建表达质粒pXMJ19*PtxD_Pst

①合成得到包含peftu启动子的PtxD_Pst基因序列；

②将步骤①获得的多核苷酸与用限制酶BamHI处理的pXMJ19质粒进行一步克隆，得到用于表达PtxD_Pst基因的重组质粒pXMJ19*PtxD_Ps；通过测序验证质粒构建是否符合预期；

(II)将步骤(I)得到的重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，通过测序验证质粒导入是否符合预期，测序验证正确的PtxD基因表达菌株命名为Cg-OEPtxD_Pst菌株。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述重组谷氨酸棒杆菌在制备氨基酸中的应用。

优选地，所述的氨基酸为赖氨酸，即所述的应用为将所述的重组谷氨酸棒杆菌用于制备赖氨酸。

优选地，所述的应用为将所述的重组谷氨酸棒杆菌用于发酵制备赖氨酸。

进一步优选地，所述的应用为将所述的重组谷氨酸棒杆菌在灭菌或不灭菌的发酵培养基中发酵制备赖氨酸；其中，所述的发酵培养基为含有亚磷酸盐的发酵培养基，或不含有亚磷酸盐的发酵培养基；优选地，本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌可以在灭菌或不灭菌的含有亚磷酸盐的发酵培养基中发酵生产赖氨酸。

进一步优选地，所述将所述的重组谷氨酸棒杆菌用于发酵制备赖氨酸包括如下步骤：

(i)将所述的重组谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中培养，得到种子液；

(ii)将步骤(i)所得种子液接入发酵培养基中发酵，得到含有赖氨酸的发酵液。

步骤(i)中，所述的种子培养基中各组分的浓度为：蔗糖15～35g/L、蛋白胨5～15g/L、酵母粉1～10g/L、硫酸铵5～10g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、磷酸氢二钾5～15g/L、尿素1～5g/L，溶剂为水。

步骤(i)中，所述的培养为在28～34℃，200～250rpm条件下培养10～14h。

步骤(ii)中，将步骤(i)所得种子液按照10％～30％的体积比接入到发酵培养基中。

步骤(ii)中，所述的发酵培养基为灭菌的发酵培养基或不灭菌的发酵培养基。

步骤(ii)中，所述的发酵培养基为含亚磷酸盐的发酵培养基，或不含亚磷酸盐的发酵培养基。

其中，所述的亚磷酸盐包括但不限于亚磷酸二氢钾、亚磷酸钠、亚磷酸铵。

其中，所述的含亚磷酸盐的发酵培养基中，亚磷酸盐的浓度为0.1～10g/L，优选为1～5g/L。

优选地，所述的含亚磷酸盐的发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80～120g/L、硫酸铵30～50g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L、糖蜜10～25g/L、亚磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸亚铁100～300mg/L、硫酸锰100～200mg/L、烟酰胺40～80mg/L、泛酸钙5～15mg/L、VB1 5～15mg/L、硫酸铜0.5～2mg/L、硫酸锌0.5～2mg/L、生物素0.5～2mg/L、碳酸钙10～50 g/L，溶剂为水。

其中，所述不含亚磷酸盐的发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80～120g/L、硫酸铵30～50g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L、糖蜜10～25g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、玉米浆10～25g/L、硫酸亚铁100～300mg/L、硫酸锰100～200mg/L、烟酰胺40～80mg/L、泛酸钙5～15 mg/L、VB1 5～15mg/L、硫酸铜0.5～2mg/L、硫酸锌0.5～2mg/L、生物素0.5～2mg/L、碳酸钙10～50g/L，溶剂为水。

步骤(ii)中，所述的发酵为在28～34℃，200～250rpm条件下发酵。

步骤(ii)中，所述的发酵待发酵培养基中糖耗尽，结束发酵，得到含有赖氨酸的发酵液；其中，所述的糖为葡萄糖和糖蜜的组合。

其中，所述的待发酵培养基中糖耗尽为发酵60～90h；优选地，所述发酵的时间为72h。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势：

1、一般环境中的污染菌株不含有PtxD基因，不能利用亚磷酸盐作为磷源，而本发明构建了一株能表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌，通过改造的菌株可以在只添加亚磷酸盐的发酵培养基中生长，从而使重组谷氨酸棒杆菌在与污染菌株共同发酵时获得优势。

2、本发明构建了一株能表达亚磷酸盐脱氢酶的谷氨酸棒杆菌，该亚磷酸盐脱氢酶可以将催化反应所必须的氧化型烟酰胺辅酶(NAD⁺)还原为还原型烟酰胺辅酶 (NAD⁺H)，强化了辅因子NAD⁺H的供给从而提高产品的合成能力。

3、本发明提供了一种能抗杂菌污染的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，能够在不灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中发酵生产赖氨酸，解决了现有技术中赖氨酸生产菌株抗杂菌能力弱，容易受杂菌污染导致发酵失败的问题，并且简化了发酵流程，降低了发酵成本。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为构建好的质粒电泳图。其中，泳道1为重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst，泳道2为重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu，泳道3为重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl，泳道4为重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pae，泳道5为重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn，泳道6为原始质粒pJYS3_crtYf，泳道7为Marker。原始的pJYS3_crtYf质粒大小为11982bp，而重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu的大小为13196bp， pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Pae的大小为13196bp， pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn的大小为13196bp，从图中可以看出Pst、Ppu、Pfl、Pae、Kpn基因片段已经插入基因敲除质粒pJYS3_crtYf中。Marker的大小为15000bp。

图2为构建好的pXMJ19*PtxD_Pst质粒电泳图。泳道1为pXMJ19原始质粒，泳道2 为重组质粒pXMJ19*PtxD_Pst，泳道3为Marker。Marker的大小为12000bp。

图3为谷氨酸棒状杆菌ATCC31269原始菌和重组菌在发酵培养基与亚磷酸盐发酵培养基中的赖氨酸产量对比图。

图4为谷氨酸棒状杆菌ATCC31269重组菌Cg-Pst与枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌MG1655和酵母菌W303-1A混合后在亚磷酸盐发酵培养基中赖氨酸产量对比图。

图5为重组菌Cg-Pst与原始菌在不灭菌亚磷酸盐发酵培养基中的赖氨酸产量图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例使用的包含peftu启动子的PtxD基因序列以及引物由南京擎科生物科技有限公司合成。一步克隆酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。如无特别说明，其余酶均从TAKARA购买，质粒提取及胶回收试剂盒从天根购买。测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。

以下实施例中，赖氨酸的测定方法为：赖氨酸含量的测定样品适当稀释后，使预计赖氨酸含量在0.1～1.0mg/mL之间，用SBA_40E生物传感分析仪进行赖氨酸含量检测。

实施例1：构建亚磷酸盐脱氢酶表达菌株

(1)扩增ExeR基因敲除位点上下游两个基因片段，命名为ExeR-R、ExeR-L；具体而言，序列ExeR-R使用下述引物1(SEQ ID NO.15)和引物2(SEQ ID NO.16)，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行 30个循环：扩增了1007bp的基因片段(SEQ ID NO.13)。序列ExeR-L使用下述引物 3(SEQ ID NO.17)和引物4(SEQ IDNO.18)，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环：扩增了1000bp的基因片段(SEQ ID NO.14)。

PCR扩增的反应体系如下，总体系100μL(如无特殊说明，其余所有PCR反应均以此体系为准)。

(2)对敲除质粒pJYS3_crtYf进行PCR，以敲除ExeR基因用的crRNA靶序列替换质粒上原本存在的靶序列，得到ExeR-1(SEQ ID NO.21)；

具体而言，以敲除质粒pJYS3_crtYf为模板，使用引物5(SEQ ID NO.22)和引物6(SEQ ID NO.23)在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸10秒钟，进行30个循环，将质粒上原本存在的靶序列(SEQ ID NO.20)替换为敲除ExeR基因用的crRNA靶序列(SEQ ID NO.19)，扩增了110bp的基因片段，得到 ExeR-1(SEQ ID NO.21)。

(3)从擎科生物科技有限公司合成得到包含peftu启动子的PtxD基因；其中，peftu启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，PtxD基因的核苷酸序列如表1所示。

(4)将步骤(1)得到的ExeR-R、ExeR-L，步骤(2)得到的ExeR-1和步骤(3) 得到的包含peftu启动子的PtxD基因序列克隆到限制酶ApaI/SwaI处理过的pJYS3_crtYf 质粒上，分别得到PtxD基因整合质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst，pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu， pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl，pJYS3_ExeR-PtxD_Pae，pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn；其琼脂糖凝胶电泳见图1。泳道6是原始pJYS3_crtYf质粒，泳道1是构建好的质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst，泳道2是构建好的质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu，泳道3是构建好的质粒 pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl，泳道4是构建好的质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pae，泳道5是构建好的质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn，泳道7是Marker。其中，原始的pJYS3_crtYf质粒大小为 11982bp，而重组质粒pJYS3_ExeR-PtxD_Pst的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Ppu的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Pfl的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Pae的大小为13196bp，pJYS3_ExeR-PtxD_Kpn的大小为13196bp。

(5)将步骤(4)得到的PtxD基因整合质粒导入谷氨酸棒杆菌ATCC31269中，筛选得到PtxD基因整合的谷氨酸棒杆菌；通过测序验证基因整合是否符合预期，测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。测序验证正确的PtxD基因整合菌株命名为 Cg-Pst、Cg-Ppu、Cg-Pfl、Cg-Pae、Cg-Kpn菌株。

其中，上述引物1具有ApaI的限制酶识别位点，引物6具有SwaI的限制酶识别位点，限制酶识别位点用粗体标出，具体如表3；

表3

实施例2：

(1)构建PtxD_Pst表达质粒pXMJ19*PtxD_Pst

从擎科生物科技有限公司合成得到的包含peftu启动子的PtxD_Pst基因，其中，peftu 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，PtxD_Pst基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将获得的多核苷酸与用限制酶BamHI处理的pXMJ19质粒进行一步克隆，得到用于表达PtxD_Pst基因的重组质粒pXMJ19*PtxD_Pst，琼脂糖凝胶电泳见图2，泳道1是原始 pXMJ19质粒，泳道2是构建好的质粒pXMJ19*PtxD_Pst，泳道3是Marker。其中，原始的pXMJ19质粒大小为6601bp，而重组质粒pXMJ19*PtxD_Pst的大小为7908bp。从图中可以看出启动子peftu和PtxD_Pst基因片段已经插入表达质粒pXMJ19。

(2)将步骤(1)所构建的表达质粒pXMJ19*PtxD_Pst导入谷氨酸棒杆菌中，筛选得到PtxD_Pst基因表达的谷氨酸棒杆菌；通过测序验证质粒的导入是否符合预期，测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。测序验证正确的PtxD基因表达菌株命名为 Cg-OEPtxD_Pst菌株。

实施例3：重组菌与原始菌在灭菌的磷酸盐发酵培养基与灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中的赖氨酸发酵实验

活化培养基配方：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。

种子培养基配方：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。

磷酸盐发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20g/L、磷酸二氢钾1g/L、玉米浆20g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙40g/L。

亚磷酸盐发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20 g/L、亚磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙 40g/L。

每50mL离心管加5mL活化培养基，接入原始菌(谷氨酸棒杆菌ATCC31269)、和实施例1制备的重组菌Cg-Pst、重组菌Cg-Ppu、重组菌Cg-Pfl、重组菌Cg-Pae、重组菌Cg-Kpn，在30℃，220rpm条件下活化20h。

活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm 条件下培养12h，得到种子液。

每500mL的摇瓶倒入50mL的磷酸盐发酵培养基或亚磷酸盐发酵培养基，灭菌， 115℃，15min。

分别向磷酸盐发酵培养基和亚磷酸盐发酵培养基中接入5mL种子液(原始菌以及五种重组菌的种子液)，在30℃，220rpm条件下发酵72h。

利用原始菌和本发明构建的重组菌在磷酸盐发酵培养基与亚磷酸盐发酵培养基进行赖氨酸发酵实验，通过72h发酵实验，发酵结果见图3。从图3可以看出，原始菌株在亚磷酸盐发酵培养基中基本没有产量，在磷酸盐发酵培养基中有26g/L的赖氨酸产量；而改造后的五种重组菌株在亚磷酸盐培养基与磷酸盐发酵培养基中的产量基本相同，并且重组菌Cg-Pst的赖氨酸产量最高，是原始菌株在磷酸盐发酵培养基中产量的 1.56倍，达到了40.3g/L。

实施例4：重组菌Cg-Pst与大肠杆菌MG1655、枯草芽孢杆菌168、酵母菌W303-1A 的共同发酵实验

重组菌活化培养基配方：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。

LB培养基配方：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L。

YPD培养基配方：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。

重组菌种子培养基配方：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。

亚磷酸盐发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20 g/L、亚磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙 40g/L。

每50mL离心管加5mL活化培养基，分别接入实施例1制备的重组菌Cg-Pst和大肠杆菌MG1655、枯草芽孢杆菌168、酵母菌W303-1A，在30℃，220rpm条件下活化20h；其中，重组菌Cg-Pst使用重组菌活化培养基活化；大肠杆菌MG1655与枯草芽孢杆菌168使用LB培养基活化；酵母菌W303-1A使用YPD培养基活化。

活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm 条件下培养12h，得到重组菌Cg-Pst，以及大肠杆菌MG1655、枯草芽孢杆菌168和酵母菌W303-1A的种子液；其中，重组菌Cg-Pst使用重组菌种子培养基作为种子培养基；大肠杆菌MG1655与枯草芽孢杆菌168使用LB培养基作为种子培养基；酵母菌W303-1A 使用YPD培养基作为种子培养基。

每500mL的摇瓶倒入50mL的亚磷酸盐发酵培养基，灭菌，115℃，15min。

分别向亚磷酸盐发酵培养基中接入5mL种子液(1、重组菌Cg-Pst，2、重组菌Cg-Pst+ 枯草芽孢杆菌168，3、重组菌Cg-Pst+酵母菌W303-1，4、重组菌Cg-Pst+大肠杆菌MG1655)，在30℃，220rpm条件下发酵72h；其中，重组菌与对照菌接种体积比例为9：1。

通过混菌发酵，发酵结果见图4。从图4可以看出，污染菌株枯草芽孢杆菌、酵母菌与大肠杆菌的添加并没有明显影响重组菌株的赖氨酸产量。

实施例5：原始菌与重组菌在不灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中的发酵实验

活化培养基配方：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。

种子培养基配方：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。

亚磷酸盐发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20 g/L、亚磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙 40g/L。

每50mL离心管加5mL活化培养基，分别接入原始菌(谷氨酸棒杆菌ATCC31269) 与实施例1制备的重组菌Cg-Pst，在30℃，220rpm条件下活化20h。

活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm 条件下培养12h。

每500mL的摇瓶倒入50mL的亚磷酸盐发酵培养基，分别向亚磷酸盐发酵培养基中接入5mL原始菌的种子液和重组菌的种子液，在30℃，220rpm条件下发酵72h。

将原始菌与重组菌Cg-Pst接种到不经过灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中，通过72h发酵实验，发酵结果见图5。从图5可以看出，原始菌无法在不灭菌的亚磷酸盐发酵培养基中生产赖氨酸，而重组菌的赖氨酸产量几乎不受影响，仍有39.15g/L，是原始菌株在灭菌的原始发酵培养基中产量的1.51倍。

本发明提供了一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> 亚磷酸脱氢酶基因(ptxDPst)

<400> 1

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctgatgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgtc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgatcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

<210> 2

<211> 1011

<212> DNA

<213> 亚磷酸脱氢酶基因(ptxDPpu)

<400> 2

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctgatgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgcc gcgatgctca ggcgatgatg gtgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

accgtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgatcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

<210> 3

<211> 1011

<212> DNA

<213> 亚磷酸脱氢酶基因(ptxDPfl)

<400> 3

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctgatgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgcc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgatcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggcattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 亚磷酸脱氢酶基因(ptxDPae)

<400> 4

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctgatgac caaccagacc gacagcacgc tgccgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgcc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcaag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgatcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc cgggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggcattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

<210> 5

<211> 1011

<212> DNA

<213> 亚磷酸脱氢酶基因(PtxDKpn)

<400> 5

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctggtgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgtc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgagcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

<210> 6

<211> 2751

<212> DNA

<213> 胞外核酸酶基因(ExeR)

<400> 6

atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60

ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgctcctgt catcaacgaa 120

atctacggag gcggtggaaa cagcggatcg ttgttctcca acgacttcat tgagctctac 180

aacccaacct caggggacat ttccctcgac ggttggagcg ttacctacta cgcagccaac 240

ggtaactccg gcggaaccac aaacctgacc ggaaacatcc ctgccaacgg ttactacctc 300

atccagcaac gcgcaggcag caacaacacc ggcgctctgc ctaccccaga cgccaccggt 360

aacttggcaa tgggtgcctc ccaaggatca gttgcactga ccgacaactc tggcctaacc 420

gctgaccttg tcggattcgg tggcacgtcc atgtttgaag gaacagctgc tgcacctgag 480

accagcaaca aattgtctgt tcaacgcaaa gaagttggcg ctgactctga taacaactcc 540

gtagacttcg agactggagc tccaactcca acgtcctcgg gaggatccgc tcctgttgac 600

ccaggcgagc cagaaactcc agtaaaccct ggggaaacag tctccatcgc acaaatccaa 660

ggaaccggtc tcgctacccc actcgagggt cagaccgtca ccaccgaagg tattgtcact 720

gccgtttacg cagaaggtgg cttcaacggt tactacatcc agacacctgg atctggtact 780

gcaccaaagg ttgctggcga cgcatccgac ggcatcttcg tctacgtggg aagcaatggt 840

tcctacccag agctcggcgc atctgtcacc gtcactggca aggccaccga acactacgag 900

atgactcagc taggcaactc ctccttcacc gtttcggaca ccgcattcga gccagtaacc 960

ccactcgaac tggacaccgt tcctactggc gatgacattc gcgaagcata cgaaggcatg 1020

ctgctgaagc caaccggcgc tcacaccgtg accaacaact acgcaaccaa caccttcggt 1080

gaaattgccc tcgccccagg taacgagcct ttgtaccagg ccactcaaat ggtggcaccg 1140

ggagccgaag cgattgcgta cgaggcggaa aacgtcgcaa agcaaattac gctggatgac 1200

ggacgctccg gcaactacac tcgcggcgac tccagcacgc ctatggcatg gcttgtgcag 1260

gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt ccaggcacca 1320

gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc tgtcaccggc 1380

aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc tgagctagct 1440

tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct caactacttc 1500

acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa caacacccca 1560

gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact cgaagatcag 1620

cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg acttgaagaa 1680

atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc actcaatacc 1740

ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt cgaatctcca 1800

gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga ccaaaccacc 1860

gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg caccgcacgc 1920

cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt cgtcggcgta 1980

gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac cggcgacggc 2040

caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga ccacctggaa 2100

aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa ctcctacgcc 2160

aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc caccgaattc 2220

gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca cgcactcggc 2280

aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa cgctgacgaa 2340

gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt cgagaacaac 2400

gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag cgagaccact 2460

gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctaccgatcc aactacccca 2520

gttaagccaa ctgatccggt agagaccacg gatccatctg agccaaccga ccctgcagaa 2580

cctactgatc cagctgaacc aactgaccct gaggaaacga agaagccaga ggagccgaag 2640

aaccctggtt cctccaacgg aagctcccaa tacgccacca ttgcagcaat catcgcagca 2700

atcctaggtg ccattgcttt ggccttccag ttcttcccat tcaagttcta a 2751

<210> 7

<211> 290

<212> DNA

<213> 启动子(peftu)

<400> 7

agatcagtag gcgcgtaggg taagtggggt agcggcttgt tagatatctt gaaatcggct 60

ttcaacagca ttgatttcga tgtatttagc tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt 120

agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt 180

aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca 240

attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac gaagtccagg aggacataca 290

<210> 8

<211> 2928

<212> DNA

<213> 插入peftu启动子与PtxDPst后的ExeR基因(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60

ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa cagatcagta ggcgcgtagg 120

gtaagtgggg tagcggcttg ttagatatct tgaaatcggc tttcaacagc attgatttcg 180

atgtatttag ctggccgtta ccctgcgaat gtccacaggg tagctggtag tttgaaaatc 240

aacgccgttg cccttaggat tcagtaactg gcacattttg taatgcgcta gatctgtgtg 300

ctcagtcttc caggctgctt atcacagtga aagcaaaacc aattcgtggc tgcgaaagtc 360

gtagccacca cgaagtccag gaggacatac aatgctgccg aaactcgtta taactcaccg 420

agtacacgat gagatcctgc aactgctggc gccacattgc gagctgatga ccaaccagac 480

cgacagcacg ctgacgcgcg aggaaattct gcgccgctgt cgcgatgctc aggcgatgat 540

ggcgttcatg cccgatcggg tcgatgcaga ctttcttcaa gcctgccctg agctgcgtgt 600

agtcggctgc gcgctcaagg gcttcgacaa tttcgatgtg gacgcctgta ctgcccgcgg 660

ggtctggctg accttcgtgc ctgatctgtt gacggtcccg actgccgagc tggcgatcgg 720

actggcggtg gggctggggc ggcatctgcg ggcagcagat gcgttcgtcc gctctggcga 780

gttccagggc tggcaaccac agttctacgg cacggggctg gataacgcta cggtcggcat 840

ccttggcatg ggcgccatcg gactggccat ggctgatcgc ttgcagggat ggggcgcgac 900

cctgcagtac cacgaggcga aggctctgga tacacaaacc gagcaacggc tcggcctgcg 960

ccaggtggcg tgcagcgaac tcttcgccag ctcggacttc atcctgctgg cgcttccctt 1020

gaatgccgat acccagcatc tggtcaacgc cgagctgctt gccctcgtac ggccgggcgc 1080

tctgcttgta aacccctgtc gtggttcggt agtggatgaa gccgccgtgc tcgcggcgct 1140

tgagcgaggc cagctcggcg ggtatgcggc ggatgtattc gaaatggaag actgggctcg 1200

cgcggaccgg ccgcggctga tcgatcctgc gctgctcgcg catccgaata cgctgttcac 1260

tccgcacata gggtcggcag tgcgcgcggt gcgcctggag attgaacgtt gtgcagcgca 1320

gaacatcatc caggtattgg caggtgcgcg cccaatcaac gctgcgaacc gtctgcccaa 1380

ggccgagcct gccgcatgtt gacgactcca gcacgcctat ggcatggctt gtgcaggacg 1440

gtggcgagac catcaagtcc atccgcaccg gcgaccaggt ggaattccag gcaccagtaa 1500

tcttcgatta ccgctacgac ctgtggaaat tccagccaac cacccctgtc accggcaaca 1560

ccgcaagctc cgaccttcct atcacctggg atgacacccg cgcggctgag ctagcttcaa 1620

tcaatgacgt tgctggcgaa ttccacatcg caagcttcaa cgtgctcaac tacttcacct 1680

ctctcggcga agatgaacca ggctgcagcg catacaggga tatcaacaac accccagtca 1740

ccgccaacaa ctgtaacgtc cgtggcgctt acaccgaaga agcactcgaa gatcagcaga 1800

gcaagatcgt cgaagcaatc aaccgccttg acgtcgatgt tcttggactt gaagaaatcg 1860

aaaacaccgc gaccgtcacc ggcgacgtct cccgtcgcga tgacgcactc aataccctcg 1920

tcgcagcact caacgaagca gttggatccg atcgctgggc ggccgtcgaa tctccagaac 1980

aattgggcac cgatgaagac tacatccgcg tcgccttcat ctacgaccaa accaccgtca 2040

agcccgtcgg cgaatcccga atcttcgacg acgcagcctt caccggcacc gcacgccagc 2100

cactcgcaca ggaattccag ccactcaacg acagcgagaa atccttcgtc ggcgtagtca 2160

accacttcaa gtccaagggc tctgtcactc gtggagacgc cgacaccggc gacggccaag 2220

gcaacaacgc caacgttcgc gtcgcacagg cacaggcact catcgaccac ctggaaaacc 2280

aggacgactg ggcatccaag ccaatcttca tcctcggcga caccaactcc tacgccaagg 2340

aaaccgcgat gaccaccctt tacggcgctg gctacaccaa catcgccacc gaattcgacg 2400

ctggctacag ctaccagttc tccggccgca ttggcagcct cgaccacgca ctcggcaacg 2460

aagcagccat gaagcacgtc atcgacgccg aggtctggga catcaacgct gacgaagcaa 2520

tcgcattcga atactcccgt cgactcaaca acacctccga cgtattcgag aacaacgtct 2580

tccgctcctc cgaccacgac ccgatcaagg tcggattcaa cctcagcgag accactgagc 2640

ccaccattcc ggtagagccc actgatcctg cagaacctac cgatccaact accccagtta 2700

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<210> 9

<211> 2928

<212> DNA

<213> 插入peftu启动子与PtxDPpu后的ExeR基因(Artificial Sequence)

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<211> 2928

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<400> 12

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tggcgcttac accgaagaag cactcgaaga tcagcagagc aagatcgtcg aagcaatcaa 420

ccgccttgac gtcgatgttc ttggacttga agaaatcgaa aacaccgcga ccgtcaccgg 480

cgacgtctcc cgtcgcgatg acgcactcaa taccctcgtc gcagcactca acgaagcagt 540

tggatccgat cgctgggcgg ccgtcgaatc tccagaacaa ttgggcaccg atgaagacta 600

catccgcgtc gccttcatct acgaccaaac caccgtcaag cccgtcggcg aatcccgaat 660

cttcgacgac gcagccttca ccggcaccgc acgccagcca ctcgcacagg aattccagcc 720

actcaacgac agcgagaaat ccttcgtcgg cgtagtcaac cacttcaagt ccaagggctc 780

tgtcactcgt ggagacgccg acaccggcga cggccaaggc aacaacgcca acgttcgcgt 840

cgcacaggca caggcactca tcgaccacct ggaaaaccag gacgactggg catccaagcc 900

aatcttcatc ctcggcgaca ccaactccta cgccaaggaa accgcgatga ccacccttta 960

cggcgctggc tacaccaaca tcgccaccga attcgacgct 1000

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物1(ExeR-R-F)

<400> 15

aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac c 41

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物2(ExeR-R-R)

<400> 16

ggcgtgctgg agtcggttcc ggcaggatta 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物3(ExeR-L-F)

<400> 17

taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc 30

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物4(ExeR-L-R)

<400> 18

tgagctagct gtcaatctag agcgtcgaat tcggt 35

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 敲除ExeR基因用的crRNA靶序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcgacggt tggagcgtta c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 质粒上原本存在的靶序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caggcaacca tagggcagga a 21

<210> 21

<211> 110

<212> DNA

<213> ExeR-1

<400> 21

acgctctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg gatccgaatt tctactgttg 60

tagatcctcg acggttggag cgttacattt aaataaaacg aaaggctcag 110

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物5(ExeR-1-F)

<400> 22

acgctctaga ttgacagcta gctca 25

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 引物6(ExeR-1-R)

<400> 23

ctgagccttt cgttttattt aaatgtaacg ctccaaccgt cgaggatcta caacagtaga 60

Claims (8)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述的谷氨酸棒杆菌中表达亚磷酸盐脱氢酶基因；

其中，所述的谷氨酸棒杆菌为ATCC31269、ATCC13032中的任意一种，

其中，所述的亚磷酸盐脱氢酶基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的表达亚磷酸盐脱氢酶基因是通过基因组整合表达的方式进行表达。

3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将亚磷酸盐脱氢酶基因插入在谷氨酸棒杆菌基因组中ExeR基因的位点上进行表达；其中，所述ExeR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的表达亚磷酸盐脱氢酶基因是通过质粒表达的方式进行表达。

5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将亚磷酸盐脱氢酶基因插入表达质粒pXMJ19中进行表达。

6.根据权利要求1~5中任意一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的表达由peftu启动子启动；其中，所述的peftu启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.根据权利要求6所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，插入peftu启动子与亚磷酸盐脱氢酶基因后的ExeR基因，其核苷酸序列选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12。

8.权利要求1~7中任意一项所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备赖氨酸 中的应用，其特征在于，将所述的重组谷氨酸棒杆菌在灭菌或不灭菌的发酵培养基中发酵制备赖氨酸。

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