CN114874964B

CN114874964B - 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114874964B
Application number: CN202210666616.7A
Authority: CN
Inventors: 沐万孟; 张文立; 刘苑琳; 朱莺莺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-06-13
Filing date: 2022-06-13
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-06-13
Also published as: CN114874964A

Abstract

本发明公开了一种高产2′‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明在敲除lacZ和wcaJ基因的BL21(DE3)宿主菌中，通过引入从头途径基因和编码α‑1,2‑岩藻糖基转移酶的wbgL基因来实现2′‑岩藻糖基乳糖的合成。在引入编码正转录调控因子的基因rcsA和rcsB基因来调节wbgL基因的表达，并采用强启动子P_J23119实现基因的表达。得到的重组大肠杆菌在分批发酵条件下2′‑岩藻糖基乳糖的产量最大可达9.055 g/L，在3 L发酵罐中，2′‑岩藻糖基乳糖的产量达到79.23 g/L，是迄今报道的最高值，在大规模工业应用中表现出显著的生产潜力。

Description

一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳低聚糖(HMO_S)是成熟人乳中含量最丰富的固体成分之一，仅次于乳糖和脂类，是婴儿发育不可或缺的成分，有助于婴儿肠道中双歧杆菌属、拟杆菌属和乳杆菌属等益生菌的生长，有助于预防病原菌感染，调节免疫系统，促进婴儿大脑早期发育等功能。在200多种HMOs中，最具代表性的是2′-岩藻糖基乳糖，其是人乳中含量最高的寡糖，也是最早被美国FDA和欧盟批准可添加到婴幼儿奶粉、普通食品、膳食补充剂和/或医疗食品中的HMOs之一。因此受到广泛关注，但是目前2′-岩藻糖基乳糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。

目前商业化2′-岩藻糖基乳糖的生产主要包括化学法合成、酶催化法合成和微生物发酵法三种方式。化学法合成所需原料成本高，且需要引入保护基团，步骤繁冗。酶催化法合成需要特定的岩藻糖基转移酶，虽然此法反应条件温和可控、速度较快、产物易于纯化，但生产所需的糖基供体成本高。相比之下，微生物发酵法有着底物廉价，酶与底物特异性高，合成步骤更简化，产率提升大等优点，更适合大规模的工业化生产。

目前主要是采用微生物发酵法来合成2′-岩藻糖基乳糖，通过使用不同来源的岩藻糖基转移酶、强化底物的转运蛋白和辅因子再生途径等，构建基因工程菌以期提升2′-岩藻糖基乳糖的产量。但现有的微生物发酵法生产2′-岩藻糖基乳糖的产量还较低，无法满足现有的需求。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法。

本发明选择了来源于大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL。在敲除lacZ和wcaJ基因的BL21(DE3)宿主菌中，通过引入从头途径基因和编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的wbgL基因来实现2′-岩藻糖基乳糖的合成；接着在引入编码正转录调控因子的基因rcsA和rcsB后，2′-岩藻糖基乳糖的产量提高到3.92g/L；将含有强启动子(P_J23119)控制下的wbgL基因整合到recA位点以加强岩藻糖基化反应，同时用该启动子取代原有的manC-manB和gmd-wcaG基因簇前的启动子以促进2′-岩藻糖基乳糖的合成；经过上述优化步骤后，在分批培养中，工程菌株生产2′-岩藻糖基乳糖产量为9.06g/L，在3L发酵罐中，2′-岩藻糖基乳糖的产量达到79.23g/L，产率达到1.45g/L/h，是迄今报道的最高值，在大规模工业应用中表现出显著的生产潜力。

本发明的第一个目的是提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因和编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的wcaJ基因，游离表达了编码磷酸甘露糖酶编码的manB基因、编码甘露糖1-鸟苷酸转移酶的基因manC、编码GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶的基因gmd、编码GDP-岩藻糖合成酶的基因wcaG中的两种或多种，游离表达编码来源于大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，并利用强启动子P_J23119取代了基因组上manC-manB或gmd-wcaG基因簇前的启动子以促进2′-岩藻糖基乳糖的合成。

在一种实施方式中，在recA位点整合利用强启动子P_J23119启动表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因。

在一种实施方式中，所述recA基因的GenBank号为ACT44368.1。

在一种实施方式中，利用pRSFDuet-1载体共同表达磷酸甘露糖酶编码基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG中的两种或多种。

优选地，利用pRSFDuet-1载体共同表达磷酸甘露糖酶编码基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC；

或者，利用pRSFDuet-1载体共同表达GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG；

或者，利用pRSFDuet-1载体共同表达磷酸甘露糖酶编码基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG。

在一种实施方式中，以pETDuet-1为表达载体，利用来源于大肠杆菌K-12MG1655的rcsA、rcsB正转录调控因子调控游离的wbgL基因的表达。

在一种实施方式中，编码正转录调控因子的基因rcsA、rcsB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，在基因组上整合来源于大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因利用强启动子P_J23119启动表达以加强岩藻糖基化反应。

在一种实施方式中，α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC、所述磷酸甘露糖酶编码基因manB、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG均来源于大肠杆菌BL21(DE3)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示。

在一种实施方式中，所述强启动子P_J23119的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1，编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ的NCBI序列号为NP_416551.1。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供了一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌发酵生产2′-岩藻糖基乳糖。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/L甘油的分批发酵体系中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀＝0.8±0.1，加入终浓度为0.1～0.5mM IPTG，同时加入终浓度为5～10g/L乳糖，25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐体系中，发酵体系的发酵温度37℃，搅拌转速500～800r/min，通气量1vvm，pH 7.0，发酵至OD₆₀₀＝15±0.5，加入终浓度为10～12g/L乳糖和终浓度为0.1～0.5mM的IPTG，在25～28℃下诱导培养不少于40h。

优选地，在发酵罐体系中诱导培养不少于50h。

在一种实施方式中，反应过程中补加乳糖和甘油，以维持甘油浓度不低于3g/L，乳糖浓度不低于3g/L。

在一种实施方式中，当反应体系中甘油浓度低于3g/L时补加甘油，以维持菌体的生长；当乳糖浓度低于3g/L时补加乳糖，以维持菌体的生长以及2′-岩藻糖基乳糖的合成。

优选地，当反应体系中甘油浓度低于3g/L时，一次性添加甘油至终浓度为20g/L；当反应体系中乳糖浓度低于3g/L，一次性添加乳糖至终浓度为10g/L。

在一种实施方式中，发酵体系中还含有13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

本发明的第三个目的是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

在一种实施方式中，以乳糖为底物，利用所述α-1,2-岩藻糖基转移酶，生产2′-岩藻糖基乳糖。

本发明的第四个目的是提供了所述重组大肠杆菌在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明的第五个目的是提供了所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，通过表达来源于大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶，并对2′-岩藻糖基乳糖的合成通路做了一系列改造，最终构建得到的重组大肠杆菌在分批发酵条件下2′-岩藻糖基乳糖产量可达9.055g/L，将此重组大肠杆菌经发酵罐发酵，发酵55h左右，2′-岩藻糖基乳糖产量即可达79.23g/L，是迄今报道的最高值，在大规模工业应用中表现出显著的生产潜力。

附图说明

图1为2′-岩藻糖基乳糖代谢通路图；

图2为工程菌BWL-W、BWL-ABW和BWLW-ABW的2′-岩藻糖基乳糖生物合成的比较图；

图3为9种工程菌中2′-岩藻糖基乳糖生物合成的比较图；

图4为工程菌BWLWC-3在3L发酵罐中2′-岩藻糖基乳糖的发酵产量结果图；

图5为产物2′-岩藻糖基乳糖标样和产物样品液相图。

具体实施方式

1、以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2、菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，热击转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。

3、质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。

4、大肠杆菌感受态的制备：TAKARA试剂盒。

5、2′-岩藻糖基乳糖发酵过程及检测：

(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

(2)LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。

(3)发酵培养基：20g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

(4)2′-岩藻糖基乳糖发酵过程：将构建的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，同时加入8g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

(5)HPLC检测条件：通过高效液相色谱(HPLC)系统(Waters e2695)；色谱柱：Carbohydrate Analysis(Rezex ROA-organic acid H+(8％))；检测器：示差检测器；流动相：0.5mmol/L H₂SO₄；流速：0.6mL/min；柱温：60℃；进样量：10μL。

实施例1：重组表达载体的构建

改造大肠杆菌所用到的重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：

(1)wbgL基因片段的获得以及质粒pET-W的构建：

以大肠杆菌O126(Escherichia coli)wbgL基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，以wbgL-F/R为引物，PCR扩增出wbgL基因片段，胶回收DNA片段；以wbgL-V-F/R为引物，以pETDuet-1模板扩增出相应的载体片段，胶回收DNA片段。

将上述扩增得到的wbgL基因片段和载体片段通过吉普森试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pET-W。

(2)质粒pET-ABW的构建：

用rcsA-F/R和rcsB-F/R分别从大肠杆菌K-12MG1655染色体上扩增出rcsA和rcsB基因，并用rcsAB-V-F/R从pET-W中扩增出载体片段，胶回收DNA片段。

将上述扩增得到的rcsA、rcsB基因片段和载体片段通过吉普森试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pET-ABW，利用rcsA、rcsB正转录调控因子调控wbgL基因的表达。

(3)质粒pRSF-CB、pRSF-GW的构建：

质粒pRSF-CBGW的公开于公开号为CN112342176A的专利文献中，在此基础上用引物CB-F/R删除pRSF-CBGW质粒MCS2处的gmd-wcaG基因簇，获得质粒pRSF-CB。同样，用引物GW-F/R删除pRSF-CBGW载体MCS1处的manC-manB基因簇，获得质粒pRSF-GW。

表1.质粒构建引物

实施例2：重组菌株的构建

敲除大肠杆菌BL21中编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ(NCBI序列号为NP_416551.1)的基因wcaJ，编码β-半乳糖苷酶LacZ(NCBI序列号为NP_414878.1)的基因lacZ，基因的敲除方法具体参见公开号为CN110804577A的专利，得到重组菌BWL。

利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在重组菌BWL基因组上recA位点整合上强启动子(P_J23119)控制下的wbgL基因，得到重组菌BWLW，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表2)：

(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用recA-UP-F/R，recA-DH-F/R，通过PCR分别扩增出recA的上下游片段，胶回收。再以合成的wbgL基因为模板，使用JwbgL-F/R，通过PCR扩增出含强启动子(P_J23119)控制下的wbgL基因片段，胶回收。通过重叠PCR将三片段连接，得到供体DNA片段。

(2)以原始pTargetF质粒为模板，recA-N₂₀-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N₂₀序列替换为与recA序列互补的N₂₀序列，得到带有靶向recA的pTargetF质粒pTargetF-wbgL。PCR产物采用DpnⅠ酶去除模板DNA，转化大肠杆菌JM109感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。

(3)取pCas质粒及大肠杆菌BWL化转感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5uL质粒加入100uL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴20min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mL LB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200uL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜成为大肠杆菌BWL/pCas。

(4)挑取大肠杆菌BWL/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1h，加入终浓度为30mM/L的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD₆₀₀达到0.6时，制备大肠杆菌BWL/pCas电转感受态。

(5)将100ng pTargetF-wbgL质粒和400ng的供体DNA片段，电转入大肠杆菌BWL/pCas电转感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，进行PCR菌落验证。

(6)将上述阳性克隆菌落挑至4mL LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和30mg/L卡那霉素，30℃培养12h，去除pTargetF-wbgL质粒。42℃培养12h，去除pCas质粒。最终获得重组菌BWLW。

利用CRISPR-Cas9基因编辑系统把重组菌BWLW基因组上manC-manB和gmd-wcaG基因簇前的启动子替换为强启动子(P_J23119)，得到重组菌BWLWC、BWLWG和BWLWCG。具体步骤同上(所涉及到的引物序列见表2)。

表2.基因编辑引物

实施例3：大肠杆菌工程菌株的构建

将实施例1所构建得到的重组质粒pRSF-CBGW、pET-W和pET-ABW分别转入重组菌BWL中，得到工程菌BWL-W和BWL-ABW。将实施例1所构建得到的重组质粒pRSF-CBGW、pET-ABW转入重组菌BWLW中，得到工程菌BWLW-ABW。得到的工程菌株如表3所示。

将实施例1所构建得到的重组质粒pRSF-CBGW、pRSF-CB、pRSF-GW和pET-ABW分别转入重组菌BWLWC、BWLWG和BWLWCG中，得到9个不同的工程菌株(如表3所示)。

实施例4：工程菌株发酵生产2′-岩藻糖基乳糖

将实施例3中构建的BWL-W、BWL-ABW和BWLW-ABW工程菌株分别接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，同时加入8g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

结果如表3所示：发酵后不同工程菌株2′-岩藻糖基乳糖的产量分别为3.273g/L，3.918g/L，6.569g/L。其中含有重组质粒pRSF-CBGW和pET-ABW的工程菌(即菌株BWLW-ABW)获得了6.569g/L的最高产量(各工程菌株2′-岩藻糖基乳糖生物合成的比较参见图2)。

将实施例3中构建的9种工程菌分别接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，同时加入8g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

结果如表3所示：发酵后不同工程菌株2′-岩藻糖基乳糖的产量分别为5.983g/L，7.423g/L，9.055g/L，5.529g/L，6.206g/L，6.599g/L，5.700g/L，6.064g/L，6.413g/L。其中含有重组质粒pRSF-CBGW和pET-ABW的工程菌BWLWC-3获得了9.055g/L的最高产量(各工程菌株2′-岩藻糖基乳糖生物合成的比较参见图3)。

表3.各工程菌摇瓶发酵详细信息

实施例5：高效生产工程菌发酵罐生产2′-岩藻糖基乳糖

为了进一步验证2′-岩藻糖基乳糖合成方法的有效性，提高2′-岩藻糖基乳糖的产量。将工程菌BWLWC-3种子液以10％(v/v)的接种量接种到工作体积为1L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵11h(OD₆₀₀约为15.3)，加入终浓度为10g/L乳糖和终浓度为0.1mM的IPTG，在25℃下培养。期间手动补料甘油和乳糖：当反应体系中甘油浓度低于3g/L的时补加30mL母液(母液甘油浓度600g/L)，乳糖浓度低于3g/L时进补加30mL母液(母液乳糖浓度200g/L)，以维持菌体的生长以及2′-岩藻糖基乳糖的合成。培养整个过程达到54.5h后，菌体OD₆₀₀达到71.6，2′-岩藻糖基乳糖的产量达到最高，达到79.23g/L(图4)。

表4.发酵过程中菌和2′-岩藻糖基乳糖合成量动态变化表

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

<130> BAA220637A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcatta ttagactgca aggcggcctg ggcaatcaac tgtttcaatt tagctttggc 60

tatgccctgt ctaaaattaa tggcacaccg ttatattttg atattagcca ttatgcagaa 120

aatgatgatc atggcggata tcgtctgaat aatctgcaaa ttccggaaga atatctgcag 180

tattatacac cgaaaattaa taacatttat aaatttctgg tcagaggatc aagactgtat 240

ccggaaattt ttctgttttt aggcttttgc aatgaatttc atgcgtatgg ctatgatttt 300

gaatatatcg cacaaaaatg gaaaagcaaa aaatatattg gatattggca atcagaacat 360

ttctttcata aacatatttt agatctgaaa gaattcttta ttccgaaaaa tgtttcagaa 420

caagcaaatc ttcttgctgc taaaatttta gaatcacagt cttcacttag cattcatatc 480

agaagaggag attatatcaa aaataaaaca gcaacactta cacatggcgt ttgttctctg 540

gaatattata aaaaagcact taataaaatt cgcgatcttg caatgattag agatgtgttt 600

atttttagcg acgatatctt ttggtgcaaa gaaaatattg aaacattact tagcaaaaaa 660

tataatattt attatagcga agatctttct caggaagaag atctgtggct tatgtcactg 720

gctaatcatc atattattgc taattcatca ttttcttggt ggggagcata tctgggcaca 780

tcagcatcac aaattgttat ttatccgaca ccgtggtatg atattacacc gaaaaacaca 840

tatattccga ttgttaatca ttggattaat gttgataaac atagctcatg ctaa 894

<210> 2

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggctcaa cgattattat ggatttatgt agttacaccc gactaggttt aaccgggtat 60

ctgttgagta gaggggttaa aaaaagagaa atcaacgaca ttgaaaccgt tgatgacctt 120

gccatagctt gtgattcaca gcgcccttca gtggtgttta ttaatgagga ctgtttcatc 180

cacgatgctt ctaacagtca gcgtatcaag ctcatcatta atcaacatcc caatacgtta 240

tttatcgttt ttatggcaat tgccaatgtt cattttgatg aatatctatt ggtcagaaaa 300

aatttattga tcagttctaa atcgattaaa ccggaatctc tcgacgatat ccttggcgat 360

attctgaaaa aagagacaac gataacctcg tttttaaata tgccgacgtt atcattgagc 420

cgaaccgaat cgagtatgtt gcgaatgtgg atggcaggtc agggaaccat tcaaatctct 480

gaccaaatga atatcaaagc caagaccgtt tcatcgcata aaggtaatat taaacgtaag 540

atcaaaacgc ataataaaca ggttatctac catgtcgtcc gactgacgga taatgtgact 600

aatggtattt ttgtcaacat gcgctaa 627

<210> 3

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaacaata tgaacgtaat tattgccgat gaccatccga tagtcttgtt cggtattcgc 60

aaatcacttg agcaaattga gtgggtgaat gttgtcggcg aatttgaaga ctctacagca 120

ctgatcaaca acctgccgaa actggatgcg catgtgttga ttaccgatct ctccatgcct 180

ggcgataagt acggcgatgg cattacctta atcaagtaca tcaagcgcca tttcccaagc 240

ctgtcgatca ttgttctgac tatgaacaac aacccggcga ttcttagtgc ggtattggat 300

ctggatatcg aagggatcgt gctgaaacaa ggtgcaccga ccgatctgcc gaaagctctc 360

gccgcgctgc agaaagggaa gaaatttacc ccggaaagcg tttctcgcct gttggaaaaa 420

atcagtgctg gtggttacgg tgacaagcgt ctctcgccaa aagagagtga agttctgcgc 480

ctgtttgcgg aaggcttcct ggtgaccgag atcgctaaaa agctgaaccg cagtattaaa 540

accatcagta gccagaagaa atctgcgatg atgaagctgg gtgtcgagaa cgatatcgcc 600

ctgctgaatt atctctcttc agtgacctta agtccggcag ataaagacta a 651

<210> 4

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60

ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120

ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180

aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240

aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300

gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360

gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420

gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480

attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540

tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600

tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660

cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720

tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780

gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840

ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900

ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960

accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020

gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080

catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140

gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200

cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260

attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320

acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380

tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437

<210> 5

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60

aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120

attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371

<210> 6

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 7

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

aaactgctgt ttctcggatc gtcctgcatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360

gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966

<210> 8

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctgtgcggt atttcacacc gcatatgctg gatccttgac agctagctca gtcctaggta 60

taatgctagc gtgatcagac ctttgtttaa ctttaaagga ggtgataaaa 110

Claims

1. 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌仅敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并利用强启动子P_J23119启动基因组上manC-manB基因簇的表达，在大肠杆菌的recA位点整合利用强启动子P_J23119启动表达α-1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL，并利用pRSFDuet-1载体游离表达了磷酸甘露糖酶基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，同时利用来源于大肠杆菌K-12 MG1655的rcsA、rcsB正转录调控因子调控游离的wbgL基因的表达；

所述wbgL的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC、所述磷酸甘露糖酶编码基因manB、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示。

2.一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法是以乳糖为底物，以权利要求1所述重组大肠杆菌为发酵菌株发酵生产2′-岩藻糖基乳糖。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌添加至含有15~20g/L甘油的分批发酵体系中，30~40 ℃，培养至OD₆₀₀=0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.5 mM的IPTG和终浓度为5~10 g/L乳糖，在25~28 ℃，180~220 rpm继续诱导培养不少于72 h；

或者，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到含有15~20 g/L甘油的发酵罐发酵体系中，在30~40 ℃，搅拌转速500~800 r/min，通气量1~2 vvm，pH 7.0±0.2，发酵至OD₆₀₀=15±0.5时，加入终浓度为10~12 g/L乳糖和终浓度为0.1~0.5 mM的IPTG，在25~28 ℃下诱导培养不少于40 h。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵过程中补加甘油和乳糖以维持甘油和乳糖浓度均不低于3 g/L。

5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中还含有12~15 g/L磷酸二氢钾，3.0~5.0 g/L磷酸氢二氨，1.0~2.0 g/L柠檬酸，1.0~2.0 g/L七水硫酸镁和5~15ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：5.0~10.0 g/L硫酸亚铁，2.0~3.0 g/L七水硫酸锌，1.0~2.0 g/L无水硫酸铜，0.3~0.5 g/L一水硫酸锰，0.2~0.5 g/L十水硼酸钠，0.1~0.3 g/L钼酸铵，1.0~3.0 g/L二水氯化钙。

6.权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备2′-岩藻糖基乳糖中的应用。