CN118127100A - 一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法，属于合成生物学和发酵工程技术领域。本发明构建了大肠杆菌工程菌株，用于实现α‑2,6‑唾液酸转移酶(ST6)或α‑2,3‑唾液酸转移酶(ST3)和NeuA酶的共表达，采用两步发酵工艺：第一阶段培养工程菌；第二阶段将其与酵母两菌耦合发酵，以乳糖和唾液酸为底物实现唾液酸乳糖的合成。工程菌株和酵母在耦合发酵模式下，摇瓶水平发酵30h，6′‑唾液酸乳糖浓度为35.58g/L，唾液酸的转化率为93.69％；摇瓶水平发酵24h，3′‑唾液酸乳糖产量最佳浓度为21.8g/L。在7L发酵罐水平发酵16h，6′‑唾液酸乳糖后达到最高产量到52.29g/L，转化率为97.99％。本研究结果为规模化生产唾液酸乳糖奠定了技术基础。

Description

一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是指一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法。
背景技术
母乳寡糖(HMOs)是母乳中天然存在的一系列寡聚糖分子，对于婴儿建立早期的肠道微生态具有重要的作用。母乳寡糖由5种结构单元组成，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc)，这些单元通过糖苷键连接从而形成具有不同性质的低聚糖。唾液酸乳糖是由唾液酸和乳糖组成的酸性寡糖，根据结合位置的不同又可以分为3′-唾液酸乳糖(3′-SL)和6′-唾液酸乳糖(6′-SL)。唾液酸乳糖是良好的益生元，在双歧杆菌的增殖，肠道微生物群的塑造以及肠道成熟方面具有独特的益生元效应。唾液酸乳糖还具有抗病毒活性，免疫调节活性，促进大脑发育和认知改善等作用，展现了其在配方奶粉中巨大的商业价值。
由于唾液酸乳糖具有重要的生物学活性和生理功能，唾液酸乳糖的合成受到了人们的广泛关注和深入研究。研究表明，目前主要有三种合成方法，化学法，酶法和生物法，由于化学法生产过程繁琐且效率低下，酶法涉及的有毒试剂不符合临床反应和食品配方的要求，而生物法弥补了化学法和酶法的不足，故人们将目光转向生物法，在生物法合成唾液酸乳糖上投入了大量的精力和研究。
由于生产成本昂贵以及生产效率低下等问题，目前仍无法实现唾液酸乳糖的廉价规模化生产。唾液酸和三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)价格昂贵，唾液酸乳糖的合成需要消耗NeuAc和大量CTP，从而导致唾液酸乳糖的成本较高。由于酵母细胞含有将CMP催化合成CTP的酶系，且不消耗乳糖，提出将面包酵母细胞引入生物转化体系，酵母细胞实现CMP到CTP的循环再生有效地降低了单纯补充CTP造成的成本高昂问题。
针对以上问题提出三菌株耦合发酵转化6′-SL的方案(图1中的A)。考虑到物质进出细胞会影响6′-SL的转化效率，本研究又构建工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-neuA-plst6与面包酵母双菌耦合共培养来合成6′-SL的策略(图1中的B)。通过比较两种策略的优缺点，从而开发更优的6′-SL发酵生产策略和发酵工艺。
6′-SL/3′-SL对婴幼儿的生长发育具有重要的生理学功能，具有广阔的的市场前景，开发6′-SL/3′-SL的合成工艺成为近年来的研究热点。由于化学法和酶法的技术限制，人们将目光转向了生物法。2010年，Drouillard等人发现通过降低唾液酸转移酶的表达水平和增加NeuABC酶的表达水平可促进6′-SL的合成，且在乳糖过量的情况下能有效防止6,6'-二唾液基乳糖的合成，故采用持续添加甘油和乳糖的策略进行高密度发酵合成6′-SL，最终6′-SL在细胞外和细胞内的浓度分别为23g/L和11g/L。2018年，Beauprez等人通过构建工程大肠杆菌用于合成6′-SL，采用补料间歇培养的策略合成6′-SL，最终浓度达到30.5g/L。考虑到单细胞合成过程中可能存在产物在细胞内积累，从而产生产物抑制效应的问题，我们提出多菌株耦合的策略来实现6′-SL的生产。
发明内容
由于唾液酸乳糖是母乳寡糖(HMOs)中含量最高的唾液酸化乳糖，对婴儿的生长发育具有重要作用，实现唾液酸乳糖的高效生产一直是寡糖合成领域的难点和挑战。针对该问题，本发明提供了一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法。本发明构建共表达唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合成酶工程菌株，评价将其与面包酵母耦合合成唾液酸乳糖的效果并优化。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一个目的是提供一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法，以唾液酸和乳糖为底物，通过酵母与共表达唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌进行耦合发酵合成唾液酸乳糖；所述唾液酸转移酶选自α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶。
在本发明的一个实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
在本发明的一个实施方式中，所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655、大肠杆菌JM109(DE3)或者大肠杆菌1917(DE3)。
在本发明的一个实施方式中，所使用到的质粒是pRSF-Duet-1、pET-Duet-1或pCDF-Duet-1，优选pETDeut-1。
在本发明的一个实施方式中，所述唾液酸的浓度为60mM-90mM，优选为60mM-70mM。
在本发明的一个实施方式中，所述乳糖的浓度为80mM-200mM。
在本发明的一个实施方式中，所述外源添加的辅因子CMP，浓度为10mM-50mM。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵的反应体系中还含有十八胺聚氧乙烯醚或者十八胺聚氧乙烯醚，浓度为1g/L-10g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述共表达唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌的添加量为50g/L-100g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述酵母的添加量为50g/L-250g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述酵母选自面包酵母、啤酒酵母和酿酒酵母中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵的温度为20℃-40℃，优选为30℃-40℃；所述发酵的时间为10h-30h，优选为16h-28h。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵的反应体系中还含有5mM-20mM的Mg+，优选为10mM-20mM。
本发明第二个目的是提供所述方法生产的唾液酸乳糖在制备婴幼儿、中老年奶粉或营养补剂中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法。目前由于工程菌株数量较多，发酵工艺较为复杂，物质进出细胞也会对唾液酸乳糖的转化率产生影响，本发明构建工程菌株实现唾液酸转移酶和NeuA酶的共表达，再将其与面包酵母两菌耦合实现唾液酸乳糖的合成。二菌株耦合发酵模式下，摇瓶水平发酵30h，6′-唾液酸乳糖浓度为35.58g/L，唾液酸的转化率为93.69％；摇瓶水平发酵3′-SL，产量最佳浓度为21.8g/L。在7L发酵罐水平，发酵16h后6′-唾液酸乳糖达到最高产量到51.29g/L，转化率为97.99％，这是目前报道的最高产量。本发明结果为规模化，量产化生产唾液酸乳糖奠定了技术基础。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明多菌耦合发酵转化合成6′-SL技术路线图；其中A为三菌耦合发酵转化合成6′-S技术路图；B为两菌耦合发酵转化合成6′-SL技术路线图；
图2是本发明重组质粒pET28a-plst6的构建流程图和电泳图；其中，A为重组质粒pET28a-plst6的构建流程图；B为重组质粒pET28a-plst6的双酶切图；C为重组质粒pET28a-plst6 SDS-PAGE图；
图3是本发明6′-SL检测分析图；A为三菌耦合发酵产物的TLC分析图:1-Neu5Ac标品，2-乳糖标品；3-6′-SL标品；4-发酵上清液；B为6′-SL的MALDI-TOF MS分析；C为6′-SL的核磁共振氢谱图；D为从上到下依次为标品6′-SL液相图、标品Neu5Ac液相图、三菌耦合发酵产物液相图；
图4是本发明不同诱导浓度对工程菌株合成6′-SL的影响；A为不同诱导浓度对E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA合成6′-SL的影响；B为不同诱导浓度对E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6合成6′-SL的影响；
图5-A为不同浓度唾液酸对三菌耦合发酵转化合成6′-SL的影响；
图5-B为不同浓度乳糖对三菌耦合发酵转化合成6′-SL的影响；
图5-C为不同温度对三菌耦合发酵转化合成6′-SL的影响；
图5-D为不同浓度Mg2+对三菌耦合发酵转化合成6′-SL的影响；
图5-E为不同酵母生物量对三菌耦合发酵转化合成6′-SL的影响；
图6-A为以乳糖为唯一诱导剂，工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA的发酵曲线；
图6-B为以乳糖为唯一诱导剂，工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6的发酵曲线；
图6-C为以乳糖为唯一诱导剂，30h三菌耦合合成6′-SL的产量以及转化效率；
图7-A为以乳糖和IPTG同时作为诱导剂，工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA的发酵曲线；
图7-B为以乳糖和IPTG同时作为诱导剂，工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6的发酵曲线；
图7-C为以乳糖和IPTG同时作为诱导剂，三菌耦合发酵过程曲线图；
图8是本发明6′-SL检测分析图；其中，A为重组质粒pETDeut-1-plst6-neuA质粒图谱；B为重组质粒pETDuet-1-plst6-neuA SDS-PAGE图；C为双菌耦合发酵产物的TLC分析图:1-乳糖标品；2-6′-SL标品；3-发酵上清液；D为从上到下依次为标品Neu5Ac液相图、标品6′-SL液相图、双菌耦合发酵产物液相图；
图9是本发明以乳糖和IPTG同时作为诱导剂的工程菌株发酵曲线；其中，A为工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-neuA-plst6的发酵曲线；B为双菌耦合发酵过程曲线图；
图10是本发明中重组质粒pCDF Deut-1-neuA-nst3构建流程图；
图11-A是本发明重组质粒pCDF Deut-1-neuA-nst3的SDS-PAGE图；
图11-B是本发明双菌耦合发酵产物的TLC分析图:1-唾液酸标品；2-3′-SL标品；3-发酵上清液；4-空白反应溶液；
图12是本发明基因片段经过同源重组连接构建的基因结构；
图13是本发明中4株工程菌株与面包酵母分别进行共培养全细胞催化合成3′-SL的产量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中所述材料的来源如下：
(1)面包酵母；通过对GDMCC61663发酵培养获得。Escherichia coli JM109(DE3)购买自天根生化科技(北京)有限公司；工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA(合成方法参考专利CN113444756A)，其他所用试剂均可商业购买得到；
(2)实验所需基因来源：发光杆菌(Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145)基因，经过人工优化后人工合成获得；
(3)培养基及主要溶液
LB液体培养基(g/L)：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，pH 7.0；灭菌条件：121℃20min。
LB固体培养基(g/L)：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，琼脂20.0，pH7.0；灭菌条件：121℃20min。
发酵培养基(g/L)：酪蛋白10.0，酵母提取物5.0，NH4Cl 2.674，Na2HPO43.549，KH2PO43.402，Na2SO40.7102，MgSO40.3244，甘油5.0，葡萄糖0.5，乳糖4.0。灭菌条件：115℃30min。
酵母种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏15g/L，氯化钠4g/L，pH 7.0。
酵母基础发酵培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵8g/L，KH2PO42.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L，pH 5.5。
二苯胺-苯胺-磷酸溶液：4g二苯胺，4mL苯胺及20mL 85％磷酸溶于200mL丙酮。
本发明中所用的检测方法如下：
(1)唾液酸乳糖的分离纯化
分离纯化方法：使用HyperSep Hypercarb固相萃取小柱(SPE小柱)进行纯化，纯化步骤如下；活化：以3mL甲醇活化SPE小柱；平衡：以3mL超纯水平衡SPE小柱并保湿润；上样：取300μL催化上清液均匀通过SPE小柱；淋洗：以1mL超纯水淋洗SPE小柱，反复三次；洗脱：以0.5mL 80％乙腈洗脱产物，反复3次。
(2)唾液酸乳糖的分析检测
薄层色谱法(TLC)：展开剂为v(正丙醇)：v(水)：v(25％氨水)＝37.5:15:10，待薄层层析板自然晾干后，使用二苯胺-苯胺-磷酸溶液浸染，放置105℃烘箱1min进行显色。
(3)基质辅助激光电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)：对纯化产物进行分子量鉴定。将1μL纯化产物和1μL点样基质2,5-二羟基苯甲酸含Na+，分别点样在靶板的同一位置，混均后干燥上机处理。质谱条件：使用反射阳离子模式；扫描分子量范围：0-2000Da。
(4)核磁共振氢谱(1HNMR)：将纯化产物冻干，使用600μL氘代水(D2O)将其溶解，在共振频率为400MHz的条件下，使用核磁共振光谱仪采集1H谱。
(5)高效液相色谱(HPLC)：紫外检测波长为210nm；色谱柱为Aminex HPX-87H IonExclusion Column(7.8mm×300mm)；流动相为5mM H2SO4；柱温为60℃；进样量为10μL；流速为0.6mL/min。
(6)SDS-PAGE凝胶电泳：取40μL诱导前和诱导后的菌液加入10μL蛋白上样缓冲液混合均匀，沸水浴4min，冰浴2min，取10μL混合液进行SDS-PAGE凝胶电泳。经过蛋白电泳后，成功诱导表达目的蛋白的菌体储存在-20℃备用。
实施例1工程菌株E.coliJM109(DE3)/pET28a-plst6的构建。
以Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145中plst6基因(GenBank登录号为MN721873.1)序列为模版合成目的基因片段，设计引物plst6F(5’-CCATGGGCAAAAAAATCCTGACTGTGCTGTCT-3’，下划线为Nco I酶切位点)和plst6R(5’-GGATCCTTAGTCAGCCCAAAACAGAACGTCT-3’，下划线为BamHI酶切位点)。利用引物plst6F和plst6R对目的基因plst6进行PCR扩增，验证回收后，用Nco I和BamH I双酶切plst6基因片段和pET28a空载体，将酶切后的plst6基因片段与载体片段纯化连接，得到重组质粒pET28a-plst6，构建流程如图2中A所示。再将其转化到感受态细胞E.coli JM109(DE3)中，以Kan为筛选标记进行平板涂布，经过菌落PCR验证后挑取单菌落进行摇瓶培养，提取菌液中的质粒酶切验证，并送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序鉴定。
对pET28a-plst6进行酶切验证的结果如图2中B所示，得到的两条片段长度大约为5300bp和1600bp，分别与pET28a载体和目的基因plst6大小一致，进一步测序验证，测序结果与模版基因序列一致，这证明重组质粒pET28a-plst6成功构建。其中，基因plst6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2工程菌株E.coliJM109(DE3)/pET28a-plst6的表达及培养。
挑取工程菌株的单菌落接种至带有Kan抗性的10mL LB培养基中，37℃过夜培养得到种子液，再将种子液以2％的接种量转接至带有Kan抗性的200mL LB培养基中，在37℃、200r·min-1条件下摇瓶培养，当菌体生长至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，将温度降至16℃诱导20h，离心收集菌体。并对诱导后的菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳验证，结果见图2中C。从图2中C可以看出在55kD-72kD之间有明显蛋白条带，与报道的目的酶蛋白大小相一致，这表明α-2,6-唾液酸转移酶ST6在工程菌株E.coliJM109(DE3)/pET28a-plst6中成功表达。
发酵培养：挑取工程菌株的单菌落接种至带有Kan抗性的10mL LB培养基中，37℃过夜培养得到种子液，将种子液以2％的接种量转接至带有Kan抗性的200mL发酵培养基中，37℃，200rpm摇瓶培养10h，离心收集菌体。
(2)发酵罐培养
挑取工程菌株的单菌落接种至带有Kan抗性的10mL LB培养基中，37℃培养12h得到一级种子液，再将一级种子液以2％的接种量转接至带有Kan抗性的250mL LB培养基中，37℃过夜培养得到二级种子液，按10％接种量将二级种子液于接种于发酵罐中，培养温度为37℃，通气量为2vvm，罐中的起始工作体积为2.5L。设定搅拌转速与溶氧偶联以控制溶氧在20％，当葡萄糖含量低于5g/L时，以0.6mL/min的流速补充浓度为300g/L葡萄糖；整个发酵过程中用50％氨水调控pH值为7.0；在工程菌株对数生长后期添加外源诱导剂进行诱导，此时用浓度为300g/L甘油替代葡萄糖作为碳源，发酵结束后，将发酵液8000r/min离心5min，收集菌体。
实施例3三菌株共培养策略的6’-唾液酸乳糖的合成。
摇瓶水平三菌耦合催化转化合成6′-SL：将50g/L工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA(合成方法参考专利CN113444756A)、E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6和100g/L面包酵母以60mMNeu5Ac、80mM乳糖为底物，在含有70mM CMP、300mM葡萄糖、1mM DTT、20mL/L甘油、10g/L二甲苯、5g/L乙醛、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4和150mMTris、4g/L十八胺聚氧乙烯醚的转化体系中，30℃、200r/min条件下反应30h。反应结束，将反应体系12000rpm/min离心2min，收集上清液用于检测。
利用TLC初步检测发现发酵液中存在与标准品6′-SL比移值相同的组分(图3中A)，可初步认定合成目的产物6′-SL。为进一步确定合成产物是否为6′-SL，通过MALDI-TOF-MS测定分子量(图3中B)，对应产物6′-SL的分子离子峰在m/z＝656.174[M+Na]+，m/z＝678.159[M+2Na-H]+，表明纯化产物中存在与标准品6′-SL相同分子量的组分，与Priem,B(Priem,B.,et al.,A new fermentationprocess allows large-scaleproductionofhuman milk oligosaccharides by metabolically engineeredbacteria.Glycobiology,2002.12(4):p.235-240)等人报道的结果一致。在此基础上，进一步采用1HNMR进行结构鉴定(图3中C)，1H NMR(400MHz,D2O)δ5.24(dd,J＝13.5,3.7Hz,0.4H),4.68(d,J＝8.0Hz,0.6H),4.44(d,J＝7.8Hz,1H),3.33(t,J＝8.4Hz,0.6H),2.73(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),2.05(s,3H),1.76(t,J＝12.2Hz,1H)，与Drouillard(Drouillard,S.,et al.,Efficientsynthesis of6′-sialyllactose,6,6′-disialyllactose,and 6′-KDO-lactose by metabolically engineeredE.coliexpressinga multifunctionalsialyltransferasefrom thePhotobacterium sp.JT-ISH-224.
Carbohydrate Research,2010.345(10):p.1394-1399)等人报道的核磁结果一致，最终确定成功合成目的产物6′-SL，由此也可以证明重组菌株表达的ST6酶具有催化活性。
确定合成目的产物6′-SL后，利用HPLC对发酵液上清液进行定量分析，反应30h时6′-SL浓度为23.31g/L，唾液酸的转化率为61.32％(图3中D)。
7L发酵罐水平三菌株耦合催化合成6′-SL：50g/L工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA、E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6和150g/L面包酵母以60mM Neu5Ac、160mM乳糖为底物，在含有70mM CMP、300mM葡萄糖、1mM DTT、20mL/L甘油、10g/L二甲苯、5g/L乙醛、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4和150mM Tris、4g/L十八胺聚氧乙烯醚的转化体系中发酵。发酵20h时，以0.6mL/min的流速补充浓度为90mM唾液酸和90mM乳糖的混合溶液，设定搅拌转速与溶氧偶联以控制溶氧在20％，设定温度为30℃，通气量为1vvm，反应结束后，将发酵液10000r/min离心5min，收集上清液用于检测。
实施例4三菌耦合合成6′-SL的优化。
(1)发酵培养基诱导剂乳糖浓度优化
乳糖可作为发酵培养基中良好的蛋白表达诱导剂，适当浓度的乳糖有利于目的蛋白的高效表达。因此，探究不同的乳糖浓度对工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA和工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6蛋白表达的影响至关重要。
调整发酵培养基中的乳糖浓度后培养两株工程菌株，通过比较三菌耦合发酵转化反应的最终产量可知E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA在乳糖浓度为4g/L时，转化效率最高，发酵液中的6′-SL浓度达到10.17g/L(图4中A)；E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6在乳糖浓度为3g/L时，转化效率最高，发酵液中浓度达到4.96g/L(图4中B)。
(2)不同浓度底物对三菌耦合发酵转化的影响；由于在技术路线中NeuA酶率先利用唾液酸，故在乳糖过量的条件下先探索不同浓度唾液酸对6′-SL合成的影响；6′-SL的合成呈现先升后降的趋势(图5-A)，在唾液酸浓度为60mM时，产量达到最高值5.43g/L，此时唾液酸转化率为14.28％；在此基础上，进一步探究不同浓度乳糖对6′-SL合成的影响(图5-B)，在转化体系中乳糖浓度从80mM升到200mM的过程中，6′-SL的产量在乳糖浓度为160mM时达到最高为12.00g/L，唾液酸转化率为27.24％。
(3)反应温度对三菌耦合发酵转化的影响：众所周知酶的催化活性受温度影响较大，由于此反应体系是混菌耦合发酵，涉及多种酶的催化反应，无法对单个酶进行最适温度的探究，故对总反应体系的最适合温度进行探究，以达到6′-SL的最大产量。结果表明(图5-C)反应体系在30℃的条件下，6′-SL的产量达到最大为13.71g/L，此时转化率为36.06％。
(4)辅因子Mg2+浓度对三菌耦合发酵转化的影响：研究表明NeuA酶、ST6酶的催化反应以及CMP-CTP循环再生需要金属离子的参与，尤其是Mg2+的参与，因此对最优Mg2+的浓度进行探究也是至关重要，结果表明(图5-D)Mg2+浓度在20mM时，6′-SL的产量得到进一步提高为27.48g/L，NeuAc转化率液相应得到提高为72.30％。
(5)酵母细胞生物量对三菌耦合发酵转化的影响：由于酵母细胞参与CMP-CTP循环再生，故在上述优化的基础上，对酵母细胞生物量进行优化。结果表明(图5-E)随着酵母细胞生物量的提高，6′-SL的产量也在不断提高，在酵母细胞生物量为250g/L时，产量达到37.55g/L，但在生物量为150g/L时，此时转化率最高为97.97％，产量为35.52g/L。因为产量相差较小，考虑到催化系统负荷以及成本问题，后续在发酵中发酵转化时选择150g/L为体系中酵母细胞最佳生物量。
经过上述转化体系的优化，6′-SL的产量由4.96g/L提升到35.52g/L，唾液酸转化率由13.04％增加到97.97％。
实施例5以乳糖作为唯一诱导剂培养工程菌株并进行三菌耦合。
在7L发酵罐中培养E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA和E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6，因为葡萄糖效应，故在发酵初期添加4g/L的乳糖浓度对E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA进行自诱导培养(图6-A)，最终OD600为13.02，此时生物量为39.8g/L(湿重)；添加3g/L的乳糖浓度对E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6进行自诱导培养(图6-B)，最终OD600为10.08，此时生物量为37.5g/L(湿重)。
在上述三菌耦合发酵转化体系优化的基础上，将发酵罐培养的两株工程菌株与酵母在发酵罐中进行三菌耦合，通过HPLC对6′-SL定量分析，发酵28h 6′-SL的产量为11.95g/L(图6-C)，此时底物Neu5Ac的摩尔转化率为25.11％，在发酵罐水平初步实现了6′-SL的三菌耦合发酵生产。
实施例6以乳糖和IPTG同时作为诱导剂培养工程菌株并进行三菌耦合。
鉴于以乳糖为唯一诱导剂三菌耦合产量仅为4.8g/L，推测是由于仅用乳糖为诱导剂对蛋白的诱导效果不佳，故采用以乳糖和IPTG同时作为诱导剂的策略，对工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA和E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6进行发酵罐培养。
为了避免在菌体生长初期大量表达蛋白从而影响其生长，故在工程菌株对数后期添加终浓度为0.15mM的IPTG对工程菌株进行诱导。工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA在发酵27h后(图7-A)，OD600达到15.835，此时生物量为56.25g/L(湿重)，工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET28a-plst6在发酵27h后(图7-B)，OD600达到16.723，此时生物量为50.02g/L(湿重)。
发酵转化过程中流加唾液酸和乳糖，发酵结束后通过HPLC对6′-SL定量分析，根据HPLC结果可知(图7-C)，6′-SL产量呈现先上升后下降的趋势，在24h时，达到最高产量43.79g/L，转化率为72.66％。
实施例7工程菌株E.coliJM109(DE3)/pETDeut-1-plst6-neuA构建与蛋白诱导表达。
使用同源重组的方式构建重组质粒pETDeut-1-plst6-neuA。将PCR扩增得到的质粒片段pETDeut-1，基因片段neuA和plst6，经过核酸电泳验证正确后，切胶回收。其中，基因片段plst6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因片段neuA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将上述片段经过同源重组连接，构建流程如图8中A所示。
将构建成功的重组质粒pETDeut-1-plst6-neuA转化到感受态细胞E.coli JM109(DE3)中，以Amp为筛选标记进行平板涂布，经过菌落PCR验证后挑取单菌落进行摇瓶培养，提取菌液中的质粒进行PCR验证，并送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序鉴定。
对工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-plst6-neuA诱导表达，并进行SDS-PAGE(图8中B)与实际分子量大小一致，这表明成功表达目的蛋白。
在摇瓶水平，利用诱导成功的菌株和面包酵母共培养进行全细胞催化合成6′-SL，催化反应30h。利用TLC检测发现发酵液中存在与标准品6′-SL比移值相同的组分(图8中C)，可认定合成目的产物6′-SL。利用HPLC对发酵液上清液进行定量分析，发酵30h时6′-SL浓度为35.58g/L，唾液酸的转化率为93.69％(图8中D)。
实施例8二菌株共培养策略的6′-唾液酸乳糖的合成。
摇瓶双菌耦合催化转化合成6′-SL：将50g/L工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-plst6-neuA和100g/L面包酵母以60mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，在含有70mM CMP、300mM葡萄糖、1mMDTT、20mL/L甘油、10g/L二甲苯、5g/L乙醛、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4、150mMTris、4g/L十八胺聚氧乙烯醚的转化体系中，30℃、200r/min条件下反应30h。反应结束，将反应体系3000rpm/min离心2min，收集上清液用于检测。
7L发酵罐水平工程菌株和酵母共培养生产6′-SL：将50g/L工程菌株E.coli JM109(DE3)/pET Deut-1-plst6-neuA和100g/L面包酵母以60mM Neu5Ac、160mM乳糖为底物，在含有70mM CMP、300mM葡萄糖、1mM DTT、20mL/L甘油、10g/L二甲苯、5g/L乙醛、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4和150mM Tris、4g/L十八胺聚氧乙烯醚的转化体系中发酵。发酵6h时，以1.2mL/min的流速补充浓度为165mM唾液酸和250mM乳糖的混合溶液，设定搅拌转速与溶氧偶联以控制溶氧在25％，设定温度为30℃，通气量为1vvm，反应结束后，将发酵液3000r/min离心5min，收集上清液用于检测。
实施例9发酵罐培养工程菌株E.coliJM109(DE3)/pETDeut-1-plst6-neuA以及双菌耦合发酵转化合成6′-SL。
在7L发酵罐中培养工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-plst6-neuA，在工程菌株对数后期添加终浓度为0.15mM的IPTG对工程菌株进行诱导。发酵28h后(图9中A)，OD600达到16.10，此时生物量为41.75g/L。
将诱导成功的工程菌株按照实施例8的方法与酵母进行双菌耦合，发酵转化过程中流加唾液酸和乳糖，发酵结束后通过HPLC对6′-SL定量分析(图9中B)。可以看出，6′-SL产量先上升后下降，最后趋于平稳，在16h时达到最高产量51.29g/L，转化率为97.99％，因此选择16h为最佳的发酵时间。
实施例10工程菌株E.coliJM109(DE3)/pETDeut-1-neuA-nst3构建与蛋白诱导表达。
使用同源重组的方式构建重组质粒pETDeut-1-neuA-nst3。将PCR扩增得到的质粒片段pETDeut-1，基因片段neuA和nst3，经过核酸电泳验证正确后，切胶回收。其中，基因片段nst3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将上述片段经过同源重组连接，构建流程如图10所示(pCDF Deut-1-neuA-nst3构建流程喜相同，构建流程图省略)。
将构建成功的重组质粒pETDeut-1-neuA-nst3转化到感受态细胞E.coli JM109(DE3)中，以Amp为筛选标记进行平板涂布，经过菌落PCR验证后挑取单菌落进行摇瓶培养，提取菌液中的质粒进行PCR验证，并送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序鉴定。
对工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-neuA-nst3诱导表达，并进行SDS-PAGE(图11-A)与实际分子量大小一致，这表明成功表达目的蛋白。
在摇瓶水平，利用诱导成功的菌株和面包酵母共培养进行全细胞催化合成3′-SL，催化反应24h。利用TLC检测发现发酵液中存在与标准品3′-SL比移值相同的组分(图11-B)，可认定合成目的产物3′-SL。
实施例11工程菌株E.coliJM109(DE3)合成3′-SL最优质粒的构建与筛选。
使用同源重组的方式构建重组质粒pETDeut-1-neuA-nst3、pETDeut-1-nst3-neuA、pCDFDeut-1-neuA-nst3、pCDFDeut-1-nst3-neuA。将PCR扩增得到的质粒片段pETDeut-1和pCDFDeut-1，基因片段neuA和nst3，经过核酸电泳验证正确后，切胶回收。将上述片段经过同源重组连接，构建基因结构如图12所示。
将构建成功的4个重组质粒分别转化到感受态细胞E.coli JM109(DE3)中，质粒载体pETDeut-1以Amp为筛选标记、质粒载体pCDFDeut-1以Str为筛选标记，进行平板涂布，经过菌落PCR验证后挑取单菌落进行摇瓶培养，提取菌液中的质粒进行PCR验证，并送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序鉴定。
在摇瓶水平，利用诱导成功的4株工程菌株和面包酵母分别进行共培养全细胞催化合成3′-SL，催化反应24h。利用HPLC对发酵液上清液进行定量分析，发酵24h后工程菌株E.coli JM109(DE3)/pETDeut-1-nst3-neuA的3′-SL产量最佳，浓度为21.8g/L，唾液酸的转化率为47.46％(图13)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种双菌耦合发酵生产唾液酸乳糖的方法，其特征在于，以唾液酸和乳糖为底物，通过酵母与共表达唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌进行耦合发酵合成唾液酸乳糖；所述唾液酸转移酶选自α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述唾液酸的浓度为60mM-90mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳糖的浓度为80mM-200mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共表达唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌的添加量为50g/L-100g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母的添加量为50g/L-250g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母选自面包酵母、啤酒酵母和酿酒酵母中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为20℃-40℃；所述发酵的时间为10h-30h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述发酵的反应体系中还含有5mM-20mM的Mg+；
(2)所述发酵的反应体系中还含有外源添加的辅因子CMP，浓度为10mM-50mM；
(3)所述发酵的反应体系中还含有十八胺聚氧乙烯醚或者十八胺聚氧乙烯醚。
10.权利要求1-9任一所述方法生产的唾液酸乳糖在制备婴幼儿、中老年奶粉或营养补剂中的应用。
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