CN112342176A - 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用 - Google Patents

产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112342176A
CN112342176A CN202011102427.4A CN202011102427A CN112342176A CN 112342176 A CN112342176 A CN 112342176A CN 202011102427 A CN202011102427 A CN 202011102427A CN 112342176 A CN112342176 A CN 112342176A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gdp
mannose
fucosyllactose
trc
manc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011102427.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张涛
江波
李梦丽
李晨晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202011102427.4A priority Critical patent/CN112342176A/zh
Publication of CN112342176A publication Critical patent/CN112342176A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1288—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01132—GDP-mannose 6-dehydrogenase (1.1.1.132)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01271—GDP-L-fucose synthase (1.1.1.271)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07013—Mannose-1-phosphate guanylyltransferase (2.7.7.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/08—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C12Y207/08031—Undecaprenyl-phosphate glucose phosphotransferase (2.7.8.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/02—Phosphotransferases (phosphomutases) (5.4.2)
    • C12Y504/02008—Phosphomannomutase (5.4.2.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及产2’‑岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用，属于代谢工程和食品发酵技术。本发明通过改变大肠杆菌中转录调控因子的表达来调控代谢路径中的磷酸甘露糖变位酶，甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶、GDP‑岩藻糖合成酶、α‑1,2‑岩藻糖基转移酶和乳糖通透酶的表达水平，以获得最佳质粒组合；通过CRISPR‑Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌合成途径中的β‑半乳糖苷酶和UDP‑葡萄糖脂质载体转移酶，以提高2’‑岩藻糖基乳糖的累积量；本发明得到的重组大肠杆菌可以利用甘油或葡萄糖合成2’‑岩藻糖基乳糖，遗传稳定，表达水平高，具有明显的工业化生产潜力。

Description

产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用，属于代谢工程和食品发酵技术。
背景技术
人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中仅次于脂肪和乳糖的第三大固体成分。岩藻糖基化的HMOs，包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL),3-岩藻糖基乳糖(3-FL)，乳酰-N-四糖，乳酰-N-新四糖，乳酰-N-岩藻戊糖，这些物质作为天然的抗粘附剂，通过防止病原体附着，降低婴幼儿由空肠弯曲杆菌、大肠杆菌和肺炎链球菌等有害菌引起的胃肠道、泌尿生殖系统和呼吸道感染的风险。2’-FL是母乳中分泌最丰富的人乳寡糖，约占总HMOs的30％，有研究表明，配方奶粉中添加2’-FL喂养的婴儿，其体内的肠道菌群种类与母乳喂养的婴儿一致。目前，欧盟，美国和中国已批准2’-FL作为新食品成分使用，且对其安全性、适用性以及使用剂量等进行了规范。
2’-FL的生产可采用母乳分离、化学合成、酶法合成和微生物发酵。因母乳来源有限及化学合成过程需精准地对侧链保护和脱保护，过程繁琐，无法实现2’-FL的高效合成。酶法合成2’-FL，可根据受体和糖基供体的构型筛选合适的酶类，但是核苷供体GDP-岩藻糖的价格昂贵，且酶的催化活力低，产量仅有毫克级别，无法实现大规模的工业化生产。随着合成生物学和代谢工程等技术手段的发展，利用微生物生产2’-FL备受关注，当前，研究较多的是以大肠杆菌为模式生物，通过从头合成途径和补救途径代谢生产GDP-岩藻糖，在此基础上异源表达α-1,2岩藻糖基转移酶，最终发酵得到2’-FL。
大肠杆菌由于生长迅速、培养简单、重组子稳定、载体受体系统完备等特点，是作为GDP-岩藻糖合成研究的理想模式微生物。在从头合成途径中，工程菌可直接利用廉价的底物(甘油或葡萄糖)实现关键前体GDP-岩藻糖的高效合成，进而为2’-FL的工业制备提供了有利条件。本发明旨在利用合成生物学手段，基于从头合成路径构建高效制备2’-FL的重组大肠杆菌，根据不同拷贝数的质粒组合实现代谢模块的优化。利用CRISPR-Cas9基因敲除技术弱化副代谢分支酶，有效提高了2’-FL的产量。该方法为2’-FL的批量生产提供了有效途径，同时具有较强的理论研究价值和社会经济效益，市场开发前景广阔。
发明内容
针对现有2’-岩藻糖基乳糖合成产率低，糖苷供体昂贵等问题，本发明提供了一种利用基因工程手段改造大肠杆菌的方法，敲除了2’-岩藻糖基乳糖分解代谢的相关基因，强化了从头合成途径的关键合成酶，该重组菌可利用廉价底物高效制备2’-岩藻糖基乳糖，具有广泛的工业应用价值。
本发明提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌，所述工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达了磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd、GDP-岩藻糖合成酶wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY。
在本发明的一种实施方式中，利用启动子T7或tac对基因进行过表达。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1对上述至少一个基因进行过表达。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1载体表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1载体表达了α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pETDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pCDFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pACYCDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pETDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pRSFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pETDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，利用pCDFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述α-1,2岩藻糖基转移酶futC来源于幽门螺旋杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG和乳糖通透酶lacY均来自于Escherichia coliK12。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG，α-1,2-岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的Gene ID为945006，UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的Gene ID为946583。
本发明提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，以所述的工程菌为发酵菌株，在以甘油或葡萄糖为底物的发酵体系中生产2’-岩藻糖基乳糖。
在本发明的一种实施方式中，甘油或葡萄糖的浓度为20.0-800.0g/L，将菌株接种至发酵体系中，培养至OD600为0.6-1，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG以及15-20g/L乳糖诱导，培养温度20℃-37℃，转速200-250rpm，培养时间为80-130h。
在本发明的一种实施方式中，溶氧控制在20-40％。
在本发明的一种实施方式中，待发酵体系中的乳糖消耗后加入乳糖，并使其在体系中的浓度维持在3～10g/L。
本发明提供了一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，敲除了大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd、GDP-岩藻糖合成酶wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1载体过表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd、GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因；并利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1载体过表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd和GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pETDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd和GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，并利用pCDFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pRSFDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因，利用pACYCDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pETDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd或GDP-岩藻糖合成酶wcaG的基因，并利用pRSFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，利用pETDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd、GDP-岩藻糖合成酶wcaG的基因，利用pCDFDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明还保护所述的工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖及含有2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
有益效果：
本发明通过敲除大肠杆菌的2’-岩藻糖基乳糖代谢途径中的β-半乳糖苷酶(lacZ)和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(wcaJ)基因，组合调控从头合成2’-岩藻糖基乳糖所需的磷酸甘露糖变位酶(manB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(manC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(gmd)，GDP-岩藻糖合成酶(wcaG)，α-1,2-岩藻糖基转移酶(futC)和乳糖通透酶(lacY)的表达，筛选得到最佳质粒组合，实现了2’-岩藻糖基乳糖在大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ中的高效合成。本发明利用重组大肠杆菌制备2’-岩藻糖基乳糖，还具有培养基简单，底物廉价，菌株生长快，遗传稳定，表达水平高等优势，具有显著的工业化生产潜力。
附图说明
图1为大肠杆菌中制备2’-岩藻糖基乳糖的从头合成途径。
图2为基因敲除lacZ和wcaG的验证结果。
图3为pRSFDuet-1-BCGW的质粒图谱。
图4为pETDuet-1-FY的质粒图谱。
图5为T7启动子调控的重组菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比对。
图6为Trc启动子调控的重组菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比对。
图7为含最佳质粒组合的重组菌补料分批发酵产量结果。
图8为发酵产物的HPLC检测结果。
具体实施方式
以下实例中所使用的质粒、PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。
LB种子培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
发酵培养基：甘油或葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，柠檬酸1.7g/L，磷酸氢二氨4g/L，七水硫酸镁1.4g/L，甘氨酸1.2g/L，精氨酸0.7g/L，微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L，七水硫酸镁2.25g/L，五水硫酸铜1.0g/L，一水硫酸锰0.35g/L，硼砂0.23g/L，钼酸铵0.11g/L，二水氯化钙2.0g/L，pH 6.8。
2’-岩藻糖基乳糖的测定方法：
使用HPLC测定：1mL发酵液于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，上清液经0.22μm膜过滤处理，利用HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖的生成量以及乳糖和甘油的消耗量。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Rezex ROA-organic acid(Phenomenex，USA)，柱温为50℃；流动相为0.005mol/L的H2SO4水溶液，流速为0.6mL/min；进样量为10μL。
本实施例中涉及到的磷酸甘露糖变位酶(manB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(manC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(gmd)，GDP-岩藻糖合成酶(wcaG)，α-1,2-岩藻糖基转移酶(futC)和乳糖通透酶(lacY)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
实施例1：含T7启动子的重组表达质粒的构建
重组表达载体构建具体步骤如下(涉及到的引物序列见表1)：
(1)manB，manC，gmd和wcaG片段的获得：以大肠杆菌K12的基因组为模板，使用引物manB_F1/R1、manC_F1/R1、gmd_F1/R1和wcaG_F1/R1进行PCR扩增，胶回收DNA，获得manB、manC、gmd和wcaG基因片段。
(2)以pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1空质粒为模板，使用V1_F/R扩增载体骨架。根据In-Fusion克隆技术，将manB片段分别与pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1连接，筛选阳性克隆并测序，得到重组质粒pRSFDuet-1-manB、pETDuet-1-manB、pCDFDuet-1-manB、pACYCDuet-1-manB和pCOLADuet-1-manB。
(3)T7-manC、T7-gmd和T7-wcaG片段的获得：T7启动子序列模板来源于pETDuet-1质粒，使用T7-manC_F/R、T7-gmd_F/R和T7-wcaG_F/R引物扩增并纯化T7启动子序列。根据重叠延伸PCR技术，将T7启动子分别与manC、gmd和wcaG片段连接，核酸电泳验证并胶回收DNA，得到T7-manC、T7-gmd和T7-wcaG片段。
(4)T7-manC-T7-gmd和T7-manC-T7-gmd-T7-wcaG长片段的获得：使用重叠延伸PCR，三片段两次PCR扩增目的片段，T7-manC-T7-gmd片段的延伸使用引物T7-manC_F和gmd_R，T7-manC-T7-gmd-T7-wcaG片段的获得使用延伸引物T7-manC_F和wcaG_R，核酸电泳验证并胶回收DNA，得到T7-manC-T7-gmd和T7-manC-T7-gmd-T7-wcaG片段。
(5)以pRSFDuet-1-manB、pETDuet-1-manB、pCDFDuet-1-manB、pACYCDuet-1-manB和pCOLADuet-1-manB为模板，使用引物V2_F/R扩增载体骨架序列。根据In-Fusion克隆技术，将长片段T7-manC-T7-gmd-T7-wcaG分别与五个载体相连，筛选阳性克隆并测序，得到重组质粒pRSF-BCGW、pET-BCGW、pCDF-BCGW、pACYC-BCGW和pCOLA-BCGW。
(6)futC和lacY片段的获得：futC的基因序列来源于幽门螺杆菌，由上海生工生物有限公司合成，lacY的基因序列来源于大肠杆菌K12基因组。使用引物futC_F1/R1和lacY_F1/R1PCR扩增目的基因，胶回收DNA片段。
(7)载体pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1的骨架序列使用引物V3_F/R扩增，futC片段与载体相连得到质粒pRSFDuet-1-futC、pETDuet-1-futC、pCDFDuet-1-futC、pACYCDuet-1-futC和pCOLADuet-1-futC。以得到的五个质粒为模板，使用引物V4_F/R扩增载体序列，将lacY分别与载体相连，最终获得重组质粒pRSF-FY、pET-FY、pCDF-FY、pACYC-FY和pCOLA-FY。
表1含T7启动子的质粒的引物序列
Figure BDA0002725835730000061
Figure BDA0002725835730000071
实施例2：含Trc启动子的重组表达质粒的构建
重组表达载体构建具体步骤如下(涉及到的引物序列见表2)：
(1)pRSFDuet-Trc、pETDuet-Trc、pCDFDuet-Trc、pACYCDuet-Trc和pCOLADuet-Trc载体的构建：以pTrcHis2B为模板，使用引物Trc_F/R扩增Trc启动子及MCS区域，以pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1空质粒为模板，使用引物VDuet_F/R扩增载体骨架序列。根据In-Fusion克隆技术，两片段连接并转化DH5α，筛选阳性克隆子，最终获得含有Trc启动子的表达载体。
(2)manB，manC，gmd和wcaG片段的获得：以大肠杆菌K12的基因组为模板，使用引物manB_F2/R2、manC_F2/R2、gmd_F2/R2和wcaG_F2/R2，PCR扩增并胶回收，获得manB、manC、gmd和wcaG基因片段。
(3)以pRSFDuet-Trc、pETDuet-Trc、pCDFDuet-Trc、pACYCDuet-Trc和pCOLADuet-Trc空质粒为模板，使用V5_F/R扩增载体骨架。采用In-Fusion克隆技术，将manB片段分别与pRSFDuet-Trc、pETDuet-Trc、pCDFDuet-Trc、pACYCDuet-Trc和pCOLADuet-Trc连接，筛选阳性克隆并测序，得到重组质粒pRSFDuet-Trc-manB、pETDuet-Trc-manB、pCDFDuet-Trc-manB、pACYCDuet-Trc-manB和pCOLADuet-Trc-manB。
(4)Trc-manC、Trc-gmd和Trc-wcaG片段的获得：使用Trc-manC_F/R、Trc-gmd_F/R和Trc-wcaG_F/R引物扩增并纯化Trc启动子序列。利用重叠延伸PCR技术，将Trc启动子分别与manC、gmd和wcaG片段连接，核酸电泳验证并胶回收DNA，得到Trc-manC、Trc-gmd和Trc-wcaG片段。
(5)Trc-manC-Trc-gmd和Trc-manC-Trc-gmd-Trc-wcaG长片段的获得：使用重叠延伸PCR，三片段两次PCR扩增目的片段，Trc-manC-Trc-gmd片段的延伸使用引物Trc-manC_F和gmd_R2，Trc-manC-Trc-gmd-Trc-wcaG片段的获得使用延伸引物Trc-manC_F和wcaG_R2，核酸电泳验证并胶回收DNA，得到Trc-manC-Trc-gmd和Trc-manC-Trc-gmd-Trc-wcaG片段。
(6)以pRSFDuet-Trc-manB、pETDuet-Trc-manB、pCDFDuet-Trc-manB、pACYCDuet-Trc-manB和pCOLADuet-Trc-manB为模板，使用引物V6_F/R扩增载体骨架序列。根据In-Fusion克隆技术，将长片段Trc-manC-Trc-gmd-Trc-wcaG分别与五个载体相连，筛选阳性克隆并测序，得到重组质粒pRSF-Trc-BCGW、pET-Trc-BCGW、pCDF-Trc-BCGW、pACYC-Trc-BCGW和pCOLA-Trc-BCGW。
(7)futC和Trc-lacY片段的获得：futC的基因序列来源于幽门螺杆菌，由上海生工生物有限公司合成，lacY的基因序列来源于大肠杆菌K12基因组。使用引物futC_F1/R1和lacY_F1/R1PCR扩增目的基因，使用引物Trc-lacY_F/R扩增Trc启动子，Trc和lacY的连接使用重叠延伸PCR，胶回收DNA片段。
(8)载体pRSFDuet-Trc、pETDuet-Trc、pCDFDuet-Trc、pACYCDuet-Trc和pCOLADuet-Trc的骨架序列使用引物V7_F/R扩增，futC片段与上述五个载体相连得到重组质粒pRSFDuet-Trc-futC、pETDuet-Trc-futC、pCDFDuet-Trc-futC、pACYCDuet-Trc-futC和pCOLADuet-Trc-futC。以含futC的五个质粒为模板，使用引物V8_F/R扩增载体序列，将Trc-lacY分别与载体相连，最终获得重组质粒pRSF-Trc-FY、pET-Trc-FY、pCDF-Trc-FY、pACYC-Trc-FY和pCOLA-Trc-FY。
表2含Trc启动子的质粒的引物序列
Figure BDA0002725835730000081
Figure BDA0002725835730000091
实施例3：基于CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ和wcaJ基因
基因敲除的具体步骤如下(涉及到的引物序列见表3)：
(1)以lacZ基因为例，通过http://www.regenome.net/cas-offinder/设计lacZ基因的gRNA，将设计的20bp序列引入gRNAR，以gRNAF/gRNAR为上下游引物，pTargetF质粒为模板进行PCR扩增。扩增产物使用限制性内切酶Dpn I酶切，去除多余环状的pTargetF质粒。将扩增产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抽提质粒，使用引物gRNAPF/gRNAPR测序鉴定，将构建成功的敲除质粒命名为pTF-ΔlacZ。
(2)选用大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，利用上游同源臂引物lacZ LF/lacZLR和下游同源臂引物lacZ RF/lacZ RR分别扩增出同源臂序列，产物纯化回收。根据SOE-PCR技术，使用引物lacZ LF/lacZ RR将上下游同源臂连接，获得基因同源修复臂。
(3)将pCas质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布到含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板上(30℃培养)，筛选获得含有pCas质粒的阳性克隆子大肠杆菌BL21-Δ。将含pCas质粒的大肠杆菌BL21-Δ制备电转化感受态细胞。构建成功的敲除载体pTF-ΔlacZ和基因同源修复臂电转化(1.8kv，5ms)上述感受态细胞大肠杆菌BL21-Δ，30℃复苏1h，涂布至含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上，30℃培养16h获得转化子。以基因组上lacZ序列设计上下游敲除鉴定引物lacZ PF/lacZ PR，对转化子进行菌落PCR验证，进行回复野生型/重组型的鉴定，将菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)-ΔlacZ。
(4)鉴定成功的大肠杆菌BL21-ΔZ菌株需消除敲除质粒和pCas，菌株培养于含有卡那霉素的LB液体培养基中，待OD600值达到0.2，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.5mmol/L)，培养12h后划线含卡那霉素抗性的LB固体平板，消除壮观霉素抗性。敲除重组菌在42℃培养过夜去除pCas质粒，划线无抗平板，消除卡那抗性。
(5)二轮敲除wcaJ基因的操作流程同lacZ，将鉴定敲除菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ。
表3基因敲除引物
Figure BDA0002725835730000101
Figure BDA0002725835730000111
实施例4：重组大肠杆菌的构建
本实施例中涉及到质粒和工程菌见表4。
制备敲除菌株BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ的感受态细胞，利用化学转化法将pRSF-BCGW和pET-CY转入感受态细胞，涂板于卡那和氨苄抗性平板，37℃过夜培养，筛选得到阳性克隆子。其他不同抗性的重组大肠杆菌构建方式如上。
表4质粒和工程菌
Figure BDA0002725835730000112
Figure BDA0002725835730000121
Figure BDA0002725835730000131
Figure BDA0002725835730000141
实施例5：高产2’-岩藻糖基乳糖重组菌的筛选
1、菌株摇瓶发酵筛选
(1)重组菌株BZW1-36的单菌落接种于5mL种子液，37℃，200r/min回旋式摇床过夜培养。
(2)重组菌株种子液以5.0％的接种量接种于50mL发酵培养基，37℃，200r/min培养菌体OD600至0.6-0.8，加入IPTG终浓度为0.2mM，同时加入20g/L乳糖，诱导培养80h。
(3)发酵过程定时取样，使用HPLC检测发酵产物。结果显示(图5和图6)，在36株重组菌摇瓶发酵过程中，BZW-1菌株代谢合成2’-岩藻糖基乳糖的积累量最高，浓度可达5.78g/L，且BZW-2、BZW-3、BZW-4和BZW-5菌株的产量分别为5.54、5.21、4.92、4.98g/L。
2、菌株遗传稳定性
将上述筛选出的菌株BZW-1～5按照上述的摇瓶生产方法，传代培养6代，检测每代的2’-岩藻糖基乳糖产量，结果表5所示，筛选出的菌株在2’-岩藻糖基乳糖生产中均保持稳定的生产性能，具备良好的遗传稳定。
表5 BZW-1～5菌株传代后2’-岩藻糖基乳糖产量(g/L)
Figure BDA0002725835730000151
实施例6：发酵重组菌补料分批发酵
为了通过高密度发酵制备高产量的2’-岩藻糖基乳糖，使用重组菌BZW-1在3L发酵罐进行补料分批发酵。
发酵条件：发酵培养基，接种量5％，诱导前培养温度37℃，待OD600达到30，加入IPTG诱导蛋白表达使得其在发酵体系中的浓度为0.2mmol/L，初始乳糖浓度为20g/L，诱导发酵温度为20℃。发酵全程使用NH4OH控制罐体pH恒定为6.80，待初始碳源消耗完后流加500g/L的甘油和20g/L的MgSO4·7H2O以补充碳源，待初始乳糖消耗完后流加200g/L的乳糖并使其在体系中的浓度维持在5g/L左右至发酵结束。发酵过程通过系统级联控制，调节转速，通气量和氧气使罐体溶氧为20％。
发酵全程定时取样并测定菌体OD600，1mL发酵液煮沸15min使细胞破碎完全，12000r/min离心10min，上清液经0.22μm膜过滤处理，发酵过程中利用HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖的生成量以及乳糖和甘油的消耗量(图7和图8)。结果显示，发酵结束后(共发酵130小时)，产物2’-岩藻糖基乳糖的浓度可达52g/L。
在发酵100、110、120小时2’-岩藻糖基乳糖的浓度分别可达41.21、45.35、50.11g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 产2'-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
<130> BAA201044A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> Escherichia coli K12
<400> 1
atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60
aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120
attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180
ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240
tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300
ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360
accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420
accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480
ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540
gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600
gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660
ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720
ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780
attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840
gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900
ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960
gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020
tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080
acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140
agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200
gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260
ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320
ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371
<210> 2
<211> 1437
<212> DNA
<213> Escherichia coli K12
<400> 2
atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60
ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120
ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180
aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240
aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300
gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360
gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420
gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480
attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540
tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600
tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660
cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720
tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780
gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840
ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900
ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960
accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020
gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080
catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140
gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200
cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260
attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320
acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380
tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437
<210> 3
<211> 1122
<212> DNA
<213> Escherichia coli K12
<400> 3
atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60
tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120
accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180
cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240
gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300
tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360
ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420
caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480
aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540
aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600
atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660
atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720
ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780
cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840
gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900
ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960
ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020
gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080
aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122
<210> 4
<211> 966
<212> DNA
<213> Escherichia coli K12
<400> 4
atgagtaaac aacgcatttt tatcgctggc catcgcggaa tggtcggttc cgccatcacg 60
cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120
ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180
ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240
taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300
aaactgctgt ttctcggatc gtcctgtatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360
gaaagcgagc tgttgcaggg tacgctggag ccgaccaacg agccttatgc cattgccaaa 420
atcgccggga tcaaattgtg cgaatcttac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctcg 480
gtcatgccaa ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc atccgagtaa ctcgcatgtg 540
atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcacc ggatgtggtg 600
gtgtggggca gcggtacacc gatgcgtgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660
agcattcatg tcatggagct ggcgcacgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgctg 720
tcgcacatta acgttggtac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780
gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagtaaacc ggatggtacg 840
ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900
ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960
gggtaa 966
<210> 5
<211> 903
<212> DNA
<213> Helicobacter pylori
<400> 5
atggctttta aggtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60
ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat cacttctttt 120
gattggagcg ataggaaaat gcaattagaa cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgagc 180
gcgaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agacgcgctc 240
aaatgcatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300
ctaaagccaa gccgcttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atactttgat 360
gctatatccc ctttaatcaa gcaaaccttc actctaccac caccaccaga aaataataag 420
aataataata aaaaagagga agaatatcag tgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480
aacagcgtgt ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540
attgactatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600
tttgtgtttt gcgaagactt agaattcacg caaaatcttg atcttggcta cccttttatg 660
gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg acatgctgct catgcaatct 720
tgtcagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggccta tttgatagaa 780
aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga gaatatcctt 840
tgtaaggagt gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa gtataacgct 900
taa 903
<210> 6
<211> 1254
<212> DNA
<213> Escherichia coli K12
<400> 6
atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60
tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180
ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240
accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300
tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420
ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480
atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600
gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720
caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840
ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900
gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960
ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020
tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080
gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140
gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200
agcggccccg gtccgctttc tctactgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

Claims (10)

1.产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达了磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，利用启动子T7或tac对基因进行过表达。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1载体进行过表达。
4.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，利用载体pRSFDuet-1或pETDuet-1表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd和GDP-岩藻糖合成酶wcaG的基因；并利用载体pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1或pACYCDuet-1表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY的基因。
5.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
6.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，以权利要求1～5任一所述的工程菌为发酵菌株，在以甘油或葡萄糖为底物的发酵体系中生产2’-岩藻糖基乳糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以IPTG和乳糖为诱导剂，乳糖在发酵体系中的浓度为4～25g/L，或至100g/L以上。
8.一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd、GDP-岩藻糖合成酶wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1载体过表达磷酸甘露糖变位酶manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG基因；利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1载体过表达α-1,2岩藻糖基转移酶futC和乳糖通透酶lacY基因。
10.权利要求1～5任一所述工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖及含有2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
CN202011102427.4A 2020-10-15 2020-10-15 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用 Pending CN112342176A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011102427.4A CN112342176A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011102427.4A CN112342176A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112342176A true CN112342176A (zh) 2021-02-09

Family

ID=74361869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011102427.4A Pending CN112342176A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112342176A (zh)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735479A (zh) * 2019-01-30 2019-05-10 光明乳业股份有限公司 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN113025548A (zh) * 2021-04-08 2021-06-25 西南大学 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
CN113186142A (zh) * 2021-04-12 2021-07-30 江南大学 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN113832092A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027A (zh) * 2021-10-20 2022-01-21 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN114214352A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 黄山同兮生物科技有限公司 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法
CN114276971A (zh) * 2022-01-07 2022-04-05 天津科技大学 一种利用甘露糖合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用
CN114480240A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 江南大学 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114806991A (zh) * 2022-05-16 2022-07-29 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN115216500A (zh) * 2022-09-20 2022-10-21 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN115806890A (zh) * 2022-09-28 2023-03-17 山东大学 一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116042682A (zh) * 2022-12-22 2023-05-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116200360A (zh) * 2023-01-30 2023-06-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116286562A (zh) * 2021-12-10 2023-06-23 虹摹生物科技(上海)有限公司 一种基因工程菌及其制备方法和应用
CN116732075A (zh) * 2023-06-09 2023-09-12 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用
CN116948928A (zh) * 2023-06-02 2023-10-27 虹摹生物科技(上海)有限公司 种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法
WO2023216685A1 (zh) * 2022-05-10 2023-11-16 南通励成生物工程有限公司 一种以葡萄糖为碳源合成2'-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190937A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 南开大学 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’‑岩藻乳糖的方法
US20180298389A1 (en) * 2016-04-25 2018-10-18 Seoul National University R&Db Foundation Method of producing 2'-fucosyllactose using corynebacterium glutamicum
CN109402158A (zh) * 2018-09-14 2019-03-01 江苏大学 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN109609422A (zh) * 2018-11-20 2019-04-12 安徽天凯生物科技有限公司 一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111471637A (zh) * 2020-05-08 2020-07-31 江苏华燕集团有限公司 2`-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180298389A1 (en) * 2016-04-25 2018-10-18 Seoul National University R&Db Foundation Method of producing 2'-fucosyllactose using corynebacterium glutamicum
CN106190937A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 南开大学 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’‑岩藻乳糖的方法
CN109402158A (zh) * 2018-09-14 2019-03-01 江苏大学 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN109609422A (zh) * 2018-11-20 2019-04-12 安徽天凯生物科技有限公司 一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111471637A (zh) * 2020-05-08 2020-07-31 江苏华燕集团有限公司 2`-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和用途

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735479B (zh) * 2019-01-30 2022-04-01 光明乳业股份有限公司 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN109735479A (zh) * 2019-01-30 2019-05-10 光明乳业股份有限公司 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN113025548A (zh) * 2021-04-08 2021-06-25 西南大学 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
CN113186142B (zh) * 2021-04-12 2023-01-31 江南大学 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN113186142A (zh) * 2021-04-12 2021-07-30 江南大学 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN113832092A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027A (zh) * 2021-10-20 2022-01-21 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113832092B (zh) * 2021-10-20 2023-10-03 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027B (zh) * 2021-10-20 2023-10-03 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN116286562A (zh) * 2021-12-10 2023-06-23 虹摹生物科技(上海)有限公司 一种基因工程菌及其制备方法和应用
CN114214352B (zh) * 2021-12-27 2024-04-16 黄山同兮生物科技有限公司 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法
CN114214352A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 黄山同兮生物科技有限公司 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法
CN114276971A (zh) * 2022-01-07 2022-04-05 天津科技大学 一种利用甘露糖合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用
CN114480240A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 江南大学 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114480240B (zh) * 2022-02-22 2024-03-26 江南大学 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
WO2023216685A1 (zh) * 2022-05-10 2023-11-16 南通励成生物工程有限公司 一种以葡萄糖为碳源合成2'-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用
CN114806991A (zh) * 2022-05-16 2022-07-29 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN114806991B (zh) * 2022-05-16 2023-08-25 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114774343B (zh) * 2022-05-24 2023-09-12 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN114874964B (zh) * 2022-06-13 2023-08-25 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN115216500A (zh) * 2022-09-20 2022-10-21 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN115806890A (zh) * 2022-09-28 2023-03-17 山东大学 一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116042682B (zh) * 2022-12-22 2024-01-23 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116042682A (zh) * 2022-12-22 2023-05-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116200360B (zh) * 2023-01-30 2023-09-15 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116200360A (zh) * 2023-01-30 2023-06-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116948928A (zh) * 2023-06-02 2023-10-27 虹摹生物科技(上海)有限公司 种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法
CN116732075A (zh) * 2023-06-09 2023-09-12 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用
CN116732075B (zh) * 2023-06-09 2024-03-08 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112342176A (zh) 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN110804577B (zh) 一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌的构建方法及其应用
CN109402158B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN106190937B9 (zh) 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’-岩藻乳糖的方法
CN114480240B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114774343B (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN112458034B (zh) 一种基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6’-唾液乳糖的方法
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
WO2023011576A1 (zh) 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
CN114107152B (zh) 一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用
CN115948307A (zh) 一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用
CN116064345A (zh) 高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用
CN114990037A (zh) 一种高产乳酰-n-四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN113832092B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN114806991B (zh) 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN113957027B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN114410561B (zh) 一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用
CN113684163B (zh) 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN116676243A (zh) 产2&#39;-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用
CN116333953A (zh) 一种高产胞嘧啶核苷的基因工程菌及其应用
CN116925993B (zh) 用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法
CN116790650A (zh) 一种利用混合碳源生产2′-岩藻糖基乳糖的方法及其应用
CN116478894A (zh) 一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN110656074B (zh) 一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用
CN116536232A (zh) 一种高产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210209

RJ01 Rejection of invention patent application after publication