CN116732075B - 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用 - Google Patents
一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生产2′‑岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用，属于生物技术领域。本发明构建的多层动态调控系统包括：组成型表达的靶向2′‑岩藻糖基乳糖合成相关基因的第一crRNA，组成型表达的靶向中心碳代谢相关基因的第二crRNA，组成型表达的调节因子LsrR，由诱导型启动子PlsrA调控的缺陷型核酸酶dCas12a，其中，上调2′‑岩藻糖基乳糖合成相关基因manB、manC、gmd、fcl、rcsA的表达，下调中心碳代谢相关基因pfkA的表达。本发明的动态调控系统有效缓解了中心碳代谢和2'‑FL从头合成途径对胞内营养物质的竞争性消耗而造成的细胞代谢压力，同时大大提高了目标产物的产量，对大肠杆菌细胞工厂合成2'‑FL的研究有着重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
母乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中一类特有的复合碳水化合物，可以通过刺激新生儿中有益肠道细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，调节肠道菌群平衡，对调节新生儿出生后的免疫系统有着重要作用。此外，HMOs还可以抑制病原体与上皮细胞表面聚糖的粘附，从而降低一些病原体的毒力。HMOs具有多种核心单糖结构单元，根据构成HMOs单糖结构单元的不同空间构型、糖基序列、链长等，可以将HMOs分为中性岩藻糖基乳糖、酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种类别。在众多HMOs寡糖结构中，大约50％的HMOs是岩藻糖基化的，而2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL)是目前最具有潜力的一种岩藻糖基乳糖，因其具有抑制病原菌感染、调节肠道菌群、增强免疫力等生理功能，已被国内外多种权威食品安全风险评估机构批准为婴幼儿奶粉、特需食品中的营养添加剂。
在目前构建的2'-FL微生物细胞工厂中，多集中于采用静态控制的途径重构和多模块组装优化等方面。例如，Katja等在大肠杆菌中设计构建了以蔗糖为唯一碳源的2'-FL从头合成途径，通过引入UDP-半乳糖基转移酶GalTpm1141，可以实现胞内内源合成底物乳糖；过表达Fkp和AfcB，增强前体GDP-L-岩藻糖的供应；进一步引入糖转运蛋白TPYb，促进2'-FL的胞外输出，发酵84h后，2′-FL的产量达到60g/L。Huang等人系统地筛选了不同来源的α1,2岩藻糖基转移酶、敲除竞争途径、改善辅因子供应等静态调控方式，获得了在E.coli中高效合成2'-FL和3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL)的菌株。与静态调控相比，动态调控策略可以消除有毒中间代谢物的积累，使细胞生长与产物合成达到相对平衡的状态，从而有效提高产物合成效率。因此，动态调控策略也被用于设计、构建高效合成2'-FL的微生物细胞工厂。例如，Deng等人基于配体凝血酶结合的适配体在Bacillus subtilis中开发了一种体内双功能基因表达调控回路用于动态调控2'-FL的合成，可以上调2'-FL合成途径中关键基因fkp和futC的表达，并下调基因purR的表达，使2'-FL的产量从24.7mg/L增加到674mg/L。Yu等人设计开发出一种基于温度响应的多模块时序调控系统，用于B.subtilis中时序调控2’-FL合成模块与竞争模块，创建了2'-FL双阶段发酵合成技术，使2'-FL合成提高至28.2g/L。
随着合成生物学工具的快速发展和动态调控策略的广泛应用，基于多个代谢通量节点的“分层”自主策略和感知多个信号刺激以响应一个或多个代谢通量节点的“多输入”自主策略已被用于设计、构建和表征更复杂的基因遗传控制电路来调控合成途径的代谢通量。多层基因回路设计的一个关键问题是开发具有高特异性和低噪声的正交调控系统，可以通过优化调节元件对底物分子响应的范围或阈值，减少各组件中间代谢产物对信号的干扰，提高基因回路的稳定性。其中，基于群体响应(quorum sensing,QS)系统的多层动态控制策略，能够以独立于合成路径的方式自主调控多个节点的代谢通量。例如，研究人员开发了一种组合LuxI/LuxR和Esa型两种QS正交系统的双层调控系统，可以实现基因的同时上调和下调，并将其成功应用于辣椒素和水杨酸的生物合成。
动态调控策略可以有效缓解静态调控所造成的细胞生长阻滞和代谢流失衡等问题，为最大化提高目标产物合成产量提供了一种新的有效手段。近年来，多层动态调控策略在解决动态响应元件调控范围有限、多基因双重调控等问题中具有较大的潜力，并已用于代谢调控多种合成产物。然而，由两种外源QS系统构建的双层基因调控回路可能对细胞的代谢造成负担，同时不同QS系统之间的串扰可能会影响代谢节点的精细调控；而响应途径中特定化合物的生物传感器的种类和数量有限，限制了其在微生物中的广泛应用。此外，目前CRISPR-dCas9可编程电路多数是通过诱导剂阿拉伯糖和四环素驱动的，在工业规模化应用中具有一定的限制。因此，设计与细胞生长偶联的CRISPR-dCas12a调控系统有望用于实现基因的多层动态双重调控中。
发明内容
为缓解中心碳代谢和2'-FL从头合成途径对胞内营养物质的竞争性消耗而造成的细胞代谢压力，本发明提供了一种多层动态调控系统，将其应用于动态下调中心碳代谢途径基因pfkA，以及上调2'-FL从头合成途径上基因manB,manC,gmd,fcl,rcsA的表达水平，无需额外添加诱导剂便可以动态协调细胞生长和产物合成的代谢流，减少因代谢溢流造成的副产物乙酸积累，以最大化提高2'-FL从头合成效率。
本发明的第一个目的是提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统，所述多层动态调控系统包括：组成型表达的靶向2′-岩藻糖基乳糖合成相关基因的第一crRNA，组成型表达的靶向中心碳代谢相关基因的第二crRNA，组成型表达的调节因子LsrR，由诱导型启动子PlsrA调控的缺陷型核酸酶dCas12a；
其中，
所述多层动态调控系统上调2′-岩藻糖基乳糖合成相关基因的表达，下调中心碳代谢相关基因的表达；
所述2′-岩藻糖基乳糖合成相关基因包括磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合酶基因fcl、转录调节蛋白基因rcsA中的一种或多种；
所述中心碳代谢相关基因包括6-磷酸果糖激酶基因pfkA。
进一步地，第一crRNA和第二crRNA可位于同一质粒上，也可位于不同质粒上。
进一步地，调节因子LsrR与由诱导型启动子PlsrA调控的缺陷型核酸酶可位于同一质粒上，也可位于不同质粒上，或直接整合至基因组上。
进一步地，在所述2′-岩藻糖基乳糖合成相关基因的上游插入WBJ序列，所述第一crRNA靶向该WBJ序列。
进一步地，WBJ序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明的实施例中，该WBJ序列由Ptac启动子调控表达，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述第一crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述第二crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述调节因子LsrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述缺陷型核酸酶dCas12a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述第一crRNA或第二crRNA由PJ23119启动子调控表达。
进一步地，所述PJ23119启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述调节因子LsrR由PJ23100启动子调控表达。
进一步地，所述PJ23100启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的是提供上述多层动态调控系统在制备2′-岩藻糖基乳糖或含2′-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述多层动态调控系统的重组大肠杆菌。
进一步地，以E.coli MG30出发菌株。该出发菌株记载于申请号为CN202210269476.X的中国专利中。具体构建方法如下：
以E.coli MG27为出发菌株，敲除了编码EIICBGlc酶的基因ptsG，过表达乳糖通透酶基因lacY，并异源表达了GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk。
进一步地，将上述基因整合至基因组上进行异源表达或过表达，基因lacY至treB基因座，基因ppk2和基因gsk组成的表达框整合至nupG基因座。其中，基因ptsG的编号为ID:945651；乳糖通透酶基因lacY的编号为ID:949083，GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2的编号为ID:879494；鸟苷肌苷激酶基因gsk的编号为ID:946584。
进一步地，基因lacY由Ptac启动子调控表达；基因ppk2由Ptac启动子调控表达；基因gsk由PJ23119启动子调控表达。
进一步地，E.coli MG27记载于申请号为CN202011240682.5的中国专利中，该专利中命名为MG-26△yjiP::trxA-futC。具体构建方法如下：
以大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC为宿主菌，将N端融合蛋白标签硫氧还蛋白A(TrxA)的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC整合至yjip位点。
进一步地，硫氧还蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第四个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
在待上调基因上游插入WBJ序列，后将第一crRNA、第二crRNA粒、调节因子LsrR、诱导型启动子PlsrA和缺陷型核酸酶dCas12a导入出发菌株中，构建得到所述重组大肠杆菌。
具体地，本发明的基因工程菌株，是在大肠杆菌MG30基础上转入dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP和crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA4、pETDuet-PJ23119-crWBJ2和pETDuet-PJ23119-crpfkAs-crWBJ2获得的。
本发明的第五个目的是提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，采用所述重组大肠杆菌进行发酵生产。
本发明的第六个目的是提供一种提高2′-岩藻糖基乳糖产量的多基因crRNA阵列表达质粒，质粒上含有如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列。
本发明的第七个目的是提供一种含有上述多基因crRNA阵列表达质粒的大肠杆菌，该大肠杆菌分别在磷酸甘露酶基因manB和rcsA上游插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的WBJ序列。
本发明的第八个目的是提供上述多基因crRNA阵列表达质粒或含有该质粒的大肠杆菌在制备2′-岩藻糖基乳糖或含有2′-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
本发明的有益效果：
为测试本发明涉及的3D回路对基因的抑制效果，设计了6种靶向pfkA的引导crRNAs用于下调中心碳代谢途径基因pfkA，考察3D回路对2'-FL从头合成的影响。结果表明，通过不同crpfkAs靶向抑制pfkA不同位置对2'-FL合成均有促进作用。其中，利用crpfkA4可以有效提高2'-FL合成，摇瓶发酵2'-FL产量从9.1g/L明显提高至16.6g/L。此外，当3D回路用于激活manB和rcsA基因时，2'-FL产量从9.1g/L增加到13.3g/L和15.3g/L。因此，为进一步考察同时抑制和激活基因表达对2'-FL从头合成的影响，组装引导crRNA序列crpfkA4和crWBJ2，构建多基因靶向的crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA4-crWBJ2，并与dCas12a-CRP融合蛋白表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG30中。结果表明，采用3D回路同时抑制pfkA和激活manB,rcsA时，可以进一步提高2'-FL从头合成的产量至18.4g/L。由此可见，3D回路可以用于有效促进2'-FL合成，合理协调中心碳代谢途径和产物合成途径代谢流。本发明的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法简单，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为六种不同靶向引导crpfkAs对融合蛋白pfkA-mCherry的荧光抑制效果以及对2'-FL的合成影响；
图2为不同靶向引导crWBJs对荧光蛋白基因gfp的激活作用；
图3为RT-qPCR分析3D回路用于动态调控从头合成途径上基因的转录表达水平；
图4为出发菌、采用3D回路分别激活manB和rcsA，以及同时激活manB激活rcsA并抑制pfkA的表达对从头合成2'-FL的差异；
图5为本发明实施例1中3-L发酵罐补料分批发酵3Dia菌株合成2'-FL的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的方案如下：
本发明提供了一种响应细胞生长的CRISPRa/i回路下调中心碳代谢途径基因pfkA，以及上调2'-FL从头合成途径上基因manB,manC,gmd,fcl,rcsA表达水平的动态调控策略，以动态协调细胞生长和产物合成的代谢流，从而有效提高2'-FL从头合成效率。
一方面，为验证3D回路可以抑制pfkA的表达，将mCherry融合在pfkA的C端，构建报告蛋白质粒pRSFDuet-Ptac-pfkA-mCherry。随后在pfkA基因编码框上随机设计六个引导crRNAs质粒。然后将报告蛋白质粒pRSFDuet-Ptac-pfkA-mCherry，crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkAs和dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG1655:ΔlsrG菌株中，将不带靶向序列的crRNA作为对照组，考察3D回路对基因的抑制效果。
进一步的，为验证3D回路对靶基因的激活作用，首先将带有Ptac的WBJ调控元件(SEQ ID NO.2)分别整合至每个靶基因manB,manC,gmd,fcl,rcsA前，以便利用crWBJ2引导序列(SEQ ID NO.3)与CRISPR蛋白形成RNA-蛋白质复合物，招募dCas12a-CRP激活剂调控基因的表达。然后，将载有3D回路的质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP和pETDuet-PJ23119-crWBJ2共转化至大肠杆菌中，验证靶基因的相对转录水平。
第二方面，本发明还提供了一种基于多层动态双重调控策略用于2'-FL从头合成的代谢调控方法，该构建方法包括以下步骤：
(1)3D回路动态抑制中心碳代谢途径
采用(GGGGS)2柔性Linker将mCherry融合在pfkA的C端，构建报告蛋白质粒pRSFDuet-Ptac-pfkA-mCherry。随后在pfkA编码框上随机设计六个引导crRNAs质粒，构建质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA1,pETDuet-PJ23119-crpfkA2,pETDuet-PJ23119-crpfkA3,pETDuet-PJ23119-crpfkA4,pETDuet-PJ23119-crpfkA5和pETDuet-PJ23119-crpfkA6。然后将报告蛋白质粒pRSFDuet-Ptac-pfkA-mCherry，crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkAs和dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至QS2菌株中，将不带靶向序列的crRNA作为对照组。随后，通过Cytation微孔板读数器(Cytation 3；BioTek,Winooski,美国)测量菌体OD600和融合蛋白pfkA-mCherry的荧光强度。最后，将crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkAs和dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG30菌株中，考察3D回路对2'-FL从头合成的影响。
(2)3D回路动态激活GDP-L-岩藻糖从头合成途径
为将WBJ序列和LsrR-QS的调控序列框基因整合至各激活靶点前，采用CHOPCHOP网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计各个靶标的sgRNA引导质粒pTarget。采用CRISPR-Cas9系统在基因组上构建带有启动子Ptac的WBJ序列和LsrR-QS的调控序列框，使用卡那霉素(Kanr)和壮观霉素(Specr)作为菌落筛选标记。首先，通过融合PCR在基因manB、manC、gmd、fcl和rcsA前分别敲入带有Ptac的WBJ序列的调控元件框，以及敲入带有LsrR-QS调控元件PJ23100-lsrR-PlsrA的序列框。随后设计靶基因的引导sgRNA质粒，将融合PCR的片段与各个位点的pTarget质粒分别电转至MG30感受态中。然后通过菌落PCR和测序验证是否敲入整合片段。
(3)构建多基因crRNA阵列，同时上调和下调基因的表达，提高2'-FL从头合成效率
根据(1)(2)中分别激活和抑制基因表达对2’-FL从头合成的结果，将抑制pfkA效果最好的crpfkA4与crWBJ2进行串联组装，构建多基因crRNA质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA4-crWBJ2，并与dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG30菌株中，考察同时抑制和激活基因的表达对2'-FL从头合成的影响。
第三方面，本发明还提供了所述的合成2'-FL工程大肠杆菌的应用，使用所述工程大肠杆菌发酵生成2'-FL。
本发明涉及的方法如下：
为检测重组大肠杆菌合成2'-FL的产量以及底物乳糖的消耗量，采用高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent Technologies 1260系列)检测大肠杆菌工程菌发酵液中2'-FL的合成量和乳糖的消耗量。具体是通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)测定发酵上清液中2'-FL和乳糖的胞外浓度。其中，HPLC检测器为示差检测器，流动相采用0.01N稀H2SO4洗脱，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速设置为0.6mL/min。
实施例1
(1)3D回路动态下调中心碳代谢途径
使用采用(GGGGS)2柔性Linker将mCherry融合在pfkA的C端，构建报告蛋白质粒pRSFDuet-pfkA-mCherry。随后在pfkA编码框上的模板链和非模板链上设计六个引导crRNAs质粒，构建质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA1,pETDuet-PJ23119-crpfkA2,pETDuet-PJ23119-crpfkA3,pETDuet-PJ23119-crpfkA4,pETDuet-PJ23119-crpfkA5和pETDuet-PJ23119-crpfkA6。然后将报告蛋白质粒pRSFDuet-pfkA-mCherry，crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkAs和dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG1655:ΔlsrG菌株中，将不带靶向序列的crRNA作为对照组。随后，通过Cytation微孔板读数器(Cytation3；BioTek,Winooski,美国)测量菌体OD600和融合蛋白pfkA-mCherry的荧光强度。如图1所示，六种不同靶向的引导crpfkAs对融合蛋白pfkA-mCherry均表现出荧光抑制作用，其中，crpfkA6和crpfkA1表现出对基因的最弱和最强的抑制程度，相比对照荧光强度降低了4.3％至82.6％，说明3D回路可以不同程度地抑制中心碳代谢途径上关键基因pfkA的表达。
最后，将crRNA表达质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA4电转到带有dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP的大肠杆菌电转感受态中，构建基因工程菌株3Di4，考察3D回路对2'-FL从头合成的影响。
大肠杆菌电转感受态制备方法：
首先将pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP质粒化转至E.coli MG30化转感受态中，涂布在30μg/mL的氯霉素平板上，37℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜含有30μg/mL氯霉素的LB培养基，于37℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1％的接种量转接至含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，待菌体OD600值达到0.6-0.7时，将菌液冰浴20min，于5000r/min离心收集菌体；用预冷的灭菌水洗涤细胞1次，倒掉上清液，用500-600μL预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP质粒的E.coli MG30电转感受态备用。
(2)3D回路动态激活2’-FL从头合成途径
为考察3D回路对基因的激活作用，通过变换WBJ序列中引导RNA的位置，考察不同crWBJs与dCas12a-CRP结合的位置区域对GFP荧光强度的影响。结果表明，当使用位于转录起始位点上游的50bp处的crWBJ2序列(SEQ ID NO.3)时，具有最高的GFP荧光强度，是不带引导crRNA序列的2.0倍(图2)。
进一步将3D回路用于调控2’-FL从头合成途径，首先将WBJ序列和LsrR-QS的调控序列框基因整合至各激活靶点manB和rcsA前，在CHOPCHOP网站上(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计各个靶标的sgRNA引导质粒pTarget。采用CRISPR-Cas9系统在基因组上构建带有启动子Ptac的WBJ序列和LsrR-QS的调控序列框，使用卡那霉素和壮观霉素作为菌落筛选标记。首先，通过融合PCR在基因manB和rcsA前分别敲入带有Ptac的WBJ序列的调控元件框，以及敲入带有LsrR-QS调控元件PJ23100-lsrR-PlsrA的序列框。随后设计靶基因的引导sgRNA质粒，将融合PCR的片段与各个位点的pTarget质粒分别电转至MG30感受态中，然后通过菌落PCR和测序验证是否敲入整合片段。随后，在消除pCas9和pTarget质粒的菌株中，共转化pETDuet-PJ23119-crWBJ2和pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP质粒，分别构建基因工程菌株3Da1和3Da5，验证靶基因的相对转录水平和2’-FL合成的情况。RT-qPCR的结果表明，manB,rcsA基因的转录水平均有明显提升，是对照组的3.5倍到9.3倍(图3)，说明3D回路可以用于动态激活从头合成途径基因的表达水平。
用于敲入带有Ptac的WBJ序列调控元件框的电转感受态MG30的制备方法：
首先将pCas9质粒化转至E.coli MG30化转感受态中，涂布在50μg/mL的卡那霉素平板上，30℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基，于30℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1％的接种量转接至含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，待菌体OD600值达到0.2时，添加终浓度为30-40mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas9质粒表达Red重组酶；继续培养至OD600为0.6-0.7，随后将菌液冰浴20min，于5000r/min离心收集菌体；用预冷的灭菌水洗涤细胞2次，倒掉上清液，用600-700μL预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pCas9质粒的E.coli MG30感受态备用。
(3)构建多基因crRNA阵列，同时上调和下调基因的表达，提高2'-FL从头合成效率
根据(1)(2)中分别激活和抑制基因表达对2'-FL从头合成的结果，将crpfkA4与crWBJ2进行串联组装(SEQ ID NO.9)，构建多基因crRNA阵列质粒pETDuet-PJ23119-crpfkA4-crWBJ2，并与dCas12a-CRP表达质粒pACYDuet-PJ23100-lsrR-PlsrA-dCas12a-CRP共转化至MG30菌株中，构建菌株3Dia，考察同时抑制和激活基因的表达对2'-FL从头合成的影响。
(4)摇瓶发酵基因工程菌株从头合成2'-FL
将上述构建的基因工程菌株3Di4、3Da1、3Da5和3Dia单菌落接种到终浓度为含有氨苄霉素(50μg/mL)和氯霉素(30μg/mL)的LB培养基中培养8-10h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有20mL发酵培养基(葡萄糖20g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L)的250mL的锥形烧瓶中，同时添加终浓度为10g/L的底物乳糖。随后于30℃、220r/min条件下摇瓶发酵至60h。
发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定发酵上清液的2'-FL产量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先取1-2mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2'-FL和乳糖的浓度。发酵液中2'-FL和乳糖的HPLC检测结果如图4所示，最终测定基因工程菌株3Di4、3Da1、3Da5和3Dia(该菌株中采用3D回路激活manB和rcsA并抑制pfkA的表达)胞外的2’-FL产量达到16.6g/L、13.3g/L、15.3g/L和18.4g/L。
(5)3-L发酵罐上发酵验证3Dia从头合成2’-FL
最后，在3-L发酵罐中对基于3D回路动态调控改造的菌株3Dia合成2'-FL的能力进行了发酵验证。3-L发酵罐上的发酵培养基为：12g/L酵母粉、18g/L酵母蛋白胨、2.0g/L柠檬酸、2.0g/L MgSO4·7H2O、3.2g/L(NH4)2SO4、7.5g/L K2HPO4·3H2O。发酵培养温度为30℃，通过氨水和磷酸溶液控制发酵pH为6.0-6.5，并维持发酵过程中溶氧参数为40-50％。如图5所示，发酵100h时，2'-FL产量增加至102.3g/L，乳糖得率为1.06mol/mol。
上述实施例中构建的重组大肠杆菌均采用高效液相色谱仪(HPLC)检测发酵上清液中2'-FL的产量和乳糖剩余量，通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)检测2'-FL标准品和乳糖的出峰时间分别为7.2min和7.9min。因此，通过不同浓度标准品的出峰时间对应的峰面积可以确定2'-FL和乳糖的标准曲线，随后检测发酵上清液中2'-FL和乳糖的峰面积，最后通过标准曲线换算出2'-FL的胞外产量以及乳糖的剩余量。其中，HPLC检测器为示差检测器，流动相通过0.01N稀H2SO4洗脱，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速为0.6mL/min。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (11)
1.一种多层动态调控系统在促进重组大肠杆菌制备2´-岩藻糖基乳糖或含2´-岩藻糖基乳糖的产品中的应用，其特征在于，所述多层动态调控系统包括：组成型表达的靶向2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的第一crRNA，组成型表达的靶向中心碳代谢相关基因的第二crRNA，组成型表达的调节因子LsrR，由诱导型启动子P lsrA 调控的缺陷型核酸酶dCas12a；
其中，所述多层动态调控系统上调2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的表达，下调中心碳代谢相关基因的表达；在2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的上游插入核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的WBJ序列，所述第一crRNA靶向该WBJ序列；所述2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因为磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因fcl、转录调节蛋白基因rcsA中的一种或多种；所述中心碳代谢相关基因为6-磷酸果糖激酶基因pfkA；
所述重组大肠杆菌以E. coli MG30为出发菌株，所述E. coli MG30以大肠杆菌MG1655△fliR::futC ,△fuck::fkp ,△lacI ,△wcaJ ,△lacZ ,△flgA::futC ,△flgG::futC为宿主菌，异源表达了N端融合蛋白标签的α-1 ,2-岩藻糖基转移酶，敲除了编码EIICBGlc酶的基因ptsG，过表达乳糖通透酶基因lacY，并异源表达了GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk。
2.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述WBJ序列由P tac 启动子调控表达。
3.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述第一crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述调节因子lsrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述缺陷型核酸酶dCas12a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述第一crRNA或第二crRNA由P J23119 启动子调控表达。
7.根据权利要求1所述的多层动态调控系统，其特征在于，所述调节因子lsrR由P J23100 启动子调控表达。
8.一种含有多层动态调控系统的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以E. coli MG30为出发菌株，所述E. coli MG30以大肠杆菌MG1655△fliR::futC ,△fuck::fkp,△lacI ,△wcaJ ,△lacZ ,△flgA::futC ,△flgG::futC为宿主菌，异源表达了N端融合蛋白标签的α-1 ,2-岩藻糖基转移酶，敲除了编码EIICBGlc酶的基因ptsG，过表达乳糖通透酶基因lacY，异源表达了GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk，并表达了多层动态调控系统；
所述多层动态调控系统包括：组成型表达的靶向2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的第一crRNA，组成型表达的靶向中心碳代谢相关基因的第二crRNA，组成型表达的调节因子LsrR，由诱导型启动子PlsrA调控的缺陷型核酸酶dCas12a；
其中，所述多层动态调控系统上调2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的表达，下调中心碳代谢相关基因的表达；在2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因的上游插入核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的WBJ序列，所述第一crRNA靶向该WBJ序列；所述2´-岩藻糖基乳糖合成相关基因为磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因fcl、转录调节蛋白基因rcsA中的一种或多种；所述中心碳代谢相关基因为6-磷酸果糖激酶基因pfkA。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述蛋白标签为硫氧还蛋白A。
10.权利要求8或9所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
在待上调基因上游插入所述WBJ序列，后将第一crRNA、第二crRNA、调节因子LsrR、诱导型启动子P lsrA 和缺陷型核酸酶dCas12a导入出发菌株中，构建得到所述重组大肠杆菌，所述待上调基因为磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因fcl、转录调节蛋白基因rcsA。
11.一种生产2´-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，采用权利要求8或9所述的重组大肠杆菌进行发酵生产。
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