CN111575220A - 合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成2'‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α‑1,2‑岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L‑墨角藻糖激酶基因fuck位点，并敲除大肠杆菌MG1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI，获得了可高效合成2'‑FL的无质粒工程菌株，其胞内胞外总量达到806.2mg/L。

Description

合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是一类构成母乳特有的复合碳水化合物，通过刺激新生儿中有益肠道细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，平衡肠道菌群的发育可能对调节新生儿出生后免疫系统起重要作用，作为先进婴儿配方食品的功能性成分非常重要。此外，HMOs可以抑制病原体与上皮细胞表面聚糖的粘附，从而限制一些病原体的毒力。根据组成HMOs的单糖结构单元，HMOs可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种。在多种HMOs寡糖结构类别中，大约50％的HMOs是岩藻糖基化的，而2'-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose,2'-FL)是目前最具有潜力的一种岩藻糖基乳糖，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为安全的食品添加剂，可作为高档婴幼儿配方食品中的营养添加剂。岩藻糖基化的2'-FL可通过α-1,2-岩藻糖基转移酶，以GDP-L-岩藻糖(GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)为供体、乳糖为底物催化合成。

目前，2'-FL的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和生物合成法。在化学合成法中，由于使用高浓度的有毒试剂，会对环境造成一定的污染。在酶法合成中，2'-FL的催化合成需要昂贵的GDP-L-Fuc前体试剂，这大幅增加了生产成本。而生物合成法是利用细菌合成GDP-L-Fuc前体，并在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下，以环境友好的方式自身代谢合成2'-FL。因此，生物合成法具有更好的工业应用前景，并受到越来越多研究者的青睐。例如，研究者利用岩藻糖补救途径可以实现在酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)中合成2'-FL，但由于酿酒酵母的发酵周期较长，限制了其在工业生产的广泛应用。

大肠杆菌MG1655能够内源性地合成2'-FL的前体物质GDP-L-Fuc，在外源α-1,2-岩藻糖基转移酶和底物乳糖的催化作用下合成岩藻糖基化的2'-FL(如图1所示)。然而，在以葡萄糖或甘油为碳源的内源性从头合成途径中，GDP-L-Fuc同时也是合成荚膜异多糖酸的中间体。因此，2'-FL的合成前体GDP-L-Fuc容易被其他竞争途径所消耗，导致大肠杆菌MG1655合成2'-FL所需的前体GDP-L-Fuc的含量非常有限。虽然在目前研究中，多种策略包括过表达与辅因子相关酶的基因、删除代谢竞争途径上的相关基因等，被用来提高2'-FL的产量，但这些方法构建的质粒容易对菌体造成一定的代谢负担，从而使细胞在生产过程中容易出现质粒丢失的情况。因此，为在发酵过程中产生更稳定的工程菌株，可以将与2'-FL和GDP-L-Fuc合成相关的基因敲入到大肠杆菌的基因组上，以构建生产2'-FL的无质粒重组大肠杆菌。但是目前整合到基因组上构建的菌株合成2'-FL的产量较低，不能适用于工业化生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的无质粒重组大肠杆菌，通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L-墨角藻糖激酶基因fuck位点，并敲除大肠杆菌MG1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI，获得了可高效合成2'-FL的无质粒工程菌株，其胞内胞外积累总量达到806.2mg/L。

本发明的第一个目的是提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，在L-墨角藻糖激酶基因fuck位点整合岩藻糖激酶的基因，并敲除大肠杆菌上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI。

进一步地，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的整合片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的岩藻糖激酶的整合片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的转录阻遏物基因lacI的敲除片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

S1、构建包含鞭毛驱动蛋白基因fliR位点的上下游同源臂、P₁₁启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC；所述的pTarget质粒包含鞭毛驱动蛋白基因fliR的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；

S2、构建包含由L-墨角藻糖激酶基因fuck位点的上下游同源臂、P₁₁启动子和岩藻糖激酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp；所述的pTarget质粒包含L-墨角藻糖激酶基因fuck的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；

S3、构建包含由乳糖操纵子转录阻遏物基因lacI位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI；所述的pTarget质粒包含乳糖操纵子转录阻遏物基因lacI的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白。

本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方法。

进一步地，所述的方法包括如下步骤：

S1、将重组大肠杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8～12h，制备成种子液；

S2、将种子液以0.5～2％的接种量接种至发酵培养基中，于35～38℃、200～250r/min条件下培养5～10h后，添加L-岩藻糖1～5g/L、乳糖1～5g/L，继续发酵至60～80h，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。

进一步地，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8～12g/L、酵母粉4～6g/L、NaCl8～12g/L。

进一步地，所述的发酵培养基包括甘油3～5g/L、胰蛋白胨10～15g/L、酵母粉20～30g/L、磷酸氢二钾12～13g/L、磷酸二氢钾2～2.5g/L。

本发明的有益效果：

通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L-墨角藻糖激酶基因fuck位点，并敲除大肠杆菌MG1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI，获得了可高效合成2'-FL的无质粒工程菌株，其胞内胞外总量达到806.2mg/L。

附图说明

图1为2'-FL的重组大肠杆菌合成代谢途径图；

图2为本发明通过融合PCR得到的用于基因敲入和基因敲除片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例1通过LC-MS定性检测2'-FL的结果图；

图4为本发明实施例4通过HPLC检测2'-FL和底物乳糖的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

涉及的检测方法：

为检测本发明所述的无质粒重组大肠杆菌合成的2'-FL，实施例1中采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)定性检测重组大肠杆菌发酵液中2'-FL的合成，通过质谱扫描质荷比m/z为487的离子碎片来确定发酵液中2'-FL的合成。实施例4中采用高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent Technologies 1260系列)定量检测重组大肠杆菌发酵液中2'-FL的合成，通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)测定发酵液中2'-FL和底物乳糖的浓度。HPLC检测器为示差检测器，色谱柱的检测温度设置为55℃，流动相通过0.01N稀H₂SO₄洗脱，检测流速为0.6mL/min。

实施例1：整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶

(1)制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态

首先将pCas9质粒转化至大肠杆菌MG1655中，涂布在50μg/mL的卡那霉素平板上，30℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜LB培养基，添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素抗生素，30℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1％的接种量转接至含有50mLLB培养基的250mL锥形瓶中，待菌体OD₆₀₀达到0.2时，添加终浓度为20-30mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas9质粒表达重组酶；继续培养至OD₆₀₀为0.6-0.7时，将菌液冰浴20min后，于5000r/min离心收集菌体细胞；用预冷的灭菌水洗涤细胞2次，倒掉上清液，用400-500μL预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态备用。

(2)制备用于基因敲入的整合片段

根据NCBI上公布的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，ATCC No.26695)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC序列，利用融合PCR技术获得由鞭毛驱动蛋白基因fliR位点上下游同源臂、P₁₁启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC组成的整合片段HAfliR-P₁₁-futC，并通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计fliR基因的N20序列，从而构建包含fliR基因的sgRNA的pTarget-fliR质粒。

将上述获得的整合片段HAfliR-P₁₁-futC与pTarget-fliR质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因fliR位点，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC。

(3)整合片段与pTarget质粒的共转化

将上述获得的整合片段HAfliR-P₁₁-futC与pTarget-fliR质粒按照2:1的质量共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，立即加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h后，涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)抗生素的平板上，于30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因fliR位点上，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC。

对比例1：

制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态，步骤同实施例1。

通过融合PCR技术获得由鞭毛驱动蛋白基因flhD位点上下游同源臂、P₁₁启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC组成的整合片段HAflhD-P₁₁-futC；利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计flhD基因的N20序列，从而构建包含flhD靶基因的sgRNA的pTarget-flhD质粒。

将上述获得的整合片段HAflhD-P₁₁-futC与pTarget-flhD质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因flhD位点，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △flhD::futC。

对比例2：

制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态，步骤同实施例1。

通过融合PCR技术获得由鞭毛驱动蛋白基因motA位点上下游同源臂、P₁₁启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC组成的整合片段HAmotA-P₁₁-futC，并通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计motA基因的N20序列，从而构建包含motA靶基因的sgRNA的pTarget-motA质粒。

将上述获得的整合片段HAmotA-P₁₁-futC与pTarget-motA质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因motA位点，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △motA::futC。

上述实施例1、对比例1和对比例2中构建的重组大肠杆菌均采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)来定性检测发酵液中2'-FL的合成，在发酵液中检测到与2'-FL标准品(500mg/L)具有相同的保留时间，保留时间为3.3min，并且在该保留时间下的质荷比m/z为487，如图3所示。因此，可以确定该保留时间对应的化合物是2'-FL。结果显示应该在鞭毛运动蛋白基因fliR位点插入α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC。

实施例2：整合外源岩藻糖激酶

制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655 △fliR::futC感受态，步骤同实施例1。

根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)的岩藻糖激酶基因fkp序列，通过融合PCR技术获得由L-墨角藻糖激酶基因fuck位点上下游同源臂、P₁₁启动子和岩藻糖激酶基因组成的整合片段HAfuck-P₁₁-fkp，并通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计fuck基因的N20序列，从而构建包含fuck靶基因的sgRNA的pTarget-fuck质粒。

将上述获得的整合片段HAfuck-P₁₁-fkp与pTarget-fuck质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源岩藻糖激酶基因成功整合至L-墨角藻糖激酶基因fuck位点，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp。

实施例3：基因敲除抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因

制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp感受态，步骤同实施例1。

利用融合PCR获得抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因lacI的上下游同源臂组成的敲除片段HAlacI，并通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计lacI基因的N20序列，从而构建包含靶基因lacI的sgRNA的pTarget-lacI质粒。

将上述获得的敲除片段HAlacI与pTarget-lacI质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认敲除抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因lacI，得到无质粒的重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI。

实施例4：摇瓶发酵生产2'-FL

将上述大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI制成种子液，种子液培养基为LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养10h。然后将种子液按1％的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基为TB培养基，其配方是：甘油4g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L，于37℃、220r/min条件下培养7h后，添加L-岩藻糖2g/L、乳糖2g/L至摇瓶，继续摇瓶发酵至72h。

发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定菌体胞外和胞内的2'-FL总量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先将2mL发酵液在12000rpm下离心15min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2'-FL和乳糖的浓度。为了确定细胞内2'-FL的浓度，用去离子水悬浮沉淀，随后在100℃下煮沸2min，于12000rpm下离心15min取上清液，最后采用HPLC检测细胞内2'-FL的浓度。2'-FL和乳糖的HPLC检测结果如图4所示，最终测定重组大肠杆菌MG1655 △fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI胞外和胞内的2'-FL总量达到806.2mg/L，而目前外源整合岩藻糖基转移酶合成2'-FL的产量仅为387mg/L，此外，乳糖的消耗达到0.93g/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2505

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

gaccagcgag ttgaaaaccg catttcagat aggcttcacg attttcatcc cttttttgat 60

tatcgacctg gtgatagcca gcgtgttgat ggcattgggg atgatgatgg ttcccccagc 120

caccattgct ctgcccttta aactgatgct gtttgtactg gtggatggct ggcaattgct 180

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catgatgatg gggactgaag cgatgaaagt cgcgctggca ctggctgccc cgctattgtt 300

ggtagcgttg gtcacgggcc ttatcatcag tattttgcag gccgccacgc agattaacga 360

aatgacgctg tcgtttattc cgaaaatcat cgccgtattt atcgccatta ttattgccgg 420

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ttcgcaaggg tgtctttttt tgcctttttt tcggtttttg cgcggtacac atagtcatgt 600

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tgctgtaaat aaactggaat ctttcggcat cccgatgaaa cttttcaccc atttttcggt 780

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tttattaatg aggactgttt catccacgat gcttctaaca gtcag 2505

<210> 2

<211> 4452

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

tcaacatcat caaaggcctg ggaccggtac tgcaaatcgc ggaaggctgg agcgtggaat 60

tgccgaagga tgtgcatgac atcctcaaca aacgcaccaa ctcaacctgg ccaaccacct 120

ggtttgcacc gcgcctcacc ggtaaagggc cgtttacgga tgtgtactcg gtaatggcga 180

actggggcgc taaccatggg gttctgacca tcggccacgt tggcgcagac tttatcactc 240

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tccggctacc gggcctgaac aagcaagagt ggttagccgg ataagcaatg ttatccggct 480

atattgcagg agcgattatg atcgacaaaa atgtcatgaa agaatcgttg taagacgctc 540

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cgccggtggg cagtcccgcc gtttgccggg ttacgctcct agtggtaaga tccttacgcc 1380

ggtcccagta tttcgctggg aaagaggaca gcacctgggc cagaaccttt tgagtttaca 1440

gcttccactt tatgagaaaa taatgagctt agctcctgac aagcttcata cccttatcgc 1500

cagcggagat gtctatatac gctctgaaaa accgttgcag tccatacctg aggccgacgt 1560

tgtttgttac gggctgtggg tcgacccttc cttggcgacg caccatgggg tattcgccag 1620

tgaccgcaaa catccggagc agctcgactt catgctccag aagccttctt tggcagaact 1680

tgaaagtctc tctaagactc atcttttcct gatggacata gggatttggt tattgtccga 1740

tcgcgcggta gagattttga tgaagcggtc ccataaggag tcctctgaag aattgaaata 1800

ctatgatctt tacagcgact ttgggcttgc cctgggcacc cacccacgga tagaagatga 1860

ggaagtgaat actctctcag ttgcaattct gcctctcccg ggcggggagt tttatcatta 1920

cggtactagc aaagagctga tttcctccac cctgtcagtc cagaataagg tttatgacca 1980

acgccggatc atgcatagaa aggtcaaacc gaaccctgcc atgtttgtcc aaaatgcggt 2040

agtacgtatc ccactgtgcg ctgagaacgc agacctctgg attgaaaact cacatatagg 2100

tccgaagtgg aagatagcga gccggcatat tattactggg gtgccggaga acgactggag 2160

tttagcagtg ccagcagggg tatgtgtcga cgttgtcccg atgggtgata aaggttttgt 2220

ggcacggcct tacgggctgg acgatgtatt taaaggagac ctgagagatt caaaaaccac 2280

tttgaccgga atcccattcg gtgaatggat gtccaaacgg ggactctcct acactgatct 2340

gaaaggtcgg actgacgacc ttcaagccgt gagcgtgttt ccgatggtca attccgttga 2400

ggaattgggc ctcgtactcc gctggatgct ttcagaacct gagttggaag agggtaagaa 2460

catctggctt cgctccgagc acttctctgc ggatgaaata agcgctggag cgaacctgaa 2520

gcgcctctat gctcaacggg aagaattccg gaaggggaac tggaaagcat tagccgttaa 2580

ccatgagaag tccgtatttt accaactcga tttggccgat gcggcggagg atttcgtacg 2640

gttgggactc gacatgcctg aattactccc tgaggacgcc ctgcagatga gtcgcatcca 2700

taatagaatg cttcgcgctc gcatcctcaa gctcgacggc aaagattacc ggcctgagga 2760

acaggcagcg ttcgatctgc tgcgcgacgg tttgctcgat ggaatctcta accgtaaaag 2820

cacaccaaag ctggacgttt attctgacca aatagtgtgg ggccggagcc cagtacggat 2880

tgatatggcc ggcggctgga ccgacacccc accttatagc ttatattccg gaggcaatgt 2940

tgtgaacctt gcgattgaat taaatggtca acctccattg caggtatacg ttaagccgtg 3000

taaggacttc catatcgtcc tgcggtccat tgacatgggg gctatggaga tagtctcaac 3060

ttttgacgag ctgcaagact acaaaaagat cggttccccg ttttccatac caaaagccgc 3120

tctctctctt gctggattcg ccccggcatt tagcgctgtg tcatatgcat cattggagga 3180

acagttgaaa gattttggag ctggtattga ggttacgtta ttagccgcca ttccggctgg 3240

ttctggtctt ggtacatcat caatactggc ttccacagtg ctcggggcaa ttaatgattt 3300

ttgtggactc gcatgggaca aaaatgaaat ttgtcagaga acattagttt tagagcaact 3360

gctgactacg ggaggaggct ggcaggacca gtacggcggg gtcttgcaag gtgttaagct 3420

tctgcagacc gaggccgggt tcgcgcaatc cccattagtt agatggctgc cagaccacct 3480

ctttacgcac cctgaataca aggactgcca tttgttatat tacacaggaa ttacgcgtac 3540

ggcaaaggga atactggcgg agatcgtctc tagcatgttt ctcaatagta gcctgcacct 3600

gaatttactc tcagaaatga aagcgcatgc cctcgacatg aacgaggcta tacagcgcgg 3660

ctcctttgtt gagttcggtc gccttgtcgg aaagacatgg gagcaaaaca aggcactcga 3720

cagtggtacc aacccaccag cagtcgaagc cataatcgac ttaattaagg attatacatt 3780

agggtataaa ctcccagggg ctggaggagg cgggtacctc tacatggttg ctaaagatcc 3840

gcaggcagca gtgcgcatcc gcaaaatttt aacagagaac gcgccaaacc ctcgtgcccg 3900

gtttgtggaa atgactctgt ccgacaaagg ctttcaagta agtcggtcct aacctgaatt 3960

tatagaggaa gtgtgaaatg ctgaaaacaa tttcgccgtt aatttctccc gaactattga 4020

aagtgctggc agagatggga catggagatg aaattatttt ttccgatgct cactttcccg 4080

cccattcgat gggaccgcag gtgatccgcg ctgatggcct gttggtgagc gacttgctcc 4140

aggcgattat cccgttattt gaactggaca gttatgcacc gccgctggtg atgatggcgg 4200

cggtagaagg tgacactctc gatcctgaag tagaacgacg ttaccgtaat gcgctttcac 4260

tacaagcccc gtgtcctgac atcatccgca tcaatcgttt tgcgttttat gaacgggcgc 4320

aaaaagcctt tgcgatcgtt atcacaggcg aacgagcgaa gtacgggaat attcttttaa 4380

aaaaaggggt aacaccgtaa tctcataccg gtacgcccgc atgacgcggg cggttatcga 4440

atgatggggt ga 4452

<210> 3

<211> 1000

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

ttttgcccgg aacaagaccg caaggaatta atcgaaatgt tagcctcccg ccccggtgat 60

gactatcaac tggcacggga accgttaaag ctggaagcca ttctggcgcg cgcgcgcaaa 120

gagggttacg gacagaacta ccgcggctgg gatcaggagg agaagatcgc ctctatcgcc 180

gtaccgctgc gcagtgaaca acgggtgatt ggctgtctga atctggtgta tatggcgagc 240

gcaatgacca ttgaacaggc agcggaaaag catcttccgg cgctacaacg ggtagcaaaa 300

cagatcgaag aaggggttga atcgcaggct attctggtgg ccggaaggcg aagcggcatg 360

catttacgtt gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc 420

ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga 480

gtatgccggt gtctcttatc ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat 540

taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga 600

agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg 660

gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 720

gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 780

ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 840

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 900

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 960

acacaggaaa cagctatgac catgattacg gattcactgg 1000

Claims (10)

1.一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，在L-墨角藻糖激酶基因fuck位点整合岩藻糖激酶的基因，并敲除大肠杆菌上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的整合片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的岩藻糖激酶的整合片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的转录阻遏物基因lacI的敲除片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

6.一种权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建包含鞭毛驱动蛋白基因fliR位点的上下游同源臂、P₁₁启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC；所述的pTarget质粒包含鞭毛驱动蛋白基因fliR的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；

S2、构建包含由L-墨角藻糖激酶基因fuck位点的上下游同源臂、P₁₁启动子和岩藻糖激酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp；所述的pTarget质粒包含L-墨角藻糖激酶基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；

S3、构建包含由乳糖操纵子转录阻遏物基因lacI位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI；所述的pTarget质粒包含乳糖操纵子转录阻遏物LacI基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白。

7.一种权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

S1、将重组大肠杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8～12h，制备成种子液；

S2、将种子液以0.5～2％的接种量接种至发酵培养基中，于35～38℃、200～250r/min条件下培养5～10h后，添加L-岩藻糖1～5g/L、乳糖1～5g/L，继续发酵至60～80h，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8～12g/L、酵母粉4～6g/L、NaCl 8～12g/L。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括甘油3～5g/L、胰蛋白胨10～15g/L、酵母粉20～30g/L、磷酸氢二钾12～13g/L、磷酸二氢钾2～2.5g/L。

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