CN114672448B - 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种合成2’‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。本发明重组大肠杆菌以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，并增加一个或多个拷贝数的乳糖通透酶基因LacY至treB基因座，以及整合GDP‑多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk组成的表达框至nupG基因座中所得。并将所得重组大肠杆菌用于2’‑岩藻糖基乳糖的合成，合成2'‑FL的胞外产量达到5.21g/L。

Description

一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于代谢工程技术领域，尤其是指一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
2′-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose,2′-FL)作为一种含量最丰富的岩藻糖基化母乳低聚糖(Humanmilkoligosaccharides,HMOs)，因其具有抑制病原菌感染、调节肠道菌群、增强免疫力的医学功能，已被国内外权威食品安全监测机构批准为婴幼儿食品的膳食强化剂。然而，化学合成法因其昂贵前体GDP-L-岩藻糖的工业成本及副产物的潜在食品危害，化学合成2′-FL不能满足大量市场需求。因此，基于环境友善型的微生物细胞工厂合成2′-FL，已被开发和应用于HMOs的商业化生产中。
在大肠杆菌中，葡萄糖主要通过磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖的磷酸转移酶系统(PTSGlc)磷酸化，或通过非PTS依赖的H+同向运输载体GalP内质化，将周质空间内的葡萄糖转运到细胞质内。当培养基中同时存在葡萄糖和乳糖两种碳源时，葡萄糖主要通过PTSGlc途径被优先利用，非磷酸化的EIIAGlc与乳糖透性酶LacY结合使之失活，抑制胞外乳糖向胞内转运，导致碳分解抑制效应(carboncataboliterepression，CCR)。然而，当葡萄糖以质子化的方式被GalP蛋白载体转运至胞内的过程中，不会抑制LacY的活性。因此，对葡萄糖PTS转运途径加以改造，使菌体可以利用NPTS途径转运葡萄糖，可以在2′-FL从头合成途径中实现葡萄糖和乳糖的共利用。
果糖-6-磷酸是2′-FL从头合成途径中重要的代谢节点，首先在甘露糖-6-磷酸异构酶(ManA)和磷酸核糖核酸酶(ManB)的作用下合成甘露糖-1-磷酸(Man-1-P)；然后Man-1-P通过甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(ManC)转化为GDP-甘露糖(GDP-Man)时，需要辅因子GTP提供磷酸基团；随后，GDP-Man在GDP-甘露糖4,6-脱水酶(Gmd)和GDP-L-岩藻糖合酶(Fcl)的作用下进一步合成前体GDP-L-岩藻糖(GDP-L-Fuc)；最后，GDP-L-岩藻糖在α-1,2-岩藻糖基转移酶(FucT2)的作用下脱去GDP基团。因此，辅因子GTP的供应不足是限制2′-FL高效合成的一个重要因素。
在目前构建的2'-FL微生物底盘细胞中，GDP-L-岩藻糖作为2'-FL合成的关键前体，主要通过两种代谢途径生成：分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等为碳源的从头合成途径(Denovopathway)，和以L-岩藻糖为主的补救合成途径(Salvagepathway)。GDP-L-岩藻糖进一步在α-1，2-岩藻糖基转移酶作用下将岩藻糖基残基从GDP-L-岩藻糖转移到底物乳糖上合成2'-FL。然而在岩藻糖补救途径中，需要外源添加L-岩藻糖，使得规模化生产2'-FL的成本较高。近年来，以不同碳源的2'-FL从头合成途径逐渐被设计、构建。例如，Katja等在大肠杆菌中设计构建了以蔗糖为唯一碳源的2'-FL从头合成途径。首先，通过引入UDP-半乳糖基转移酶GalTpm1141，首次实现在胞内内源合成底物乳糖；随后过表达Fkp和AfcB，以增强前体GDP-L-岩藻糖的积累；最后，进一步在大肠杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL作用下合成2'-FL，并在糖转运蛋白TPYb作用下，促进2'-FL的胞外输出，发酵84h后，2′-FL的产量可达60g/L。
此外，提高辅因子ATP和GTP的再生能力也是提高2′-FL产量的有效策略。近年来，多种NTP再生系统被设计、构建，并用于调控微生物合成代谢中内关键酶的辅因子，如GDP/GTP、ADP/ATP、NADP+/NADPH等的浓度和形式来最大化目标产物的代谢流。多聚磷酸激酶(PPK)是广泛存在于细菌基本代谢途径中的重要保守酶，可以催化AMP、ADP、GMP和GDP磷酸化为相应的核苷二磷酸酯和三磷酸酯。例如，以多磷酸盐(poly(p))为供体，AMP为起始物，将PPK和AMP磷酸转移酶(PAP)结合起来可以从AMP和poly(p)中再生ATP，进一步与乙酰CoA合成酶结合起来，构建了以乙酰CoA合成酶为载体的PAP-PPKATP再生体系，并成功用于乙酰CoA的合成中。目前广泛存在的polyP激酶包括聚磷酸激酶I族(FamilyIpolyphosphatekinase,PPK1)和聚磷酸激酶Ⅱ族(FamilyIIpolyphosphatekinase,PPK2)。其中，PPK2被证明是一种GDP-聚磷酸激酶，对GDP具有较高的亲和力，可以利用poly(p)优先将GDP转化为GTP。研究人员利用一个来源于哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的双功能多磷酸激酶PPK2建立了基于单一聚磷酸激酶的无细胞蛋白合成NTP再生体系，可以在重组无细胞蛋白质合成系统中构建一个人工ATP/GTP再生系统来驱动蛋白质的合成。优化后的单激酶再生系统产生的sfGFP最终浓度(530μg/mL)比三激酶体系产生的浓度(400μg/mL)高1.3倍，且mRNA翻译速率比三激酶体系快5倍。
目前，大肠杆菌是作为2′-FL微生物底盘细胞工厂最常用的一种模式菌株。尽管已构建出利用蔗糖为唯一碳源合成2'-FL的大肠杆菌底盘细胞，但该方法需要外源添加L-岩藻糖来增强胞内GDP-L-岩藻糖前体的合成。L-岩藻糖的工业价格在270元/公斤左右，因此，这种2'-FL合成方法因其工业成本，进一步限制了2'-FL的规模化生产。而在其他构建的2′-FL生产菌株中，多采用甘油和乳糖为发酵碳源合成2′-FL。尽管甘油是作为2′-FL合成的一种优势碳源(Deng等人，2019年)，但葡萄糖可以更加高效迅速的转化成6磷酸-果糖，且葡萄糖在发酵过程中更容易监测。因此，采用葡萄糖(4元/公斤)和乳糖(11元/公斤)为发酵碳源的2'-FL从头合成途径相比利用蔗糖为唯一碳源合成2'-FL更加经济低廉。
在2′-FL的从头合成与岩藻糖补救途径中，GTP的供应都被认为是影响2′-FL高效合成的一个限制因素，GTP的合成主要来源于鸟嘌呤核苷的代谢。近年来，采用过表达GTP合成代谢途径上的关键基因gsk、gmk、ndk、guaA，敲除yfkN和guaC，可以促进鸟苷一/二磷酸(GMP/GDP)的积累，增强合成GDP-Man酶促反应所需GTP的再生，从而提高前体GDP-L-岩藻糖的合成量。尽管过表达鸟嘌呤核苷代谢途径上的核苷二磷酸激酶(NdK)，可以将GDP转化成GTP，为合成GDP-Man的酶促反应中提供GTP辅因子。但是NdK具有广泛的底物谱，不仅能催化GDP转化为GTP，同时也可以催化ATP、UTP转化为对应的核苷二磷酸ADP和UDP。其次，随着2’-FL合成途径加快，岩藻糖基化反应脱去的GDP基团会逐渐增多，仅利用内源的核苷二磷酸激酶NdK难以实现GTP的快速再生。因此，可以利用其他来源且高特异性催化GDP转化为GTP的酶，来促进GTP的再生。铜绿假单胞菌
(Pseudomonasaeruginosa)来源的GDP-多聚磷酸转移酶(PPK2)对GDP的催化特异性高，可以亲和催化GDP转化为GTP。在2′-FL从头合成途径中引入PPK2酶后，岩藻糖基化反应中脱去的GDP基团可以回收再生为GTP，为合成GTP-Man的反应不断提供辅因子，GTP的再生促进了2′-FL从头合成中GTP的供给，从而增强前体GDP-L-岩藻糖的积累，有望进一步提高2'-FL在重组大肠杆菌中的合成。
发明内容
为解决上述葡萄糖和乳糖共利用以及GTP循环再生的问题，本发明构建了基于葡萄糖NPTS转运的2'-FL合成途径，可以解除葡萄糖的阻遏效应，实现葡萄糖和乳糖的共利用；此外，引入铜绿假单胞菌来源的PPK2，构建了GTP循环再生系统，可以回收岩藻糖基化反应脱去的GDP，强化GTP的再生供应，促进2'-FL在重组大肠杆菌中的从头合成。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于葡萄糖NPTS途径的GTP辅因子循环再生系统合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
本发明的第一个目的在于提供一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，以大肠杆菌E.coliMG26△yjiP::trxA-futC为出发菌株，并将其命名为E.coliMG27，通过敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，并增加一个或多个拷贝数的乳糖通透酶基因LacY至treB基因座，以及整合GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk组成的表达框至nupG基因座中所得。
在本发明的一个实施例中，所述出发菌株为大肠杆菌E.coliMG26△yjiP::trxA-futC(见专利公开号为CN202011240682.5中的大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC)。
在本发明的一个实施例中，所述编码EIICBGlc酶的基因ptsG的编号为ID:945651；乳糖通透酶基因LacY的编号为ID:949083，treB基因座的编号为ID:948761，GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2的编号为ID:879494，鸟苷肌苷激酶基因gsk的编号为ID:946584，nupG基因座的编号为ID:946282。
本发明的第一个目的在于提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
S1：构建由大肠杆菌中ptsG位点上下游同源臂组成的ptsG基因敲除片段，与包含pTarget-ptsG质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌E.coliMG27感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，得到重组大肠杆菌E.coliMG28；所述ptsG基因敲除片段的序列如SEQ ID NO.1所示；
S2：构建包含由treB位点的上下游同源臂、Ptac启动子和乳糖通透酶基因lacY组成的基因敲入片段(基因序列如SEQ ID NO.2所示)，与包含pTarget-treB位点质粒共同电转到S1中所述重组大肠杆菌E.coliMG28感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认lacY基因成功整合至treB位点，得到重组大肠杆菌E.coliMG29；
S3：构建包含由nupG基因位点的上下游同源臂，组成型Ptac启动子表达ppk2基因和PJ23119启动子表达gsk基因组成的GTP辅因子基因表达框Ptac-ppk2-PJ23119-gsk(基因序列如SEQ ID NO.3所示)，与包含pTarget-nupG质粒共同电转到S2中所述重组大肠杆菌E.coliMG29感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认Ptac-ppk2-PJ23119-gsk表达框成功整合至nupG位点，得到所述重组大肠杆菌。
在本发明的一个实施例中，S1中，所述的pTarget-ptsG质粒包含ptsG基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
在本发明的一个实施例中，S2中，所述的pTarget-treB位点质粒包含treB基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
在本发明的一个实施例中，S3中，所述的pTarget-nupG位点质粒包含nupG基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
本发明的第三个目的在于提供所述的重组大肠杆菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
在本发明的一个实施例中，将所述重组大肠杆菌的种子液在培养基中摇瓶发酵。
在本发明的一个实施例中，发酵中所用发酵培养基中乳糖浓度为5-10g/L。
在本发明的一个实施例中，发酵时间为24-72h。
为提高重组大肠杆菌共利用葡萄糖和乳糖混合碳源从头合成2'-FL的效率，需要对葡萄糖转运途径进行改造。在大肠杆菌中，葡萄糖主要通过PEP依赖的PTSGlc途径和非PTSGlc依赖的H+同向运输蛋白GalP转运。在PTSGlc途径中，EIICBGlc接收磷酸化EIIAGlc传递的磷酸基团，使EIIAGlc去磷酸化，使得非磷酸化的EIIAGlc与LacY结合使之失活，从而抑制胞外乳糖向胞内转运，造成CCR效应。因此，为实现葡萄糖和乳糖的共利用，可以敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，使葡萄糖以质子化的方式被GalP蛋白转运至胞内，以解除CCR作用，从而提高重组大肠杆菌共利用葡萄糖和乳糖混合碳源发酵合成2'-FL的效率。
其次，在目前构建的2′-FL底盘细胞，多采用兼容拷贝质粒系统强化辅因子供给途径上关键基因(gsk、gmk、ndk等)，以增强辅因子GTP的再生来促进2′-FL的合成。由于采用过表达Gsk和Gpt来强化GTP供给的方式，胞内GTP的供应依然有限。而PPK2是一种对GDP特异性较高的GDP-多聚磷酸转移酶，可以亲和催化GDP转化为GTP。此外，由于多质粒系统在发酵传代过程中容易丢失，并对宿主细胞有一定代谢负担，导致质粒上基因的表达不稳定。因此，可以将外源PPK2整合到大肠杆菌基因组，将岩藻糖基化反应中前体GDP-L-Fuc脱去的GDP磷酸基团回收再利用，强化从头合成途径中GDP-Man反应需要的GTP辅因子，从而促进重组大肠杆菌中2′-FL的从头合成(图1)。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明的重组大肠杆菌，是在本实验室前期构建的大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC专利公开号为CN202011240682.5)基础上敲除编码EIICBGlc酶基因ptsG，进一步整合乳糖通透酶基因lacY，并整合GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk，最终获得的一株无质粒重组大肠杆菌E.coliMG30杆菌。
本发明通过敲除编码EIICBGlc酶基因ptsG，使大肠杆菌利用NPTS途径转运葡萄糖，同时可以消耗利用乳糖来从头合成2'-FL。敲除ptsG基因后，尽管葡萄糖消耗速率减慢，但葡萄糖消耗的总量几乎不变。同时，乳糖的消耗有明显提高，从0.80g/L提高至2.25g/L，乳糖向胞内的转运提高了胞内底物的供应，从而提高2’-FL的合成量至2.70g/L(图2)。进一步，本发明通过整合乳糖通透酶LacY，2’-FL的合成提高至3.57g/L；然后通过整合GDP-多聚磷酸转移酶PPK2和鸟苷肌苷激酶Gsk，回收利用岩藻糖基化反应脱去的GDP，促进GTP辅因子的循环再生，使大肠杆菌中2'-FL的合成提高至5.21g/L(图3)。最后，优化了乳糖初始添加量对2'-FL合成的影响，结果表明，当乳糖的添加量提高至10g/L时，2'-FL的合成量(8.91g/L)可以提高1.7倍(图4)。
由此可见，利用葡萄糖NPTS转运途径，可以增强大肠杆菌对乳糖的胞内转运能力。此外，通过引入PPK2和强化Gsk的表达，可以促进GTP辅因子的循环再生，增强2'-FL从头合成途径中GTP的供应，最终有效提高2'-FL的合成。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明GTP辅因子循环再生系统构建示意图。
图2是本发明利用葡萄糖PTS途径与NPTS转运途径对2’-FL从头合成的结果图。
图3是本发明实施例2-4摇瓶发酵重组大肠杆菌合成2'-FL的结果图。
图4是本发明实施例4摇瓶优化乳糖添加量对E.coliMG30合成2'-FL影响的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
为检测本发明所述的重组大肠杆菌合成2'-FL的产量以及底物乳糖的消耗量，采用高效液相色谱(HPLC)系统(AgilentTechnologies1260系列)检测重组大肠杆菌发酵液中2'-FL的合成量和乳糖的消耗量。具体是通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)测定发酵上清液中2'-FL和乳糖的浓度。其中，HPLC的流动相采用5mMH2SO4，检测器为示差检测器，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速设置为0.6mL/min。
实施例1
基因敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG
(1)制备带有pCas9质粒的E.coliMG27感受态
首先将pCas9质粒转化至E.coliMG27中，涂布在50μg/mL的Kan平板上，30℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜LB培养基，添加终浓度为50μg/mL的Kan抗生素，30℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1-2％的接种量转接至含有50mLLB培养基的250mL锥形瓶中，当菌体OD600达到0.2时，添加终浓度为20-30mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas9质粒表达λ-Red重组酶；继续培养至OD600为0.6-0.7时，将菌液冰浴20-30min后，于5000r/min离心收集菌体细胞；用预冷的灭菌水洗涤细胞2次，倒掉上清液，用400-500μL预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pCas9质粒的E.coliMG27感受态备用。
利用融合PCR获得ptsG的上下游同源臂组成的敲除片段HAptsG，通过网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计ptsG基因的N20序列，从而构建包含靶基因ptsG的sgRNA的pTarget-ptsG质粒。
将上述获得的敲除片段HAptsG与pTarget-ptsG质粒共同电转到带有pCas9质粒的E.coliMG27感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有Kan(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认敲除ptsG基因，获得重组大肠杆菌E.coliMG28。
实施例2
整合乳糖通透酶LacY
制备带有pCas9质粒的E.coliMG28感受态，步骤同实施例1。
根据大肠杆菌MG1655基因组上的乳糖通透酶基因lacY序列，通过融合PCR技术获得由大肠杆菌MG1655基因座treB上下游同源臂、Ptac启动子和lacY基因组成的整合片段HAtreB-Ptac-lacY，通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计treB基因的N20序列，从而构建包含treB基因座的sgRNA的pTarget-treB质粒。
将上述获得的供体片段HAtreB-Ptac-lacY与pTarget-treB质粒共同电转到带有pCas9质粒的E.coliMG28感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有Kan(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认乳糖通透酶基因成功整合至treB位点，获得重组大肠杆菌E.coliMG29。
实施例3
构建GTP辅因子再生体系
制备带有pCas9质粒的E.coliMG29感受态，步骤同实施例1。
根据NCBI上公布的铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC15692)的GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2序列和大肠杆菌MG1655基因组上鸟苷肌苷激酶基因gsk，通过融合PCR技术获得由大肠杆菌MG1655基因座nupG上下游同源臂、组成型启动子Ptac和PJ23119分别表达ppk2基因和gsk基因构成的GTP辅因子再生体系的表达框HAnupG-Ptac-ppk2-PJ23119-gsk，通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计nupG基因的N20序列，从而构建包含nupG基因座的sgRNA的pTarget-nupG质粒。
将上述获得的基因整合片段HAnupG-Ptac-ppk2-PJ23119-gsk与pTarget-nupG质粒共同电转到带有pCas9质粒的E.coliMG29感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有Kan(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认GTP表达框HAnupG-Ptac-ppk2-PJ23119-gsk基因序列成功整合至nupG位点，获得重组大肠杆菌E.coliMG30。
实施例4
摇瓶发酵无质粒基因工程菌E.coliMG30合成2'-FL
挑取上述测序正确的重组E.coliMG30单菌落到LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中培养8-10h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有20-25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵培养基配方是：葡萄糖10-15g/L、乳糖5-10g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。随后将三角瓶置于30℃、220r/min条件下发酵至72-80h。最后，摇瓶优化E.coliMG30发酵的乳糖添加量(5g/L和10g/L)，测试提高乳糖的外源添加量对2'-FL合成的影响。
发酵结束时，首先取1-2mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集上清液，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定E.coliMG30摇瓶发酵后上清液中2'-FL的浓度。HPLC检测结果如图4所示，E.coliMG30从头合成2'-FL的胞外产量达到5.21g/L，是对照菌E.coliMG28胞外2'-FL产量的1.9倍。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
atcggttact ggtggaaact gactcacctt accttgcgcc ggtaccgcat cgaggaaaag 60
agaatcaacc tgcgatggtt cgtgacgttg cagaatacat ggctgtgttg aaaggtgttg 120
ccgttgaaga actggcgcag gtaaccaccg ataacttcgc ccgtctgttt cacatcgacg 180
cttcccgcct tcaatccatc cgttgaatga gtttttttaa agctcgtaat taatggctaa 240
aacgagtaaa gttcaccgcc gaaaattggg cggtgaataa ccacgtttga aatattgtga 300
catatgtttt gtcaaaatgt gcaacttctc caatgatctg aagttgaaac gtgatagccg 360
tcaaacaaat tggcactgaa ttattttact ctgtgtaata aataaagggc gcttagatgc 420
cctgtacacg gcgaggctct ccccccttgc cacgcgtgag aacgtaaaaa aagcacccat 480
actcaggagc actctcaatt tccgtaagac gttggggaga ctaaggcagc cagatggctg 540
ccttttttac aggtgttatt cagaattgat acgtgccggt aatgctgaaa ttacgcggtg 600
tgccgtagac gatagaacct tccacgttgg tatcgtaggt tttgtcgaac aggttattga 660
cgttcccctg taacgagaag tttttcgtca cctggtagcg ggtgaagaga tccaccagcg 720
cgtagctacc ttgctcggcg cggaaggtgc catacggcgt cacggtgtcg gtatacacgc 780
gattttgcca gttaacacca ccgccgaccg tcaactctgg catgacaggc aaccgatagc 840
tggtgaacat tttaaccgtg gtgcgtggca gattaggatt aacggcgttt ccttcgttat 900
cctctgcaat atagcgcgtt gcgccaaatg tcagctgcca gttgtcggta attgcgccgt 960
tgagttcaaa ttccacccct ttactgactg tcccatccac 1000
<210> 2
<211> 2322
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
aaccggtaag cgacgtcacg aagcctacct ggcgttctgc aaagcgcata aactgcatcc 60
cgttgccgcc ctgccagggc ttgctatgaa gcaaggctat gagaacgttg caaaagtgat 120
tacgcctgaa actaccgcct tactgtgcgc aaccgacacg ctggcacttg gcgcaagtaa 180
atacctgcaa gagcaacgca tcgacacctt gcaactggcg agcgtcggta atacgccgtt 240
aatgaaattc ctccatccgg agatcgtaac cgtagatccc ggttacgccg aagctggacg 300
ccaggcggct tgccagttga tcgcgcaggt aaccgggcgc agcgaaccgc aacaaatcat 360
catccccgcc accctgtcct gatcgtttcc tgaacgataa attgtgatct tcgctgcgtt 420
tcgggaacgt tcccgttttt aaatttttcc gcgcaatata ttctgcagcc aaccaaaaat 480
gtcatctgcc atggggcttt ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gatcagacct 540
ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gtactattta aaaaacacaa acttttggat 600
gttcggttta ttctttttct tttacttttt tatcatggga gcctacttcc cgtttttccc 660
gatttggcta catgacatca accatatcag caaaagtgat acgggtatta tttttgccgc 720
tatttctctg ttctcgctat tattccaacc gctgtttggt ctgctttctg acaaactcgg 780
gctgcgcaaa tacctgctgt ggattattac cggcatgtta gtgatgtttg cgccgttctt 840
tatttttatc ttcgggccac tgttacaata caacatttta gtaggatcga ttgttggtgg 900
tatttatcta ggcttttgtt ttaacgccgg tgcgccagca gtagaggcat ttattgagaa 960
agtcagccgt cgcagtaatt tcgaatttgg tcgcgcgcgg atgtttggct gtgttggctg 1020
ggcgctgtgt gcctcgattg tcggcatcat gttcaccatc aataatcagt ttgttttctg 1080
gctgggctct ggctgtgcac tcatcctcgc cgttttactc tttttcgcca aaacggatgc 1140
gccctcttct gccacggttg ccaatgcggt aggtgccaac cattcggcat ttagccttaa 1200
gctggcactg gaactgttca gacagccaaa actgtggttt ttgtcactgt atgttattgg 1260
cgtttcctgc acctacgatg tttttgacca acagtttgct aatttcttta cttcgttctt 1320
tgctaccggt gaacagggta cgcgggtatt tggctacgta acgacaatgg gcgaattact 1380
taacgcctcg attatgttct ttgcgccact gatcattaat cgcatcggtg ggaaaaacgc 1440
cctgctgctg gctggcacta ttatgtctgt acgtattatt ggctcatcgt tcgccacctc 1500
agcgctggaa gtggttattc tgaaaacgct gcatatgttt gaagtaccgt tcctgctggt 1560
gggctgcttt aaatatatta ccagccagtt tgaagtgcgt ttttcagcga cgatttatct 1620
ggtctgtttc tgcttcttta agcaactggc gatgattttt atgtctgtac tggcgggcaa 1680
tatgtatgaa agcatcggtt tccagggcgc ttatctggtg ctgggtctgg tggcgctggg 1740
cttcacctta atttccgtgt tcacgcttag cggccccggc ccgctttccc tgctgcgtcg 1800
tcaggtgaat gaagtcgctt aattttcttc ggggcgcaat tgcgccccct cgcattcgca 1860
ggaataacgt aatgactcat cttccccact ggtggcaaaa cggcgttatc taccagattt 1920
atccaaagag ttttcaggac accacgggta gcggtaccgg cgatttacgt ggcgttatcc 1980
aacacctgga ctatctgcat aaactgggcg ttgatgccat ctggctaacc cccttttatg 2040
tctctcccca ggtcgataac ggttacgacg tagcgaacta tacggcgatt gatcccacct 2100
acggcacgct ggacgatttt gacgaactgg tgacgcaggc aaaatcgcgc gggattcgta 2160
tcattctcga tatggtgttt aaccatacct ctacccaaca tgcctggttt cgcgaggcgc 2220
tgaacaaaga aagcccttac cgccagtttt atatctggcg cgatggagaa ccagaaacgc 2280
caccgaacaa ctggcgttca aaatttggcg gtagtgcgtg gc 2322
<210> 3
<211> 3290
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
cgtcaatcat catgtcgatt tcgcagatct ctgaaaccct gttcattctg accatcccgt 60
tcttcttaag ccgctacggt attaagaacg taatgatgat cagtattgtg gcgtggatcc 120
tgcgttttgc gctgtttgct tacggcgacc cgactccgtt cggtactgta ctgctggtac 180
tgtcgatgat cgtttacggt tgcgcattcg acttcttcaa catctctggt tcggtgtttg 240
tcgaaaaaga agttagcccg gcaattcgcg ccagtgcaca agggatgttc ctgatgatga 300
ctaacggctt cggctgtatc ctcggcggca tcgtgagcgg taaagttgtt gagatgtaca 360
cccaaaacgg cattaccgac tggcagaccg tatggttgat tttcgctggt tactccgtgg 420
ttctggcctt cgcgttcatg gcgatgttca aatataaaca cgttcgtgtc ccgacaggca 480
cacagacggt tagccactaa ttgacaatta atcatcggct cgtataatgc ctgtatttgt 540
ttaactttaa gaaggagcgt atatcatgtt cgaatccgcg gaagttggcc acagcatcga 600
caaggacacc tacgagaagg ccgtcatcga gttgcgcgaa gcgctgctcg aggcgcagtt 660
cgagctcaag cagcaggcgc gcttcccggt gatcatcctg atcaacggca tcgagggcgc 720
cggcaagggc gagacggtca agctgctcaa cgagtggatg gacccgcgcc taatcgaggt 780
gcagagcttc ctccgtcctt ccgacgagga gctggagcgg ccgccgcagt ggcgcttctg 840
gcggcgcctg ccgcccaagg ggcggaccgg tatcttcttc ggcaactggt acagccagat 900
gctctacgcg cgggtcgagg ggcatatcaa ggaggccaag ctggaccagg ccatcgatgc 960
cgccgaacgc ttcgagcgca tgctctgcga cgaaggcgcg ctgctcttca agttctggtt 1020
ccatctctcc aagaaacagt tgaaggagcg tctcaaggcg ctggagaagg acccgcagca 1080
cagttggaag ctcagtccgc tggactggaa gatgcagagc gaggtctacg accgcttcgt 1140
gcattacggc gagcgtgtgc tgcgccgtac cagccgggac tacgcgccct ggtacgtggt 1200
ggaaggcgcg gacgagcgct accgcgccct gaccgtcggc cgcatccttc tcgaagggtt 1260
gcaggccgcg ctggccacca aggagcgcgc caagcgccag ccgcacgccg caccgctggt 1320
gtcgagcctg gacaaccgtg gcctgctgga ctccctggac ctgggccagt acctggacaa 1380
ggacgcctac aaggagcagc tcgccgccga acaggcacgt tgattgacag ctagctcagt 1440
cctaggtata atgctagcga attcattaaa gaggagaaag gtaccatgaa atttcccggt 1500
aaacgtaaat ccaaacatta cttccccgta aacgcacgcg atccgctgct tcagcaattc 1560
cagccagaaa acgaaaccag cgctgcctgg gtagtgggta tcgatcaaac gctggtcgat 1620
attgaagcga aagtggatga tgaatttatt gagcgttatg gattaagcgc cgggcattca 1680
ctggtgattg aggatgatgt agccgaagcg ctttatcagg aactaaaaca gaaaaacctg 1740
attacccatc agtttgcggg tggcaccatt ggtaacacca tgcacaacta ctcggtgctc 1800
gcggacgacc gttcggtgct gctgggcgtc atgtgcagca atattgaaat tggcagttat 1860
gcctatcgtt acctgtgtaa cacttccagc cgtaccgatc ttaactatct acaaggcgtg 1920
gatggcccga ttggtcgttg ctttacgctg attggcgagt ccggggaacg tacctttgct 1980
atcagtccag gccacatgaa ccagctgcgg gctgaaagca ttccggaaga tgtgattgcc 2040
ggagcctcgg cactggttct cacctcatat ctggtgcgtt gcaagccggg tgaacccatg 2100
ccggaagcaa ccatgaaagc cattgagtac gcgaagaaat ataacgtacc ggtggtgctg 2160
acgctgggca ccaagtttgt cattgccgag aatccgcagt ggtggcagca attcctcaaa 2220
gatcacgtct ctatccttgc gatgaacgaa gatgaagccg aagcgttgac cggagaaagc 2280
gatccgttgt tggcatctga caaggcgctg gactgggtag atctggtgct gtgcaccgcc 2340
gggccaatcg gcttgtatat ggcgggcttt accgaagacg aagcgaaacg taaaacccag 2400
catccgctgc tgccgggcgc tatagcggaa ttcaaccagt atgagtttag ccgcgccatg 2460
cgccacaagg attgccagaa tccgctgcgt gtatattcgc acattgcgcc gtacatgggc 2520
gggccggaaa aaatcatgaa cactaatgga gcgggggatg gcgcattggc agcgttgctg 2580
catgacatta ccgccaacag ctaccatcgt agcaacgtac caaactccag caaacataaa 2640
ttcacctggt taacttattc atcgttagcg caggtgtgta aatatgctaa ccgtgtgagc 2700
tatcaggtac tgaaccagca ttcacctcgt ttaacgcgcg gcttgccgga gcgtgaagac 2760
agcctggaag agtcttactg ggatcgttaa cttcctattc ttacttcaac acataaccgt 2820
acaaccgttt cacgccatcc gcatcggttt cgctataaac accttgcagc tccggcgaaa 2880
atcccggcaa caaattcacc ccttcttcca gtgcaaggaa ataacgttga accgccccac 2940
cccagacttc cccgggtacc acgcaaagca cgccaggtgg ataaggcaac gccccttctg 3000
ccgcaattcg cccttcggca tcacgaatcc gcaccaactc cacgtcaccg cgaatataag 3060
cgctatgcgc atcctggggg ttcatcacca ctgacgggaa actctgctgg cggaacatcg 3120
ctttttgtag gtctttgacg tcgaaactga catacagatc gtgcatctcc tgacacaact 3180
ggcgcagggt gtagtcgcga tagcgcaccg gatacttgtt ataaacgctc ggcaacacct 3240
caaccagcgg cgagtcatcc tcaatatgct gttcaaattg cgccagcatc 3290

Claims (9)

1.一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌E .coli MG26△ yjiP:: trxA futC为出发菌株，通过敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，并增加一个或多个拷贝数的乳糖通透酶基因LacY至treB基因座，以及整合GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2和鸟苷肌苷激酶基因gsk组成的表达框至nupG基因座中所得；所述编码EIICBGlc酶的基因ptsG的编号为GenBank ID: 945651；乳糖通透酶基因LacY的编号为GenBank ID: 949083，treB基因座的编号为GenBank ID: 948761，GDP-多聚磷酸转移酶基因ppk2的编号为GenBank ID: 879494，鸟苷肌苷激酶基因gsk的编号为GenBank ID: 946584，nupG基因座的编号为GenBank ID: 946282。
2.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：构建由大肠杆菌中ptsG位点上下游同源臂组成的ptsG基因敲除片段，与包含pTarget-ptsG质粒共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认敲除编码EIICBGlc酶的基因ptsG，得到重组大肠杆菌E. coli MG28；
S2：构建包含由treB位点的上下游同源臂、Ptac启动子和乳糖通透酶基因lacY组成的基因敲入片段，与包含pTarget-treB位点质粒共同电转到S1中所述重组大肠杆菌E. coliMG28感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认lacY基因成功整合至treB位点，得到重组大肠杆菌E. coli MG29；
S3：构建包含由nupG基因位点的上下游同源臂，组成型Ptac启动子表达ppk2基因和PJ23119启动子表达gsk基因组成的GTP辅因子基因表达框Ptac-ppk2-PJ23119-gsk，与包含pTarget-nupG质粒共同电转到S2中所述重组大肠杆菌E. coli MG29感受态中，通过菌落PCR和测序验证，确认Ptac-ppk2-PJ23119-gsk表达框成功整合至nupG位点，得到所述重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，S1中，所述的pTarget-ptsG质粒包含ptsG基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，S2中，所述的pTarget-treB位点质粒包含treB基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
5.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，S3中，所述的pTarget-nupG位点质粒包含nupG基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶。
6.权利要求1所述的重组大肠杆菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述重组大肠杆菌的种子液在培养基中摇瓶发酵。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵中所用发酵培养基中乳糖浓度为5-10g/L。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵时间为24-72h。
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