CN113755413A - 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产NMN的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产β‑烟酰胺单核苷酸（NMN）的重组微生物，以及利用该重组微生物生产NMN的方法，所述重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征，这些特征是：（1）在发酵培养基中添加烟酰胺经由重组微生物转化生成NMN；（2）过表达了烟酰胺磷酸核糖转移酶。（3）重组微生物基因组上编码碱性磷酸酶、核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。

Description

生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产NMN的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种或多种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物构建，以及利用重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN CAS:1094-61-7)是一种自然存在的生物活性核苷酸，有α和β2种不规则存在形式；而β-异构体是NMN的活性形式，分子式C11H15N2O8P，分子量334.22。它含有一分子烟酰胺组分，因为烟酰胺属于维生素B3，因此NMN也被归纳到维生素B族衍生物，它是在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化下，由烟酰胺(Nam)与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应的产物，同时是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的关键前体。哺乳动物体内的NAD+经由细胞内的各种酶生成NMN和Nam，在NAD+供应不足时，细胞会重新利用NMN和Nam来合成NAD+。Nam在Nampt的催化下生成NMN，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)的催化下生成NAD+，即NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。

近期的研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用，因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。

NMN的体外制备方法分为化学合成，半酶法合成和全酶法合成，其中以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应；这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题；半酶法合成是利用化学合成制备烟酰胺核糖，再利用烟酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN；全酶法则是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺，磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN，不仅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸，整个合成中需要大量昂贵的ATP，而且由于现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的酶活性较低，使得酶法反应存在耗时长、成本高、收率低等问题，难以实现工厂化大规模生产，因此限制了NMN的大规模应用。

生物发酵法生产NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN，克服酶法生产中的限制因素，其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低。

发明内容

本发明的目的是利用基因工程手段构建具有高产NMN的生物合成和积累能力的重组微生物，从而在菌种发酵过程中生产大量NMN，达到绿色环保低成本的NMN生产。

技术方案

本发明的技术方案可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌(Bacillus)，乳酸杆菌(Lactococcus)，棒杆菌(Corynebacteria)，酿酒酵母(Saccharomyces)，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。

在微生物中，NMN是烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)由烟酰胺(NAM)和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)产生的NAD⁺生物合成的中间体。NAD⁺的两种典型的从头合成途径涉及三个主要的酶：喹啉酸磷酸核糖基转移酶(nadC，EC 2.4.2.19)、烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶(nadD，EC 2.7.7.18)、NAD⁺合成酶(nadE，EC 6.3.1.5)，NadC将来自磷酸核糖基焦磷酸的磷酸核糖基部分转移到喹啉酸氮并催化随后的中间体脱羧以产生烟酸单核苷酸(NaMN)，NadD利用三磷酸腺苷(ATP)腺苷酸化NaMN，从而产生烟酸二核苷酸(NaAD)，NadD还能够腺苷酸化NMN，但与使用NaMN作为底物时相比，具有较低的活力，NAD⁺生物合成的最后一步由NadE催化，NadE利用氨或谷氨酰胺作为氨基供体将NaAD酰胺化为NAD⁺。

除了从头合成途径外，NAD⁺还有多种补救途径，如NMN补救途径：NMN通过烟酰胺核苷酸酰胺酶(E.coli中的PncC，B.subtilis中的CinA，EC 3.5.1.42)的作用被再循环为NaMN，胞外NMN通过周质酸性磷酸酶(E.coli中的UshA，B.subtilis中的YfkN，EC 3.1.3.5)被去磷酸化为烟酰胺核糖(NR)，并且胞外NR可以通过NR转运体(E.coli中的PnuC，B.subtilis中的NupG)被导入细胞，进而通过烟酰胺核糖苷激酶(E.coli中的NadR，EC2.7.1.22)被磷酸化成NMN或在可逆反应中通过嘌呤核苷磷酸化酶(E.coli中的DeoD，B.subtilis中的DeoD，PupG，Pdp，EC 2.4.2.1)被降解为Nam，Nam可以通过DeoD被磷酸核糖基化为NMN或通过烟酰胺酶(PncA，EC 3.5.1.19)被脱酰胺为烟酸(NA)；NA或Nam通过烟酸磷酸核糖基转移酶(E.coli中的PncB,B.subtilis中的YueK EC 6.3.4.21)分别被转变为NaMN或NMN。

(1)去除利用和降解NMN的编码基因使NMN不再参与细胞中的代谢

本发明以大肠杆菌为例，依次敲除降解NMN至NR已知的各种磷酸酶编码基因，如ushA、aphA、CDP-二酰基甘油二磷酸酶的编码基因cdh；催化NMN至NaMN的烟酰胺核苷酸酰胺酶的编码基因pncC；利用NMN合成NAD⁺的烟酰胺核糖苷激酶的编码基因nadR以及消耗底物烟酰胺生成烟酸的烟酰胺酶编码基因pncA。通过上述方法，减少NAD⁺合成中NMN的补救路径，即削弱或者中断NMN的降解和利用，从而使细胞在生长过程中积累NMN。

(2)去除与NMN合成有底物竞争的编码基因

进一步的，本发明通过将nadC基因敲除，同时在细胞生长时补喂NA，通过上述方法，使重组微生物不表达基因nadC编码的喹啉酸磷酸核糖基转移酶，由于在NAD⁺的从头合成途径中，基因nadC编码的喹啉酸磷酸核糖基转移酶可以催化磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的磷酸核糖基转移至喹啉酸氮从而产生NaMN，在这一反应过程中，底物PRPP同时参与了NaMN和NMN的合成，底物竞争将明显降低NMN的合成速率，因此敲除nadC后一方面使得PRPP能够极大限度被用于NMN的合成，另一方面，补喂NA提供维持细胞生长所需的NAD⁺。

(3)去除具有广泛底物催化特性的磷酸酶或核苷酸酶编码基因

在生产过程中，我们发现将构建的工程菌种在5L发酵罐中验证NMN产量时，即便敲除了NMN已知的磷酸酶和相关的降解利用基因后，发酵液中生成的NMN仍然在随着时间的推移不断降解，表明代谢路径中存在某些未被发现的具有水解NMN的磷酸酶。作为本发明的一种优选方式，本发明通过敲除phoA、surE、nagD中的一个或者多个，用于去除NMN的降解途径从而实现更多地积累NMN，结果在敲除phoA、surE、nagD中的一个或者多个后，NMN产量可以提高近2倍，摇瓶发酵24h产量达200mg/L以上。

(4)过表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶生产NMN

在哺乳动物体内，NMN由Nam在Nampt的催化下生成，而在大肠杆菌中，由于缺乏NAM磷酸核糖基转移酶使得NAM通常通过烟酰胺酶(PncA)转化为烟酸(NA)进行代谢，因此，作为本发明的一种优选方式，为了使细胞代谢积累NMN，本发明通过引入外源的烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如Shewanella oneidensis MR-1来源的SonadV(NC_004347.2)、小鼠来源的Nampt(NP_067499.2)、Haemophilus ducreyi ATCC 27722来源的HdnadV(NC_005329.1)以及Acinetobacter baylyi来源的nadV(WP_004921916.1)，在基因工程菌发酵培养时，细菌能够以外源添加底物烟酰胺(Nam)为底物，在烟酰胺磷酸核糖基转催化下反应生产NMN。

附图说明：

图1为大肠杆菌NMN的代谢路径示意图；

图2为NMN及各类副产物检测的HPLC图谱；

图3为比较JN02和JN06KC中NMN产量；

图4为比较phoA敲除前后菌株产NMN的效果；

图5为比较nadC敲除前后菌株产NMN的效果；

图6为5L发酵罐中验证JN11KC产NMN的效果；

图7为在各敲除菌株中比较NMN降解；

图8为验证敲除surE、nagD的菌株对NMN产量的影响；

其中：NA：烟酸；NR：烟酰胺核糖；NMN：β-烟酰胺单核苷酸；NAM：烟酰胺；Asp：天冬氨酸；QA：喹啉酸；NaMN：烟酸单核苷酸；NaAD：烟酸腺嘌呤二核苷酸；NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；PRPP：磷酸核糖焦磷酸；NadC：喹啉酸磷酸核糖基转移酶；NrdA、NrdB：核苷二磷酸还原酶；NadD：烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶；NadE：NAD合成酶；NadR：烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶；PncA：烟酰胺酶；PncB：烟酸磷酸核糖基转移酶；PncC：NMN脱酰胺酶；DeoD：嘌呤核苷磷酸化酶I；XapA：嘌呤核苷磷酸化酶II；Cdh：CDP-二酰基甘油二磷酸酶；AphA：磷酸转移酶；UshA：周质酸性磷酸酶；PhoA：碱性磷酸酶；surE：酸性磷酸酶；nagD：UMP磷酸水解酶。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

本发明的技术方案可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌(Bacillus)，乳酸杆菌(Lactococcus)，棒杆菌(Corynebacteria)，酿酒酵母(Saccharomyces)，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。

实施例1在大肠杆菌中基因敲除的方法

本发明采用Datsenko的方法在大肠杆菌中进行基因敲除(Datsenko 2000.ProcNatl Acad Sci USA,97(12):6640-6645)，相应的基因敲除引物见Baba 2006.Mol SystBiol,2(1)0008。

实施例2摇瓶发酵验证重组菌株的方法

验证重组菌株在摇瓶发酵中生产NMN的能力，具体成分为每升培养基中葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，以无菌去离子水定容至1L。其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠每升75.6g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠每升2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100ml，去离子水定容至1L。上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。对于缺陷型菌株在发酵培养基中补加烟酸5mg/L。

摇瓶发酵过程如下：首先接种重组菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中(著[美]J.莎姆布鲁克黄培堂译,子克隆指南2002，1595)，置37℃摇床250rpm培养；取培养16小时后的种子200μl转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h；随后将2ml二级种子全部转入装有18ml发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养3～4h，添加IPTG至终浓度1mM后，同时添加底物烟酰胺(Nam)300mg/L，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取800ul发酵液加800ul乙腈，旋涡震荡5min，12000rpm离心2min，取上清液过0.22um有机滤膜，HPLC检测，检测方法见实施例3。

实施例3 5L发酵罐利用重组菌株发酵生产NMN的方法

发酵培养基为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵5g，氯化钠2g，磷酸二氢钾4g，七水硫酸镁2g，葡萄糖15g，氯化钙0.105g，氯化锌0.01g，TM3 1mL，柠檬酸铁94mg，玉米浆5g，VB₁ 2.5mg，NA 40mg，泡敌1g，以去离子水定容，补料培养基为每升含葡萄糖500g，以氨水调节pH至6.9；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100ml，去离子水定容至1L。

具体发酵过程如下：(1)活化种子，从种子甘油管按接种量0.25％接入装有30mLLB的250mL摇瓶，37℃培养16小时，OD₆₀₀至3～4；(2)以接种量1％接种至装有100mL LB培养基的500mL种子摇瓶，37℃培养4小时至OD₆₀₀ 1～2；(3)以接种量10％接种到装有2L半合成培养基的5L发酵罐中，37℃培养，用氨水调节pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30％，当溶氧高于40％时，开始偶联补料，使溶氧维持在30％～45％。发酵8小时，OD₆₀₀至10～30时，温度维持在37℃，加入IPTG，使终浓度为0.4mmol/L进行诱导，发酵19小时后开始取样HPLC检测，检测方法见实施例4。

实施例4 HPLC测定发酵液中的NMN和相关副产物

精密吸取800ul发酵液加800ul乙腈，旋涡震荡5min，12000rpm离心2min，取上清液过0.22um有机滤膜，HPLC检测。HPLC的参数如下：采用Agilent SB Aq 4.6*150mm 5um，流动相为甲醇和10mM乙酸铵(pH 5.0)，流动相比例0.01-4.4分钟甲醇比例维持在1％，流速0.8mL/min，4.4-5.4分钟甲醇比例由1％上升到7％，流速0.8mL/min，5.4-6.5分钟甲醇比例由7％上升到18％，流速1.2mL/min，6.5-6.6分钟甲醇比例由18％下降到2％，6.6-12分钟甲醇比例维持2％，流速1.2mL/min，利用紫外检测器检测波长260nm；发酵液的上样量2μL，柱温30℃。NMN出峰时间为2.348分钟，乳清酸出峰时间为2.471分钟，NR出峰时间为3.074分钟，NA出峰时间为3.915分钟，NAD出峰时间为8.347分钟，Nam出峰时间为10.505分钟。HPLC图谱如图2所示。

实施例5构建不能利用和降解NMN的重组大肠杆菌

如图1所示，NMN是由烟酰胺(Nam)与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应的产物，是NAD⁺补救合成途径的关键前体，在大肠杆菌中，NMN的流向主要有如下三种：第一种通过烟酰胺核苷酸酰胺酶(PncC ECK2695)的作用被降解为NaMN，进而进入NAD⁺的合成中；第二种利用方式为胞外NMN通过周质酸性磷酸酶(UshA ECK0474)被去磷酸化为烟酰胺核糖(NR)，胞外NR通过NR转运体(PnuC ECK0740)被导入细胞，胞内NMN经由CDP-二酰基甘油二磷酸酶(CdhECK3910)、磷酸转移酶(Apha ECK4047)的作用去除NMN的侧链磷酸基团产生NR，进而通过烟酰胺核糖苷激酶(NadR，EC 2.7.1.22)被磷酸化成NMN或在可逆反应中通过嘌呤核苷磷酸化酶(DeoD ECK4376)被降解为底物Nam；第三种降解NMN的途径也是由nadR基因编码的烟酰胺核糖苷激酶起作用，将NMN进一步磷酸化到NAD⁺。

另外，在由Nam反应生产NMN的过程中，首先需要保证进入胞内的Nam不被降解，如图1所示，在大肠杆菌体内，胞内Nam可以通过烟酰胺酶(PncA，EC 3.5.1.19)被脱酰胺为烟酸(NA)，底物的分流将直接导致产物NMN的产量降低。因此，为了使细胞中更多地积累NMN，需要敲除ushA、cdh、pncC、nadR、pncA、aphA基因将降解和利用NMN的补救途径进行截断。本专利以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为出发菌株，按照实施例1中的方法在W3110中敲除利用和降解NMN的基因，构建菌株JN06KC(表1)。

表1菌株改造

实施例6构建过表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶的质粒

在哺乳动物体内，NMN由Nam在烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)的催化下生成，而在大肠杆菌中，由于缺乏NAM磷酸核糖基转移酶使得NAM通常通过烟酰胺酶(PncA)转化为烟酸(NA)进行代谢，因此，我们通过在发酵过程中外源添加底物Nam，结合引入外源的烟酰胺磷酸核糖基转移酶，使得细胞在代谢过程中利用核糖磷酸焦磷酸激酶(Prs)催化5-磷酸核糖生成的核糖磷酸焦磷酸PRPP来积累NMN。

我们分别通过表达Shewanella oneidensis MR-1来源的SonadV(NC_004347.2)、小鼠来源的Nampt(NP_067499.2)、Haemophilus ducreyi ATCC 27722来源的HdnadV(NC_005329.1)和Acinetobacter baylyi来源的nadV(WP_004921916.1)，它们都能够催化底物PRPP上的磷酸核糖基转移至Nam上从而生成NMN。具体的：分别合成针对大肠杆菌进行序列优化的基因SonadV、Nampt、HdnadV、nadV(苏州金唯智)，将合成的基因连接至载体pEZ07上构建过表达质粒pNM01-pNM04。

将构建的表达质粒转化基因工程菌株JN02，以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，结果质粒pNM01(pEZ07-nadV)、pNM04(pEZ07-SonadV)的表达效果较好，检测有约70mg/L的NMN积累，而表达质粒pNM02(pEZ07-Nampt)、pNM03(pEZ07-HdnadV)的NMN产量较低(～15mg/L)；所以将pNM04质粒转化到宿主JN06KC中与JN02比较，结果见图3，在敲除了ushA、cdh、pncC、nadR、pncA、aphA基因的菌株JN06KC中过表达pNM04，NMN产量明显高于JN02/pNM04，表明敲除这些降解基因是有效可行的。其中，质粒构建过程如下：

以pNM01为例，以合成的基因pUC57-nadV为模板，分别以引物pNM01-F/pNM01-R(见下表2)扩增nadV片段，得到的PCR产物大小为1500bp，且电泳检测无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的纯化片段与NcoI/KpnI酶切回收的pEZ07载体(载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)片段以纳摩尔比3:1进行无缝克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒)，重组克隆反应液于45度水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，转入TG1化转感受态细胞，42度热击2min，冰浴2min后加入800ul复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含100mg/L壮观酶素抗性的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pNM01。

表2 pNM01构建引物

实施例7筛选降解NMN至NR的磷酸水解酶

虽然在JN06KC菌株中敲除了已知降解NMN的磷酸水解酶编码基因ushA、cdh、aphA，但是在摇瓶发酵JN06KC/pNM04过程中，HPLC检测发现发酵液中有NR，推测仍然有其他一些未被发现的水解酶在NMN积累同时参与其降解。

大肠杆菌中的水解磷酸基团的酶有多种，包括磷酸酶如yfbT、phoA、yniC、appA、yedJ，和核苷酸酶如deoA，yfbR。因此我们通过构建过表达质粒，并以NMN作为反应底物进行体外催化，筛选能够催化NMN至NR的基因。

具体地，根据实施例6中质粒构建的方法，分别将基因deoA、yfbT、phoA、yniC、appA、yedJ、yfbR构建到载体pET28a上(质粒pET28a购买自淼灵生物科技有限公司)，获得质粒pHD01(pET28a-deoA)、pHD02(pET28a-yfbT)、pHD03(pET28a-yniC)、pHD04(pET28a-appA)、pHD06(pET28a-yedJ)、pHD07(pET28a-yfbR)、pHD09(pET28a-phoA)，转化宿主JN06KC，将带有不同质粒的菌株进行过表达，获得相关酶液。催化反应体系为：在3mL反应液中加入底物NMN终浓度为10g/L、酶液200ul，缓冲液100mM pH5.5的PBS，于37C水浴锅中搅拌反应一定时间，取样检测是否有NR生成，结果质粒pHD09(pET28a-phoA)表达的酶液在反应3h后能检测到产物NR，其余质粒表达的酶液未检测到。

酶的过表达及制备具体流程：从平板挑取单克隆于4mL带抗性试管，37度摇床250rpm培养过夜；次日转接500ul过夜菌液于50mL LB培养基(带抗性)中，继续在37C摇床上250rpm培养约2.5h(菌浓大约为0.8)，加入终浓度0.4mM IPTG进行诱导表达，温度调整为30C，摇床转速250rpm过夜培养19h后，离心收集菌体；称取0.1g菌体用2mL pH7.0的PBS(2mM)缓冲液重悬后，以40％功率超声破碎细胞(2s*4s，6min)，破碎液7830rpm离心10min，离心获得的上清即为表达的粗酶液。

实施例8去除胞质碱性磷酸酶编码基因

根据实施例7中的结果，碱性磷酸酶编码基因phoA应该是造成发酵液中产生副产物NR的原因之一，由此，我们按照实施例1中基因敲除的方法在菌株JN06KC的基础上敲除phoA，获得菌株JN10K，进而表达质粒pNM04，通过实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵验证，结果JN10K的NMN产量提高至132mg/L(见图4)，且发酵液中检测不到副产物NR，表明phoA编码的碱性磷酸酶确实能够水解底物NMN。

重组菌株W3110△ushA△cdh△pncC△nadR△pncA△aphA△phoA::KF简写为菌株JN10K，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.)，该菌株已于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.19572。

实施例9敲除与NMN合成有底物竞争的编码基因

NAD⁺的从头合成途径中，基因nadC编码的烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶催化PRPP的磷酸核糖基转移至喹啉酸氮从而产生NaMN，因此，在发酵生产NMN的反应过程中，底物PRPP将同时参与NaMN和NMN的合成，底物竞争将明显降低NMN的合成速率，为了解除底物竞争，我们在敲除了NMN的降解基因后继续敲除nadC，但是敲除nadC后会使得NAD⁺的从头合成途径被截断，为了提供细胞生长所需的NAD⁺，在发酵过程中补喂NA，通过NA的补救路径获得NAD⁺，一方面使得PRPP能够极大限度被用于NMN的合成，另一方面，补喂NA维持细胞生长。

因此，按照实施例1中基因敲除的方法，本发明在构建的JN10K菌株上继续敲除基因nadC，获得菌株JN11KC，将构建的表达质粒pNM04转化宿主JN11KC，以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，结果见图5，在去除了消耗PRPP的竞争路径后，NMN摇瓶发酵产量可达180mg/L，与JN10K比较提高了约60mg/L。

重组菌株W3110△ushA△cdh△pncC△nadR△pncA△aphA△phoA::KF△nadC::CF简写为菌株JN11KC，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.)，该菌株已于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.19573。

实施例10 JN11KC上罐验证产量

JN11KC/pNM04在摇瓶发酵时检测不到副产物NR，预想在发酵罐上可以积累可观的NMN，因此按照实施例3中的方法，将菌株JN11KC/pNM04进行5L发酵罐的NMN产量验证，不同时间点取样进行HPLC检测，结果如图6所示，在发酵前期，NMN产量积累明显，23h可达2.35g/L，但是随着发酵时间的延长，NMN产量在不断下降，同时又有副产物NR检测到，发酵72h后NMN仅剩余1g/L，并不能达到积累NMN的目的。这一结果表明虽然我们已经在大肠杆菌W3110中敲除了已知代谢路径中的NMN降解及利用基因，但是仍然存在某些未被发现的水解NMN到副产物NR的基因，设法找到这些基因是构建高产NMN菌株的关键。

实施例11构建不同敲除菌株筛选磷酸水解酶

基于实施例10的结果，水解NMN产生副产物NR的基因并不仅限于phoA，还有一些未被发现的同样具有广泛底物催化特性的磷酸水解酶参与这一步降解反应，因此我们从EcoCyc(https://ecocyc.org/)中寻找大肠杆菌中具有多底物磷酸水解功能的核苷酸酶或者磷酸酶编码基因，通过构建基因敲除菌株来验证是否能够缓解NMN的降解，从而筛选有降解NMN功能的水解酶。

具体地，按照实施例1中基因敲除的方法在菌株JN11KC基础上分别敲除基因surE、yrfG、nagD、nadB、nudB、agp、pgpA构建菌株JN16K-JN19K、JN23K-JN25K(见表1)，通过实施例2中的发酵培养基进行空宿主的摇瓶发酵，在发酵3.5h时加入终浓度200mg/L NMN进行降解实验比较，不同时间点取样检测NMN残留，结果见图7，与空瓶对照比较，敲除surE、nagD的菌株JN16K、JN18K虽然仍有NMN的降解，但是降解速率明显变慢，发酵24h残留170mg/L以上，而其余敲除菌株24h检测NMN残留在100mg/L左右，甚至更低，表明敲除基因surE、nagD将对积累NMN产生有益效果。

实施例12比较敲除surE、nagD以及双基因敲除菌株发酵产NMN的效果

基因surE编码5’(3’)核苷酸酶和多磷酸酶，属金属依赖型酸性磷酸酶，能有效水解嘌呤和嘧啶核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸以及多磷酸盐，对SurE的进一步生化特征研究表明，它具有广泛的底物特异性，可以水解各种核糖和脱氧核糖核苷5'-单磷酸和核糖核苷3'-单磷酸，对3'-AMP具有最高的亲和力，SurE还水解多磷酸盐，尤其偏爱短链底物(P_(20-25))；UMP磷酸水解酶编码基因nagD，属于核糖核苷磷酸水解酶(包括三磷酸、二磷酸、单磷酸)，在以UMP为底物时显示出最强活性，但在AMP、GMP和CMP中也是非常有效的磷酸酶，因此它是一种相当普遍的核糖核苷酸单磷酸酶，结合实施例11中的实验结果，我们推测这两个基因表达的核苷酸酶同样能够作用于NMN，催化其脱磷酸基生成NR，导致发酵过程中产物NMN的边合成边降解，限制了NMN的高产及产物的纯度。

据此，按照实施例1中基因敲除的方法，我们在JN16K(JN11△surE::KF)的基础上进一步敲除nagD，构建菌株JN26K，将表达质粒pNM01(pEZ07-nadV)分别转化宿主JN16K(JN11△surE::KF)、JN18K(JN11△nagD::KF)和JN26K(JN16△nagD::KF)，以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，检测结果表明(见图8)，与菌株JN11KC/pNM01比较，敲除surE、nagD以及同时敲除surE、nagD的菌株在NMN产量上都有不同程度的提高，其中JN26K可达到320mg/L，明显高于JN11KC菌株，表明敲除surE、nagD是显著有效的。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护。

序列表

<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司

<120> 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产NMN的方法

<130> 2020052203

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> pNM01-F

<400> 1

gattaaataa ggaggaataa accatgagct tccgtatcaa ccc 43

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> pNM01-R

<400> 2

gtaccagctg cagatctcga gttaattgct atccttaaaa ctctccag 48

Claims (9)

1.生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物具有如下至少一个特征：

所述重组微生物利用烟酰胺生产β-烟酰胺单核苷酸；

所述重组微生物中编码碱性磷酸酶、核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。

2.如权利要求1所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中编码碱性磷酸酶的基因phoA缺失或失活或活力降低。

3.如权利要求1所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中编码核苷酸酶的基因surE缺失或失活或活力降低。

4.如权利要求1所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中编码核苷酸酶的基因nagD缺失或失活或活力降低。

5.如权利要求1所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述的重组微生物为大肠杆菌（Escherichia coli），芽孢杆菌（Bacillus），乳酸杆菌(Lactococcus)，棒杆菌(Corynebacteria)，酿酒酵母 (Saccharomyces)。

6.如权利要求5所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述的棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）。

7.如权利要求5所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

8.一种生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：通过权利要求1-7中任一项所述的重组微生物经发酵，得到所述β-烟酰胺单核苷酸。

9.如权利要求8所述的生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：在发酵的培养基中添加烟酰胺。

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