CN108949865A - 固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)的新方法，以D‑5‑磷酸核糖、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化，实现了高效生物合成β‑烟酰胺单核苷酸，合成β‑烟酰胺单核苷酸的浓度达到13.3g/L。提高β‑NMN的酶法合成量和转化率，固定化全细胞的反复使用，降低反应复杂度和生产成本。
Description
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，尤其涉及固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸。
背景技术：
β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶催化后得到的产物，在体内有着重要的作用，是NAD+的关键前体之一。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《science》上的一项研究表明，NAD+在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD+的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了“不老神药”。这也促使全球各大医药和食品界不断的对NMN进行开发，目前大部分β-NMN来源于化学法合成，造成严重的环境污染以及带来高成本；用有机溶剂合成保健品药物，难除净小分子有机物，对人体存在潜在危险。正因如此，生物转化制备β-NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。
在酶法制备β-NMN的研究中，也有一些专利，如：WO2018023209、WO2018023210、CN106755209，公开了酶法合成技术，但是它们所涉及的合成方法相对比较复杂，需要多步反应，且转化率和收率普遍不高。
针对现有技术中所存在的缺陷，本发明公开了一种高效的β-NMN的酶法合成方法，可以有效降低反应复杂度和生产成本。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是针对目前化学合成法存在的弊端和现有生物酶法催化的复杂性，开发一种简单的一步酶法制备β-NMN，有效降低反应的复杂性，提高实验可操作性及ATP的转化率。
本发明技术方案如下：
一种一步酶法催化合成β-NMN，工艺路线如式I所示：
以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为底物，在ATP存在下，用固定化含有磷酸焦磷酸合成酶(PRPPs)和烟酰胺焦磷酸转移酶(NAMPT)的基因工程菌全细胞催化，一步实现β-NMN的生物合成。
进一步，反应步骤包括：
a.用10-50mM的磷酸盐缓冲液溶解D-5磷酸核糖、烟酰胺和ATP，MgCl2的浓度为1-50mM，MnSO4的浓度为1-100mM。
b.搅拌条件下用磷酸与饱和氢氧化钠溶液调pH至7.0-8.5。
c.D-5磷酸核糖和烟酰胺溶解后，向反应釜中投入固定化全细胞，控制固定化全细胞在在20-50g/L，反应温度控制在30-45℃。
d.搅拌反应过程中用5-20％的K2CO3溶液控制pH在7.8-8.5，3h后离心收集上清液，进行HPLC分析。
本发明的有益效果：全细胞催化剂或者共表达细胞催化剂具有成本低、生产工艺相对简单、辅酶用量少等优点。共表达细胞催化剂菌株的构建利用了分子生物学技术，将两个酶(PRPPs和NAMPT)同时克隆到一个细胞中，不仅具有使用价值，而且技术难度高。将共表达细胞进行固定化，得以实现固定化全细胞催化，使得细胞可以反复利用，从而进一步降低生产成本，突显生物催化路线的优势。
与现有的β-NMN制备方法相比，本发明采用廉价的原料D-5磷酸核糖，在固定化含有PRPPs和NAMPT双酶的基因工程菌全细胞催化下，实现多批次转化制备β-NMN。这也是首次报道利用固定化全细胞一步酶法催化实现从D-5-P到β-NMN的合成，提高了β-NMN的产量，降低了生产成本。
附图说明
图1为NAMPT和PRPPs共表达蛋白电泳图
图2为一步法制备β-NMN的转化结果分析图
图3为固定化全细胞合成β-NMN的结果分析图
图4为10g/L的β-NMN标准品的分析图
图5为定位分析图，其中A为NAM定位分析图，B为ATP定位分析图
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。以下实施例是对本发明的解释，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1酶基因共表达体系的构建
利用限制性酶切位点NdeⅠ和EcoRⅠ将NAMPT基因构建到质粒pET-42a上，形成重组质粒pET-42a-NAMPT。然后利用带有SaclⅠ和XhoⅠ的引物扩增出基因PRPPs，用限制性酶FDSaclⅠ和FD XhoⅠ快速切割PRPPs的扩增片段和重组质粒pET-42a-NAMPT，在连接酶NEBligase的作用下，实现PRPPs和NAMPT两个基因同时克隆到pET-42a上，形成新的重组全基因质粒pET-42a-NAMPT-PRPPs。将重组的全基因质粒，在42℃水浴锅中热击90s转入感受态细胞BL21(DE3)。转化液与37℃恒温振荡箱孵育1h，后涂布于含100mg/L的卡那霉素平板上，37℃培养24h，挑取单克隆。对平板上随意筛选5个单克隆进行PCR鉴定，利用菌体作为模板，得到的阳性克隆转入含有5mL LB培养基的试管中培养，37℃和120rpm转速下培养12h。再以1％的接种量转入100mL 2YT培养基中表达，先是37℃表达至OD达到0.8，用0.1mM的IPTG诱导，同时温度调至20℃，诱导表达12h后提取菌体，并做超声处理，观察蛋白的表达情况(见图1)。
实施例2一步酶法制备β-NMN
为了减少反应体系中菌体的使用量，充分利用微生物细胞内的蛋白高密度表达，开发了同一个菌体细胞表达两种酶。具体的转化反应体系含20mM烟酰胺、20mM ATP、40mMD-5-磷酸核糖、10mM MgCl2、20mM MnSO4，用饱和氢氧化钠调整pH至8.0。然后向原料溶液中投入10g/L的共表达PRPPs和NAMPT的菌体细胞，边加入边搅拌，保证菌体充分溶解，控制搅拌速度在60rpm，温度在37℃，并借助自动滴定仪设备，用15％的K2CO3溶液控制pH在8.3，反应3h后取样进行HPLC分析，通过与标准品对照，可以得到5.8g/L的β-NMN生成量，转化率在86.8％。
实施例3一步酶法制备β-NMN
一转化体系中含50mM烟酰胺、40mM ATP、80mM D-5-磷酸核糖、10mM MgCl2、20mMMnSO4，用饱和氢氧化钠调整pH至8.3。然后向原料溶液中投入20g/L的共表达PRPPs和NAMPT的菌体细胞，边加入边搅拌，保证菌体充分溶解，控制搅拌速度在60rpm，温度在37℃，并借助自动滴定仪设备，用15％的K2CO3溶液控制pH在8.3，反应3h后取样进行HPLC分析，通过与标准品对照，可以得到12g/L的β-NMN生成量(见图2)，转化率在89.8％。
实施例4固定化全细胞的制备
将含有PRPPs和NAMPT双酶的重组基因工程菌培养后获得的湿菌体加入到100mM磷酸盐缓冲液中，制成浓度为20％(v/v)的菌悬液。向菌悬液中添加氨基型树脂载体，搅拌均匀，再加入戊二醛进行交联，25℃搅拌6h后，过滤抽干，再用4℃的蒸馏水淋洗固定化细胞两次，真空抽干即可获得固定化共表达全细胞。
实施例5固定化全细胞催化合成β-NMN
为了充分利用共表达的全细胞，实现多批次催化制备β-NMN，采用固定化全细胞进行一步法转化。转化体系中含50mM烟酰胺、40mM ATP、50mM D-5磷酸核糖、10mM MgCl2、10mMMnSO4，用饱和氢氧化钠调整pH至8.3。然后向原料溶液中投入50g/L的固定化全细胞，边加入边搅拌，控制搅拌速度在50rpm，温度在37℃，并借助自动滴定仪设备，用15％的K2CO3溶液控制pH在8.3，反应3h后取样进行HPLC分析，通过与标准品对照，可以得到13.2g/L的β-NMN生成量。将反应溶液过滤移走，用去离子水冲洗固定化全细胞两次，继续投入反应釜中，反应原料投放跟上述一致，3h后再次液相分析检测，得到13.3g/L的β-NMN生成量，(见图3)，转化率在99.5％，说明固定化全细胞实现了生物催化剂的再次使用。
实施例6固定化全细胞催化合成β-NMN
一转化体系中含40mM烟酰胺、40mM ATP、40mM D-5磷酸核糖、10mM MgCl2、10mMMnSO4，用饱和氢氧化钠调整pH至8.5。然后向原料溶液中投入40g/L的固定化全细胞，边加入边搅拌，保控制搅拌速度在50rpm，温度在37℃，并借助自动滴定仪设备，用15％的K2CO3溶液控制pH在8.5，反应3h后取样进行HPLC分析，通过与标准品对照，可以得到13.0g/L的β-NMN生成量，转化率在97.3％。
实施例7 β-NMN转化的分析方法
利用高压液相(HPLC)分析一步法合成β-NMN的浓度，其中液相的配备要求如，分析的柱子型号：Hypersil BDS C18,5u,200×4.6；流动相:10％乙腈和pH 6.0缓冲液(V/V)(3.4g磷酸二氢钾溶于850mL水,用85％磷酸调pH至6.0,加100mL乙腈,再用水加至1L)；流速:1mL/min；检测:UV检测,254nm；柱温：25℃。10g/L的β-NMN标准品的配制，精确称量5g标准品β-NMN，利用去离子水溶解定容到到500mL容量瓶中，超声后过滤，利用自动进样阀注入20ul样品分析(见图4)，β-NMN的出峰定位在3.3min。ATP和NAM的定位分析，称量ATP和NAM各10mg，利用去离子水溶解在1mL离心管中，超声过滤后，单独进样分析(见图5)，NAM的出峰时间在4.78min，ATP的出峰时间在7.55min。
Claims (8)
1.一种新的酶法催化制备β-NMN的方法，其特征在于：以D-5磷酸核糖和烟酰胺为底物，在ATP存在下，通过固定化共表达磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化一步实现β-NMN的生物合成。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于:所述固定化共表达的磷酸焦磷酸合成酶和烟酰胺焦磷酸转移酶的形态可以是菌体细胞、酶液、酶粉或者固定化酶、固定化细胞。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于:所述的反应温度为30-45℃，优选37℃。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于:所述的反应缓冲液为磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-Hcl缓冲液。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于:反应所需要的pH＝7.0-8.5，优选8.3。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于:反应所需要MgCl2的浓度为1-50mM，优选20mM。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于:反应所需要MnSO4的浓度为1-100mM，优选40mM。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于:所述的菌体微生物为大肠杆菌，酵母，动物细胞。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20181207 |
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