CN113122594A - 烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备烟酸或其衍生物的单核苷酸的方法，包括下列步骤：采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸。本发明还提供了制备生物产物的方法。本发明能够采用新型的酶法制备或生产烟酸或其衍生物的单核苷酸以及采用该单核苷酸作为中间体制备烟酸或其衍生物的核苷等生物产物，克服了传统方法的缺点。

Description

烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物科技领域，具体而言，本发明属于生化领域，特别是涉及烟酸或其衍生物的单核苷酸的制备方法以及利用烟酸或其衍生物的单核苷酸作为中间体制备各种生物产物的方法。

背景技术

烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸是合成各种身体需要的生物产物的重要中间体。其中，一个代表性的例子是β-烟酰胺单核苷酸(NMN)。β-烟酰胺单核苷酸是一种生物中都需要的烟酰胺腺苷二核苷酸中间体，在身体中通过烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶在各器官细胞中转化成烟酰胺腺苷二核苷酸。生物中均需要烟酰胺腺苷二核苷酸的存在，是维持生命的必要物质和不可缺少的辅酶：细胞中氢离子的生化反应、细胞核中的能量代谢调控以至维护生理时钟的机制中烟酰胺腺苷二核苷酸都参与其中并且其身体中的水平对上述生理作用有着决定性的影响，如此同时，烟酰胺腺苷二核苷酸肩负了基因修复和稳定端粒体的功能，增强身体的免疫能力和促进增生肌肉中的微丝血管等作用。

哈佛大学教授David Sinclair首先发现身体中烟酰胺腺苷二核苷酸的水平与身体的健康和衰老有着紧密的关联：人体随着年岁增长而身体中烟酰胺腺苷二核苷酸的水平会下降，继而减低新陈代谢并引发相关的疾病，并提出提升烟酰胺腺苷二核苷酸的水平有助身体新陈代谢从而抵抗衰老所带来的影响，并认为使用β-烟酰胺单核苷酸能达至相关的目的。华盛顿大学教授今井真一郎在小鼠上引证β-烟酰胺单核苷酸能提升烟酰胺腺苷二核苷酸的水平并在体能上表现出逆转衰老的效果，加上国内外的研究圴指出提升烟酰胺腺苷二核苷酸水平的重要性，大众对β-烟酰胺单核苷酸加深了认识。

β-烟酰胺单核苷酸是天然物质，可以在日常膳食中吸取，以牛油果和西兰花中的蕴含量较高，但只透过饮食摄取每天身体所需的分量，则需要进食数十公斤的蔬果方能达标，恐怕难以实现。因此，服用β-烟酰胺单核苷酸作为烟酰胺腺苷二核苷酸补充剂更为合适。

烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)可以从酵母菌中提取或利用化学和传统酶法合成。酵母菌中的烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)含量极微，需要透过多个步骤才能提取到纯度较低的产物，因此售价高昂并且质量较低，并非适合普罗大众使用，而化学方法有着与提取法相同的缺点，因此这两种方法逐被淘汰。

酶法合成有着产能较高和节能的优点，并能生产出纯度较高的产品，将成为生产烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)的主流工艺。传统酶法合成烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)以核糖为初始原材料进行酶法反应。核糖的需求每年迅速增长，除可用于烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)的生产外，更经常使用在膳食补充剂、食品饮料、功能营养领域，其中近年核糖更应用于改良新兴“人造肉”的风味，是生产该潮流食品中不可或缺的成分。核糖的需求远比其供应高，做成近年价格上涨和供应不稳的情况。

全球人口老化，在老年护理的开支和需求连年具增，大多数已发展和发展中的国家在该问题上亦已束手无策；烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)的使用正能改善上述方面的压力，延缓和逆转衰老符合普罗大众的愿望并切合社会上的需要的双赢机会。因此，烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)的需求将按年上升，核糖的供求将更为严峻，以致价格和供应都不稳，不利烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸的生产，对用家和社会都做成巨大损失，因此有必要开发以使用多元化和可持续性的烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸的酶法制备工艺。

发明内容

如上所述，烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸为生物中生成各种生物产物(特别是烟酰胺腺苷二核苷酸)的前体，科学界近年对该物质已经进行了深入的研究。提供一种烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的改进方法可以为该物质进行量化生产，对该领域上的研究提供便利。

因此，本发明提供了一种新型的烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的工业量化制备方法以及利用烟酸或其衍生物的单核苷酸作为中间体制备各种生物产物(特别是烟酸或其衍生物的核苷)的方法。

具体而言，本发明提供了：

1.一种制备烟酸或其衍生物的单核苷酸的方法，包括下列步骤：采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸。

其中所述烟酸或其衍生物的单核苷酸选自β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸中的至少一者。

其中所述己糖源来自具有六个碳原子的单糖、能够生成己糖的多糖或其混合物。

其中所述的单糖选自D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-果糖或其混合物中的任意一者，优选为D-葡萄糖、D-甘露糖和D-果糖，更优选为D-葡萄糖和D-果糖。

其中所述的己糖源来自通过糖苷键连接多种己糖单元的多糖，优选为蔗糖、麦芽糖、菊粉、棉子糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物，更优选为蔗糖、麦芽糖和棉子糖，更优选为蔗糖和麦芽糖。

其中所述生物酶为单独的生物酶或者包含多种生物酶的生物酶组。

其中所述反应的条件包括：温度为25-40℃，优选为30-39℃，更优选为35-38℃；并且/或者反应体系的pH为6.0-8.5，优选为pH 7.0-8.0，更优选为pH7.5-7.8。

其中所述反应底物还包含辅助离子，辅助离子包含金属离子、氯离子、镁离子、钙离子、钾离子、钠离子、锌离子、氟离子、硫离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子以及含磷类离子中的至少一者，优选钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子和含磷类离子中的至少一者。

其中所述磷酸供体选自ATP或其盐、ADP或其盐、AMP或其盐、CTP或其盐、GTP或其盐、UTP或其盐、ITP或其盐和多聚磷酸或其盐中的至少一者，优选ATP或其盐、ADP或其盐、AMP或其盐和多聚磷酸或其盐中的至少一者。

其中所述磷酸供体可以为多聚磷酸或ATP或其盐，所述己糖源来自D-葡萄糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)；其中生物酶组中的聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶以多聚磷酸和D-葡萄糖为底物转化合成至葡萄糖-6-磷酸和多聚磷酸(n-1)，生物酶组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶以葡萄糖-6-磷酸为底物转化合成至果糖-6-磷酸，生物酶组中的己酮糖6-磷酸异构酶以果糖-6-磷酸为底物转化合成至阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯，生物酶组中的己酮糖6-磷酸合酶以阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯为底物转化合成至核酮糖-5-磷酸和甲醛，生物酶组中的核糖5-磷酸异构酶核酮糖-5-磷酸为底物转化合成至核糖-5-磷酸，生物酶组中的磷酸核糖二磷酸激酶以核糖-5-磷酸和磷酸供体为底物转化合成至5-磷酰核糖-1-焦磷酸和AMP，生物酶组中的烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化合成至β-烟酰胺单核苷酸和焦磷酸，或以烟酸为底物转化合成至烟酸单核苷酸和焦磷酸。

其中所述己糖源来自D-葡萄糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.5)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC2.4.2.12)。

其中所述己糖源来自D-果糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)。

其中所述己糖源来自D-甘露糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含甘露糖激酶(EC 2.7.1.7)、甘露糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.8)、己酮糖6-磷酸异构酶(6EC5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶。

其中所述己糖源来自蔗糖、双糖麦芽糖、棉子糖、麦芽糊精和淀粉中的至少一者并且其中在生物酶催化反应之前，将所述己糖源用选自热、酸、碱中的至少一种方法水解蔗糖转化为选自D-葡萄糖、半乳糖、D-果糖和D-甘露糖中的至少一种单糖，然后将所述单糖投入反应底物中；或者

其中所述己糖源为蔗糖、双糖麦芽糖类、棉子糖、麦芽糊精和淀粉中的至少一者，并且直接使用生物酶组将包含所述己糖源和烟酸或其衍生物的核苷和反应底物转化为β-烟酰胺单核苷酸，其中所述生物酶组包含淀粉酶类(EC 3.2.1.1-3)、普鲁兰酶(EC3.2.1.41)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异麦芽糖酶(EC 3.2.1.10)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蔗糖酶(EC 3.2.1.26)、、蔗糖α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.48)、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。

其中，所述蔗糖包含白砂糖、黄砂糖、赤砂糖、绵白糖、单晶体冰糖、多晶体冰糖、红糖、黑糖、冰片糖、方糖、糖霜、液体糖浆中的至少一者；并且

所述双糖麦芽糖包含选自麦芽糖和异麦芽糖中的至少一者。

其中，所述生物酶包含ATP再生酶，ATP再生酶包含聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC2.7.4.B2)、多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)、腺苷激酶(EC 2.7.1.20)中的至少一者；并且其中所述方法还包括ATP再生步骤，该步骤包括：聚磷酸-AMP磷酸转移酶以多聚磷酸和AMP为底物转化生成ADP，多聚磷酸激酶以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP/ATP，以及腺苷激酶以两分子的ADP为底物转化生成ATP和AMP。

其中，多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)包括II类和III类中的两组酶，其中使用II类的多聚磷酸激酶以多聚磷酸和ADP为底物转化生成ATP，使用III类的多聚磷酸激酶以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP/ATP；在使用II类的多聚磷酸激酶时由AMP转化合成至ATP时还包括使用聚磷酸-AMP磷酸转移酶和/或腺苷激酶，并且在使用III类的多聚磷酸激酶时，所述方法还包括单独使用该酶由AMP转化合成至ADP和ATP。

其中，所述反应底物还包含多聚磷酸、腺苷和腺嘌呤中的至少一者，所述磷酸供体为ATP，所述生物酶包含ATP再生酶，并且ATP再生酶包含腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)中的至少一者，

其中所述方法还包括ATP再生步骤，该步骤包括：腺苷酸激酶先以一分子的腺苷和ATP为底物转化生成AMP和ADP，然后使用所述ATP再生酶组以多聚磷酸为主要底物将AMP和ADP转化生成两分子的ATP或一分子的ADP和ATP；腺嘌呤磷酸核糖转移酶则以一分子的腺嘌呤和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化生成一分子的AMP和磷酸，然后使用ATP再生酶组以多聚磷酸为主要底物将AMP转化生成ADP和ATP。

其中，所述反应底物还包含烟酰胺和烟酸中的至少一者，并且所述单核苷酸为β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸中的至少一者。

其中所述方法还包括在反应底物中添加出用于吸咐或分解甲醛的隋性物料的步骤，优选地所述惰性物料为沸石。

其中所生物酶组为重组酶，该重组酶在所属的菌种进行合成并于大肠杆菌HB101中进行表达和提取；

优选地，所述生物酶为选自细胞破碎液、上清酶液、纯酶和以任何方式制备的固定化酶/细胞中的至少一种形式。

2.一种制备生物产物的方法，包括下列步骤：

(i)采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸；以及

(ii)利用生成的烟酸或其衍生物的单核苷酸作为中间体制备所述生物产物。

其中所述生物产物选自烟酰胺核苷或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、烟酸核苷或其任何盐分的衍生物、烟酸腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物中的至少一者。

本发明具有以下优点和积极效果：

1.本发明的方法采用新型的酶法制备或生产烟酸或其衍生物的单核苷酸以及采用该单核苷酸作为中间体制备烟酸或其衍生物的核苷等生物产物，克服了提取法和化学合成法的缺点。

2.本发明利用生物酶制备烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物除了继承该生产方式的优点外面，更比传统酶法工艺的成本更相宜，而且其中的制备方法与生物中的烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸)的生成相呼应，其产物较化学生产更适合生物所使用。

3.本发明选择各种的己糖源替代核糖作为底物原料之一制备β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸，通过各种酶组合的使用以进行β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸的生产，使用不同的己糖和产生己糖的多糖进行生产时只需使用相配的生物酶组合而不需要作大规模的生产设备改动，有利于灵活工业生产操作。

4.己糖源可以优选为D-葡萄糖和D-果糖：这两种己糖都是流通全球并且价格低廉，是代替核糖为原材料的理想选择，并且各种生物酶的配合上更可以使用更多糖类，其中蔗糖、淀粉、麦芽糖等也在日常生活中十分普遍，因此本发明的制备方法的多样化和可持续性是传统酶法无可比拟的。

5.本发明的制备方法还可以使用ATP再生酶或其组合：ATP再生酶或其组合可以循环使用反应体系中的ATP，进一步降低生产成本，同时酶法反应中的ADP和AMP皆为副产物，使用该酶组转化合成该副产物至底物对β-烟酰胺单核苷酸/的烟酸单核苷酸生产更为有利。ATP再生酶或其组合则使该制备方法更多样化，以腺苷和腺嘌呤辅助ATP的使用能降低ATP的使用量，降低生产成本的同时可减少传统酶法生产中对ATP用量的依赖。

6.本发明的制备方法还可以使用隋性物料去除制备方法中所产生的甲醛，隋性物料可以为沸石或具有相等效果的材料如活性炭；去除副产物能对烟酸或其衍生物的单核苷酸及其各种生物产物的生产更为有利，提升酶法反应的产能。

附图简要说明

图1示出聚磷酸葡糖磷酸转移酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1为聚磷酸葡糖磷酸转移酶细胞破碎液；

列2为聚磷酸葡糖磷酸转移酶酶上清液以及

列3为预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder，10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图2示出葡萄糖-6-磷酸异构酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列2为葡萄糖-6-磷酸异构酶细胞破碎液；列3为葡萄糖-6-磷酸异构酶上清液以及列1为预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图3示出己糖激酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:己糖激酶细胞破碎液；

列2:己糖激酶酶上清液；以及

列3:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图4示出6-磷酸己酮糖异构酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1为6-磷酸己酮糖异构酶细胞破碎液；

列2为6-磷酸己酮糖异构酶上清液以及

列3为预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10to180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图5示出己酮糖6-磷酸合酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:己酮糖6-磷酸合酶细胞破碎液；

列2:己酮糖6-磷酸合酶酶上清液；

列3:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10至180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图6示出核糖5-磷酸异构酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10to180kDa,Thermo Fisher Scientific)；

列2:核糖5-磷酸异构酶细胞破碎液；

列3:核糖5-磷酸异构酶酶上清液。

图7示出磷酸核糖二磷酸激酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10to180kDa,Thermo Fisher Scientific)

列2:磷酸核糖二磷酸激酶细胞破碎液；以及

列3:磷酸核糖二磷酸激酶酶上清液。

图8示出烟酰胺磷酸核糖转移酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)

列2:烟酰胺磷酸核糖转移酶细胞破碎液

列3:烟酰胺磷酸核糖转移酶酶上清液。

图9示出多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)

列2:多聚磷酸-AMP磷酸转移酶细胞破碎液；

列3:多聚磷酸-AMP磷酸转移酶酶上清液。

图10示出腺苷酸激酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)

列2:腺苷酸激酶细胞破碎液

列3:腺苷酸激酶酶上清液。

图11示出多聚磷酸激酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)；

列2:多聚磷酸激酶细胞破碎液；

列3:多聚磷酸激酶酶上清液。

图12示出甘露糖激酶细胞的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:甘露糖激酶细胞破碎液；

列2:甘露糖激酶酶上清液；

列3:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)。

图13示出甘露糖-6-磷酸异构酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10to180kDa,Thermo Fisher Scientific)；

列2:甘露糖-6-磷酸异构酶细胞破碎液；以及

列3:甘露糖-6-磷酸异构酶酶上清液。

图14示出聚麦芽糖酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)

列2:麦芽糖酶细胞破碎液

列3:麦芽糖酶酶上清液。

图15示出蔗糖酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder，10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)；

列2:蔗糖酶细胞破碎液；以及

列3:蔗糖酶酶上清液。

图16示出5’-核苷酸酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果图，其中

列1:预染蛋白分子量标准(PageRuler^TM Prestained Protein Ladder,10到180kDa,Thermo Fisher Scientific)；

列2:5’-核苷酸酶细胞破碎液；以及

列3:5’-核苷酸酶酶上清液。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明人开发了一种方制备烟酸或其衍生物的单核苷酸的方法，包括下列步骤：采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸。以己糖源(例如多糖、D-葡萄糖和D-果糖等单糖)为烟酸或其衍生物的单核苷酸的生产工艺的原材料，打破传统酶法工艺上使用核糖或更稀有和昂贵的化合物为原材料的做法。

本发明同时开启了工艺上的便利：在两种己糖为原材料的同时，使用不同的己糖时只需使用或者更换相配合的酶组合进行生产而其中的生产设备无需更换并且可以互通使用，确保了工业上的可行性。本发明人认为，烟酸或其衍生物的单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)或以其作为中间体制备的各种生物产物的长远发展必须建基于制备方法上可提供的多样性和可持续性，而这两方面皆与原材料的供应和价格息息相关。传统酶法工艺只能倚靠核糖为单一原材料，做法与上述两大重点背道而驰。本发明人还意识到现有核糖的供求在技术上的量产发展远远追不上应用的步伐，若再加上烟酸或其衍生物的单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)或以其作为中间体制备的各种生物产物的需求，情况在可预见的将来会更加严峻，直接打击烟酸或其衍生物的单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)或以其作为中间体制备的各种生物产物在社会上的普及。如此同时，工艺上缺乏多样性和可持续性对投资生产烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸(例如β-烟酰胺单核苷酸)带来不确定的因素，对工业生产存在隐忧。

本发明人开发的方法，在解决当前的问题时同时将成本降低，比传统工艺上需要使用的三磷酸腺苷(ATP)的用量减少，再配合辅助组合中以多聚磷酸再生三磷酸腺苷进一步压定成本，创造更有利的条件。

具体来说，本发明的方法采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸。

烟酸或其衍生物可以为烟酸和烟酰胺。因此，烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物可以为β-烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、烟酸核苷或其任何盐分的衍生物、烟酸单核苷酸、烟酸腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物，优选β-烟酰胺单核苷酸。烟酸和烟酰胺的结构是本领域已知的，并且可以通过市场方便地获得。

如上所述，本发明的一个显著优点是己糖源(例如多糖、D-葡萄糖和D-果糖等单糖)为烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的生产工艺的原材料，这代替了传统酶法工艺上使用核糖或更稀有和昂贵的化合物为原材料的做法。己糖源可以来自具有六个碳原子的单糖、能够生成己糖的多糖或其混合物。

具有六个碳原子的单糖可以选自D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-果糖或其混合物中的任意一者，优选为D-葡萄糖、D-甘露糖和D-果糖，更优选为D-葡萄糖和D-果糖。

己糖源也可以来自通过糖苷键连接多种己糖单元的多糖，只要该多糖类能够被生物酶的活性催化降解至己糖单糖(如D-葡萄糖和/或D-果糖)即可。多糖可以为蔗糖、麦芽糖、菊粉、棉子糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物，更优选为蔗糖、麦芽糖和棉子糖，最优选为蔗糖和麦芽糖。

蔗糖可以包含白砂糖、黄砂糖、赤砂糖、绵白糖、单晶体冰糖、多晶体冰糖、红糖、黑糖、冰片糖、方糖、糖霜、液体糖浆中的至少一者；并且麦芽糖可以包含选自麦芽糖和异麦芽糖中的至少一者。

在生物酶催化反应之前，可以通过选自热、酸和碱中的至少一种方法水解多糖转化为选自D-葡萄糖、半乳糖、D-果糖和D-甘露糖中的至少一种单糖，然后将所述单糖投入反应底物中。

磷酸供体是指在酶法反应中能够提供磷酸的任何化合物。磷酸供体可以选自ATP或其盐、ADP或其盐、AMP或其盐、CTP或其盐、GTP或其盐、UTP或其盐、ITP或其盐和不同磷酸链长度所组成的多聚磷酸或其盐中的至少一者。

在一个实施方案中，反应底物还可以包含辅助离子和多聚磷酸或其盐中的至少一者。多聚磷酸或其盐优选多聚磷酸的钠盐。多聚磷酸的聚合度可为3-20,000；优选地，多聚磷酸聚合度可为3-7,000，更优选为3-75。

任选地，辅助离子可以包含金属离子、氯离子、镁离子、钙离子、钾离子、钠离子、锌离子、氟离子、硫离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子以及含磷类离子中的至少一者，优选钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子和含磷类离子中的至少一者。辅助离子可为其无机盐或有机盐的状态，优选为六水氯化镁、氯化钠、氯化锰、硫酸镁和碳酸钾中的至少一者，更优选为六水氯化镁、氯化钠和碳酸钾中的至少一者。

此外，本领域公知的是，反应底物还可以包含其他添加剂，例如，pH调节剂，如缓冲液/盐，优选为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液、更优选为磷酸钠缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液。pH调节剂的浓度可以为0.001M-1M，优选为0.01M-0.5M，更优选为0.05M-0.3M。

在一个实施方案中，生物酶为单独的生物酶或者包含多种生物酶的生物酶组。

在一个实施方案中，生物酶组为重组酶，该重组酶在所属的菌种进行合成并于载体中进行表达和提取。

优选地，所述生物酶为选自细胞破碎液、上清酶液、纯酶和固定化酶/细胞中的至少一种形式。

任选的，载体可以包括大肠杆菌(例如大肠杆菌HB101)、酵母菌。这样，可以使用包含重组酶的细胞或其碎片作为所述生物酶。例如，细胞可以为大肠杆菌细胞、酵母菌细胞。载体可以包括大肠杆菌、酵母菌、芽胞杆菌等生物科学中常用的方式来进行重组酶的表达。生物酶或生物酶组可以在细胞、破碎液、上清液或纯化酶的液态中使用，或以任何方式和其对应载体制成固定化细胞或固定化酶进行酶催化反应。

根据本发明的一个实施方案，可以根据底物的组成选择合适或者相配合的生物酶或者生物酶组。

例如，当反应底物含有烟酰胺或烟酸、多聚磷酸和D-葡萄糖，并且磷酸供体为ATP时，生物酶组包含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。在这种情况下，具体的反应过程包括：生物酶组中的聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶以多聚磷酸和D-葡萄糖为底物转化合成至葡萄糖-6-磷酸和多聚磷酸(n-1)，生物酶组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶以葡萄糖-6-磷酸为底物转化合成至果糖-6-磷酸，生物酶组中的己酮糖6-磷酸异构酶以果糖-6-磷酸为底物转化合成至阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯，生物酶组中的己酮糖6-磷酸合酶以阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯为底物转化合成至核酮糖-5-磷酸和甲醛，生物酶组中的核糖5-磷酸异构酶核酮糖-5-磷酸为底物转化合成至核糖-5-磷酸，生物酶组中的磷酸核糖二磷酸激酶以核糖-5-磷酸和磷酸供体为底物转化合成至5-磷酰核糖-1-焦磷酸和AMP，生物酶组中的烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化合成至β-烟酰胺单核苷酸和焦磷酸，或以烟酸为底物转化合成至烟酸单核苷酸和焦磷酸。

如果己糖源来自D-果糖，生物酶组可以包含己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。

如果己糖源来自D-葡萄糖，生物酶组可以包含葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.5)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。

如果己糖源来自D-甘露糖，生物酶组可以包含甘露糖激酶(EC 2.7.1.7)、甘露糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.8)、己酮糖6-磷酸异构酶(6EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶中的至少一者。

当己糖源为蔗糖、双糖麦芽糖类、棉子糖、麦芽糊精和淀粉中的至少一者，可以直接使用生物酶组将包含所述己糖源和烟酸或其衍生物的核苷和反应底物转化为β-烟酰胺单核苷酸/单核苷酸。在这种情况下，生物酶组包含淀粉酶类(EC 3.2.1.1-3)、普鲁兰酶(EC3.2.1.41)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异麦芽糖酶(EC 3.2.1.10)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蔗糖酶(EC 3.2.1.26)、、蔗糖α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.48)、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。

根据一个优选的实施方案，生物酶还可以包含ATP再生酶，ATP再生酶可以包含聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.B2)、多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)、腺苷激酶(EC2.7.1.20)中的至少一者。在这种情况下，本发明的方法还可以包括ATP再生步骤，该步骤包括：聚磷酸-AMP磷酸转移酶以多聚磷酸和AMP为底物转化生成ADP，多聚磷酸激酶以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP/ATP，以及腺苷激酶以两分子的ADP为底物转化生成ATP和AMP。

任选地，多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)包括II类和III类中的两组酶，其中使用II类的多聚磷酸激酶以多聚磷酸和ADP为底物转化生成ATP，使用III类的多聚磷酸激酶则可以以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP/ATP；在使用II类的多聚磷酸激酶时由AMP转化合成至ATP时还包括使用聚磷酸-AMP磷酸转移酶和/或腺苷激酶，并且在使用III类的多聚磷酸激酶时，本发明的方法还可以包括单独使用该酶由AMP转化合成至ADP和ATP。

本发明的反应底物还可以包含腺苷和腺嘌呤中的至少一者，并且ATP再生酶包含腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)中的至少一者，

根据一个优选的实施方案，本发明的方法还可以包括ATP再生步骤，该步骤包括：腺苷酸激酶先以一分子的腺苷和ATP为底物转化生成AMP和ADP，然后使用所述ATP再生酶组以多聚磷酸为主要底物将AMP和ADP转化生成两分子的ATP；腺嘌呤磷酸核糖转移酶则以一分子的腺嘌呤和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化生成一分子的AMP和磷酸，然后使用ATP再生酶组以多聚磷酸为主要底物将AMP转化生成ATP。

本发明的方法还可以包括下列的任意一个步骤或其组合：

1.以己糖类中的D-葡萄糖为反应底物，生物酶组包含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(polyphosphate-glucose phosphotransferase；EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase；EC 5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphatesynthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase；EC5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphate diphosphokinase；EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase；EC 2.4.2.12)中的至少一者；其中酶组中的聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶以多聚磷酸和D-葡萄糖为底物转化合成至葡萄糖-6-磷酸和多聚磷酸(n-1)；酶组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶以葡萄糖-6-磷酸为底物转化合成至果糖-6-磷酸；酶组中的己酮糖6-磷酸异构酶以果糖-6-磷酸为底物转化合成至阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯；酶组中的己酮糖6-磷酸合酶以阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯为底物转化合成至核酮糖-5-磷酸和甲醛；酶组中的核糖5-磷酸异构酶核酮糖-5-磷酸为底物转化合成至核糖-5-磷酸；酶组中的磷酸核糖二磷酸激酶以核糖-5-磷酸和ATP为底物转化合成至5-磷酰核糖-1-焦磷酸和AMP；酶组中的烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化合成至β-烟酰胺单核苷酸和焦磷酸，或以烟酸为底物转化合成至烟酸单核苷酸和焦磷酸；

2.以己糖类中的D-葡萄糖为反应底物，生物酶组包含葡萄糖异构酶(glucoseisomerase；EC 5.3.1.5)、己糖激酶(hexokinase；EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphateisomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphate diphosphokinase；EC2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase；EC2.4.2.12)中的至少一者；

3.以己糖类中的D-果糖为反应底物，其中生物酶组包含己糖激酶(hexokinase；EC2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphatediphosphokinase；EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase；EC 2.4.2.12)中的至少一者。

4.以己糖类中的D-甘露糖为反应底物，其中生物酶组包含甘露糖激酶(mannokinase；EC 2.7.1.7)、甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase；EC5.3.1.8)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphatediphosphokinase；EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶中的至少一者；

5.以双糖类中的蔗糖类为反应底物，其中可以包括白砂糖、黄砂糖、赤砂糖、绵白糖、单晶体冰糖、多晶体冰糖、红糖、黑糖、冰片糖、方糖、糖霜、液体糖浆等；蔗糖的分子结构是由己糖类中的D-葡萄糖和D-果糖组成，可以先使用常用的物理方法如热、酸、碱等进行水解由双糖降解至单糖后使用上述的生物酶组进行转化合成至β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸；

6.以双糖类中的蔗糖类为反应底物并直接使用生物酶组转化合成至β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸；该生物酶组包含蔗糖酶类(sucrase)中的一种或多种的酶、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(polyphosphate-glucose phosphotransferase；EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase；EC 5.3.1.9)、己糖激酶(hexokinase；EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphate diphosphokinase；EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase；EC 2.4.2.12)；

7.以双糖麦芽糖类为反应底物，其中可以包括麦芽糖和异麦芽糖；麦芽糖类的分子结构是由己糖类中的两个D-葡萄糖组成，可以先使用常用的物理方法如热、酸、碱等进行水解由双糖降解至单糖后使用上述的酶组进行转化合成至β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸；麦芽糖类还可以直接使用酶组转化合成至产物；该酶组包含麦芽糖酶(maltase；EC3.2.1.20)和/或异麦芽糖酶(isomaltase；EC 3.2.1.10)、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(polyphosphate-glucose phosphotransferase；EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase；EC 5.3.1.9)、己糖激酶(hexokinase；EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphatediphosphokinase；EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase；EC 2.4.2.12)中的至少一者；

8.以三糖类中的棉子糖为反应底物；棉子糖的分子结构是由己糖类中的半乳糖、D-葡萄糖和D-果糖组成；该酶组包含α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase；EC 3.2.1.22)、蔗糖酶类(sucrase)中的一种或多种的酶、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(polyphosphate-glucose phosphotransferase；EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase；EC 5.3.1.9)、己糖激酶(hexokinase；EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase；EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphate synthase；EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphateisomerase；EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(ribose-phosphate diphosphokinase；EC2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase；EC2.4.2.12)中的至少一者；或者

9.以常见的多糖类如麦芽糊精和淀粉等在其结构上全部或部分以D-葡萄糖和/或D-果糖组成为底物，该多糖可以是先使用常用的物理方法如热、酸、碱等进行水解至单糖继而使用上述的生物酶组转化合成至β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸；该多糖类还可以使用包括淀粉酶类(Amylase；EC 3.2.1.1-3)、普鲁兰酶类(Pullulanase；EC 3.2.1.41)等水解多糖类至单糖并单独或混合使用上述的的酶组转化合成至β-烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸。

在一个方面中，蔗糖酶中的一种或多种的酶可以是包含蔗糖酶(invertase；EC3.2.1.26)、异麦芽糖酶(isomaltase；EC 3.2.1.10)、蔗糖α-葡糖苷酶(sucrose alpha-glucosidase；EC 3.2.1.48)等，只要该酶的活性能催化多糖类降解至己糖类的D-葡萄糖和/或D-果糖即可。

作为一个优选实施方案，本发明的方法还可以包括在反应底物中添加出用于吸咐或分解甲醛的隋性物料的步骤。优选地，惰性物料可以是只与甲醛发生物理或化学上的变化并不对生物酶反应具有任何影响的物料，优选沸石、三氧化铝、活性炭、石灰、滤膜等。

在一个实施方案中，本发明的方法中的反应条件可以包括：温度为25-40℃，优选为30-39℃，更优选为35-38℃。反应体系的pH为6.0-8.5，优选为pH 7.0-8.0，更优选为pH7.5-7.8。

如上所述，烟酸或其衍生物的单核苷酸可以用作各种有价值的生物产物的中间体或者前体。因此，本发明还提供了一种制备生物产物的方法，包括下列步骤：

(i)采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸；以及

(ii)利用生成的烟酸或其衍生物的单核苷酸作为中间体制备所述生物产物。

生物产物可以选自烟酰胺核苷或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、烟酸核苷或其任何盐分的衍生物、烟酸腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物中的至少一者。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将烟酰胺和烟酸混合使用，并且在酶反应后可同时产得β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸。

在一个实施方案中，本发明制备的方法生产的β-烟酰胺单核苷酸和/或烟酸单核苷酸可以使用为中间体以生物酶法或化学合成化的方法进一步转化合成得到烟酸核糖、烟酸腺苷二核苷酸、磷酸烟酸腺苷二核苷酸、烟酰胺核糖、还原型和氧化型烟酰胺腺苷二核苷酸和还原型和氧化型磷酸烟酸腺苷二核苷酸中的至少一者。

为了进行本发明的反应，可以将所述的固定化细胞和固定化酶置于固定化反应装置中，以进行固定化反应。例如，可按照中国专利申请CN106032520A记载的步骤进行所述固定化反应。

固定化反应装置可以包括具有入口和出口的柱状反应器、反应调控罐、高流量水泵、pH调控装置与pH探头、温度调控装置与温度探头。

在一个具体例子中，本发明的方法可以包括：首先以多聚酶链式反应从生物酶所属的菌种进行重组酶蛋白合成并于大肠杆菌HB101中进行表达，将该菌体以细胞破碎机进行破碎和离心后取得酶上清液并且以其破碎液或上清酶液制备固定化酶/细胞；在反应罐中进行100ml反应溶液配置，当中加入1.21g三羟甲基氨基甲烷、90mg D-葡萄糖(食用葡萄糖)、406mg的六水氯化镁、667mg的多聚磷酸盐、242mg烟酰胺和605mg三磷酸腺苷二钠盐，加入80ml纯水后以0.1M盐酸/氢氧化钠调节至pH 7.5-7.8；反应溶液维持在37℃和pH 7.5并加入20g沸石进行搅拌，同时加入1ml聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶上清酶液、1ml葡萄糖-6-磷酸异构酶上清酶液混合、2ml己酮糖6-磷酸异构酶上清酶液、2ml己酮糖6-磷酸合酶上清酶液、2ml核糖5-磷酸异构酶上清酶液、0.5ml磷酸核糖二磷酸激酶上清酶液和0.5ml烟酰胺磷酸核糖转移酶上清酶液和0.5ml多聚磷酸激酶上清酶液、0.25ml腺苷酸激酶上清酶液和0.25ml聚磷酸-AMP磷酸转移酶上清酶液，以附件2的高效液相色谱分析反应液中β-烟酰胺单核苷酸的浓度变化，反应3小时后β-烟酰胺单核苷酸的浓度达至2mM，而4小时的样本中浓度变化不大，可以结束酶反应，以中速滤纸将沸石过滤后得含有β-烟酰胺单核苷酸溶液。

当以D-果糖为的方法的原材料时，反应溶液的配置和组合有变化外，反应设备则保持不变。反应罐中进行100ml反应1溶液配置，当中加入1.21g三羟甲基氨基甲烷，90mg D-果糖、406mg的六水氯化镁、667mg的多聚磷酸盐、242mg烟酰胺和605mg三磷酸腺苷二钠盐，加入80ml纯水后以0.1M盐酸/氢氧化钠调节至pH 7.5-7.8；反应溶液维持在37℃和pH 7.5并加入20g沸石进行搅拌，同时加入1ml己糖激酶上清酶液和1ml多聚磷酸激酶上清酶液混合、2ml己酮糖6-磷酸异构酶上清酶液、2ml己酮糖6-磷酸合酶上清酶液、2ml核糖5-磷酸异构酶上清酶液、0.5ml磷酸核糖二磷酸激酶上清酶液和0.5ml烟酰胺磷酸核糖转移酶上清酶液和0.5ml多聚磷酸激酶上清酶液、0.25ml腺苷酸激酶上清酶液和0.25ml聚磷酸-AMP磷酸转移酶上清酶液，以附件2的高效液相色谱分析反应液中β-烟酰胺单核苷酸的浓度变化，反应3小时后β-烟酰胺单核苷酸的浓度达至1.8mM，而4小时的样本中浓度变化不大，可以结束酶反应，以中速滤纸将沸石过滤后得含有β-烟酰胺单核苷酸溶液。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。

例子

以下例子中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明，否则所述百分比为重量百分比。

下列例子中所用材料和设备的描述如下：

反应调控罐：来自基因港(香港)生物科技有限公司，BR-1L；

可调节流量式吸水泵：购自SURGEFLO公司，FL-32；

酸碱度调控装置：来自基因港(香港)生物科技有限公司，AR-1；

LB培养基:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

IPTG:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

氨苄青霉素:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

葡萄糖-6-磷酸钠盐:购自Merck,USA；

果糖-6-磷酸二钠盐：购自Merck,USA；

己酮糖6-磷酸:来自基因港(香港)生物科技有限公司；

核酮糖5-磷酸钠盐:购自Merck,USA；

核糖5-磷酸二钠盐:购自Merck,USA；

甘露糖6-磷酸钠盐:购自Merck,USA；

磷酸核糖二磷酸五钠盐:购自Merck,USA；

单磷酸腺苷二钠盐：购自Merck,USA；

二磷酸腺苷钠盐：购自Merck,USA；

腺苷:购自Merck,USA；

六水氯化镁：购自Merck,USA；

多聚磷酸纳：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

三羟甲基氨基甲烷：购自Merck,USA；

三磷酸腺苷二钠盐：购自Merck,USA；

D-葡萄糖一水：购自购自Merck,USA；

D-果糖:购自购自Merck,USA；

D-甘露糖:购自Merck,USA；

麦芽糖:购自Merck,USA；

蔗糖:购自Merck,USA；

烟酰胺：购自Merck,USA；

烟酸：购自Merck,USA；

制备例1：制备聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)

基于Mycobacteroides abscessus基因组中的编码聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的DNA序列STZ38851.1(SEQ3)设计PCR引物，具体为

上游引物PGPT1：

5’-CTGACCGGATCCATGACAGCCACCGACTCCGCACCG-3'(SEQ1)

下游引物PGPT2：

5'-TATGCGGAATTCCTAAGGCGAAACGCCAGCGTGTGC-3'(SEQ2)

以分枝杆菌(Mycobacteroides abscessus)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-PGPT。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的大肠杆菌细胞1.22kg。将所得含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液；上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图1所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5,10mM多聚磷酸盐(n＝3-20)，5mM D-葡萄糖)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱方法对样本中在酶反应中所产生的进行葡萄糖-6-磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活为约0.22nmol/min/mg。

制备例2：制备葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)

基于大肠肝菌(Escherichia colis)基因组中的编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的DNA序列KXG93161.1(SEQ6)设计PCR引物，具体为

葡萄糖-6-磷酸异构酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物G6PI1：

5’-CTGACCGGATCCATGAAAAACATCAATCCAACGCAG-3'(SEQ4)

下游引物G6PI2：

5'-TATGCGGAATTCTTAACCGCGCCACGCTTTATAGCG-3'(SEQ5)

以大肠肝菌(Escherichia colis)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得葡萄糖-6-磷酸异构酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-G6PI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到葡萄糖-6-磷酸异构酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含葡萄糖-6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞1.07kg。将所得含葡萄糖-6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图2所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了葡萄糖-6-磷酸异构酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM葡萄糖-6-磷酸钠盐)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行果糖-6-磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.24nmol/min/mg。

制备例3：制备己糖激酶(EC 2.7.1.1)

基于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)基因组中的编码己糖激酶的DNA序列EEZ28043.1(SEQ9)设计PCR引物，具体为

己糖激酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物FHK-1：

5’-CTGACCGGATCCATGGAGAAGAATATTTTCAAACTG-3'(SEQ7)

下游引物FHK-2：

5'-TATGCGGAATTCTCAGGATAATGCCGCAATCCCCGT-3'(SEQ8)

以脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得己糖激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-FHK。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到己糖激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含己糖激酶的大肠杆菌细胞1.55kg。将所得含己糖激酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图3所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了己糖激酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，10mM D-果糖，5mM三磷酸腺苷二钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱方法对样本中在酶反应中所产生的进行果糖-6-磷酸含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.18nmol/min/mg。

制备例4：制备己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)

基于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组中的编码己酮糖6-磷酸异构酶的DNA序列AOR96716.1(SEQ12)设计PCR引物，具体为

己酮糖6-磷酸异构酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物6P3HI-1：

5’-CTGACCGGATCCATGAAAACGACTGAATACGTAGCG-3'(SEQ10)

下游引物6P3HI-2：

5'-TATGCGGAATTCCTATTCAAGGTTTGCGTGGTGAGT-3'(SEQ11)

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得己酮糖6-磷酸异构酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-6P3HI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到己酮糖6-磷酸异构酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含己酮糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞1.57kg。将所得含己酮糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图4所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了己酮糖6-磷酸异构酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM果糖-6-磷酸二钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行己酮糖6-磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.12nmol/min/mg。

制备例5：制备己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)

基于枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)基因组中的编码己酮糖6-磷酸合酶的DNA序列ARW30002.1(SEQ15)设计PCR引物，具体为

己酮糖6-磷酸合酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物3H6PS-1：

5’-CTGACCGGATCCATGGAATTACAGCTTGCATTAGAC-3'(SEQ13)

下游引物3H6PS-2：

5'-TATGCGGAATTCTTATCCTTGGACAATCAGCTGCTT-3'(SEQ14)

以枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得己酮糖6-磷酸合酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-3H6PS。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到己酮糖6-磷酸合酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含己酮糖6-磷酸合酶的大肠杆菌细胞1.91kg。将所得含己酮糖6-磷酸合酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液。上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图5所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了己酮糖6-磷酸合酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM己酮糖6-磷酸，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行核酮糖5-磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.07nmol/min/mg。

制备例6：制备核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)

基于大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中的编码核糖5-磷酸异构酶的DNA序列QNS47947.1(SEQ18)设计PCR引物，具体为

上游引物R5PI-1：

5’-CTGACCGGATCCATGACGCAGGATGAATTGAAAAAA-3'(SEQ16)

下游引物R5PI-2：

5'-TATGCGGAATTCTCATTTCACAATGGTTTTGACACC-3'(SEQ17)

以大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得核糖5-磷酸异构酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-R5PI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到核糖5-磷酸异构酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含核糖5-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞1.02kg。将所得含核糖5-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图5所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了核糖5-磷酸异构酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM核酮糖5-磷酸钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行核糖5-磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.16nmol/min/mg。

制备例7：制备磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)

基于大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中的编码磷酸核糖二磷酸激酶的DNA序列KXG95745.1(SEQ21)设计PCR引物，具体为

磷酸核糖二磷酸激酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物PPDK-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCCTGAGGTTCTTCTCGTGCCT-3'(SEQ19)

下游引物PPDK-2：

5'-TATGCGGAATTCTTAGTGTTCGAACATGGCAGAGAT-3'(SEQ20)

以大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得磷酸核糖二磷酸激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-R5PI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到磷酸核糖二磷酸激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含磷酸核糖二磷酸激的大肠杆菌细胞1.67kg。将所得含磷酸核糖二磷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图7所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了磷酸核糖二磷酸激酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，10mM核糖5-磷酸二钠盐，5mM三磷酸腺苷二钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行磷酸核糖二磷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.14nmol/min/mg。

制备例8：制备烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)

基于吡啶菌(Rhodococcus pyridinivorans)基因组中的编码烟酰胺磷酸核糖转移酶的DNA序列RKE26735.1(SEQ24)设计PCR引物，具体为

烟酰胺磷酸核糖转移酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物NAMPT-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCCCACTATCTCGGGATTCGAC-3'(SEQ22)

下游引物NAMPT-2：

5'-TATGCGGAATTCTCAGGCAGGCACCGCGGCGCTGTC-3'(SEQ23)

以吡啶菌(Rhodococcus pyridinivorans)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得烟酰胺磷酸核糖转移酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-R5PI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到烟酰胺磷酸核糖转移酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含烟酰胺磷酸核糖转移酶的大肠杆菌细胞1.22kg。将所得含烟酰胺磷酸核糖转移酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图8所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了烟酰胺磷酸核糖转移酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM磷酸核糖二磷酸五钠盐，10mM烟酰胺，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件2的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.09nmol/min/mg。

制备例9：制备辅助组合的多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.B2)

基于约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)基因组中的编码多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的DNA序列BAC76403.1(SEQ27)设计PCR引物，具体为

多聚磷酸-AMP磷酸转移酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物PAP1-1：

5’-CTGACCGGATCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGT-3'(SEQ25)

下游引物PAP1-2：

5'-TATGCGGAATTCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTTT-3'(SEQ26)

以约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得多聚磷酸-AMP磷酸转移酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-PAP1。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到多聚磷酸-AMP磷酸转移酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的大肠杆菌细胞1.01kg。将所得含多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图9所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM磷酸核糖二磷酸，10mM单磷酸腺苷二钠盐，5mM多聚磷酸盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件2的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行二磷酸腺苷分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.12nmol/min/mg。

制备例10：制备腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)

基于杀螟硫磷降解菌(Burkholderia sp.MR1)基因组中的编码腺苷酸激酶的DNA序列KIG05708.1(SEQ30)设计PCR引物，具体为

腺苷酸激酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物AK-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCGTTTGATCCTGTTGGGCGCG-3'(SEQ28)

下游引物AK-2：

5'-TATGCGGAATTCTTACTTCAATGCCTCGAACACGCG-3'(SEQ29)

以杀螟硫磷降解菌(Burkholderia sp.MR1)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得腺苷酸激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-AK。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到腺苷酸激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含腺苷酸激酶的大肠杆菌细胞1.33kg。将所得含腺苷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图10所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了腺苷酸激酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM腺苷，10mM三磷酸腺苷二钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件2的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行單磷酸腺苷分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.48nmol/min/mg。

制备例11：制备多多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)

基于陶厄氏菌属细菌(Thauera sp.28)基因组中的编码多多聚磷酸激酶的DNA序列ENO92539.1(SEQ33)设计PCR引物，具体为

多多聚磷酸激酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物PPK2-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCCCCAGTTCAATCGCACCTCC-3'(SEQ31)

下游引物PPK2-2：

5'-TATGCGGAATTCTCAGCTGCTGGCTGCGAGCTCATT-3'(SEQ32)

以陶厄氏菌属细菌(Thauera sp.28)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得多多聚磷酸激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-PPK2。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到多多聚磷酸激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含多多聚磷酸激酶的大肠杆菌细胞1.11kg。将所得含多多聚磷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml上清酶液中含0.2g细胞。如图11所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了多多聚磷酸激酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，10mM二磷酸腺苷钠盐，5mM多聚磷酸盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行三磷酸腺苷含量分析。根据上述方法本上清酶液的酶活约为0.03nmol/min/mg。

制备例12：制备甘露糖激酶(EC 2.7.1.7)

基于玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)基因组中的编码甘露糖激酶的DNA序列AWV22863.1(SEQ36)设计PCR引物，具体为

甘露糖激酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物MK-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCGCATCAAGCTTGGCGTGGAT-3'(SEQ34)

下游引物MK-2：

5'-TATGCGGAATTCTCAGCCGCGGTCCCAGAGCCGGGC-3'(SEQ35)

以玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得甘露糖激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-MK。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到甘露糖激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含甘露糖激酶的大肠杆菌细胞1.36kg。将所得含甘露糖激酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。如图12所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了甘露糖激酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM甘露糖，10mM三磷酸腺苷二钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行甘露糖6-磷酸分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.14nmol/min/mg。

制备例13：制备甘露糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.8)

基于大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中的编码甘露糖-6-磷酸异构酶的DNA序列BCA74065.1(SEQ39)设计PCR引物，具体为

甘露糖-6-磷酸异构酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物M6PI-1：

5’-CTGACCGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCAGTG-3'(SEQ37)

下游引物M6PI-2：

5'-TATGCGGAATTCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGC-3'(SEQ38)

以大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得甘露糖-6-磷酸异构酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-M6PI。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到甘露糖-6-磷酸异构酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含甘露糖-6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞0.78kg。将所得含甘露糖-6-磷酸异构酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。如图13所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了甘露糖-6-磷酸异构酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，10mM甘露糖6-磷酸钠盐，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行果糖6-磷酸分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.21nmol/min/mg。

制备例14：制备麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)

基于Aurantimicrobium minutum基因组中的编码麦芽糖酶的DNA序列BAV00088.1(SEQ42)设计PCR引物，具体为

麦芽糖酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物MALT-1：

5’-CTGACCGGATCCATGGTTGAAAAAGAGTGGTGGCGT-3'(SEQ40)

下游引物MALT-2：

5'-TATGCGGAATTCCTAGACCAACCACACCGCAGTAGC-3'(SEQ41)

以Aurantimicrobium minutum的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得麦芽糖酶酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-MALT。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到麦芽糖酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得到含麦芽糖酶的大肠杆菌细胞0.78kg。将所得含麦芽糖酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。如图14所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了麦芽糖酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM麦芽糖，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行葡萄糖分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.08nmol/min/mg。

制备例15：制备蔗糖酶(EC 3.2.1.26)

基于屎肠球菌(Enterococcus faecium)基因组中的编码蔗糖酶的DNA序列QQJ91524.1(SEQ45)设计PCR引物，具体为

麦芽糖酶序列设计PCR引物，具体为

上游引物SUC-1：

5’-CTGACCGGATCCATGGTTGAAAAAGAGTGGTGGCGT-3'(SEQ43)

下游引物SUC-2：

5'-TATGCGGAATTCCTAGACCAACCACACCGCAGTAGC-3'(SEQ44)

以屎肠球菌(Enterococcus faecium)的DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得麦芽糖酶酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-SUC。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到蔗糖酶酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得到含蔗糖酶的大肠杆菌细胞0.78kg。将所得含蔗糖酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液:上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。如图15所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了蔗糖酶的合成。

根据其酶法反应对细胞进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBSpH 7.5，5mM蔗糖，20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的进行葡萄糖分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.06nmol/min/mg。

制备例16：制备5’-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)

基于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)基因组中的编码5’-核苷酸酶的DNA序列AVB07708.1(SEQ48)设计PCR引物，具体为

上游引物NUCL1：

5’-CTGACCGGATCCATGAAAGTAAAACTGCTTGCTGCC-3'(SEQ46)

下游引物NUCL2：

5’-TATGCGGAATTCTTACTTCTTCACATCCGCAACGCG-3'(SEQ47)

以肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的基因组DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得5’-核苷酸酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoR I处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-USHA。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到5’-核苷酸酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞1.55kg。将所得含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞配制成上清酶液：上清酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10，000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。如图16所示，SDS-PAGE凝胶电泳测试证实了5’-核苷酸酶的合成。

根据其酶法反应对该上清酶液进行酶活力检测，根据其酶法反应对该酶液进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBS pH 7.5,10mMβ-烟酰胺单核苷酸)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的烟酰胺核苷进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.62nmol/min/mg。

实施例1:使用D-葡萄糖(食用葡萄糖)以酶组合的酶上清液进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按制备例制备各种所属的酶上清液并按下表1的比例进行混合成100ml备用。

表1

生物酶	各种酶的上清酶液的总蛋白重量与总混合上清酶液的总蛋白重量对比
		聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶	1
葡萄糖-6-磷酸异构酶	1
		<u>6-磷酸己酮糖</u>异构酶	4
己酮糖6-磷酸合酶	4
		核糖5-磷酸异构酶	4
磷酸核糖二磷酸激酶	1
		烟酰胺磷酸核糖转移酶	1
多多聚磷酸激酶	2
		腺苷酸激酶	1
聚磷酸-AMP磷酸转移酶	1

使用2L反应器配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷、990mg食用葡萄糖、4.1g的六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH7.5，以纯水定容到1L并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-20rpm的搅拌下同时加入100ml上述制备的上清酶液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2的方法分析β-烟酰胺单核苷酸含量分析的高效液相分析的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析；反应在3hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量已达至3.3mM(见下表2)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表2

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	1.2
120	2.8
		180	3.3

实施例2:使用D-果糖以酶组合的上清酶液进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按制备例制备D-果糖组合、核心组合和辅助组合中所属的酶上清液并按下表3的比例进行混合得混合上清酶液各100ml备用。

表3

生物酶	各种酶的上清酶液的总蛋白重量与总混合上清酶液的总蛋白重量对比
		己糖激酶	1
多聚磷酸激酶	2
		6-磷酸己酮糖异构酶	4
己酮糖6-磷酸合酶	4
		核糖5-磷酸异构酶	4
磷酸核糖二磷酸激酶	1
		烟酰胺磷酸核糖转移酶	1
多聚磷酸激酶	2
		腺苷酸激酶	1
聚磷酸-AMP磷酸转移酶	1

使用2L反应器配制反应溶液，在反应器内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷，900mgD-果糖、4.1g六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定容到1L并并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-2-rpm的搅拌下同时加入100ml上述制备的上清酶液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析；反应在3hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量达至3.4mM(参见下表4)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表4

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	1.7
120	3.2
		180	3.4

实施例3:使用D-葡萄糖(食用葡萄糖)以固定化酶进行混合酶组的酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法，在固相载体上按下表5的各组合中的上清酶液用量比例制备混合固定化酶；载体的形状皆为条形：长25cm、宽5cm、厚5mm，下表为各固定化酶成品的重量为32.6g。

表5

将上述制得的固定化酶载体安装于固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径4.5cm的均质圆柱体，重量为8.8g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合中国发明专利申请CN106032520A中松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序，其中反应调控罐容量为2L；高流量水泵是可调节流量式吸水泵，流速为0.5L/分钟；酸碱度调控装置采用0.1M盐酸/氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液泵的流量为每分钟1ml。

在反应调控罐中按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷、990mg食用葡萄糖、4.1g六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定溶至1L并并保温至溶液的温度稳定在37℃后加入沸石，将反应调控罐连接高流量水泵和装有混合各组口固定化酶的反应器中并启动反应，每30min取样一次，以附件2的高效液相色谱分析当中β-烟酰胺单核苷酸在反应溶液中的含量变化，经1.5hr的反应后，β-烟酰胺单核苷酸的浓度已达至3.3mM(见下表6)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。采用固定化酶有多个便利工业生产和降低成本的好处：固定化酶可以在不增加液体溶量的情况下增加酶的使用量，对增加反应速度和提升转化率作用巨大，与此同时，固定化酶可以简便地多次重用，而且反应溶液中不会因含有大量蛋白而需要作多步的纯化工序。

表6

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		30	1.4
60	3.1
		90	3.3

实施例4:同时使用D-葡萄糖(食用葡萄糖)和D-果糖以混合酶组合的酶上清液进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按实施例1-12制备所属的酶上清液并按下表7的比例进行混合得100ml上清酶液备用。

表7

使用2L反应器配制反应溶液，在反应器内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷，495mg食用葡萄糖、450mg D-果糖、4.1g六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺

二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定溶至1L并并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-20rpm的搅拌下加入100ml的上清酶液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析。如表8所示，反应在3hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量达至2.3mM而在4hr时没有明显的增幅。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表8

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	0.9
120	1.7
		180	2.3
240	2.4

实施例5:使用麦芽糖以酶组合的上清酶液进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按制备例制备各种所属的酶上清液并按下表9的比例进行混合成100ml综合酶上清液备用。

表9

生物酶	各种酶的上清酶液的总蛋白重量与总混合上清酶液的总蛋白重量对比
		聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶	1
葡萄糖-6-磷酸异构酶	1
		<u>6-磷酸己酮糖</u>异构酶	4
己酮糖6-磷酸合酶	4
		核糖5-磷酸异构酶	4
磷酸核糖二磷酸激酶	1
		烟酰胺磷酸核糖转移酶	1
多聚磷酸激酶	2
		腺苷酸激酶	1
聚磷酸-AMP磷酸转移酶	1
		麦芽糖酶	2

使用2L反应器配制反应溶液，在反应器内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷，495mg麦芽糖、4.1g六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定容到1L并并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-2-rpm的搅拌下加入100ml综合酶上清液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析；反应在12hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量达至2.4mM(参见下表10)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表10

反应时间(hr)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		1	0
2	0
		3	0.2
4	0.28
		5	0.4
6	0.6
		7	0.8
8	1.4
		9	1.6
10	1.8
		11	2.2
12	2.4

实施例6:使用蔗糖以酶组合的上清酶液进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按制备例制备各种所属的酶上清液并按下表11的比例进行混合成100ml综合酶上清液备用。

表11

使用2L反应器配制反应溶液，在反应器内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷，495mg蔗糖、4.1g六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定容到1L并并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-2-rpm的搅拌下加入100ml综合酶上清液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析；反应在12hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量达至2.1mM(参见下表12)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表12

实施例7:使用D-葡萄糖(食用葡萄糖)以酶组合的酶上清液进行酶法反应制备β-烟酸单核苷酸

按制备例1-2和5-10制备各种所属的酶上清液并按下表13的比例进行混合成100ml综合酶上清液备用。

表13

生物酶	各种酶的上清酶液的总蛋白重量与总混合上清酶液的总蛋白重量对比
		聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶	1
葡萄糖-6-磷酸异构酶	1
		<u>6-磷酸己酮糖</u>异构酶	4
己酮糖6-磷酸合酶	4
		核糖5-磷酸异构酶	4
磷酸核糖二磷酸激酶	1
		烟酰胺磷酸核糖转移酶	1
多聚磷酸激酶	2
		腺苷酸激酶	1
聚磷酸-AMP磷酸转移酶	1

使用2L反应器配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷、990mg食用葡萄糖、4.1g的六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酸和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH7.5，以纯水定容到1L并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-20rpm的搅拌下同时加入100ml上述制备的上清酶液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2对该样进行β-烟酰胺单核苷酸含量分析；反应在3hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量已达至3.1mM(见下表14)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表14

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	1.4
120	2.7
		180	3.1

实施例8:使用D-葡萄糖(食用葡萄糖)以酶组合的酶上清液进行酶法反应制备β-烟酰胺核苷

按制备例制备各种所属的酶上清液并按下表15的比例进行混合成100ml综合酶上清液备用。

表15

使用2L反应器配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷、990mg食用葡萄糖、4.1g的六水氯化镁、12.2g多聚磷酸盐(n＝3-20)、1.2g烟酰胺和1.2g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH7.5，以纯水定容到1L并保温至溶液的温度稳定在37℃，在10-20rpm的搅拌下同时加入100ml上述制备的上清酶液和20g的沸石，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60min取样并以附件2对该样进行β-烟酰胺核苷含量分析；反应在3hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量已达至3.5mM(见下表16)。反应溶液从反应器中排出后使用中速滤纸过滤取去沸石后得β-烟酰胺单核苷酸溶液。

表16

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	1.6
120	2.7
		180	3.5

比较例1:使用常规生物酶法以核糖作为底物进行酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

使用2L反应器配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序加入12.1g三羟甲基氨基甲烷、990mg核糖、4.1g的六水氯化镁、1.21g烟酰胺和12.1g三磷酸腺苷二钠盐并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 7.5，以纯水定容到1L并保温至溶液的温度稳定在37℃，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，在10-20rpm的搅拌下按次序加入20mL的核糖5-磷酸激酶上清酶液，每30min取样并以附件1对该样进行核糖5-磷酸的含量检测；反应在60min的样本中能检测得到核糖5-磷酸的合成，此时可同时加入40ml的磷酸核糖二磷酸激酶上清酶液和40mL的烟酰胺磷酸核糖转移酶，每30min取样并以附件2对该样进行β-烟酰胺单核苷酸的含量检测；反应在180min的样本中开始检测得到β-烟酰胺单核苷酸的含量，在反应540min后，β-烟酰胺单核苷酸的含量已达至1.3mM(见下表17)并没有再显注增长，反应随之结束，反应溶液从反应器中排出。

以核糖为底物的常规生物酶法制备β-烟酰胺单核苷酸，需要比本发明的方法多用三磷酸腺苷二钠盐以作为磷酸组的供应和能量，因此在同等份量的三磷酸腺苷的反应中，本发明的方法可以在更短时间生产较多的β-烟酰胺单核苷酸，在生产时间和成本效益上较常规生物酶法更优。

表17

反应时间(min)	β-烟酰胺单核苷酸(mM)
		60	1.4
120	2.7
		180	3.1

本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种修改或改变。这些改变均在本发明要求保护的范围之内。

附件1:以高效液相分析糖类和其衍生物的含量的条件

色谱流出曲线:梯度

附件2:以高效液相分析烟酸或其衍生物的核苷和单核苷酸含量(例如β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺核苷、烟酸单核苷酸、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸核苷等)的条件

高效液相色谱分析方法

序列表

<110> 百瑞全球有限公司

<120> 烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的制备方法

<130> FI-205733-59:52

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgaccggat ccatgacagc caccgactcc gcaccg 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatgcggaat tcctaaggcg aaacgccagc gtgtgc 36

<210> 3

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacagcca ccgactccgc accggccgca accgcggcgg acccctccaa cacgcctcag 60

caggcgttcg gcatcgacgt cggcggcagt gggatcaagg gtgcgatcgt ggatctgacg 120

accggcgaga tggtcggcga gcgggtcaag taccccacac ctcagcccgc cacgccgaag 180

gctgtcgcag agaccattgc cagagtcgtg cgtgatttct cctggaccgg gcccgtcggt 240

gtgacgtacc ccggcgtgat cgtgcgcggc gaggcgcgca ccgccgccaa cgtcgacaaa 300

tcgtggctgg gcgtcaacgt ccacgacatc atcagcaccg aacttggggg tcaaaccgtc 360

accgtcctca acgatgccga tgccgccggg ctggccgagg accgatacgg cgcgggcaag 420

gatcagtcgg gtgtcgtggt cctgctgacg ttcggaaccg ggatcggctc tgccgtcctg 480

cacaacggaa tcctgttgcc caataccgag ttcggacata tccaggtgga cggcatggag 540

gccgagcacc gcgcggcgtc atcggtcaag gaaaagaacg actggagcta caagcagtgg 600

gcgcccgagg tcaccaaggt gctggaagcg gtcgagaacg cgctgtggcc ggatctgttc 660

atcgtgggcg gcggtatcag ccgcaaggcc gacaaatggg tgccgctgct gaccaaccgc 720

acacccgtcg tggccgctgc gctgcagaac accgcgggga tcgtcggcgc ggcgatggcc 780

gcacacgctg gcgtttcgcc ttag 804

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaccggat ccatgaaaaa catcaatcca acgcag 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatgcggaat tcttaaccgc gccacgcttt atagcg 36

<210> 6

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acagcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca agatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtact gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattctg gttgatggca aagatgttat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcggaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggctataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccgtaca tggtgactga agcactgcgt ccatacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttcc tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaaccatgac caacgcccac 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaga agcacgttgc gaaacacttt 720

gcggcgctct caaccaacgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt cggcggtcgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttctggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggcgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggaatccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaaggt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacct 1140

ggcacgaacg gtcagcacgc gttctatcag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tctttgctca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgcgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtgttcg aaggtaaccg cccgactaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga caaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgaccggat ccatggagaa gaatattttc aaactg 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tatgcggaat tctcaggata atgccgcaat ccccgt 36

<210> 9

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggagaaga atattttcaa actggacaat gaacaactga aaggaatcgc acacgcattc 60

cgggagaaag tggaagaggg attaaataag aataatgctg aaatacaatg tattcctacc 120

tttattttac ctaaggcgac cgatgttaaa ggcaaggctt tggttctgga cctgggaggt 180

accaactata gagtggcaat tgtcgatttc tcaaccgaaa agccaatcat ctatcccaat 240

aatggttgga agaaggatat gtcgattatg aagtcacccg gttatacccg tgaagagttg 300

ttcaaagagt tggccgacct gattgttgaa ataaagcggg aagaggaaat gcctatcggt 360

tattgttttt cttatccgac cgaatcgata ccgggaggcg atgcaagatt gcttcgttgg 420

accaaggggg tagacattcg ggaaatggtg ggacagtttg ttgggaaacc cttactcgac 480

tacctgaatg aaaaaaataa aatcagattt acaggagtta aagtgctgaa tgacacgatt 540

gccagtttat ttgccgggct taccgacaaa agctatgatg cttatattgg cctgattgta 600

gggacaggta caaatatggc aacttttatt ccgtctgaca agataacgaa gttggacccg 660

gaatgtcacg tacaaggctt gattccggtc aatctggaat cgggaaactt ttatcctccc 720

ttcctgactg cggtggacga tactgttgac gcaacttctg acagtttggg taaacagcgt 780

tttgagaaag cggtatccgg catgtatctg ggggatatcc tgaaagcagc tttccctttg 840

gaagaatttg aagagaaatt tgatgcaagg aaactgactg ctattatgaa ttatcctgat 900

atacacaaag atatctatgt tcaggtagcc cattggatct ataacagatc ggcccagctc 960

gtcgctgcct ctcttgccgg attaatcgca ttgctgaaat cgtataatcg agatatccat 1020

cggggttgtc tgattgccga gggcagtctt ttctggagtg aaagtcggaa agataaaaac 1080

tataatatcc ttgtaatgga gaaattgcag gaacttcttc gtgagcttga actggaagat 1140

gtcgaagttc atattaatag tatggataat gccaatctga taggaacggg gattgcggca 1200

ttatcctga 1209

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgaccggat ccatgaaaac gactgaatac gtagcg 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatgcggaat tcctattcaa ggtttgcgtg gtgagt 36

<210> 12

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaaaacga ctgaatacgt agcggaaatt ctcaatgagt tacacaattc agcagcttat 60

atttctaatg aagaggctga ccagcttgcc gatcacattc tgtcatccca ccaaattttc 120

accgcgggtg cgggtcggtc tggcctgatg gcaaaatcct tcgcgatgag actgatgcac 180

atgggcttca acgcccatat agtaggtgag attctcactc cgccgctcgc cgaaggagat 240

ctagttatta tcggctcagg atcaggcgag acaaagagct tgattcatac cgcagcaaaa 300

gcaaaaagct tacacggaat tgttgccgct ttaaccatca atccggaatc aagcgtcgga 360

aaacaagcgg acctcatcat cagaatgcct ggttctccta aagacccgtc aaacggaagc 420

tataaaacca ttcagccaat gggatcatta tttgaacaaa ctttgctgct attctatgat 480

gcagtgattt taaaactcat ggagaaaaaa ggactcgatt ctgaaactat gttcactcac 540

cacgcaaacc ttgaatag 558

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgaccggat ccatggaatt acagcttgca ttagac 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tatgcggaat tcttatcctt ggacaatcag ctgctt 36

<210> 15

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggaattac agcttgcatt agacctcgtc aacatcccgg aagccattga gctcgtcaaa 60

gaggtagaac aatacatcga cgtagttgaa atcggaacac cggtcgtcat caatgaaggc 120

ctaagagccg ttaaagaaat aaaagaagca tttcctcaat tgaaggttct tgcagacctg 180

aaaatcatgg atgccggagg ctacgaaatt atgaaagcgt cggaagcagg cgctgacatc 240

atcaccgttt taggggctac agacgatgca acgattaaag gcgcagtaga agaagccaaa 300

aaacaaaaga agaaaatctt agtggacatg attaacgtga aggatatcga atcccgtgcg 360

aaagaaattg acgcactcgg tgttgactac atctgcgtcc acactggcta tgatcttcaa 420

gcagagggca aaaactcttt cgaagaatta acgacaatca aaaataccgt aaaaaacgca 480

aaaaccgcaa tcgcgggcgg catcaaactt gatacactgc cagaagtgat caagcaaaac 540

cctgaccttg tcattgttgg gggcggaatt acaagcgcag ctgataaggc ggaaacagct 600

tcaaaaatga agcagctgat tgtccaagga taa 633

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgaccggat ccatgacgca ggatgaattg aaaaaa 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tatgcggaat tctcatttca caatggtttt gacacc 36

<210> 18

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgacgcagg atgaattgaa aaaagcagta ggatgggcgg cacttcagta tgttcagccc 60

ggcaccattg ttggtgtagg cacaggttcc accgccgcac actttattga cgcgctcggc 120

acgatgaaag gccagattga aggggccgtt tccagttcag atgcttccac tgaaaaactg 180

aaaagcctcg gcattcacgt ttttgatctc aacgaagtcg acagccttgg catctacgtt 240

gatggcgcag atgaaatcaa cggccacatg caaatgatca aaggcggcgg cgcggcgctg 300

acccgtgaaa aaatcattgc ttcggttgcg gaaaaattta tctgtattgc cgacgcctcc 360

aagcaggttg atattctggg caaattcccg ctgccagtag aagttattcc gatggcacgt 420

agtgcagtgg cgcgccagct ggtgaaactg ggcggtcgtc cggaataccg tcagggcgtg 480

gtgaccgata atggcaacgt gatcctcgac gtccacggca tggaaatcct tgacccgata 540

gcgatggaaa acgccataaa tgcgattcct ggcgtggtga ctgttggctt gtttgctaac 600

cgtggcgcgg acgttgcgct gattggcaca cctgacggtg tcaaaaccat tgtgaaatga 660

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgaccggat ccatgcctga ggttcttctc gtgcct 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tatgcggaat tcttagtgtt cgaacatggc agagat 36

<210> 21

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgcctgagg ttcttctcgt gcctgatatg aagctttttg ctggtaacgc caccccggaa 60

ctagcacaac gtattgccaa ccgcctgtac acttcactcg gcgacgccgc tgtaggtcgc 120

tttagcgacg gcgaagtcag tgtacaaatt aatgaaaatg tacgcggtgg tgatattttc 180

atcatccagt ccacttgtgc ccctactaac gacaacctga tggaattagt cgttatggtt 240

gatgccctgc gtcgtgcttc cgcaggtcgt atcaccgctg ttatccccta ctttggctat 300

gcgcgccagg accgtcgcgt ccgttccgct cgtgtaccaa tcactgcgaa agtggttgca 360

gacttcctct ccagcgtcgg tgttgaccgt gtgctgacag tggatctgca cgctgaacag 420

attcagggtt tcttcgacgt tccggttgat aacgtatttg gtagcccgat cctgctggaa 480

gacatgctgc agctgaatct ggataaccca attgtggttt ctccggacat cggcggcgtt 540

gtgcgtgccc gcgctatcgc taagctgctg aacgataccg atatggcaat catcgacaaa 600

cgtcgtccgc gtgcgaacgt ttcccaggtg atgcatatca tcggtgacgt tgcaggtcgt 660

gactgcgtac tggtcgatga tatgatcgac actggcggta cgctgtgtaa agctgctgaa 720

gctctgaaag aacgtggtgc taaacgtgta tttgcgtacg cgactcaccc gatcttctct 780

ggcaacgcgg cgaacaacct gcgtaactct gtaattgatg aagtcgttgt ctgcgatacc 840

attccgctga gcgatgaaat caaatcactg ccgaacgtgc gtactctgac cctgtcaggt 900

atgctggccg aagcgattcg tcgtatcagc aacgaagaat cgatctctgc catgttcgaa 960

cactaa 966

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctgaccggat ccatgcccac tatctcggga ttcgac 36

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tatgcggaat tctcaggcag gcaccgcggc gctgtc 36

<210> 24

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgcccacta tctcgggatt cgacaatctg atcctcaaca ccgataccta caagcattgc 60

caccacactc tctatcctca gggaaccgag tacgtctcca gctacgtcga atcgcgtggt 120

ggcatcttcc cggcgacgat gttcgtcgga ctgcaggcct acatccagga gcgcttgctc 180

cggccgatca ccctcgccga catcgatgag gccgaagcgg tgaccagggc gcaggggatg 240

cccttctgca gggagaactg gatgggcatc ctcaacgacc acggcggatt ccttcctgta 300

gagatcgagg cagtccccga ggggactgtg ctgcccaccc gcaatgtcct tgtgcaggtt 360

atcaacaccg atccgaagta ccactgggtg accagcttct tcgagaccgc gttgctgcga 420

gcggtgtggt acccgaccac gatcggaacg gtcagttgga tgtgcaagca gatcatcaag 480

gaagcgttcg ctcgcacctc ggacaatccg gatctgctgc gcttccagct gcacgattac 540

ggcgctcgcg gcgtgagctc ccaggaatct gctgcattgg gtggtctggc acacctggtc 600

aacttcaacc agagtgacac ggtgccgggc atcctggctg cgatgaaata ctacaacgcg 660

gtgtgtccgg cgaactcggg cccgaacagc gagcatgcag gtttcacggc atggggccgg 720

gatcaggaag tcgacgctct tcgcaacatg atgaacacct accgcgatgc cggtgtggtg 780

ctgttgctga ccgactcgta cgaccatgag aacgctgtga agaacatcct cggcaaagaa 840

ctgaaggccg agatcgagaa cttcccgggc gtggtctgtg ctcgtccgga ctcgggcgac 900

cctgtgcagg tgaccgcgga taccgctgag tggctcatgg atgccttcgg ctatgaggtc 960

aactccaagg gattcaaggt tctgccccgg tatctgcggg tcgtccaggg cgacggcatc 1020

acgctcgata ccctgtcgga gatctacatg gaactcgaac gccggggcat ggcggcagag 1080

aacgcgattt tcggtatggg cggcggtctg ctccagcact tcaaccgaga cacgttgaac 1140

ttcgggcaga agtgcaacgc tgtgcgagtc aacggtgaat ggcgcgatgt ggccaagcag 1200

ccgaccgggg cgagcttcaa ggtgtccaag gccggccgtc tcgccctcgt caagcgggat 1260

ggtgagtacc gcacggtgcg acgcgactcg gtttctcccg aggagaacct ccttcagccg 1320

gtgtaccgca acggcaagct cctgaagaag tgggatttct ccgagctgat cgagcggagc 1380

gaggcggagg tccccgagga gtactactac cccgtcatcg aacagatgcg tgcgcaggac 1440

agcgccgcgg tgcctgcctg a 1461

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctgaccggat ccatggatac agaaacgatc gccagt 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tatgcggaat tcttaatccg tgtcgcgatc cgcttt 36

<210> 27

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atggatacag aaacgatcgc cagtgcagtg ctgaatgaag aacagctttc actggactta 60

attgaagcgc aatatgcgtt gatgaatacc cgtgatcaga gcaatgcaaa aagtttagtg 120

attttggtca gtggaatcga acttgcgggt aaaggcgaag cggtgaaaca gctccgcgaa 180

tgggtcgatc ctcgtttttt atatgtcaaa gccgatccac cgcatctgtt taatctaaaa 240

cagccttttt ggcagcccta tacccgattt gtgcctgccg aagggcaaat tatggtgtgg 300

tttggtaatt ggtatgggga tttgttggct acggccatgc atgcttcaaa gcctttagat 360

gacactttgt ttgatgaata cgtcagcaat atgcgggctt ttgaacagga cttaaaaaat 420

aacaacgtag atgtcttaaa agtttggttc gatttgtcgt ggaagtctct gcaaaagcgt 480

ctagatgata tggacccgag cgaagtgcat tggcataagt tgcatgggct agactggcgc 540

aataaaaaac aatatgacac cttacaaaag ctacgtacgc gcttcaccga tgactggcaa 600

atcattgatg gtgaagatga ggatttgcgt aatcacaatt ttgcacaagc aattttaacg 660

gcactacgac actgcccaga gcatgaaaaa aaggccgcgc taaaatggca gcaagcacca 720

ataccagata ttctgactca gtttgaagtc cctcaagctg aggatgcgaa ctataaatca 780

gaattgaaaa aactcaccaa acaagtggcc gatgccatgc gctgtgatga ccgtaaagtg 840

gtgattgctt ttgaaggtat ggatgctgcg ggtaaagggg gggcgattaa gcgtattgtg 900

aaaaagctcg acccacgaga atatgaaatt cataccattg ccgcacctga aaaatatgag 960

ttacgccgtc cttatctgtg gcgtttttgg agcaaattgc agtcggatga catcactatt 1020

tttgatcgga cgtggtatgg acgcgtttta gtcgagcggg tagaaggctt cgcaaccgag 1080

gtagagtggc aacgcgctta tgcggaaatc aatcgttttg aaaaaaacct cagtagcagc 1140

caaaccgtgc tgattaagtt ttggctggcg attgataaag atgaacaagc agcgcgtttt 1200

aaagcccgcg aaagtactcc gcataaacgt tttaaaatta ccgaagaaga ttggcgcaat 1260

cgcgacaaat gggatgacta tttaaaggca gccgcggata tgtttgcgca taccgacacc 1320

agctatgcgc cttggtatat tatttccacc aatgataaac aacaggcccg cattgaagtc 1380

ttaagggcaa ttttaaaaca gctcaaagcg gatcgcgaca cggattaa 1428

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctgaccggat ccatgcgttt gatcctgttg ggcgcg 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tatgcggaat tcttacttca atgcctcgaa cacgcg 36

<210> 30

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atgcgtttga tcctgttggg cgcgcccggc gcgggcaagg gcacccaggc aaacttcatc 60

aaggagaaat tcggcatccc gcagatttcg acgggcgaca tgctgcgcgc ggccgtcaag 120

gcgggctcgc cactcggcgt cgaggcgaag cgcttcatgg atgcaggcga actcgtgccg 180

gatctgctca tcatcaatct ggtgaaagag cgtctgctcg aaagcgactg cacgaacggc 240

tatctgttcg acggttttcc gcgcaccatt ccgcaagcgg aagccatgaa gaacgccggc 300

gtcgtgatcg actacgtgct ggaaatcgac gttccgttcg acgagatcat cacgcgcatg 360

agcgggcgtc gcgtgcatgc ggcgtcgggc cggacgtatc acgtcaagtt caatccgccg 420

aagaacgaca tgctcgacga cgtcaccggc gaaccgctga tccagcgcga ggacgacaag 480

gaagaaacgg ttcgcaagcg tctcgacgtg tacgaagcgc agaccaagcc gctgatcgcc 540

tattacaacg actgggcgaa gagcggtccg tcgaatgggc tgaaggcgcc ggaatatcgc 600

cgcatttccg gcctcggcac cgtcgacgaa attcgcacgc gcgtgttcga ggcattgaag 660

taa 663

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctgaccggat ccatgcccca gttcaatcgc acctcc 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tatgcggaat tctcagctgc tggctgcgag ctcatt 36

<210> 33

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atgccccagt tcaatcgcac ctccatgcag tacccggccg atcatttcct caaccgcgaa 60

ctgtccctgc tgcaattcca gcgccgcgtc ctggcgcagg cggccgaccc gaccgttccc 120

ctgctcgaac gcctgcgttt cctgtgcatc gtgtcgagca atctcgatga gttcttcgag 180

atccgcgtct ccggcatcaa ggaacagatc cgtatcggca gccgaaagtc gggcgaggac 240

ggcatcacgc cgtccgacct gctcgcacgc gtcagcgacg aggtgcacga gatcatctcc 300

gagcagtacg aactgctcaa cgacgacatc ctgcccgcac tcgagaacga aggcgtagtt 360

ttcctgcgcc gcagcctatg gaccgaggcc cagcgtgact ggatcgagga ctacttcgtg 420

cgcgaggtga tgccggtcct gaccccggtc ggtctcgatc ctgcccaccc gttcccgcgt 480

gtgctcaaca agagcctgaa cttcgcggtc gagctcgaag gtcgcgacgc cttcggccgc 540

gactcgggtg ccgccatcgt gcaggcgccg cgtgcgctgc cgcgcgtgat caggctgccg 600

cgagaaattt caacgcagga gtacaccttc gtattcctgt cctcggtgct gcatgcccac 660

gttgccaggt tgtttgcagg catgcaggtg ctcggctgct accagttccg cgtcacccgc 720

aattccgacc tgttcgtgga tgaggaagag gtgaaggatc tgcgcgcatc gctcaagggc 780

gaactccagc agcgtcattt cggcgacgcg gtgcgccttg aggtggccga caactgctcg 840

gatgaaatgg ccagcttcct gctgcagcat tttcatctca cgcccagcga cctttatcgc 900

gcgcccggca tcgtcaacct cgtccgcctg atgcaggtac ccgactgggt cgagcgcgcc 960

gacctcaagt accaggcctt cgtgcccggc cttccgagag gtctcgacaa gcgccgccag 1020

atcttcacgg cgatccgcaa cggcgacatc ctgctccatc accctttcca gagcttcgcc 1080

ccggtcattg aaatgctgcg cgctgcggct gacgaccccc aggtgctggc gatcaagatg 1140

acggtgtacc ggaccgggac ggattcggtg ctcatggagc acctggcgcg cgcggcgcaa 1200

aagggcaagg aagtcaccgt cgtgctcgaa ctcatggcgc gcttcgacga agaggctaac 1260

atcactttgg ccaaccgcct cgaagaagtc ggcgcccatg tggtgtatgg cgtcttcggc 1320

tacaagaccc atgccaagct gctgatggtc gtgcgacgcg aggaagacgg tctgcgccac 1380

tacgtacatc tgggcacagg caactaccat ccgcgcacca cccgcttcta taccgacttc 1440

ggcctcatga cctgcaacaa ggagatcggc gaggacgtcg cagcggtctt tacccagctg 1500

accggacttg ggcgcgccac ggaactgcgc cacctctggc aagcaccgtt ttcgctccaa 1560

cccaacgtgg tggcggcgat tcgccgagaa gccgagatcg cccgcgccgg ccggcgcgga 1620

cgcatcatca ccaagatgaa cgccctgctc gagccggaaa cgatcgaggc gctctacgaa 1680

gcgtcgcaag ccggtgtcga ggtggacctg atcatccgtg gcccctgcgc gctgcgcccc 1740

ggcgtgcccg gcttgtcgga gaacatacgc gtgcgctcgg tcgtcgggcg tttcctggag 1800

caccaccgca tcttccactt ccacgctgac ggcgaagacc tggtgtacct gtccagcgcc 1860

gactggatgg accgcaactt cttccgtcgc atcgagatcg ccttcccggt gctggacccg 1920

cgcctgaagc gccgcgtgat gaaggaaggc ctgcgcccct acctcggcga caattgccag 1980

gcctgggaaa tgcagcccag cggcagctac cggcgcaagc atccgcgcag cgtacgccgt 2040

gcggcccagc tcatcctgct caatgagctc gcagccagca gctga 2085

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ctgaccggat ccatgcgcat caagcttggc gtggat 36

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tatgcggaat tctcagccgc ggtcccagag ccgggc 36

<210> 36

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

atgcgcatca agcttggcgt ggatctgggt ggcacgaaga cggagatcgt cgccctggac 60

gaggatggcc gcgtgcgcct tcgcaggcgc aggccgacac cccgggccta tgacgacatc 120

gtgaacaaca tcgccgcgct ggtggcggag gcgcaggcgg agttccaggg caccgatgcg 180

aggccgacca tcggcatcgg catcccgggc agcatcagcc cccataccgg cctggtgcgg 240

aacgccaaca cgcaggagat gaacgggcat ccgctcgacg tcgatctggc caatgccatc 300

ggccgcgagg tccgggtcat gaacgacgcc aactgcctgg cgatgagcga ggccgccgac 360

ggggcgggcc ggggctatcc ggtcgtcttc gcggtgatcc tgggcacggg ctgcggcgcc 420

ggcatcgtgg tgaacggcta tccgctggac ggtccgaacc ggatcgccgg cgaatggggg 480

cacacccccc tgccctggat gcgcgccgag gagatgccgg gcacccattg ctggtgcggc 540

aacccgaact gcctggagac ctatctttcc ggccccggcc tggccatcga cacctatggt 600

cccggccacc gggacgcctc cgcgatcggc gagcaggccg ccgccggcga tgccatcgcc 660

cgtgccgggc tggagcgcca cgccgaccgg ctggcccggg ccctggccaa cctgacgaac 720

atgctggacc cggacgtgat cgtgctcggc ggcggcgtct cgaatctgga acactgctac 780

cacgaggtgc cgcgcctgat ggaaccctgg atcttcgggg attctcgccg gatcaacatc 840

gtgcaggcga agcacgggga cagttcgggc gtcttcggcg ccgcccggct ctgggaccgc 900

ggctga 906

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctgaccggat ccatgcaaaa actcattaac tcagtg 36

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tatgcggaat tcttacagct tgttgtaaac acgcgc 36

<210> 39

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120

catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180

gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240

ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccgc tctccattca ggttcatcca 300

aacaaacgca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360

gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420

cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgag ttttccgaga ttgtctccct actccagcca 480

gtcgcaggtg cacatccggc aattgctcac tttttacaac agcctaatgc cgaacgttta 540

agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600

attttaaaat cggcgctcga cagtcagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660

tctgaatttt acccggaaga cagcggcctg ttctccccgc tgttactgaa tgtggtgaaa 720

ttgaatcctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780

gtggcgctgg aagtgatggc gaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaag 840

tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900

ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960

tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020

gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080

cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140

cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ctgaccggat ccatggttga aaaagagtgg tggcgt 36

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tatgcggaat tcctagacca accacaccgc agtagc 36

<210> 42

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

atggttgaaa aagagtggtg gcgttcctcc gttatttatc agatttaccc caggtccttt 60

gccgattcca acggtgatgg cattggtgat cttccgggaa ttacctcacg ccttcccaag 120

ctcaaagagc tgggtgttga tgctatttgg ctgtcaccat ttatgactag cccgcaaaaa 180

gatgccggat atgacgtcgc caactattgc gatgttgacc ccctgtttgg cacacttgca 240

gatttcgatg cacttgaggc ccgagcacac agtctcggtc tcaaagtgat tgtggattta 300

gttcccaacc actgctcttc cgagcaccca tggttcgttg aagctcttgc tgccggtgag 360

ggcagcacgg agcgcgctcg gtttatgttc cgggaaggaa aaggagaaaa cggagaactt 420

ccgcccaata actgggaatc tgtgtttggc ggtccggcat ggactcgaac caccaatcct 480

gacggaacac ctggacagtg gtatcttcac ctctttgatt ccagccaacc cgacttcgac 540

tggaccaacc cctgggtacg cgagcgcttc attgaaattc tgaagttctg gctcgaccgt 600

ggagttgacg gcttccgtgt tgatgttgca cacggacttt ctaaagcacc tgggcttcct 660

gatttccgcc gtgacgagga gtactggaac actcctcccg aggagcgcat cgacaacccc 720

tacttcggcc acgaaggtgt gcacgaaatc taccgagagt ggaacaaggt tcttgccgaa 780

taccccggcg agcgcatttt gtgtgccgag gcttttgtgg agcctttgac caagatggcc 840

ttgtgggttc gacctgatga aatgcagcag gccttcaact tccccttcct cgtcacacgc 900

tggaatggcg aacagatgcg tcaggttatc aaggattcca tctccgcttt tggcgaggtg 960

ggtgcaccaa gtacgtgggt gctctccaac catgaccagg tgcgacatgc cactcgatta 1020

gctctggacc ccaacaccaa caccgcagat cgcattaccg gtattggacc attgacggaa 1080

cccaagccag atccagcttt aggtcttgcc cgcgcgcgag cagcgtccgt gatgatgctc 1140

gctttgcctg gggttgcgta catgtatcag ggtgaagagc tgggtcttcc cgaagctgtt 1200

gatattcctg atgataaacg ccaagaccct acgttcttta gaacagctgg cgaatcctat 1260

ggtcgtgatg gctgccgcgt tcctcttcct tgggaagccg aagagacaaa ctatggtttt 1320

ggtcctgcgg gagaaccttg gttgcctcag cctgaggttt accgcgcgta ttctcgtgat 1380

ctcgaagaag cagaccctga ctcaacactg tcattgtata aagcagcgct agcggggcgt 1440

aaagagttgc gtcttggcga gggagacctg gagtggattg aaggaactcc cgagaacatt 1500

cttggtttcc gcaacagtga cgtcacggtg tttatcaact acagcgagga cgactttgct 1560

cttccagcgg gaaagatcat cctcgatagt gctgacagta gtgacgggat tctcaagcct 1620

gctactgcgg tgtggttggt ctag 1644

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ctgaccggat ccatggttga aaaagagtgg tggcgt 36

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tatgcggaat tcctagacca accacaccgc agtagc 36

<210> 45

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atgcaaaaaa ttttttacaa gcctaaagat ttttggtttg gggattgcat gcctttttat 60

aaagatggaa ctttttatct atttcatcaa cgagatacga gaaatcctaa acctttaact 120

gatccttttg ggtggtcact agttacaacc actgattttg tgaaatttga agaatacggg 180

gaagtaattc atcgtggtgg caacgatgac attgatcaat acatttacgc tggaagtatt 240

gtccaaggaa tcaatgagta tttagctttg tatactggac ataatcgcaa agctaagttg 300

gatggaaaaa cttcagaagt gttaatgatt gcaagttcta aagatttaat tcattggaaa 360

aaggatggcg aagcagcaaa acttgttcct caagaaggat atgataagaa tgattggcgc 420

gatccttttg caatttttga tcaagatcat ggaaaatacg ttttgatact aggagctaga 480

aaaccagcaa gtaagaaaaa gccgacgggg agattggtct attttgaatc cgaagattta 540

aaagattgga atttcaaagg agactactgg gctaataatg aatttaacat gattgaaatg 600

cctgatatat ttgaaattga tggaacgtgg tatttacttt tttcagagta ttgtgaagat 660

aaaaagacta aatatcgagt cggagcagga ttattttcag attggaaatc accagtagac 720

gaagctttcg acggaaaagc ctattatgca gcaagaacag tcggaactaa tgaaactggc 780

cgttttctaa ctggctgggt ggcaacaaaa gaaggggaga acgatcaaaa taactgggat 840

tggggcggtg cacttgttcc acatcaaatt attcaaaaga cagacaaaac tcttggtgtt 900

aaactgcctg aaaaaataat tgagaatttt aaagaaatca ctccattttc aagttttaag 960

ttagagaaag aatttggaaa aaaagaaaga gtaattgttc ctaaaatcga agattatttt 1020

ctatttgaaa caactttgac tattacatcg ttaacaaagg agtttgcttt aaaattattt 1080

gtagatagtg atactcaaga aggatacgaa tttcgtattt cattgattaa taatcagctt 1140

actttcggaa aaactccgaa ctatccttgg cctcaaatgt ttgataaggg gctgcaacga 1200

ccactatttt tggaaatagg caaagaatat gaactaaagt taattgttga tgatacgata 1260

gctgttttat atattgataa tgttgcttta agtactagaa tgtatgataa agtcggaaca 1320

gcattaagta tgactgttac ggagggagca atcaaggtag ataaactaga ctattcaata 1380

aattatgaat gtggatttta a 1401

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ctgaccggat ccatgaaagt aaaactgctt gctgcc 36

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tatgcggaat tcttacttct tcacatccgc aacgcg 36

<210> 48

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

atgaaagtaa aactgcttgc tgccggtatt ttgttcacgc tgccgttctg ggcctgcgcc 60

aaagatgtca ccattattta caccaacgat ctacacgccc atgtggagcc ttataaagta 120

ccgtggattg ctgacggtaa acgcgatatt ggcggttggg ccaatatcac tacgctggtg 180

aagcaggaaa aagccaaaaa taaggcgacg tggttttttg atgccggaga ttactttacc 240

ggaccgtata tcagcagcct gacgaagggt aaagcgatta tcgatatttt gaataccatg 300

cagtatgacg ctgccactat cggtaatcat gagttcgatc atggctggga caatacattg 360

ttgcaactga gccgagcaaa attccctatc gtgcagggca atatttttta tgaggacagc 420

agtaaatcct tctgggataa gccgtacacc attgttgaaa aagatggcgt caagattggc 480

gtaatcggct tacacggtgt ctttgctttt aatgatacgg tatccgccgc gacgcgcgtg 540

ggcattgagg cacgcgatga gattaagtgg ctgcaacgtt acattgatga acttaaaggt 600

aaagtcgatc tgaccgtcgc gctgatccac gaaggcaccc cggcccgcca gtccagcatg 660

gggaataccg atgtgcgacg cgcgctggat aaagatattc agaccgcaag tcaggtaaaa 720

gggctggata ttttgattac cggccacgcg catgtcggta cgccggaacc gattaaagtc 780

ggtaatacgc tgattctttc aacggacagc ggcggcattg atgtcggcaa attggtgctg 840

gactaccagg aaaagccgca tcagtttacc gtgaagaact tcgagctgaa gaccattttt 900

gctgatgagt ggaagccaga tccgcaaacg aaacaggtga tcgacggctg gaacaaaaag 960

ctcgataaag tcgtgcagca aacggtggcg cagtcgccgg ttgagctgac ccgcgcgtat 1020

ggcgaatcgt cgtcgctggg gaatctggcg gcggatgcgc tgctttttac ggcggggaaa 1080

gacacccagt tagcgcttac taactctggc ggtatccgca acgaaatccc ggctggcgcg 1140

gtgacgatgg gggcggtaat cagtaccttc ccgttcccta atgaactggt cacgatggat 1200

ttaaccggta aacaattgcg cagcctgatg gagcatggcg ctggcttaag caacggcgta 1260

ttgcaggtgt ctaaagggct ggagatgaag tatgacagca gcaaacctgt cggccagcgg 1320

gttaccgtgc tgacgctcaa tggcaagccg attgatgatg cggcggttta tcacatcgct 1380

accaacagct tccttgccga cggcggcgac ggttttgcgg cattcacgga aggccaggcg 1440

cggaatacct ccggcggcta ctatgtgtcg aatgcgatag tcgattactt taaggcgggc 1500

aacaccatca cggatgagca gctcaaagga atgcgcgttg cggatgtgaa gaagtaa 1557

Claims (23)

1.一种制备烟酸或其衍生物的单核苷酸的方法，包括下列步骤：采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述烟酸或其衍生物的单核苷酸选自β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸中的至少一者。

3.根据权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述己糖源来自具有六个碳原子的单糖、能够生成己糖的多糖或其混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的单糖选自D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-果糖或其混合物中的任意一者，优选为D-葡萄糖、D-甘露糖和D-果糖，更优选为D-葡萄糖和D-果糖。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述的己糖源来自通过糖苷键连接多种己糖单元的多糖，优选为蔗糖、麦芽糖、菊粉、棉子糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物，更优选为蔗糖、麦芽糖和棉子糖，更优选为蔗糖和麦芽糖。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述生物酶为单独的生物酶或者包含多种生物酶的生物酶组。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述反应的条件包括：温度为25-40℃，优选为30-39℃，更优选为35-38℃；并且/或者反应体系的pH为6.0-8.5，优选为pH 7.0-8.0，更优选为pH7.5-7.8。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述反应底物还包含辅助离子，辅助离子包含金属离子、氯离子、镁离子、钙离子、钾离子、钠离子、锌离子、氟离子、硫离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子以及含磷类离子中的至少一者，优选钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子和含磷类离子中的至少一者。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述磷酸供体选自ATP或其盐、ADP或其盐、AMP或其盐、CTP或其盐、GTP或其盐、UTP或其盐、ITP或其盐和多聚磷酸或其盐中的至少一者，优选ATP或其盐、ADP或其盐、AMP或其盐和多聚磷酸或其盐中的至少一者。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述磷酸供体可以为多聚磷酸或ATP或其盐，所述己糖源来自D-葡萄糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)；其中生物酶组中的聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶以多聚磷酸和D-葡萄糖为底物转化合成至葡萄糖-6-磷酸和多聚磷酸(n-1)，生物酶组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶以葡萄糖-6-磷酸为底物转化合成至果糖-6-磷酸，生物酶组中的己酮糖6-磷酸异构酶以果糖-6-磷酸为底物转化合成至阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯，生物酶组中的己酮糖6-磷酸合酶以阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸酯为底物转化合成至核酮糖-5-磷酸和甲醛，生物酶组中的核糖5-磷酸异构酶核酮糖-5-磷酸为底物转化合成至核糖-5-磷酸，生物酶组中的磷酸核糖二磷酸激酶以核糖-5-磷酸和磷酸供体为底物转化合成至5-磷酰核糖-1-焦磷酸和AMP，生物酶组中的烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化合成至β-烟酰胺单核苷酸和焦磷酸，或以烟酸为底物转化合成至烟酸单核苷酸和焦磷酸。

11.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述己糖源来自D-葡萄糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.5)、己糖激酶(EC2.7.1.1)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)。

12.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述己糖源来自D-果糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)。

13.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述己糖源来自D-甘露糖，并且所述生物酶为生物酶组，该生物酶组包含甘露糖激酶(EC 2.7.1.7)、甘露糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.8)、己酮糖6-磷酸异构酶(6EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶。

14.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述己糖源来自蔗糖、双糖麦芽糖、棉子糖、麦芽糊精和淀粉中的至少一者并且其中在生物酶催化反应之前，将所述己糖源用选自热、酸、碱中的至少一种方法水解蔗糖转化为选自D-葡萄糖、半乳糖、D-果糖和D-甘露糖中的至少一种单糖，然后将所述单糖投入反应底物中；或者

其中所述己糖源为蔗糖、双糖麦芽糖类、棉子糖、麦芽糊精和淀粉中的至少一者，并且直接使用生物酶组将包含所述己糖源和烟酸或其衍生物的核苷和反应底物转化为β-烟酰胺单核苷酸，其中所述生物酶组包含淀粉酶类(EC 3.2.1.1-3)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异麦芽糖酶(EC 3.2.1.10)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蔗糖酶(EC 3.2.1.26)、、蔗糖α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.48)、聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC2.7.1.63)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)、己酮糖6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.27)、己酮糖6-磷酸合酶(EC 4.1.2.43)、核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、磷酸核糖二磷酸激酶(EC 2.7.6.1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.12)中的至少一者。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述蔗糖包含白砂糖、黄砂糖、赤砂糖、绵白糖、单晶体冰糖、多晶体冰糖、红糖、黑糖、冰片糖、方糖、糖霜、液体糖浆中的至少一者；并且

所述双糖麦芽糖包含选自麦芽糖和异麦芽糖中的至少一者。

16.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中，所述生物酶包含ATP再生酶，ATP再生酶包含聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.B2)、多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)、腺苷激酶(EC 2.7.1.20)中的至少一者；并且其中所述方法还包括ATP再生步骤，该步骤包括：聚磷酸-AMP磷酸转移酶以多聚磷酸和AMP为底物转化生成ADP，多聚磷酸激酶以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP/ATP，以及腺苷激酶以两分子的ADP为底物转化生成ATP和AMP。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)包括II类和III类中的两组酶，其中使用II类的多聚磷酸激酶以多聚磷酸和ADP为底物转化生成ATP，使用III类的多聚磷酸激酶以多聚磷酸和AMP/ADP为底物转化生成ADP和ATP；在使用II类的多聚磷酸激酶时由AMP转化合成至ATP时还包括使用聚磷酸-AMP磷酸转移酶和/或腺苷激酶，并且在使用III类的多聚磷酸激酶时，所述方法还包括单独使用该酶由AMP转化合成至ATP。

18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其中，所述反应底物还包含多聚磷酸、腺苷和腺嘌呤中的至少一者，所述磷酸供体为ATP，所述生物酶包含ATP再生酶，并且ATP再生酶包含腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)中的至少一者，

其中所述方法还包括ATP再生步骤，该步骤包括：腺苷酸激酶先以一分子的腺苷和ATP为底物转化生成AMP和ADP，然后使用所述ATP再生酶以多聚磷酸为主要底物将AMP和ADP转化生成两分子的ATP或一分子的ADP和ATP；腺嘌呤磷酸核糖转移酶则以一分子的腺嘌呤和5-磷酰核糖-1-焦磷酸为底物转化生成一分子的AMP和磷酸，然后使用ATP再生酶组以多聚磷酸为主要底物将AMP转化生成ADP和ATP。

19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其中，所述反应底物还包含烟酰胺和烟酸中的至少一者，并且所述单核苷酸为β-烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸中的至少一者。

20.根据权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括在反应底物中添加出用于吸咐或分解甲醛的隋性物料的步骤，优选地所述惰性物料为沸石。

21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法，其中所生物酶组为重组酶，该重组酶在所属的菌种进行合成并于大肠杆菌HB101中进行表达和提取；

优选地，所述生物酶为选自细胞破碎液、上清酶液、纯酶和以任何方式制备的固定化酶/细胞中的至少一种形式。

22.一种制备生物产物的方法，包括下列步骤：

(i)采用包含己糖源和烟酸或其衍生物的反应底物，在磷酸供体的存在下，经生物酶催化反应生成烟酸或其衍生物的单核苷酸；以及

(ii)利用生成的烟酸或其衍生物的单核苷酸作为中间体制备所述生物产物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物产物选自烟酰胺核苷或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物、烟酸核苷或其任何盐分的衍生物、烟酸腺嘌呤二核苷酸或其任何盐分的衍生物和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其任何盐分的衍生物中的至少一者。

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