CN107815444A - 一种用于atp再生的底盘系统与应用 - Google Patents

一种用于atp再生的底盘系统与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于ATP再生的底盘系统与应用，所述用于ATP再生的底盘系统包括以下5个酶：α‑葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸转酮酶以及乙酸激酶，此外还可以包括以下7个酶：转醛醇酶、转酮醇酶、核糖‑5‑磷酸异构酶、核酮糖磷酸3‑差向异构酶、磷酸丙糖异构酶、果糖‑二磷酸醛缩酶以及果糖‑1,6‑二磷酸酶；所述底盘系统可以与需要ATP的酶催化反应耦合，利用淀粉或麦芽糊精为能源，不添加辅酶，一锅式反应高效低成本地再生ATP，是经济、高效、稳定、可持续的ATP再生系统。

Description

一种用于ATP再生的底盘系统与应用
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其是一种用于ATP再生的底盘系统与应用。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是一种高能磷酸化合物，它与二磷酸腺苷(ADP)的相互转化实现贮能和放能，从而保证了各种生物催化过程的能量供应。ATP不稳定，价格昂贵，不适合直接大量加入工业化酶反应生产过程，因此构建经济高效的ATP再生系统是酶催化领域关注的焦点之一。
根据使用的底物，ATP再生系统可分为转移高能磷酸键的反应系统和利用碳水化合物降解来产生能量的系统。含有高能磷酸键的化合物主要有磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、乙酰磷酸、磷酸肌酸和多聚磷酸盐。除多聚磷酸盐外，这类化合物价格高，在反应体系中容易被水解。低聚合度的多聚磷酸盐价格低廉，可以在多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase)的催化下，一步反应产生ATP，是近年来ATP再生的主要关注点。然而，使用这些含磷酸底物作为ATP的供体会导致反应体系中磷酸离子的积累，高浓度的磷酸离子容易与反应体系中的镁离子结合，生成沉淀，而镁离子是维持很多酶活性的关键辅因子，镁离子的浓度减少会导致反应体系中的酶失活。
另一方面，葡萄糖、麦芽糊精、淀粉等碳水化合物较为经济，在反应系统中相对稳定，是ATP再生的系统更为理想的能量来源。例如，在糖酵解途径中，每1mol葡萄糖可以生成2mol ATP。使用酿酒酵母自身的酵解途径作为ATP再生系统已被成功地用于很多生物合成反应，如谷胱甘肽、谷氨酰胺、茶氨酸等。但这类体内的ATP再生系统往往受到其他酶的干扰，对底物的利用率低。Calhoun和Swartz(Biotechnol Bioeng 2005 90:606-613)的对于无细胞蛋白表达系统的研究发现，使用葡萄糖作为能源物质时，通过控制反应过程中pH和磷酸盐的浓度，可以提升蛋白产量。Wang和Zhang(BMC Biotechnology 2009 9(1):58)以麦芽糊精为底物进行无细胞蛋白合成，每1mol葡萄糖当量能产生4molATP。但上述研究中的反应体系都需要辅酶CoA和NAD的参与，因此提升了目标产物的生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于ATP再生的底盘系统。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述用于ATP再生的底盘系统的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于ATP再生的底盘系统，包括以下5个酶：(1)α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucanphosphory lase,αGP,EC 2.4.1.1)，从淀粉或麦芽糊精上释放出葡萄糖1-磷酸；(2)磷酸葡萄糖变位酶(phosphog lucomutase,PGM，EC 5.4.2.2)，催化葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；(3)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI，EC 5.3.1.9)，催化葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸；(4)磷酸转酮酶(phosphoketolase,PKL，EC 4.1.2.22)，催化果糖6磷酸和无机磷生成乙酰磷酸，赤藓糖4-磷酸和水；(5)乙酸激酶(acetate kinase,AK，EC2.7.2.1)，将乙酰磷酸的高能磷酸基团转移到ADP，生成乙酸和ATP。
优选的，上述用于ATP再生的底盘系统，还包括碳重排(carbon rearrangement,CR)模块，所述碳重排模块由以下7个酶组成：(1)转醛醇酶(transaldolase,TAL，EC2.2.1.2)，催化果糖6-磷酸和赤藓糖4-磷酸生成甘油醛3-磷酸和景天庚酮糖7-磷酸；(2)转酮醇酶(transkelolase,TK，EC 2.2.1.1)，催化甘油醛3-磷酸和景天庚酮糖7-磷酸生成核糖5-磷酸和木酮糖5-磷酸，以及催化木酮糖5-磷酸和赤藓糖4-磷酸生成果糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸；(3)核糖-5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase,RPI，EC 5.3.1.6)，催化核糖5-磷酸转化为核酮糖5-磷酸；(4)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose-phosphate3-epimerase,RPE，EC 5.1.3.1)，催化核酮糖5-磷酸转化为木酮糖5-磷酸；(5)磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TIM，EC 5.3.1.1)，催化甘油醛3-磷酸转化为磷酸二羟丙酮；(6)果糖-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphatealdolase,ALD，EC 4.1.2.13)，催化甘油醛3-磷酸和磷酸二羟丙酮合成1，6-二磷酸果糖；(7)果糖-1,6-二磷酸酶(fructose1,6-bisphosphatase,FBP，EC 3.1.3.11)，催化1，6-二磷酸果糖水解为果糖6-磷酸和无机磷。
上述碳重排模块的作用是将磷酸转酮酶反应生成的副产物赤藓糖4-磷酸(E4P)重新转化为可被用于ATP再生的底物果糖6-磷酸(F6P)。
优选的，上述用于ATP再生的底盘系统，由α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucanphosphorylase,αGP)，磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase,PGM)，磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI)，磷酸转酮酶(phosphoketolase,PKL)，转醛醇酶(transaldolase,TAL)，转酮醇酶(transkelolase,TK)，核糖-5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase,RPI)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose-phosphate 3-epimerase,RPE)，磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TIM)，果糖-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase,ALD)，果糖-1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)，乙酸激酶(acetate kinase,AK)组成，各酶在体系中酶活单位的浓度比为：α-葡聚糖磷酸化酶：磷酸葡萄糖变位酶：磷酸葡萄糖异构酶：磷酸转酮酶：转醛醇酶：转酮醇酶：核糖-5-磷酸异构酶：核酮糖磷酸3-差向异构酶：磷酸丙糖异构酶：果糖-二磷酸醛缩酶：果糖-1,6-二磷酸酶：乙酸激酶＝2:2:2:2：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：2。
上述用于ATP再生的底盘系统的制备方法，具体步骤为：
(1)将系统中各种酶的基因克隆至pET载体中，然后将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，添加IPTG进行诱导表达；
(2)蛋白表达后，通过超声破碎或高压匀浆破碎大肠杆菌，获得粗酶液；
(3)粗酶液通过热处理或镍柱纯化的方式获得纯酶。
应用上述用于ATP再生的底盘系统进行ATP再生的方法，在HEPES缓冲盐体系和镁离子、锰离子、焦磷酸硫胺素(TPP)存在的条件下，向反应液中添加淀粉或麦芽糊精、无机磷、ADP为底物，进行ATP再生反应。
本发明的有益效果：
所述用于ATP再生的底盘系统，可以与需要ATP的酶催化反应耦合，利用淀粉或麦芽糊精为能源，不添加辅酶，一锅式反应高效低成本地再生ATP，是经济、高效、稳定、可持续的ATP再生系统，具体来讲：
(1)利用可被缓慢降解的淀粉或麦芽糊精作为底物，实现稳定、可持续的ATP再生；
(2)该ATP再生系统包含一系列热力学有利的反应，反应的中间产物积累少；
(3)当使用不含碳重排模块的ATP再生系统时，理论上每1mol葡萄糖当量可生成1mol ATP；
(4)体系中的碳重排模块能够提高ATP再生系统对底物的利用率，使用含有碳重排模块的ATP再生系统时，理论上每1mol葡萄糖当量可生成3molATP；
(4)含有碳重排模块的ATP再生系统的副产物仅为乙酸，反应体系可循环利用无机磷，目标产物的生产不受抑制，分离成本低；
(5)淀粉和麦芽糊精是经济的化合物，同时，本发明产生ATP的过程不需要辅酶(如NAD，NADP，CoA等)参与，目标产物生产成本低。
附图说明
图1为本发明所制备的用于ATP再生的酶和用于生产L-茶氨酸的酶的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。其中，αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；PKL，磷酸转酮酶；TAL，转醛醇酶；TK，转酮醇酶；RPI，核糖-5-磷酸异构酶；RPE，核酮糖磷酸 3-差向异构酶；TIM，磷酸丙糖异构酶；ALD，果糖-二磷酸醛缩酶；FBP，果糖-1,6-二磷酸酶；AK，乙酸激酶；GMAS，-谷氨酰甲胺合成酶(-Glutamylmethylamide synthetase)。
图2为本发明使用2种酶构建的简单的ATP再生底盘系统，与-谷氨酰甲胺合成酶组合，以果糖 6-磷酸和无机磷为能量来源进行ATP再生，并生产L-茶氨酸的催化途径示意图。其中，Pi，无机磷；F6P，果糖 6-磷酸；AcP，乙酰磷酸；Ac，乙酸；E4P，赤藓糖 4-磷酸。
图3为本发明使用含有9种酶的包含碳重排模块的ATP再生底盘系统，与-谷氨酰甲胺合成酶组合，以果糖 6-磷酸和无机磷为能量来源进行ATP再生，并生产L-茶氨酸的催化途径示意图。其中，G3P，甘油醛 3-磷酸；S7P，景天庚酮糖 7-磷酸；Xu5P，木酮糖 5-磷酸；R5P，核糖 5-磷酸；Ru5P，核酮糖 5-磷酸；DHAP，磷酸二羟丙酮；F1,6P，1，6-二磷酸果糖。
图4为本发明应用于L-茶氨酸(L-thean i ne)生产时，以果糖6-磷酸(F6P)代替麦芽糊精为底物，果糖6-磷酸和L-茶氨酸的浓度变化图。其中,without CR为不添加碳重排模块的ATP再生系统；with CR为含有碳重排模块的ATP再生系统。
图5为本发明使用5种酶构建的不含碳重排模块的ATP再生底盘系统，与-谷氨酰甲胺合成酶组合，以麦芽糊精和无机磷为能量来源进行ATP再生，并生产L-茶氨酸的催化途径示意图。其中，G1P，葡萄糖 1-磷酸；G6P，葡萄糖 6-磷酸。
图6为本发明使用含有12种酶的包含碳重排模块的ATP再生底盘系统，与-谷氨酰甲胺合成酶组合，以麦芽糊精和无机磷为能量来源进行ATP再生，并生产L-茶氨酸的催化途径示意图。
具体实施方式
(1)本发明所述ATP再生底盘系统所涉及的酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
(2)克隆ATP再生底盘系统的酶的基因，或进行基因合成。
(3)将基因克隆至pET载体中，构建基因重组表达载体。
(4)将构建好的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，添加I PTG进行诱导表达。
(5)离心收集菌体，进行超声破碎或高压匀浆破碎，离心后得到粗酶上清液。
(6)对热稳定性较好的酶的上清液进行热处理纯化；对常温酶的上清液进行镍柱纯化，用咪唑洗脱，得到纯酶。
(7)使用Bradford法对酶浓度进行测定。
(8)使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法对酶活性进行检测。将能在1分钟内完全转化1 μmole底物的酶量定义为1个活性单位(U)。
(9)酶法合成ATP。在HEPES缓冲盐体系和镁离子、锰离子、磷酸盐、焦磷酸硫胺素(TPP)存在的条件下，向反应液中添加ATP再生底盘系统的酶、以淀粉或麦芽糊精、无机磷、ADP为底物，催化进行ATP再生反应；淀粉或麦芽糊精也可以被ATP再生体系中的中间产物所代替，这些中间产物可以是葡萄糖1-磷酸，葡萄糖6-磷酸，或果糖6-磷酸。
(10)酶法合成L-茶氨酸。在HEPES缓冲盐体系和镁离子、锰离子、磷酸盐、焦磷酸硫胺素(TPP)存在的条件下，向反应液中添加ATP再生底盘系统的酶和-谷氨酰甲胺合成酶、以淀粉或麦芽糊精、无机磷、ADP、L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物，合成L-茶氨酸；淀粉或麦芽糊精也可以被ATP再生体系中的中间产物所代替，这些中间产物可以是葡萄糖1-磷酸，葡萄糖6-磷酸，或果糖6-磷酸。
(11)采用使用现有技术记载的HPLC测定方法对L-茶氨酸进行检测。
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1ATP再生体系所涉及到的酶以及用于生产L-茶氨酸的-谷氨酰甲胺合成酶的制备。
ATP再生底盘系统的酶的表达载体的构建：使用相应的基因组DNA(购于ATCC)为模板，利用PCR获取酶的基因，并通过简单克隆(Simple Cloning)的方法(You et al.ApplEnviron Microbiol 2012 78(5):1593-5)将基因分别克隆至pET载体(Novagen，Madison，WI)中，获得每个酶相应的表达载体。
-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays。按照Liu等人的方法(ProcessBiochemistry 2016 51(10):1458-63)制备表达载体gmas/pET21a后，用定点突变的方法去除gmas基因的终止子，获得C端带有组氨酸标签的GMAS的表达载体。定点突变所用引物如下：
正向引物：5’-CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATC-3’
反向引物：5’-GTAGAATTGAACATAGCGGTTGATTTCC-3’
将构建好的表达载体质粒转化于BL21(DE3)大肠杆菌中，挑菌后接种到LB培养基，37℃培养生长至OD600约为0.4-1.0后，以0.1mM-1mM的IPTG诱导，在18℃培养下进行胞内表达，16–20小时后收集菌体。
将收获的菌体重悬于pH 7.2的200mM HEPES缓冲液中，经超声或高压匀浆破碎后，离心收集上清。
对于具有热稳定性的酶(αGP，PGM，PGI，AK，TAL，TK，RPI，RPE，TIM，ALD，FBP)，将菌体破碎液上清置于70℃水浴中，热处理30分钟以纯化蛋白，离心后收集上清。
对于不能耐受高温的PKL和GMAS，使用金属螯合亲和色谱的方式进行纯化，将菌体破碎液上清加入镍NTA亲和层析介质(Ni-NTA)，以10–500mM浓度的咪唑梯度洗脱，经SDS-PAGE分析后，收集含有目的蛋白的洗脱样品，超滤除去咪唑。
酶纯化的结果如图1所示。
表1为本实施例所使用的用于ATP再生底盘系统的12种酶的相关信息。
实施例2以果糖6-磷酸和磷酸盐为能量来源进行ATP的再生，并生产L-茶氨酸。果糖6-磷酸是本发明中的ATP再生底盘系统的中间产物之一，可代替麦芽糊精作为ATP再生的能源底物。
在螺口瓶中配置1ml反应体系，体系包含pH 7.2的200mM HEPES缓冲液，5mM的pH为7.2的磷酸钠，10mM的氯化镁，0.5mM的氯化锰，1mM的焦磷酸硫胺素，1mM的ADP，30mM的谷氨酸钠，60mM的乙胺盐酸盐，5mM的果糖6-磷酸。实验组1为仅含有PKL，AK，GMAS酶的ATP再生系统(图2)，各酶在反应体系中的浓度(酶活单位的浓度)均为2U/ml。实验组2为添加碳重排模块的ATP再生系统，除含有相同浓度的上述3个酶之外，额外添加参与碳重排反应的TAL，TK，RPI，RPE，TIM，ALD，FBP(图3)，碳重排模块中的各酶在反应体系中的浓度(酶活单位的浓度)均为1U/ml。37℃反应0，1，3，6，24h时取样，在沸水中煮样5分钟终止反应。样品稀释2倍后，按照Liu等人的方法(Process Biochemistry 2016 51(10):1458-63)使用HPLC检测样品中的L-茶氨酸含量。使用酶法测定样品中底物果糖6-磷酸的消耗：首先向上述终止反应后的样品添加NAD+和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)，通过测量样品在340nm吸光度的增加，对样品中的葡萄糖6-磷酸含量进行测定，之后添加磷酸葡萄糖异构酶将样品中剩余的果糖6-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸并进行测定。
当使用不含有碳重排的ATP再生系统时，反应结束后，每1mol果糖6-磷酸最终转化为1mol L-茶氨酸(相当于生成1mol ATP)；当使用含有碳重排模块的ATP再生系统时，每1mol果糖6-磷酸最终转化为3mol L-茶氨酸(相当于生成3mol ATP)(图4)。以这两种ATP再生系统进行的L-茶氨酸的生产均达到100％理论得率。
实施例3以麦芽糊精和磷酸盐为能量来源进行ATP的再生，并生产L-茶氨酸。
在螺口瓶中配置1ml反应体系，体系包含pH 7.2的200mM HEPES缓冲液，5mM的pH为7.2的磷酸钠，10mM的氯化镁，0.5mM的氯化锰，1mM的焦磷酸硫胺素，1mM的ADP，30mM的谷氨酸钠，60mM的乙胺盐酸盐，含有6.3mM葡萄糖当量的麦芽糊精(DE 4-7)。实验组1为仅含有αGP，PGM，PGI，PKL，AK和GMAS的ATP再生系统(图5)，各酶在反应体系中的浓度均为2U/ml。实验组2为添加碳重排模块的ATP再生系统，除含有相同浓度的上述6个酶之外，额外添加参与碳重排反应的TAL，TK，RPI，RPE，TIM，ALD，FBP(图6)，碳重排模块中的各酶在反应体系中的浓度均为1U/ml。37℃反应0，1，3，6，8h时取样，在沸水中煮样5分钟终止反应。样品稀释2倍后，按照Liu等人的方法(Process Biochemistry 2016 51(10):1458-63)使用HPLC检测样品中的L-茶氨酸含量。
将样品用糖化酶(amyloglucosidase)处理，分解剩余的麦芽糊精，并使用HK法对产生的葡萄糖进行测定。
当使用不含有碳重排的ATP再生系统时，反应结束后，每1mol葡萄糖当量最终转化为1mol L-茶氨酸(相当于生成1mol ATP)，L-茶氨酸的生产达到100％理论得率；当使用含有碳重排模块的ATP再生系统时，每1mol葡萄糖当量最终转化为2.7mol L-茶氨酸(相当于生成2.7mol ATP)，L-茶氨酸的得率为理论的90％。
上述参照实施例对该一种用于ATP再生的底盘系统与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种用于ATP再生的底盘系统与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 正向引物(primer)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(31)
<400> 1
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat c 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 反向引物(primer)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(28)
<400> 2
gtagaattga acatagcggt tgatttcc 28

Claims (5)

1.一种用于ATP再生的底盘系统，其特征在于：包括以下5个酶：α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸转酮酶以及乙酸激酶。
2.根据权利要求1所述的用于ATP再生的底盘系统，其特征在于：还包括碳重排模块，所述碳重排模块由以下7个酶组成：转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖磷酸3-差向异构酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-二磷酸醛缩酶以及果糖-1,6-二磷酸酶。
3.根据权利要求2所述的用于ATP再生的底盘系统，其特征在于：各酶在体系中酶活单位的浓度比为：α-葡聚糖磷酸化酶：磷酸葡萄糖变位酶：磷酸葡萄糖异构酶：磷酸转酮酶：转醛醇酶：转酮醇酶：核糖-5-磷酸异构酶：核酮糖磷酸3-差向异构酶：磷酸丙糖异构酶：果糖-二磷酸醛缩酶：果糖-1,6-二磷酸酶：乙酸激酶＝2:2:2:2：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：2。
4.权利要求1-3之一所述用于ATP再生的底盘系统的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)将系统中各种酶的基因克隆至pET载体中，然后将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，添加IPTG进行诱导表达；
(2)蛋白表达后，通过超声破碎或高压匀浆破碎大肠杆菌，获得粗酶液；
(3)粗酶液通过热处理或镍柱纯化的方式获得纯酶。
5.应用权利要求1-3之一所述用于ATP再生的底盘系统进行ATP再生的方法，其特征在于：在HEPES缓冲盐体系和镁离子、锰离子、焦磷酸硫胺素存在的条件下，向反应液中添加淀粉或麦芽糊精、无机磷、ADP为底物，进行ATP再生反应。
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