CN113755466B - 果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用 - Google Patents

果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及果糖‑二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用。本发明的果糖‑二磷酸酶突变体能够解除ADP和ATP在合成碳水化合物中的抑制作用，因而可以用于C6化合物和Cn化合物的合成。实验表明，本发明的突变体在应用于以二羟基丙酮为原料时合成C6化合物，产量提高近10倍；在合成Cn化合物方面，产量提高4倍以上。

Description

果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用。
背景技术
果糖-二磷酸酶(FBP，EC 3.1.3.11)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶，催化1,6-二磷酸果糖(F1,6-2P)转化为6-磷酸果糖(F-6-P)。FBP激活糖异生途径促使碳通向磷酸戊糖途径并增加NADPH的水平，可用来产生各种理想的代谢产物，如脂肪酸和固醇类物质的合成。同时，糖异生途径中产生的F-6-P可以用来生产果糖、葡萄糖、阿洛酮糖、塔格糖等许多小分子碳水化合物甚至淀粉(如图5所示)。
不同中间代谢产物对FBP活性有不同程度抑制作用，不利于小分子产品及碳水化合物的合成，我们发现辅因子ADP和ATP严重抑制FBP酶活性，通过对酶结构分析，进行定点突变后解除了抑制作用，大幅提高合成C6化合物和Cn化合物的产量及合成速度。
农业种植是目前生产淀粉的唯一方式。农作物中淀粉的天然合成途径包括卡尔文循环，共涉及二十几个化学反应和中间代谢产物以及多个细胞器。有报道称可以实现一碳到三碳化合物的合成，而从三碳化合物合成六碳甚至淀粉体系中，FBP作为关键酶，解除辅因子ADP和ATP对其抑制作用，使得一碳到多碳化合物的体外合成成为了可能，对于生产小分子碳水化合物和开发能够替代农业种植生产淀粉的方法将具有重要意义。
体外合成生物学通过合理地人工组装不同来源的酶/酶复合物、辅酶和酶载体等，在体外构建催化体系，模拟胞内的催化过程或者完全按照人工设计的催化途径来实现体外合成。相比于化学催化方法，体外生物合成具有立体选择性高、反应条件温和、污染低等优点；相比于传统的发酵过程和农业种植，体外合成体系具有反应速率快、目标产物得率高、对有毒物质的耐受性强、设计灵活等优势。
发明内容
本发明提供了果糖-二磷酸酶突变体，其在特定位点的突变可以解除ADP和ATP对活性的抑制作用，该突变体在以二羟基丙酮为原料，合成C6化合物和Cn化合物的应用中，合成速度及产量大大提高。
因此，本发明提供一种果糖-二磷酸酶突变体，其相对于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型果糖-二磷酸酶而言，其第104位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且第132位精氨酸突变为异亮氨酸。野生型的果糖-二磷酸酶酶活受ADP和ATP抑制作用明显，所示突变体一定程度上解除了ADP和ATP的抑制作用。
进一步的，在上述突变的基础上，第210位酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及第218位赖氨酸突变为谷氨酰胺，获得果糖-二磷酸酶突变体。该突变体在上述突变的基础上同样可以解除ADP和ATP的抑制作用。
本发明提供上述的果糖-二磷酸酶突变体的编码基因。优选地，核苷酸序列如SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示，以及含有所述编码基因的表达盒，表达载体及重组细胞。
本发明进一步提供上述的果糖-二磷酸酶突变体或其编码基因在碳水化合物合成中的应用。
在一个实施方式中，以二羟基丙酮为原料，经过羟基丙酮激酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-二磷酸醛缩酶以及本发明所述的果糖-二磷酸酶突变体的催化反应，转化成F6P；优选地，其反应体系是Hepes缓冲液100mM，NaCl 100mM，Mg2+5mM，Zn2+10μM，DAK 0.77mg/mL，TPI0.33mg/mL，FBA 0.15mg/mL，EDTA 0.1mM，ADP 1mM，多聚磷酸0.4mM(每小时补加0.2mM)，PPK0.44mg/mL(多聚磷酸激酶，用于ATP再生)，化合物DHA 25mM，以及本发明果糖-二磷酸酶突变体0.3mg/mL。
或者以二羟基丙酮为原料，经过羟基丙酮激酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-二磷酸醛缩酶、葡糖磷酸异构酶、磷酸己糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、淀粉合酶以及本发明所述的果糖-二磷酸酶突变体的，转化成直链淀粉。优选地，其反应体系是Hepes缓冲液100mM，NaCl 100mM，Mg2+5mM，Zn2+10μM，DAK 0.2mg/mL，TPI 0.33mg/mL，FBA 0.15mg/mL，PGI 0.069mg/mL，EDTA 0.1mM，ADP 1mM，多聚磷酸0.4mM(每小时补加0.2mM)，PPK0.44mg/mL(多聚磷酸激酶，用于ATP再生)，PGM 0.113mg/mL，G1,6-2P 50μM，GlgA 0.5mg/mL，GlgC-M3 1mg/mL，化合物DHA 25mM，糊精100mg/L，Dipase 0.2mg/mL，以及本发明果糖-二磷酸酶突变体0.6mg/mL。
本发明的果糖-二磷酸酶突变体能够解除ADP和ATP在合成碳水化合物中的抑制作用，因而可以用于C6化合物和Cn化合物的合成。实验表明，本发明的突变体在应用于以二羟基丙酮为原料时合成C6化合物，产量提高近10倍；在合成Cn化合物方面，产量提高4倍以上。
附图说明
图1 FBP与ADP、ATP结合位点蛋白结构
图2A FBP突变体F1、F2解除ADP的抑制结果。
图2B FBP突变体F1、F2解除ATP的抑制结果。
图3 FBP突变体F1和F2对DHA到F6P的转化结果。
图4 FBP突变体F1和F2对DHA到直链淀粉的转化结果。
图5糖异生途径生产果糖、葡萄糖、阿洛酮糖、塔格糖等许多小分子碳水化合物甚至淀粉过程示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1以二羟基丙酮为原料，合成F6P方法中酶的信息及基因构建
所述合成F6P方法中所用酶的信息在表1中列出，羟基丙酮激酶(DAK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、果糖-二磷酸醛缩酶(FBA)、果糖-二磷酸酶(FBP)、葡糖磷酸异构酶(PGI)通过PCR或基因合成的方式获得，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."SimpleCloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichiacoli."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET28a和pET21b载体中，获得相应的表达载体pET28a-DAK、pET21b-TPI、pET21b-FBA、pET21b-FBP、pET21b-PGI。这五个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达与纯化。
其中，果糖-二磷酸酶(FBP)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2以二羟基丙酮为原料，合成直链淀粉方法中酶的信息及基因构建
所述合成直链淀粉方法中所用酶的信息在表1中列出，羟基丙酮激酶(DAK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、果糖-二磷酸醛缩酶(FBA)、果糖-二磷酸酶(FBP)、葡糖磷酸异构酶(PGI)在实施例1中已给出，另外的磷酸己糖磷酸变位酶(PGM)、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC)、淀粉合酶(GlgA)通过PCR或基因合成的方式获得，并通过实施例1中的方法分别克隆至pET21b载体中，获得相应的表达载体pET21b-PGM、pET21b-GlgC、pET21b-GlgA。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达与纯化。
表1各化学反应所用的酶
Figure BDA0002797383490000041
实施例3果糖-二磷酸酶FBP的突变体构建
FBP来源于Escherichia coli MG1655，对其蛋白结构进行理性设计，残基K104和R132为ADP和ATP抑制FBP酶活性的关键点(图1)，以实施例1中获得的野生型基因重组质粒pET21b-FBP为模板，对目的基因进行定点突变。引物见表2，PCR完成后，将载体线性片段用BsaI(NEB)，DpnI(NEB)和T4 DNA Ligase(NEB)自连，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养箱培养至长出单克隆。
表2 FBP定点突变对应引物
Figure BDA0002797383490000051
用通用引物PCR鉴定后得到阳性转化子，测序得到正确的突变体。其中，相应于第104和132位的引物，定点突变后的FBP突变体F1，是将SEQ ID NO.1的第104位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且将第132位精氨酸突变为异亮氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到突变株F1。其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；相应于第210和218位的引物，定点突变后的FBP突变体F2，是进一步将SEQ ID NO.1的第210位酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第218位赖氨酸突变为谷氨酰胺，其他氨基酸残基保持不变，得到突变株F2。其编码的核苷酸序列为SEQ IDNO.4。也就是说，是在F1基础上继续得到突变株F2，即相对于SEQ ID NO.1有四个位点发生突变。
实施例4葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC)的突变体构建
葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC)来源于Escherichia coli MG1655，以实施例2中获得的野生型基因重组质粒pET21b-GlgC为模板，对目的基因进行定点突变。引物见表3，用Vector片段上游引物和定点突变下游引物PCR扩增出线性片段1，再用Vector片段下游引物和定点突变上游引物PCR扩增出线性片段2，将载体线性片段用Uni SeamlessCloning and Assembly Kit(Transgen Biotech)融合，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养箱培养至长出单克隆。
表3 GlgC定点突变对应引物
Figure BDA0002797383490000061
用通用引物PCR鉴定后得到阳性转化子，测序得到正确的突变体pET21b-GlgC-M3。
实施例5所述酶蛋白在大肠杆菌中的表达
接种针挑取实施例1～4中相关酶的单克隆接种于LB培养基中，以37℃培养12h，然后以1％(V/V)接种量接种于50mL LB培养基中，以37℃培养至OD600＝0.8，调至16℃进行IPTG诱导表达，IPTG使用浓度为0.5mM。将上述培养菌液收集到离心管中，离心弃上清，用缓冲液重悬并清洗菌体，低温保存上述菌体，SDS-PAGE确定蛋白正常表达。
实施例6所述酶蛋白的纯化
按实施例1～4中蛋白表达条件，扩大培养，收集1L菌体，破菌：将上述收集好的菌体用蛋白裂解液重悬(50mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl)，采用超声破碎或者高压低温破碎仪充分裂解细胞，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中。离心：将破碎好的菌液于预冷好的离心机中12000rpm，离心20min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液；纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：(1)柱平衡：先用dd H2O洗2个柱体积，再用20mM咪唑蛋白裂解液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积。(2)上样：将上清与Ni亲和层析柱混合，颠倒混匀半小时。(3)洗脱杂蛋白：用50mL含20mM咪唑的蛋白裂解液buffer去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样。(4)洗脱目的蛋白：用20mL含250mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，制样，12％SDS-PAGE检测。d.浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、4000r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白裂解液buffer，浓缩至1mL，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到酶蛋白，用Brandford法测试蛋白浓度，BSA标准蛋白做标准曲线。
实施例7实施例3中得到的FBP突变体F1、F2解除ADP、ATP抑制
如表4体系测试FBP酶活，在反应体系中分别加入不同浓度ADP(0/0.5/1/5/10mM)，比较FBP与F1活性差异。结果如图2A和图2B，以1mM ADP结果为例，不添加ADP的反应相对活性定义为100％，野生型相对活性仅剩余17.46％，而突变株F1相对活性为81.21％，突变株F2相对活性为80.94％，F1大大缓解了ADP对FBP的抑制作用，而在F1基础上的突变体F2同样解除ADP抑制，此浓度ADP用于实施例8和9中，解除抑制后大幅提高C6和Cn产量。
如表4体系测试FBP酶活，在反应体系中分别加入不同浓度ATP(0/0.5/1/5/10mM)，比较FBP与F1活性差异。结果如图2，以5mM ATP结果为例，不添加ATP的反应相对活性定义为100％，野生型相对活性剩余17.71％，而突变株F1相对活性为38.51％，突变株F2相对活性为31.26％，F1在一定程度上缓解了ATP对FBP的抑制作用，而在F1基础上的突变体F2同样有此效果。
表4 FBP酶活测试体系
Figure BDA0002797383490000071
Figure BDA0002797383490000081
实施例8 FBP突变体F1和F2在实现DHA到F6P的应用
25mM DHA串联产生F6P反应体系，反应体系是Hepes缓冲液100mM，NaCl 100mM，Mg2+5mM，Zn2+10μM，DAK 0.77mg/mL，TPI 0.33mg/mL，FBA 0.15mg/mL，EDTA 0.1mM，ADP 1mM，多聚磷酸0.4mM(每小时补加0.2mM)，PPK 0.44mg/mL(多聚磷酸激酶，用于ATP再生)，化合物DHA25mM，分别用FBP、F1、F2，酶量为0.3mg/mL，在反应2h、4h、终止反应，测试体系产生的F-6-P。其中体系中的相关酶由前述实施例制备纯化得到的，但除本发明突变体的酶外，也可以用已知的方法或购买得到的酶。
F6P含量的检测：反应结束后100℃加热5min灭活，酶法检测产生的F6P，通过偶联PGI产生的G6P，再偶联G6PDH测试OD340变化确定F6P含量。
结果如图3，反应4h，野生型FBP不能产生更多的F-6-P，仅产生1.02mM F-6-P；利用F1突变株的串联体系产生9.92mM F-6-P，较野生型提高9.73倍；利用F2突变株的串联体系产生10.24mM F-6-P，较野生型提高10.04倍。
实施例9 FBP突变体F1和F2在实现DHA到直链淀粉的应用
25mM DHA串联产生直链淀粉反应体系，反应体系是Hepes缓冲液100mM，NaCl100mM，Mg2+5mM，Zn2+10μM，DAK 0.2mg/mL，TPI 0.33mg/mL，FBA 0.15mg/mL，PGI 0.069mg/mL，EDTA0.1mM，ADP 1mM，多聚磷酸0.4mM(每小时补加0.2mM)，PPK 0.44mg/mL(多聚磷酸激酶，用于ATP再生)，PGM 0.113mg/mL，G1,6-2P 50μM，GlgA 0.5mg/mL，GlgC-M3 1mg/mL，化合物DHA 25mM，糊精100mg/L，Dipase 0.2mg/mL，分别用FBP、F1、F2，酶量为0.6mg/mL，在反应2h、4h、终止反应，测试体系产生的直链淀粉。其中体系中的相关酶由前述实施例制备纯化得到的，但除本发明突变体的酶外，也可以用已知的方法或购买得到的酶。
直链淀粉的检测：反应终止后适当稀释样品，然后与30U/mLα-淀粉酶和33U/mL葡萄糖淀粉酶孵育一定时间，直到直链淀粉完全被水解为葡萄糖，然后通过葡萄糖测定试剂盒检测葡萄糖含量。直链淀粉的产量用葡萄糖含量表示。
结果如图4所示，其中带有两个突变位点的F1和F2均有利于合成体系，4h野生型合成直链淀粉产量为216.43mg/L；利用F1突变株的串联体系4h合成直链淀粉产量为954.27mg/L，产量较野生型提高4.41倍；利用F2突变株的串联体系4h合成直链淀粉产量为944.95mg/L，产量较野生型提高4.37倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用
<160>12
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>332
<212>PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
MKTLGEFIVE KQHEFSHATG ELTALLSAIK LGAKIIHRDI NKAGLVDILG ASGAENVQGE 60
VQQKLDLFAN EKLKAALKAR DIVAGIASEE EDEIVVFEGC EHAKYVVLMD PLDGSSNIDV 120
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<210>2
<211> 996
<212>DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
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<211> 996
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<213> Escherichia coli
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gagctcactg ctttgctgtc ggcaataaaa ctgggcgcca agattatcca tcgcgatatc 120
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gttcagcaga aactcgactt gttcgctaat gaaaaactga aagccgcact gaaagcacgc 240
gatatcgttg cgggcattgc ctctgaagaa gaagatgaga ttgtcgtctt tgaaggctgt 300
gaacacgcac agtacgtggt gctgatggac cccctggatg gctcgtccaa catcgatgtt 360
aacgtctctg tcggtaccat tttctccatc tacattcgcg ttacgcctgt tggcacgccg 420
gtaacggaag aagatttcct ccagcctggt aacaaacagg ttgcggcagg ttacgtggta 480
tacggctcct ctaccatgct ggtttacacc accggatgcg gtgttcacgc ctttacttac 540
gatccttcgc tcggcgtttt ctgcctgtgc caggaacgga tgcgcttccc ggagaaaggc 600
aaaacctact ccatcaacga aggaaactac attaagtttc cgaacggggt gaagaagtac 660
attaaattct gccaggaaga agataaatcc accaaccgcc cttatacctc acgttatatc 720
ggttcactgg tcgcggattt ccaccgtaac ctgctgaaag gcggtattta tctctaccca 780
agcaccgcca gccacccgga cggcaaactg cgtttgctgt atgagtgcaa cccgatggca 840
ttcctggcgg aacaagcggg cggtaaagcg agcgatggca aagagcgtat tctggatatc 900
atcccggaaa ccctgcacca gcgccgttca ttctttgtcg gcaacgacca tatggttgaa 960
gatgtcgaac gctttatccg tgagttcccg gacgcg 996
<210>4
<211> 996
<212>DNA
<213> Escherichia coli
<400>4
atgaaaacgt taggtgaatt tattgtcgaa aagcagcacg agttttctca tgctaccggt 60
gagctcactg ctttgctgtc ggcaataaaa ctgggcgcca agattatcca tcgcgatatc 120
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tacggctcct ctaccatgct ggtttacacc accggatgcg gtgttcacgc ctttacttac 540
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ggttcactgg tcgcggattt ccaccgtaac ctgctgaaag gcggtattta tctctaccca 780
agcaccgcca gccacccgga cggcaaactg cgtttgctgt atgagtgcaa cccgatggca 840
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atcccggaaa ccctgcacca gcgccgttca ttctttgtcg gcaacgacca tatggttgaa 960
gatgtcgaac gctttatccg tgagttcccg gacgcg 996
<210>5
<211> 82
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 5
ggctacggtc tccgttaaca tcgatgttgg acgagccatc cagggggtcc atcagcacca 60
cgtactgtgc gtgttcacag cc 82
<210>6
<211> 71
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 6
ggctacggtc tcttaacgtc tctgtcggta ccattttctc catctacatt cgcgttacgc 60
ctgttggcac g 71
<210>7
<211> 71
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 7
ggctacggtc tcgaaggaaa ctttattaag tttccgaacg gggtgcagaa gtacattaaa 60
ttctgccagg a 71
<210>8
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
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<210>9
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
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<210>10
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
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<210>11
<211> 58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gcttactgga aagcgaacct cgatctggcc tctgtggtgg atgaactgga tatgtacg 58
<210>12
<211> 59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
aacggactgc accaccaccg aaccggagat cacacaacca tcggaaacca gtgagttaa 59

Claims (10)

1. 一种果糖-二磷酸酶突变体，其特征在于，其相对于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型果糖-二磷酸酶而言，其第104位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且第132位精氨酸突变为异亮氨酸。
2.如权利要求1所述的果糖-二磷酸酶突变体，其特征在于，进一步的，其第210位酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及第218位赖氨酸突变为谷氨酰胺。
3.如权利要求1至2任一项所述的果糖-二磷酸酶突变体的编码基因。
4. 如权利要求3所述的果糖-二磷酸酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
5.含有如权利要求3或4所述基因的表达盒。
6.含有如权利要求3或4所述基因的表达载体。
7.权利要求1或2所述的果糖-二磷酸酶突变体或其编码基因在碳水化合物合成中的应用；所述碳水化合物是6-磷酸果糖或直链淀粉。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以二羟基丙酮为原料，经过羟基丙酮激酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-二磷酸醛缩酶以及如权利要求1或2所述的果糖-二磷酸酶突变体的催化反应，转化成6-磷酸果糖。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，其反应体系是Hepes缓冲液100 mM，NaCl100 mM，Mg2+ 5 mM，Zn2+ 10 μM，羟基丙酮激酶0.77 mg/mL，磷酸丙糖异构酶0.33 mg/mL，果糖-二磷酸醛缩酶0.15 mg/mL，EDTA 0.1 mM，腺苷二磷酸1 mM，多聚磷酸 初始为0.4 mM，随后每小时补加0.2 mM，多聚磷酸激酶0.44 mg/mL，化合物1,3-二羟基丙酮 25 mM，以及如权利要求1或2果糖-二磷酸酶突变体 0.3 mg/mL。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以二羟基丙酮为原料，经过羟基丙酮激酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-二磷酸醛缩酶、葡糖磷酸异构酶、磷酸己糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、淀粉合酶以及如权利要求1或2所述的果糖-二磷酸酶突变体，转化成直链淀粉。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2010091185A2 (en) * 2009-02-05 2010-08-12 Trustees Of Boston College Inhibitors of fructose 1,6-bisphosphatase and methods of use thereof
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赵银霞 ; 梁娟 ; 刘静 ; 陆彪 ; 于辛酉 ; .果糖1,6二磷酸酶缺乏症的遗传学诊断及突变位点分析.临床儿科杂志.2017,(第12期),全文. *

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