TW201732039A - 新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案是有關於一種熱穩定性優異的高溫活性及耐熱性的新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、包括其的組成物及利用其的葡萄糖-6-磷酸製備方法。

Description

新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法
本申請案是有關於一種新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、包括上述葡萄糖激酶的組成物及利用其的葡萄糖-6-磷酸製備方法。
作為生物代謝中的主要磷酸化化合物的葡萄糖-6-磷酸（D-glucose 6-phosphate）可藉由糖酵解路徑（glycolysis pathway）、戊糖磷酸路徑（pentose phosphate pathway）及胺基己糖生物合成路徑（hexosamine biosynthetic pathway）等而轉化成多種代謝產物，因此於產業上為重要的化合物。於欲利用一連串的多重酶反應自葡萄糖-6-磷酸生產特定的高價化合物的生物製程中，葡萄糖-6-磷酸的經濟性製備方法非常重要。
迄今為止，為了藉由酶促方式製備葡萄糖-6-磷酸，已報導有如下方法：利用向原料葡萄糖轉移二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）或三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的磷酸基（於利用ADP的情形時為β-磷酸基，於利用ATP的情形時為γ-磷酸基）的ADP依存性葡萄糖激酶（ADP-dependent glucokinase，酶學委員會（Enzyme Commission，EC）2.7.1.147）或ATP依存性葡萄糖激酶（ATP-dependent glucokinase，EC 2.7.1.2）、或利用向葡萄糖原料轉移磷酸（phosphate）聚合物（即多磷酸鹽（polyphosphate，Poly(Pi)n ）的磷酸基的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶（Poly(Pi)n -dependent glucokinase，EC 2.7.1.63）。
就製備製程的經濟性與穩定性的方面而言，利用ADP依存性葡萄糖激酶或ATP依存性葡萄糖激酶生產葡萄糖-6-磷酸的方法具有需要高價的ADP或ATP作為磷酸基供與化合物的缺點。為了解決上述缺點，已報導有一併使用可向經脫磷酸化生成的單磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）或ADP轉移Poly(Pi)n 的磷酸基的多磷酸鹽-二磷酸腺苷磷酸轉移酶（polyphosphate-AMP/ADP phosphotransferase）而再生ADP或ATP的方法（如以下反應式1所示），但腺核苷酸（adenine nucleotides，即AMP、ADP及ATP）具有物理化學（熱、pH值等）穩定性較差等問題，因此實用化有限。
[反應式1]
相反地，利用多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶生產葡萄糖-6-磷酸的方法（如以下反應式2所示）可使用相對廉價且穩定的Poly(Pi)n 作為磷酸基供與化合物直接生產葡萄糖-6-磷酸。因此，上述製備方法在製備製程的經濟實用化方面優於利用ADP依存性葡萄糖激酶或ATP依存性葡萄糖激酶生產葡萄糖-6-磷酸的方法。
[反應式2]
[發明欲解決的課題]
本申請案是有關於一種多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、包括上述酶的組成物及利用其的葡萄糖-6-磷酸生產方法。就特定化合物的酶促製備製程的效率化方面而言，酶的穩定性為非常重要的特性。然而，迄今為止，已報導有部分微生物種中存在與本申請案相關的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，然而所報導的大部分所分離的酶為源自中溫性微生物的酶而熱穩定性等較低（表1）。為了解決此種問題，本申請案自嗜熱性微生物提供一種穩定性優異的高溫性及耐熱性的新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、包括上述酶的組成物及利用其生產葡萄糖-6-磷酸的方法。
[表1]
作為生物代謝中的糖酵解路徑（glycolysis pathway）及戊糖磷酸路徑（pentose phosphate pathway）的磷酸化化合物的葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）可轉化成各種代謝產物，因此為於產業上非常有用的磷酸化化合物。於欲利用一連串的多重酶反應自葡萄糖-6-磷酸生產高價產物的製程中，需要葡萄糖-6-磷酸的經濟性製備方法。
通常，為了於生物代謝中自葡萄糖酶促轉化成葡萄糖-6-磷酸而使用ATP或ADP作為磷酸基供與化合物，上述反應路徑因ATP或ADP的商業價格較高而於開發葡萄糖-6-磷酸的酶促製備製程的方面存在極限。此外，所生產的葡萄糖-6-磷酸無法藉由微生物醱酵而穿透細胞膜，因此不適於用作上述葡萄糖-6-磷酸的生產方法。
作為磷酸基供與化合物的磷酸鹽聚合物(即Poly(Pi)n （Polyphosphate）)大量存在於自然界、或可藉由化學製備方法經濟廉價地生產，因此為商業價值較高的化合物。因此，開發使用酶而利用此種Poly(Pi)n 有效地自葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的製備方法於商業上非常重要。
然而，在先前報導的利用Poly(Pi)n 生產葡萄糖-6-磷酸的酶中，大部分的酶具有較低的反應溫度及熱穩定性，因此於製程應用上存在極大的限制。
[解決課題的手段]
本申請案提供一種新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶及利用其生產葡萄糖-6-磷酸的方法，上述新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶源自嗜熱性微生物且具有高溫活性及耐熱性優異。
以下，詳細地對本申請案的各種實施方式進行說明。
具體而言，本申請案的一實施方式可提供一種源自厭氧繩菌（Anaerolinea）屬的具高溫活性及耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶。
具體而言，上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶可為序列編號2的胺基酸序列，或只要具有與上述序列表現出70%以上、具體而言80%以上、更具體而言90%以上、進而具體而言95%以上的同源性的胺基酸序列且構成實質上與上述酶相同或相應的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的蛋白質即可，故未對其加以限制。此外，只要具有此種同源性的序列為實質上表現多磷酸鹽依存性葡萄糖磷酸化功能的胺基酸序列，則一部分序列缺失、變形、取代或加成而成的蛋白質變異體亦當然包括於本發明的範圍內。
於本申請案中，用語“同源性”是指可共有或不共有共同進化起源的所給出的多肽序列或聚核苷酸序列間的相同性或相應性程度，能夠以百分率來表示之。於本說明書中，以“%同源性”表示具有與所給出的多肽序列或聚核苷酸序列相同或相似的活性的上述多肽序列或聚核苷酸序列的同源性序列。例如，可利用計算得分（score）、相同性（identity）及相似度（similarity）等參數（parameter）的標準軟體、具體而言為基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）2.0、或於定義的嚴格條件下藉由南方雜交實驗對序列進行比較而確認，可藉由業者所熟知的方法確定所定義的適當雜交條件（例如，參考薩姆布魯克等，1989年，基礎研究）。於一個具體例中，在兩個胺基酸序列於胺基酸序列的特定長度的多肽匹配度為至少21%（具體而言，至少為約50%、特別是為約75%、90%、95%、96%、97%或99%）時，將此兩個胺基酸序列定義為“實質上同源”或“實質上相似”。
進而，本申請案的另一實施方式可提供一種對源自厭氧繩菌（Anaerolinea）屬的耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶進行編碼的聚核苷酸。具體而言，本申請案可提供一種以序列編號1的鹼基序列記載而對具有多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的蛋白質進行編碼的聚核苷酸。
於本申請案中，用語“聚核苷酸”是指核苷酸單體藉由共價鍵連接成長鏈狀而成的核苷酸聚合物，通常指固定長度以上的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）鏈。
對具有上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的蛋白質進行編碼的聚核苷酸序列可包括對上述序列編號2的胺基酸進行編碼的聚核苷酸序列。上述聚核苷酸因密碼子的簡並性（degeneracy）或考慮欲表現上述酶的生物所優選的密碼子而可於不改變多肽的胺基酸序列的範圍內，在編碼區域實現各種變形。上述聚核苷酸序列例如可具有序列編號1的聚核苷酸序列。此外，可包括如下的聚核苷酸：具有與上述序列表現出70%以上、具體而言80%以上、更具體而言90%以上、進而具體而言95%以上、最具體而言98%以上的同源性的核苷酸序列而可對實質上具有多磷酸鹽依存性葡萄糖磷酸化活性的多肽進行編碼。此外，具有一部分序列缺失、變形、取代或加成的胺基酸序列的變異體亦當然包括於本發明的範圍內。
當葡萄糖-6-磷酸製備用組成物以上述組成物的整體體積為基準而包括1重量%至3重量%的葡萄糖、1重量%至10重量%的多磷酸鹽、10 U/ml至50 U/ml的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、及1 mM至20 mM的任一鎂離子（例如，MgSO4 、MgCl2 ）時，轉化產率可為70%以上、具體而言80%以上且更具體而言90%以上。
具體而言，當上述葡萄糖-6-磷酸製備用組成物包括2重量%的葡萄糖、1.5重量%的多磷酸鹽、10 U/ml至50 U/ml的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、及可選地存在的10 mM的MgSO4 時，轉化產率可為60%以上、更佳為70%且進而較佳為80%以上。
葡萄糖-6-磷酸製備用組成物以上述組成物的整體體積為基準而包括5重量%至20重量%的葡萄糖、5重量%至12重量%的多磷酸鹽、10 U/ml至50 U/ml的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶及1 mM至20 mM的任一鎂離子（例如，MgSO4 、MgCl2 ），藉此向葡萄糖-6-磷酸的轉化產率可為50%以上、具體而言60%以上且更具體而言70%以上。
具體而言，於以組成物的整體體積為基準而包括15重量%的上述葡萄糖、10重量%的多磷酸鹽、10 U/ml至50 U/ml的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶及可選地存在的10 mM的MgSO4 的條件下，轉化產率可為50%以上、更具體而言可為60%以上且進而具體而言可為65%以上。
上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶可於45℃至90℃下表現出活性、更具體而言可於55℃至80℃下表現出活性且最具體而言可於65℃至70℃下表現出活性。
上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶可於pH 4至pH 10下表現出活性且最具體而言可於pH 4至pH 5下表現出活性。
上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的活性可於存在鎂離子的條件下增大。
上述鎂的濃度具體而言可為0.5 mM至20 mM、更具體而言可為0.2 mM至10 mM且進而具體而言可為1 mM。
本申請案的又一實施方式是有關於一種包括本申請案中所揭示的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸鹽的組成物。
上述組成物可更包括鎂離子。上述組成物可用於製備葡萄糖-6-磷酸。於本實施方式中，各成分及含量等的詳細說明與上述實施方式或下述實施方式中所說明的成分及含量相同，因此省略其詳細記載。
本申請案的又一實施方式可提供一種自包括本申請案中所揭示的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸鹽的組成物製備葡萄糖-6-磷酸的方法。
上述製備反應條件可為溫度45℃至90℃或pH 4至pH 10的條件。
上述葡萄糖的特徵可為將澱粉或纖維素液化或糖化而成者。
上述多磷酸鹽為磷酸基供與化合物，例如可為六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate）、六偏磷酸鉀（potassium hexametaphosphate）等，當然並不限制於此，亦可使用市售者。
上述葡萄糖-6-磷酸的製備可於45℃至90℃下執行、更具體而言可於55℃至80℃下執行且最具體而言可於65℃至70℃下執行。
上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的分子量可為10 kDa至100 kDa且具體而言20 kDa至50 kDa。
於上述葡萄糖-6-磷酸的製備中可更包括例如MgCl2 或MgSO4 等鎂離子。具體而言，可更包括MgSO4 。
上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的含量可為10 U/ml至50 U/ml。
上述葡萄糖以組成物的整體體積為基準而可為0.1重量%至40重量%、更具體而言可為1重量%至20重量%且最具體而言可為1重量%至10重量%。
上述多磷酸鹽以組成物的整體體積為基準而可為0.5重量%至25重量%、更具體而言可為1重量%至20重量%且最具體而言可為1重量%至10重量%。
本申請案的又一實施方式可提供一種自包括本申請案所述的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、糖化酶、澱粉及多磷酸鹽的組成物製備葡萄糖-6-磷酸的方法。
上述製備反應條件可為溫度45℃至90℃或pH 4至pH 10的條件。
上述糖化酶可為α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶及α-葡萄糖苷酶中的一種以上。
作為又一實施方式，本申請案可提供一種生產上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的微生物且具體而言為埃希氏菌屬（Escherichia sp.）微生物。
於本申請案中，用語“生產多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的微生物”是指可於生物體內生產上述酶的原核微生物菌株或真核微生物菌株，具體而言是指可藉由遺傳操作或自然突變而於培養基或微生物體內累積上述酶的微生物。
具體而言，上述微生物只要為可表現序列編號2的多肽的微生物即可，未對其種類加以限制，因此可使用原核細胞或真核細胞，且具體而言可使用原核細胞。例如，可包括屬於埃希氏菌（Escherichia）屬、伊文氏桿菌（Erwinia）屬、沙雷氏菌（Serratia）屬、普羅威登斯菌（Providencia）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬及短桿菌（Brevibacterium）屬的微生物菌株，具體而言可為屬於埃希氏菌（Escherichia）屬的微生物，例如可為大腸桿菌（Eschrichia coli），但並不限定於此。
於本申請案中，用語“表現”可藉由將本申請案的對多肽進行編碼的聚核苷酸轉形成可操作地包括上述聚核苷酸的重組載體、或對上述多肽進行編碼的聚核苷酸插入至染色體內而達成，但並不特別限制於此。
於本申請案中，用語“轉形”是指將包括對靶蛋白進行編碼的聚核苷酸的載體導入至宿主細胞內而使由上述聚核苷酸進行編碼的蛋白質可於宿主細胞內表現。經轉形的聚核苷酸只要可於宿主細胞內表現，則無論插入至宿主細胞的染色體內或位於染色體的外部均可。此外，上述聚核苷酸包括對靶蛋白進行編碼的DNA及RNA。上述聚核苷酸只要為可導入至宿主細胞內而表現者即可，則無論以哪種形態導入均可。例如，上述聚核苷酸能夠以包括自主表現所需的所有要素的基因結構體即表現卡匣（expression cassette）的形態導入至宿主細胞，並不限定於此。上述表現卡匣可包括通常可操作地連接於上述聚核苷酸的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖體結合部位及轉譯終止訊號。上述表現卡匣可為可實現自主複製的表現載體形態。此外，上述聚核苷酸亦可為如下者：以其本身的形態導入至宿主細胞，於宿主細胞內可操作地與表現所需的序列連接。
此外，於上述內容中，用語“可操作地連接”是指使本申請案的對靶蛋白進行編碼的聚核苷酸開始轉錄及介導的啟動子序列與上述基因序列功能性地連接。
於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至宿主細胞的任意的介導物。載體可為結合其他DNA片段而可複製所結合的片段的複製單元（replicon）。“複製單元”是指於體內作為DNA自主複製單元而發揮功能的、即可藉由自我調節而實現複製的任意的遺傳單元（例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒）。“載體”包括用以於試驗管內、體外或體內將鹼基導入至宿主細胞的病毒及非病毒介導物，此外，可包括微球形DNA。例如，上述載體可為不具有細菌DNA序列的質體。為了減少轉移基因表現沉默（silence）而自質體DNA載體實現更持續的表現，於CpG區域去除富集的細菌DNA序列（例如，埃爾哈特等，2003年，人類基因治療10：215-25；耶特等，2002年，多重感染治療5：731-738；陳等，2004年，基因治療11：856-864）。此外，上述載體可包括轉位子（遺傳學年鑒，2003，37：3-29）或人工染色體。具體而言，可使用pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322及pMW118載體或使啟動子等自上述載體變異而成的變異載體等，但並不限定於此。
特別是，於本申請案中，載體可為含有如下的聚核苷酸的鹼基序列的DNA製備物：對可操作地連接於適當的表現調節序列的上述靶蛋白進行編碼，以便可使靶蛋白於適當的宿主內表現。上述表現調節序列可包括可開始轉錄的啟動子、用以調節此種轉錄的任意的操縱子序列、對適當的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）的核糖體結合部位進行編碼的序列、及對轉錄終止及解碼終止進行調節的序列。載體可於轉形至適當的宿主細胞內後，與宿主基因組無關地複製或發揮功能，可整合至基因組其本身。
本申請案中所使用的載體只要為可於宿主細胞內複製者，則並無特別限定，可利用業界已知的任意的載體。可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體作為通常使用的載體的實例。例如，作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用例如pWE15、M13等噬菌體載體或λE15、λE1515、M13等噬菌體載體、或/及Charon21A等噬菌體載體，但並不限定於此。可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體，但並不限定於此。
可提供一種包括對上述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶加密的基因的重組表現載體。
可提供一種大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_at_ppgk（Escherichia coli BL21（DE3）/CJ_at_ppgk）（寄存機關：韓國微生物保存中心，寄存日期：2016.02.16，寄存編號：KCCM11814P），其特徵在於以包括序列目錄1號的基因的重組載體轉形而成。
可提供一種可使用本申請案的酶及額外功能的酶（α-澱粉酶（α-amylase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）、異構酶（isomerase）、醛縮酶（aldolase）、合成酶（synthase）、激酶（kinase）、磷酸酶（phosphatase）等），同時利用酶反應（一鍋酶法轉化（one-pot enzymatic conversions））自多磷酸鹽及葡萄糖或澱粉經濟地製備下述各種化合物的方法。
於產業上有用的各種化合物為葡萄糖-1-磷酸（D-glucose 1-phosphate）、果糖-6-磷酸（D-fructose 6-phosphate）、果糖-1,6-二磷酸（D-fructose 1,6-bisphosphate）、肌醇-3-磷酸（myo-inositol 3-phosphate）、肌醇（myo-inositol）、葡萄糖醛酸（D-glucuronate）、葡萄糖胺-6-磷酸（D-glucosamine 6-phosphate）、葡萄糖胺（D-glucosamine）、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸（N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate）、N-乙醯葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸（N-acetyl-D-mannosamine 6-phosphate）、N-乙醯甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine）、N-乙醯神經胺酸（N-acetylneuraminic acid、唾液酸（sialic acid））、甘露糖-6-磷酸（D-mannose 6-phosphate）、甘露糖（D-mannose）、塔格糖-6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）、塔格糖（D-tagatose）、阿洛酮糖-6-磷酸（D-allulose 6-phosphate）、阿洛酮糖（D-allulose）、甘油醛3-磷酸（D-glyceraldehyde 3-phosphate）、二氫丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate）等，並不限制於此，當然可包括利用葡萄糖-6-磷酸的各種化合物。
[發明之效果]
本申請案的酶可於高溫下進行酶反應，故而可於高溫的反應製程中增加基質（葡萄糖，Poly(Pi)n ）的溶解度，因此能夠以高濃度使用基質，可藉由增加物質擴散速度、增加反應速度、縮短反應時間等而可提高單位生產性。另外，可藉由高溫的酶反應製程而將因外部微生物等引起的製程污染最小化。此外，若於公認安全（generally recognized as safety，GRAS）微生物中重組本申請案的酶並大量表現後利用耐熱性的特性，則於欲用作不活化菌體的情形時，不僅可藉由在高溫下進行熱處理的方法有效地將重組微生物不活化，而且於欲分離重組酶而利用的情形時，亦可將源自重組微生物的蛋白質選擇性地改質並去除，因此具有可有效地進行酶的精製製程的優點。
目前，為了生產於化學、醫藥、化妝品及食品產業中有用的各種化合物，使用為相對廉價的碳源且可大量生產的源自澱粉或纖維素的葡萄糖作為化學或生物學轉化製程的基礎原料。
然而，特別是由於目前於生物製程中的酶促轉化製程中作為基礎原料的磷酸化葡萄糖為高價，因此使用非常有限。
於產業方面而言，葡萄糖-6-磷酸作為於葡萄糖代謝中非常重要的代謝產物，且葡萄糖-6-磷酸可為利用存在於自然界（生物體）的各種代謝酶誘導非常有用的反應的基礎原料。
因此，本申請案提供一種可自葡萄糖及多磷酸鹽經濟地生產葡萄糖-6-磷酸的酶及酶促製備方法，其中葡萄糖-6-磷酸可作為於產業上生產各種有用化合物的原料。
此外，提供一種於活用本申請案中所製備的葡萄糖-6-磷酸及製備方法時可酶促地製備的醫藥、化妝品及食品產業中的高價功能性化合物。
[實施例]
實施例 1: 包括多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的基因的重組 表現載體及轉形微生物的製備
為了提供本申請案的具有高溫活性及耐熱性的特性的新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶酶，分離源自作為嗜熱性微生物的嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的基因而製備重組表現載體及轉形微生物。
具體而言，以登錄於基因庫（Genbank）中的基因序列為對象而篩選與本申請案的酶相關的基因序列，於上述與本申請案的酶相關的基因序列中僅選定源自嗜熱性微生物的基因序列。基於登錄為基因鹼基序列（序列編號1）與胺基酸序列（序列編號2）的嗜熱厭氧繩菌的基因鹼基序列而製備正向引子（forward primer，序列編號3）及反向引子（reverse primer，序列編號4）。利用合成的引子藉由聚合酶鏈反應（PCR）自嗜熱厭氧繩菌染色體DNA（genomic DNA）放大相應的基因，放大的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶基因使用限制酶NdeⅠ及XhoⅠ插入至大腸桿菌表現用質體載體pET21a（諾禾致源（Novagen）公司）而製作命名為CJ_at_ppgk的重組表現載體。CJ_at_ppgk藉由通常的轉形方法（參照：薩姆布魯克等，1989）轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備命名為E. coli BL21（DE3）/CJ_at_ppgk的轉形微生物。
實施例 2 ：重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的製備
為了製備重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，將E. coli BL21（DE3）/CJ_at_ppgk接種至包括5 ml的溶菌肉湯（Lysogeny Broth，LB）液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至在600 nm下吸光度成為2.0為止。將進行上述種菌培養所得的培養液接種至包括LB液體培養基的培養燒杯而進行正式培養。於在600 nm下的吸光度成為2.0時，添加1 mM的異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）而誘導重組酶表現。將上述培養過程中的攪拌速度保持為200 rpm，將培養溫度保持為37℃。於在4℃下以8,000 xg對培養液進行20分鐘的離心分離後，回收菌體。利用50 mM的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽（tris hydroxymethyl aminomethane hydrochloride，Tris-HCl）（pH 7.0）緩衝溶液對回收的菌體進行兩次清洗，利用相同的緩衝溶液進行懸濁，之後利用超音波細胞粉碎機粉碎細胞。於在4℃下以13,000 xg對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後，僅取上清液。使用組胺酸標籤（His-tag）親和層析法自上述上清液精製重組酶。精製而成的重組酶液於利用50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液進行透析後，藉由酶的特性分析而使用。
圖4的M為蛋白質大小測定標記（size marker），CFE為細胞粉碎上清液，PE為精製而成的酶。藉由SDS-PAGE分析而確認到精製而成的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶為約28 kDa（圖4）。
實施例 3 ：重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的活性分析
使用懸濁於50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液的4%（w/v）葡萄糖、3%（w/v）六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）及1 mM的MgCl2 作為活性分析的反應組成物。於上述反應組成物中添加0.1 mg/ml的精製酶而於60℃下反應15分鐘，之後利用高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）對反應物進行分析。以如下的條件執行HPLC分析，即使用Aminex HPX-87C（伯樂（Bio-rad）公司）管柱於80℃下按照流動相使5 mM的H2 SO4 溶液以0.6 ml/分鐘的流速流動，並利用折射率檢測器（Refractive Index Detector）對葡萄糖-6-磷酸進行檢測分析。
根據分析結構，可確認已於重組精製酶的反應物中生成葡萄糖-6-磷酸。
實施例 4 ：與 pH 值對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的 分析
為了調查pH值對本申請案的酶的影響性，使用懸濁於各種pH值的緩衝溶液（pH 4至7，檸檬酸鈉（sodium citrate）；pH 4至7，乙酸鈉（sodium acetate）；pH 7至10，Tris-HCl）中的50 mM的4%（w/v）葡萄糖、3%（w/v）六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）及1 mM的MgCl2 作為反應組成物。於上述各反應組成物中添加0.1 mg/ml的精製酶而於60℃下反應15分鐘，之後利用HPLC對葡萄糖-6-磷酸進行定量分析。
本實施例的結果顯示可確認到如下情形：如圖5所示，不同於先前所報導的酶，本申請案的源自嗜熱厭氧繩菌的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶於pH 4至5附近的酸性下表現出最大活性，於與上述pH值對應的緩衝溶液中的乙酸鈉緩衝溶液中表現出最高的活性。此外，於跨及pH 4至10的非常廣泛的範圍內，表現出相對於最大活性為70%以上的活性（圖5）。
根據本申請案的此種多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶所具有的嗜酸性及高溫活性的新穎特性，於與作為澱粉糊精（dextrin）糖化酶的源自麴菌（Aspergillus）屬的葡萄糖澱粉酶[源自黑麴菌（Aspergillus niger）的商用化糖化酶AMG 300L（諾維信（novozymes）公司）於pH 4.5、溫度60℃下表現出最佳活性]等一併使用的情形時，可自澱粉糊精有效地生產葡萄糖-6-磷酸。另外，於跨及pH 4至10的廣泛的範圍內具有相對於最大活性為70%以上的活性的本申請案的酶的特性於產業上的活用性亦非常大。
實施例 5 ：與溫度對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶 活性的分析
為了進行與溫度對應的重組酶活性的分析，使用懸濁於50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液的4%（w/v）葡萄糖、3%（w/v）六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）及1 mM的MgCl2 作為反應組成物。於上述反應組成物中添加0.1 mg/ml的精製酶而於40℃至80℃下反應15分鐘，之後利用HPLC對葡萄糖-6-磷酸進行定量分析。
本實施例的結果如圖6所示，本申請案的酶於65℃至70℃附近表現出最大活性。此外，於跨及60℃至80℃的廣泛的溫度範圍內，表現出相對於最大活性為95%以上的活性（圖6）。
迄今為止所報導的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶中的源自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的酶已知為高溫活性及耐熱性酶，報導中顯示其最佳活性溫度為55℃（參考廖等，2012年，應用微生物學與生物技術93：1109-1117）。
因此，本申請案的源自嗜熱厭氧繩菌的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的最佳活性溫度為65℃至70℃，其為迄今為止所報導的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶中高溫活性最優異的酶。
實施例 6 ：與金屬離子對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶 活性的分析
已知迄今為止所報導的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶為了活性而需要Mg2+ 、Mn2+ 、Co2+ 及Zn2+ 等金屬離子。為了調查各金屬離子種類對本申請案的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的影響，使用於利用10 mM的四乙酸乙二胺（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）進行處理後透析所得的酶試樣。使用懸濁於50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液的2%（w/v）葡萄糖、1.5%（w/v）六偏磷酸鈉及1 mM的金屬離子（NiSO4 、CuSO4 、MnSO4 、CaCl2 、ZnSO4 、MgSO4 、MgCl2 、FeSO4 、NaCl、LiCl、KCl）作為反應組成物。於各反應組成物中添加去除金屬離子的上述酶試樣0.1 mg/ml而於60℃下反應15分鐘，之後利用HPLC對葡萄糖-6-磷酸進行定量分析。對未進行金屬離子處理的酶的活性與利用各金屬離子進行處理的情形時的酶活性進行比較分析。
本實施例的結果如圖7所示，源自嗜熱厭氧繩菌的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶為了活性而對Mg、Mn、Zn、Fe及Ni等表現出金屬離子需求性。與先前報導的酶相似，金屬離子中的鎂最有效，特別是於添加MgSO4 的情形時表現出最大活性（圖7）。
實施例 7 ：重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的溫度穩定性分析
為了對本申請案的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的溫度穩定性進行分析，於55℃至65℃的溫度範圍內按照多個時間對重組精製酶（0.2 mg/ml）進行熱處理，之後對酶的殘留活性進行比較分析。
使用懸濁於50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液的4%（w/v）葡萄糖、3%（w/v）六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）及1 mM的MgCl2 作為反應組成物。為了測定殘留活性，於上述反應組成物中添加按照各溫度進行熱處理的酶試樣0.1 mg/ml而於60℃下反應15分鐘，之後利用HPLC對葡萄糖-6-磷酸進行定量分析。
本實施例的結果如圖8所示，於55℃的溫度下，6小時後仍未表現出酶活性減少，但於60℃的溫度下，在經過4小時後，酶活性減少約49%。此外，可確認到於65℃的溫度下，在經過0.5小時後，酶活性亦保持約62%（圖8）。
迄今為止所報導的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶中的源自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的酶已知為耐熱性最優異的酶，報導中指出於在50℃下進行0.25小時的熱處理後，酶失去50%的活性。報導中用以提高耐熱性的固定化形態的酶（immobilized-enzyme）於2小時後失去50%的活性（參考廖等，2012，應用微生物學與生物技術93：1109-1117）。
因此，本申請案的源自嗜熱厭氧繩菌的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶於在60℃下進行4小時的熱處理後亦保持約51%的活性，因此於迄今為止所報導的酶中熱穩定性最優異的酶。
實施例 8: 各基質濃度下的轉化產率的分析
對葡萄糖及六偏磷酸鈉的各濃度下的葡萄糖-6-磷酸的轉化產率進行分析。使用懸濁於50 mM的Tris-HCl（pH 7.0）緩衝溶液的2%至15%（w/v）葡萄糖、1.5%至11.5%（w/v）六偏磷酸鈉及10 mM的MgSO4 作為反應組成物。於各反應組成物中添加10 U/ml至50 U/ml的精製酶而於55℃下反應12小時，之後利用HPLC對葡萄糖-6-磷酸進行定量分析。
本實施例的結果顯示，於利用2%（w/v）葡萄糖及1.5%（w/v）六偏磷酸鈉時，在反應12小時後表現出81%的轉化產率，於利用5%（w/v）葡萄糖及3.5%（w/v）六偏磷酸鈉時，在反應12小時後表現出78%的轉化產率，於利用10%葡萄糖及7%（w/v）六偏磷酸鈉時，在反應12小時後表現出77%的轉化產率，於利用15%（w/v）葡萄糖及10%（w/v）六偏磷酸鈉時，在反應12小時後表現出65%的轉化產率。
無
圖1是利用流程圖（flow-chart）表示本申請案的製備方法的圖。 圖2是使葡萄糖與ATP反應的反應式。 圖3是使葡萄糖與多磷酸鹽反應的反應式。 圖4是細胞粉碎上清液（CFE）、蛋白質大小測定標記（M）及精製的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶（PE）的蛋白質電泳（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE））分析結果。 圖5是表示與pH值對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的圖表。 圖6是表示與溫度對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的圖表。 圖7是表示與金屬離子的種類對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的圖表。 圖8是表示與熱處理溫度對應的重組多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶活性的圖表。
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Claims (22)

  1. 一種耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，其源自厭氧繩菌屬。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，其由序列編號1的脫氧核糖核酸序列表現。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，其具有序列編號2的胺基酸序列。
  4. 一種葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其包括源自厭氧繩菌屬的耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸鹽。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其以所述組成物的整體體積為基準而包括1重量%至3重量%的所述葡萄糖、1重量%至10重量%的所述多磷酸鹽以及10 U/ml至50 U/ml的所述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，使得轉化為葡萄糖-6-磷酸的轉化產率為70%以上。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其以所述組成物的整體體積為基準而包括5重量%至20重量%的所述葡萄糖、5重量%至12重量%的所述多磷酸鹽以及10 U/ml至50 U/ml的所述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶，使得轉化為葡萄糖-6-磷酸的轉化產率為50%以上。
  7. 如申請專利範圍第5項或第6項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其更包括鎂離子。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中所述鎂離子的濃度為0.2 mM至20 mM。
  9. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中於45℃至90℃的溫度及/或pH 4至pH 10的條件下製備所述葡萄糖-6-磷酸。
  10. 一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其由包括源自厭氧繩菌屬的耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸鹽的組成物製備葡萄糖-6-磷酸。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述葡萄糖是藉由將澱粉或纖維素液化或糖化所形成的。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸鹽為六偏磷酸鈉。
  13. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中於45℃至90℃的溫度及/或pH 4至pH 10的條件下執行所述葡萄糖-6-磷酸的製備。
  14. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述組成物更包括鎂離子。
  15. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的含量為10 U/ml至50 U/ml。
  16. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述葡萄糖以所述組成物的體積為基準而為0.1重量%至40重量%。
  17. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸鹽以所述組成物的體積為基準而為0.5重量%至25重量%。
  18. 一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其由包括源自厭氧繩菌屬的耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、糖化酶、澱粉及多磷酸鹽的組成物製備葡萄糖-6-磷酸。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的葡萄糖-6-磷酸的製備方法，其中所述糖化酶為α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶及α-葡萄糖苷酶中的一種以上。
  20. 一種重組表現載體，其包括編碼有如申請專利範圍第3項所述的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶的基因。
  21. 一種大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_at_ppgk（KCCM11814P），其特徵在於以包括序列目錄1的基因的重組表現載體轉形而成。
  22. 一種生產葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、肌醇-3-磷酸、肌醇、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺-6-磷酸、葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯神經胺酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、塔格糖-6-磷酸、塔格糖、阿洛酮糖-6-磷酸、阿洛酮糖、甘油醛3-磷酸、二氫丙酮磷酸中的任一種的方法，其包括藉由源自厭氧繩菌屬的耐熱性的多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶、葡萄糖或澱粉、多磷酸鹽與額外的酶進行反應。
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