KR101361688B1

KR101361688B1 - 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법

Info

Publication number: KR101361688B1
Application number: KR1020110081385A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 김영수
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2014-02-12
Also published as: KR20130019309A

Abstract

본 발명은 엔아세틸 글루코사민 2-에피어레이즈 (N-acetyl glucosamin 2-epimerase)를 이용하여 유당(lactose)으로부터 락툴로스(lactulose)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 유래의 엔아세틸 글루코사민 2-에피어레이즈유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환 된 미생물 및 효소를 이용하여 락툴로스를 얻는 생산 방법에 관한 것이다.

Description

엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법{Method for production of lactulose from lactose using N-acetyl glucosamin 2-epimerase}

락툴로스(lactulose)는 유당(lactose)의 포도당(glucose) 부분이 과당(fructose)로 대체된 유당의 이성질체 당으로서 천연에는 거의 존재하지 않는 당이다. 락툴로스는 소장에서 베타갈락토시다제에 의해 분해되지 않으며 대장에 도달하여 비피도박테리움을 포함한 여러 유산균에 의해 이용되어 대장의 pH를 저하시킴으로서 유해한 균의 성장을 억제하고 대장의 균총을 유익한 방향으로 개선하는 효과를 나타낸다. 또한 락툴로스는 비소화성 당이며 이들 당은 수용성 식이섬유로 작용을 하며 변비와 만성 간질환으로 인한 뇌질병의 치료에 이용되고 있다. 최근에는 lactulose가 폐경기 이후 여성의 칼슘 흡수를 촉진한다는 연구도 있다 (Eurpean Journal of Clinical Nutrition Vol 58 no 3 pp 462-466 (2004); Biochimica Biophysica Acta Vol 110 pp 635-636 (1965); Journal of Clinical Investigation Vol 75 no 2 pp 608-613 (1985),; Journal of Bone and Mineral Research Vol 14 no 7 pp 1211-1216 (1999)).그리고 산업적으로 락툴로스는 유당에 비해 감미도 및 용해성이 우수하여 제빵 및 제과 산업등에 유용하게 사용될 수 있다 (Bulletin of the International Dairy Federation Vol 212 pp 69-76(1987)).

이러한 락툴로스는 원유에는 존재하지 않고 열처리한 우유에 소량 함유되어져 있다. 락툴로스를 유당을 강알칼리 조건에서 이성화 시키는 화학적 방법과 베카갈락토시다제 (-galactosidase)의 갈락토스 전이활성을 이용한 효소학적 방법으로 생산할 수 있다 (Trend in Food Science and Technology Vol 18 no 7 pp 356-364 (2007); Enzyme and Microbial Technology Vol 38 no 4 pp 903-908 (2006)). 화학적 방법은 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨 등 강알칼리 화합물을 첨가하여 반응을 하고 중화 과정에서 강산을 사용하여 환경 오염을 유발할뿐 아니라 강알칼리 조건에서 생성된 락툴로스를 분해시키고 부산물이 생성되기 때문에 생산후 처리 과정 및 락툴로스 정제 과정이 복잡한 단점을 지니고 있다. 이에 반해 베타갈락토시다제를 이용한 효소학적 방법은 친환경적이고 부산물이 나오지 않기 때문에 정제가 간단한 장점을 가지고 있지만 낮은 수율이 문제시되어져 왔다. 또한 반응에 기질로서 유당뿐 아니라 과당을 함께 사용해야 하며 높은 기질 농도에서만 반응이 이루어 지기 때문에 경제적으로 비효율적이라는 단점이 있다. 그렇기 때문에 친환경적이고 유당 하나의 기질만 사용하여 높은 수율로 락툴로스를 생산할 수 있는 효소를 구하고 적용하는 연구가 필요하다.

관련 선행 특허로 대한민국 특허공개번호 제10-1989-0009961호는 고순도의 결정성 락툴로오스 및 이의 제조방법에 관한 것으로

(a) 수용액중의 락툴로오스의 농도가 50 내지 80중량%이고, 락토오스의 농도가 락툴로오스 농도의 5중량% 미만이며, 갈락토오스의 농도가 락툴로오스 농도의 5중량% 미만이고, 및 기타 탄수화물의 농도가 락툴로오스 농도의 4중량% 미만인 락툴로오스 수용액에 결정성 락툴로오스 씨드(seed)를 가하고; (b) 5 내지 40℃의 온도에서 10 내지 60시간 동안 수득된 락툴로오스 용액을 결정화하고; 및 (c) 수득된 결정성 락툴로오스를 건조시킴을 특징으로 하여, 순도가 98% 이상이며 락툴로오스 이외의 탄수화물의 농도가 2% 미만인 결정성 락툴로오스를 제조하는 방법이 기재되어 있으며,

또 다른 관련 선행 특허로 대한민국 특허공개번호 제 10-1989-0009959호는 고순도의 락툴로오스 시럽 및 이의 제조방법에 관한 것으로, a) 45 내지 55중량%의 락툴로오스를 함유하며 건조물질을 기본으로 한 락툴로오스 함량에 74 내지 81중량%인 시럽을 물로 희석하여 락툴로오스 함량이 15 내지 25중량%인 시럽을 수득하고, b)시럽을 브롬 또는 이작용성 붕소 수지로 전처리한 다음, c) b) 단계로부터 수득한 시럽을 통과된 시럽의 pH가 8 내지 10이 되도록 하는 조건하에서 강한 음이온 형태의 이온교환수지로 처리함을 특징으로 하여 고순도의 락툴로오스를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

이에 본 발명자들은 환경 친화적인 방법으로 안정하게 보다 효과적으로 락툴로스(lactulose) 를 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주들에서 발견되는 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈가 유당(lactose)으로부터 락툴로스(lactulose)를 생산할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 목적은 환경 친화적인 방법으로 안정하게 보다 효과적으로 락툴로스(lactulose) 를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 환경 친화적인 방법으로 안정하게 보다 효과적으로 락툴로스(lactulose) 를 생산하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a)서열번호 1 내지 10의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 단계;b)상기 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환된 미생물로부터 락툴로스 생산에 사용되는 효소액을 얻어서 기질을 처리하는 단계를 포함하는 락툴로스(lactulose)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 유전자는 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 기질은 유당 (lactose)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,

상기 효소와 기질 반응은 pH 6.5 내지 pH 8.5 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 65 내지 90℃의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 기질 농도는 50 내지 700 g/L 범위인 것이 바람직하다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고;

b) 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;

c) 상기 유전자의 발현을 유도하고;

d) 발현된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 과정을 포함하는

엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 '엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈'는 '셀로비오스 2-에피머레이즈'로 혼용될 수도 있다.

또 본 발명은 서열번호 31 내지 40에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 유효성분으로 포함하는 락툴로스(lactulose) 제조용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 a)서열번호 1 내지 10의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 단계;b)상기 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환된 미생물로부터 에피락토스(epilactose) 생산에 사용되는 효소액을 얻어서 기질을 처리하는 단계를 포함하는 에피락토스(epilactose)의 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 31 내지 40에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 유효성분으로 포함하는 에피락토스(epilactose) 제조용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주로부터 유래하고, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET28a(+)를 제공한다.

또한, 본 발명은 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주로부터 유래한 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase)를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 이알(ER) 2566 pET28a(+)/N-acetyl glucosamin 2-epimerase를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 락툴로스의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 pET28a(+)를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 어느 벡터라도 사용될 수 있고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 미생물로는 대장균 ER 2566을 사용하는 것이 바람직하나 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고; (3) 상기 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase) 유전자의 발현을 유도하고; 및 (4) 발현된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는; 과정을 포함하는 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈(N-acetyl glucosamin 2-epimerase)를 얻는 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 가) 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 30의 프라이머를 가지고 PCR을 실시하여 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈 유전자를 포함하는 DNA 절편을 증폭한 다음; 나) 증폭된 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈 유전자를 포함하는 DNA 절편에 제한효소 를 처리한 후 발현벡터인 pET28a(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET28a/엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈를 제작하고; 다) 이를 통상적 형질전환방법으로 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하고; 라) 형절전환 된 대장균을 배양한 다음 과발현을 유도하여 엔글루코사민 2-에피머레이즈를 생산하고; 및 마) 발현된 엔글루코사민 2-에피머레이즈를 분리하여 정제한다.

또한, 상기 마) 과정에서 발현된 엔글루코사민 2-에피머레이즈 단백질은, (a) 상기 미생물을 파쇄하고; (b) 상기 세포 파쇄물은 원심분리 하여 상등액을 얻고; (c) 상기 상등액을 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography)로 분리하는; 과정으로 효소액을 분리 정제할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조되는 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 이용하여 락툴로스를 고수율로 얻는 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 조효소를 첨가하지 않고 락툴로스를 특징적으로 합성할 수 있는 상기 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 락툴로스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈는 상기와 같이 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 과정으로 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 락툴로스는 기질로서 유당(lactose)를 사용하여 합성되는 것이 바람직하고 상기 기질의 농도는 50 g/L 내지 700 g/L 범위인 것이 바람직하고, 700 g/L 내의 범위인 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 효소 반응 시간은 통상적인 방법에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명은 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 대량으로 얻는 제조방법, 그리고 상기 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 이용하여 락툴로스를 고수율로 얻는 생산 방법을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 락툴로스의 제조방법은 종래의 효소적 방법과 비교하여 과당의 첨가 없이 유당으로부터 락툴로스를 고수율로 생산할 수 있으므로 기능성 식품 및 의약품 등의 제조시 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈들의 락툴루스 생산에 대한 최적 pH를 나타낸 표이다.
도 2는 본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈들의 락툴루스 생산에 대한 최적 온도를 나타낸 표이다.
도 3은 본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈들의 효소양 에 따른 락툴로스 생산량을 나타낸 것이고,
도 4는 기질 농도에 따른 락툴로스 생산량을 나타낸 표이다
도 5a부터 5j는 본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈들에 의한 기질농도 700 g/L에서 반응 시간에 따른 락툴로스의 생산량을 각각 나타낸 것이다(○: Lactose; ●: Lactulose; ■: Epilactose). 도 5a는 에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 도 5b는 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725),도 5c는 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 도 5d는 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 도 5e는 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 도 5f는 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 도 5g는 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 도 5h는 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 도 5i는 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 도 5j는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571)를 나타냄.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 셀로비오스 2- 에피머레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 제조하기 위하여, 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주로부터 유래한 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 유전자를 먼저 분리하였다.

구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 각각 서열번호 1 내지 10의 염기서열을 포함하는 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725), 칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 (Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 (Caldicellulosiruptor kristjanssonii), 칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 (Caldicellulosiruptor obsidiansis), 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum), 페니바실러스 (Paenibacillus sp.), 로도써머스 마리너스 (Rhodothermus marinus DSM 4252), 스피로케타 써모필라 (Spirochaeta thermophila DSM 6192), 또는 써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571) 유전자의 서열을 기초로 하여 하기 서열번호 11 내지 30의 프라이머들(primers)을 고안 제작하였다.

언에어로리네 써모필라 ( Anaerolinea thermophila )

(정방향 프라이머): 5'-TTCATATGATGGAGATCCGTATGCTCAG-3'(서열번호 11)

(역방향 프라이머): 5'-TTCTCGAGTCACTCTCTTGACGATTGCGAG-3'(서열번호 12)

칼디셀룰로시럽토 베시 ( Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGATATTACAAAGTTTAA-3'(서열번호 13)

(역방향 프라이머): 5'-TTGTCGAGTCAACCAACTCTCTTTATTAT-3'(서열번호 14)

칼디셀룰로시럽토 하이드로써머리스 ( Caldicellulosiruptor hydrothermalis )

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGATATTACAAGGTTTAA-3'(서열번호 15)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTTAGTCAACCCTTTTTATTATC-3'(서열번호 16)

칼디셀룰로시럽토 크리스트잔쏘니 ( Caldicellulosiruptor kristjanssonii )

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGATATTACCAGGTTTAA-3'(서열번호 17)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTTAACCAACTCTCTTTATTA-3'(서열번호 18)

칼디셀룰로시럽토 옵시디안시스 ( Caldicellulosiruptor obsidiansis )

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGATATTACCAGTTTTAA-3'(서열번호 19)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTTAACCAACTCTCTTTATTAT-3'(서열번호 20)

딕티오글루모스 터기듐 ( Dictyoglomus turgidum )

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGATTTAAAAGTTTTAAA-3'(서열번호 21)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTTAAATCCTTTTTATTACCT-3'(서열번호 22)

페니바실러스 ( Paenibacillus sp .)

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGACAATGACTTTACATAC-3'(서열번호 23)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTTAGAGCTTGCTGCTTACAT-3'(서열번호 24)

로도써머스 마리너스 ( Rhodothermus marinus DSM 4252)

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGAGCACGGAAACCATCCC-3'(서열번호 25)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCCTACCGGGATCGAGCGTGTT-3'(서열번호 26)

스피로케타 써모필라 ( Spirochaeta thermophila DSM 6192)

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGCCTCTTCCCACTACCCT-3'(서열번호 27)

(역방향 프라이머): 5'-TTGAATTCTCATCTTCGTTCCTCCTCGA-3'(서열번호 28)

써모언에어로박테리운 써모싸카로리튬 ( Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571)

(정방향 프라이머): 5'-TTGCTAGCATGGAGAAAATAGCACAGGA-3'(서열번호 29)

(역방향 프라이머): 5'-TTCTCGAGTTAAACCTCATTGCCTTTCAC-3'(서열번호 30)

상기 프라이머는 각각 엔디이 원(Nde I, 언더라인), 엔에이치이 원 (Nhe I, 언더라인), 엑스에이치오 원(Xho I, 언더라인), 그리고 이코알원 (EcoR I, 언더라인) 제한효소 절단부분으로 설계되었으며, 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다.

대량으로 얻은 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈 유전자는 각각의 제한효소를 사용하여 벡터 pET28a(+)(Novagen사 제품)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 발현 벡터 pET28a(+)/엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 이알(ER) 2566 균주에 형질전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerin) 용액에 첨가하여 락툴로스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동보관 하였다. 상기 재조합 대장균은 E. Coli ER2566 pET28a(+)/엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 균주로 명명하였다.

실시예 2. 엔아세틸 글루코사민 2- 에피머레이즈의 제조

본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 상기 실시예 1의 재조합 대장균 ER 2566 균주들을 LB 배지 3ml가 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고, 600nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 20 μg/ml의 kanamycin 항생제가 첨가된 LB 배지 500 ml이 들어있는 2,000 ml 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다.

또한, 600nm에서 흡광도가 0.5가 될 때, 0.1 mM 아이피티지(IPTG)를 첨가하여 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈의 대량 발현을 유도하였다. 이때 교반 속도는 200 rpm, 배양온도는 37℃가 유지될 수 있도록 조절하였으며, ITPG 첨가 후에는 교반 속도 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하여 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 50 mM 제일일산나트륨, 300 mM 염화나트륨, 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물을 다시 13,000 g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 제거하고 세포 상등액만 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 히스텍(His-tag)을 이용한 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 흡착 컬럼을 장착하여 락툴로스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 3. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈 활성에 미치는 pH 및 온도 효과 조사

본 발명의 락툴로스 생산에 있어 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈의 pH 및 온도에 따른 활성 변화를 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

3-1. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈 활성에 미치는 pH 효과

먼저, 락툴로스 생산에 있어서 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 활성에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 50 g/L 유당, 1 mg/ 효소가 포함된 50 mM 피페스(piperazine-N,N'-bis(2-ethane sulfonic acid), PIPES) 완충용액과, 50 g/L 유당, 1 mg/ 효소가 포함된 50 mM 이피피에스(N-(2-hydroxyethyl piperazine-N-(3-propane sulfonic acid, EPPS) 완충용액을 사용하여 pH 6.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하되, 65-80℃에서 10분 동안 효소 반응을 실시한 후 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 1 에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 7.0-8.0인 것을 확인하였다.

3-2. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈 활성에 미치는 온도 효과

락툴로스 생산에 있어서 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈 활성에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응 온도를 60에서 90℃ 범위까지 변화시키면서 50 g/L 유당, 1 mg/ml 효소가 포함된 50 mM EPPS 완충용액을 사용하여 각각 20분 동안 실시한 후 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켰다.

그 결과, 최적 온도는 65-80℃임을 확인하였다(도 2 참조).

실시예 4. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈의 효소 양 및 기질 농도에 따른 락 툴로스 생산성 확인

4-1. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈 효소 양에 따른 락툴로스 생산

본 발명의 락툴로스 생산에 있어 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈의 효소양에 따른 락툴로스 생산을 확인하기 위하여 기질로서 400 g/L 유당 및 0.5에서 10 mg/ml 효소가 포함된 50 mM PIPES 완충용액 에서 2 시간 동안 온도 75℃로 효소 실시한 후 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켜 락툴로스 생산을 비교하였다.

그 결과, 도 3에서와 같이 3-7 mg/ml 이상의 효소 농도에서 최고의 락툴로스 생산을 확인할 수 있었다.

4-2. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈 기질농도에 따른 락툴로스 생산

본 발명의 락툴로스 생산에 있어 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈의 효소양에 따른 락툴로스 생산을 확인하기 위하여 기질로서 50 - 700 g/L 유당을 사용하여 10 mg/ml 효소가 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.5)에서 2 시간 동안 온도 75℃로 효소 실시한 후 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켜 락툴로스 생산을 비교하였다.

그 결과, 도 4에서와 같이 기질 농도가 높을수록 높은 락툴로스 생산을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 엔아세틸글루코사민 2- 에피머레이즈를 이용한 락툴로스의 생산성 확인

본 발명의 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 락툴로스의 생산성을 확인하기 위하여, 기질로서 700 g/L 유당 및 3-7 mg/ml 효소가 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.5)에서 4 시간 동안 온도 각각 효소의 최적 온도로 효소 반응을 수행하였다. 매시간 효소 반응액을 수집하고 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, HPLC를 통하여 락툴로스 생산량을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이 반응 2-3 시간 후에 700 g/L의 유당에서 350-420 g/L의 락툴로스가 생산되어 시간당 150-208.5 g/L의 생산성과 50-59% 전환수율을 나타내었다. 그리고, 락툴로스 생산에 있어서 락툴로스 이외에도 유당의 글루코스가 만노스(mannose)로 전환된 에피락토스(epilactose)도 함께 생산당으로 생산되었으며, 2시간 동안 약 60-100 g/L 가 생산되었다.

현재까지 보고된 효소를 이용한 락툴로스의 생산은 기질로서 유당과 과당을 혼합하여 베타갈락토시다제에 의해서 락툴로스를 생산하는 방법에 대한 보고 (Enzyme and Microbial Technology Vol 38 no 4 pp 903-908 (2006); Applied Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 787-793 (2004); Food Resource International Vol 43 pp 716-722 (2010))가 전부이며 효소를 이용하여 유당만을 기질로 사용하여 락툴로스를 생산하는 보고는 본 보고가 처음이다.

이는 본 발명에 따른 엔아세틸글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 락툴로스 생산 방법은 과당의 혼합으로 인한 추가 비용 없이 유당으로부터 락툴로스를 고수율로 생산하는 방법으로 친환경적이며 경제성이 있어서 기존의 락툴로스를 생산하는 방법보다 많은 경쟁력을 보유하고 있다고 할 수 있다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

a)서열번호 6의 염기서열을 함유한 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 단계;
b)상기 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계; 및
c) 상기 형질전환된 미생물로부터 락툴로스 생산에 사용되는 효소액을 얻어서 기질을 처리하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 기질은 유당 (lactose)이고, 상기 효소와 기질 반응은 pH 7.5, 및 80℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 락툴로스(lactulose)의 제조방법
제 1항에 있어서,
상기 유전자는 딕티오글루모스 터기듐 (Dictyoglomus turgidum) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 락툴로스(lactulose)의 제조방법.
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제 1항에 있어서,
상기 효소와 기질 반응에서 기질 농도는 50 내지 700 g/L 범위인 것을 특징으로 하는 락툴로스(lactulose)의 제조방법.
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