JP6209526B2

JP6209526B2 - Ｄ−アロースの生産方法

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Publication number: JP6209526B2
Application number: JP2014544561A
Authority: JP
Inventors: プシュパキラングラッパリ; 知也新谷; 幸史西本; 幸一原園
Original assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Nagase Chemtex Corp; Nagase and Co Ltd
Current assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Nagase Chemtex Corp; Nagase and Co Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2017-10-04
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: EP2918677A1; US20150284759A1; EP2918677B1; JPWO2014069537A1; WO2014069537A1; CN104769109A; KR20150076257A; EP2918677A4

Description

本発明は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の新規用途、すなわちＤ−プシコースをＤ−アロースへと異性化する酵素の用途に関する。
本発明は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物の生産する上記酵素の有する糖異性化反応を触媒する触媒機能を明らかにしたものであり、該新規触媒機能を利用してＤ−アロースを生産する技術に関する。

単糖類は還元基（カルボニル基）の状態によりアルドース（カルボニル基としてアルデヒド基を持つ糖）、ケトース（カルボニル基としてケトン基を持つ糖）、糖アルコール（別名：ポリオール、カルボニル基を持たない糖）に大別される。単糖類には「希少糖」といわれるものがある。希少糖とは、国際希少糖学会の定義によれば自然界に希にしか存在しない糖と定義されており、その種類によっては、有機化学的合成方法における収量も少ないものも多い。そのため、アロースを含めたアルドヘキソース（アルドース）希少糖の効率的な製造方法の開発とその特異な性質が探求されているのが現状である。

希少糖が生理活性を有することは知られている。例えば、Ｄ−アロースの誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤が開示され（特許文献１）、糖類の活性酸素に対する性質を利用したものでは、例えば、活性酸素を抑制する性質を有する多糖類を含有させた活性酸素産生抑制剤は知られている（特許文献２）。

プシコースは、還元基としてケトン基を持つ六炭糖であり、近年、エピメラーゼの出現により比較的入手が容易となった糖である。Ｄ−プシコースは、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化粧品・医薬品の原料・中間体などとして有効に利用できることが示唆されている。プシコースの試薬・医薬品等の中間原料としての応用例としては、例えば、Ｄ−プシコースを原料としたヒダントイン誘導体の合成例が報告されている（非特許文献１）。

Ｄ−アロースはＤ−プシコースから製造することができる。例えば、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生産することができる酵素であるイソメラーゼを利用したＤ−アロースの製造に関する特許文献には、例えば、異性化を触媒する酵素の作用で基質希少糖から目的希少糖へ変換し、得られる原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。（特許文献３）や、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＩＰＯＤＦＥＲＭＢＰ−０８５９３）由来のＬ−ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を作用させてＤ−アロースへと異性化するＤ−アロースの生産方法（特許文献４）が提案されている。

また、Ｄ−プシコースおよび／またはＬ−プシコースを含有する溶液にＤ−キシロース・イソメラーゼを作用させて、Ｄ−プシコースからはＤ−アロースとＤ−アルトロースを、Ｌ−プシコースからはＬ−アルトロースを生成せしめ、これらＤ−アロース、Ｄ−アルトロースおよびＬ−アルトロースから選ばれる１種または２種以上のアルドヘキソースを採取するアルドヘキソースの製造方法が提案されている（特許文献５）。

特公昭５９−４０４００号特開平０７−２８５８７１号公報特開２００６−１５３５９１号公報特開２００８−１０９９３３号公報特開２００２−１７３９２号公報国際公開ＷＯ２００７−０５８０８６号米国特許５，６２０，９６０（１９９９）特開２００９−１５３５１６号公報

Tetrahedron, 47, No.12/13, p2113 (1991) J. Bacteriol.,73:410-414 (1956). J. Biosci Bioeng., 96:89-91 (2003). Davis et al.,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986 Methods Carbohydr. Chem., 1:102-104 (1962). Carbohydr. Res., 24:192-197 (1972). J. Ferment Bioeng., 8: 539-541 (1998). J. Mol. Biol., 300:917-933 (2000).

これまで各種の微生物からＤ−アロースを製造する技術は開発されてきたが、その微生物の安全性に問題があるため食用のＤ−アロースの生産への実用化が困難であった。そこで、従来、安全性に問題のない微生物由来の酵素を用いて希少糖を生産することが求められていた。
希少糖の製造に関しては、例えば、シュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｉｃｈｏｒｉｉ）由来のＤ−ケトへキソース３−エピメラーゼを利用することによりＤ−フラクトースからＤ−プシコースが製造できることが知られている。しかしながら、シュードモナス・チコリは植物病原性微生物であるから食品用途に利用する上で適しているとは言えない。リゾビウム属に属する微生物によるＤ−プシコースの製造も提案されている（特許文献６）が、リゾビウム属に属する微生物は、植物病原性微生物の場合もあり、食品用途に使用する菌としては望ましくない。また、これら技術は、いずれもＤ−プシコースを生産する技術であって、Ｄ−アロースを生産するものではない。

こうした従来技術の安全性に関する問題点を解決するために、本発明は、食品を製造する際に使用が認められている既存添加物名簿収載品目リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないと推定できる菌種から、高い収率でＤ−プシコースからＤ−アロースへの異性化を触媒するイソメラーゼを取得すること、その酵素を用いたＤ−アロースの製造方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、既存添加物として食品の製造に問題なく使用できる可能性が高い放線菌から得られる新規な酵素によりＤ−アロースを製造する方法を提供するものである。

本発明者らはこうした従来技術の問題点である安全性に関する懸念のないＤ−アロースを産生する微生物、つまりは、微生物が生産する当該酵素を求めて研究を積み重ねることにより本発明に到達したのである。すなわち、本発明は、土壌より放線菌を単離してライブラリーを作成し、その中から、Ｄ−プシコースからＤ−アロースに転換する作用を有する酵素を見出したことに基づくものである。放線菌は既存添加物酵素の起源微生物として食品製造に問題なく使用できる可能性が高いことから、放線菌から得られるイソメラーゼは非常に有用なＤ−アロースの大量生産手段となりうる。

すなわち具体的には、本発明は以下の技術的事項からなる。
（１）Ｄ−プシコースに下記（１）または（２）のいずれかのタンパク質を作用させてＤ−アロースへと異性化することを特徴とする、Ｄ−アロースの生産方法。
（１）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（２）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、以下（ａ）および（ｄ）の活性を有するタンパク質。
（ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する活性を有する。
（ｄ）Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、およびＬ−アラビノースに対して反応性を有する。
（２）前記（２）のタンパク質が、以下（ｂ）および（ｃ）の性質を有するタンパク質である、上記（１）に記載のＤ−アロースの生産方法。
（ｂ）作用ｐＨは６．０〜１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ｃ）作用温度は１０〜８０℃であり、至適温度は６０℃である。

（３）上記（１）に記載の配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号３もしくは配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡを含むそれぞれの組換えベクターで、宿主細胞を形質転換して得られた組換えタンパク質である、上記（１）に記載のＤ−アロースの生産方法。
（４）Ｄ−プシコースが、Ｄ−フラクトースをエピ化して生産したものである上記（１）に記載のＤ−アロースの生産方法。

（５）Ｄ−プシコースが、Ｄ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産したものである上記（１）に記載のＤ−アロースの生産方法。
（６）Ｄ−プシコースが、未利用資源からＤ−グルコースを得て、そのＤ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産したものである上記（１）に記載のＤ−アロースの生産方法。
（７）目的とするＤ−アロースがＤ−プシコースとＤ−アロースの混合物である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のＤ−アロースの生産方法。

本発明により、すなわち、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の酵素タンパク質を使用することにより、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換すること、好ましくはＤ−プシコースからＤ−アロースを生産すること、が可能となった。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する、好ましくはＤ−プシコースをＤ−アロースへと異性化する酵素を提供することができ、また、それを使用することによりＤ−アロースを生産することが可能となった。
本発明により、菌体培養物の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩であり、Ｄ−プシコースを異性化してＤ−アロースを産生する酵素とその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。また、本発明は、最も安価に大量に入手できるＤ−グルコースや、フラクトースを原料としてＤ−プシコース経由でＤ−アロースの製造を可能とした。

実施例１の組換え型イソメラーゼの構成（制限酵素地図）を示す図である。本酵素活性へ及ぼす金属イオンの影響を示す図である。至適酵素活性に及ぼす温度の影響 (a)と１時間保温後の安定性(b) を示す図である。至適酵素活性に及ぼすｐＨの影響 (a)と２４時間保温後の酵素安定性（ｂ）を示す図である。本発明の酵素の基質特異性を示す図である。反応前(Ｄ−プシコース)と反応後(Ｄ−プシコース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−アロース混合液)のＨＰＬＣ分析を示す図である。

Ｄ−アロースは非常に有用な希少糖のひとつであり、ガン細胞の増殖抑制に重要な役割を果たす。ＡｒｎｏｌｄとＳｉｌａｄｙは、Ｄ−アロースが、他の有害な臨床的影響を及ぼさずに、実質的に分節核好中球の産生を阻害し、血小板数を下げるということを報告しており（特許文献７）、活性酸素の産生を阻害する報告もある(非特許文献３)。Ｄ−アロースについては、ここ数年、特に抗癌作用について多くの研究がなされている。そこで、本発明者らは、この有用なＤ−アロースを大量にかつ安全に製造できる手法として、食品製造に用いることのできる安全な菌種から、Ｄ−プシコースをＤ−アロースへと変換する酵素を得ることを目的とし、鋭意研究を試みた。
Ｄ−プシコースからＤ−アロースへの異性化反応を触媒する酵素のひとつとしては、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ（Ｌ−ＲｈＩ, Ｅ.Ｃ: ５.３.１.１４）があり、これは本来、Ｌ−ラムノースを相応するケトースであるＬ−ラムニュロースへ可逆的に異性化する反応を触媒する酵素で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（非特許文献２)において知られているが、食品製造に安全に利用できる菌とは言えない。
よって、本発明者らは、この産業的に有望なＤ−アロースの生産をより容易にする手法を確立する目的で、土壌より放線菌を単離してライブラリーを作成し、そのライブラリーよりＤ−プシコースからＤ−アロースへ変換するイソメラーゼを生産する菌を探索した。

本発明におけるＤ−プシコースからＤ−アロースを生産することができる酵素としては、上記のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは微生物由来の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＤ−プシコースからＤ−アロースに変換する活性を有するタンパク質を用いる。
通常、得られた培養菌体から目的とする酵素を抽出し、そのままで反応に用いることができるが、好ましくは固定化した形態で用いる。固定化の対象とする上記の活性を有する酵素そのものは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記の活性を有する酵素産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。

上記固定化酵素は、例えば本発明の目的とする酵素を担体結合法、架橋法、または包括法等の定法によって固定化して用いることができる。これは、酵素に限定せず、菌体そのものや粗酵素を樹脂等の担体に対して固定化等することで得られる。固定化によって、これまで１週間ほどの安定性であったものが数ヶ月の安定性を持つ固定化酵素を得ることができる。
例えば、本発明の目的とする酵素および／または微生物を、担体結合法のうちのひとつである共有結合法によって固定化した固定化酵素および／または固定化微生物に、５０％エタノールを含むＤ−プシコース溶液を通液することで、反応時は４２℃、結晶化時は４℃というように、温度をコントロールすることによりＤ−アロースの結晶を連続的に製造することができる。また、その結晶化後のろ液をエタノール除去、濃縮することなしに上記の固定化酵素および／または固定化微生物に再度通液することで、再度連続的にＤ−アロースを製造することができる。
これは、Ｄ−プシコースとＤ−アロースの混合溶液に、エタノールを添加することでＤ−アロースのみを分離することができる画期的な方法であり、しかも、酵素反応に用いる緩衝液を除く必要もなく、分離過程を大幅に省力化し、効率化できるという非常に大きなメリットがある。５０％Ｄ−プシコースを原料にして酵素反応でＤ−アロースを生産した場合、生産物は、３５％Ｄ−プシコースと１５％Ｄ−アロースの混合溶液として得られるので、酵素反応産物から迅速にＤ−プシコースとＤ−アロースを分離して高純度のＤ−アロースを得ることが可能となる。
本発明において、例えば、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生産する場合の酵素反応は、通常、下記の条件で行われる。即ち、基質としてＤ−プシコースを含有する溶液として、通常、水溶液を用い、その基質濃度は、１〜６０ｗ／ｖ％、望ましくは、１０〜５０ｗ／ｖ％、さらに望ましくは２０〜４０ｗ／ｖ％の範囲から適宜選ばれる。酵素反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、１０〜８５℃、望ましくは４０〜８０℃、より望ましくは至適温度６０℃から選ばれる。同様に、酵素反応ｐＨは６．０〜１１．０、より望ましくは至適ｐＨ９．０から選ばれる。酵素活性は基質グラム当り１単位以上、望ましくは、５０〜５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、使用する基質量、酵素量、温度、ｐＨ条件等により変動するが、固定化酵素ではなくバッチ式を採用する場合を例に挙げるとすれば、経済性を考慮して、約２〜１００時間、望ましくは約５〜５０時間の範囲で行うことが望ましい。

本発明は、Ｄ−プシコースに、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の活性を有するタンパク質を作用させてＤ−アロースへと異性化することを特徴とするＤ−アロースの生産方法に関するものであり、安全性の高い放線菌から産生されるＤ−プシコースからＤ−アロースを生産する酵素によりＤ−プシコースからＤ−アロースを製造する。
（ａ）配列番号１もしく配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
上記タンパク質のＬ−ラムノースイソメラーゼ活性は、以下の（d）〜（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである。
本発明の酵素活性は、以下の（d）〜（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである。
（ｄ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
作用ｐＨは６．０〜１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ｅ）作用温度および至適温度
作用温度は１０〜８０℃であり、至適温度は６０℃である。
（ｆ）Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、およびＬ−アラビノースに対して反応性を有する。

［Ｄ− プシコース］
本発明で使用するＤ−プシコースは様々な方法で製造することができるが、例えば、Ｄ−フラクトースをエピ化して生産する、Ｄ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産する、Ｄ−プシコースが、未利用資源からＤ−グルコースを得て、そのＤ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産する、などを挙げることができる。

本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によってなんら限定されるものではない。

［Ｄ−プシコースからＤ−アロースへの変換能を有する酵素の生産菌株の取得］
環境から採取した土壌０．１ｇを滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁した。この懸濁液を滅菌蒸留水で５０倍希釈し、その０．１ｍＬを放線菌分離培地に接種し、３０℃で３日間培養した。現れたコロニーをピックアップ（約２００株）した。放線菌分離培地は表１の組成の放線菌培地を用いた。

次に、得られた約２００菌株を、試験管に入れた下記に示す生産培地５ｍＬにそれぞれ植菌し、２８℃、振とう速度２２０ｒｐｍの条件下で振とう培養した。培養７日目にそれぞれの培養液を１５ｍＬずつ遠心管に回収し、ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬに懸濁し、ＨＥＡＴＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）、ＤＵＴＹＣＹＣＬＥ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収して粗酵素液とした。この粗酵素液のタンパク濃度を０．１０ｍｇ/５０μＬとなるよう調整したものを「酵素試料」とし、以下、酵素活性測定に用いることとした。

［生産培地組成］
糖培地（１．０％Ｄ−プシコース、０．１％Ｄ−タガトース、０．１％グリセロール）とミネラル培地（０．２６％硫酸アンモニウム、０．２４％リン酸二水素カリウム、０．５６％リン酸水素二カリウム、０．０１％硫酸マグネシウム７水和物、０．０５％酵母エキス：ｐＨ７．０）のそれぞれを１２１℃、２０分間滅菌処理して等量ずつを無菌的に混合調製する。

[酵素活性の確認方法]
上記方法で得た酵素試料を用いて、各酵素試料のイソメラーゼ活性は、ＨＰＬＣ法または／およびシステインカルバゾール法（ＣｙｓｔｅｉｎｅＣａｒｂａｚｏｌｅ法）により確認した。
ＨＰＬＣ法：表２に示される組成で酵素反応させた後、１００℃・２分間の処理により酵素反応を停止させ、室温まで冷却してからイオン交換樹脂およびフィルターによる精製処理を施し、ＨＰＬＣに供する試料とした。このＨＰＬＣ用試料を、三菱化学株式会社製ＣＫ０８ＥＣカラム（８０℃）に供し、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎの純水で溶出させて、東ソー株式会社製検出器ＲＩ−８０２０にて生成する糖組成を測定した。
システインカルバゾール法：表２に示される組成で反応させた後、反応液を１００℃・２分間の処理により酵素反応を停止させ、室温まで冷却してから、５００μＬの酵素反応溶液に５０μＬの１０％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。この試料５５０μＬに、１００μＬシステイン溶液と３ｍＬの７０％硫酸を加えて２０℃で１分間保温後、さらに１００μＬのＣａｒｂａｚｏｌｅ溶液を加えて３５℃で２０分間加温し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、生成する糖組成を測定した。

上記一連の手順により、目的とする酵素活性の高い２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７２０株。属は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列から同定した。）を得た。これらの菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７２０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、それぞれ平成２４年（２０１２年）１０月１０日付け（原寄託日）で受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１４２３、ＮＩＴＥＢＰ−０１４２４の下でブタペスト条約に基づき国際寄託されており、そこから入手可能である。なお本寄託の７１０株は平成２５年（２０１３年）１０月７日に、７２０株は平成２５年（２０１３年）１０月３０日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求し、受領された。そして、それらの２株について２５年（２０１３年）１０月３０日に国際寄託の受託証が発行された。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７２０株からショットガンクローニングを行った。
［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体の調製］
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株（または７２０株）を０．５％のグリシンを加えたトリプティック・ソイ・ブロス培地（ベクトン・ディッキンソン社製）（５０ｍＬ）で３０℃、１６０ｒｐｍで２日間培養し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。ＴＳ緩衝液（１０．３％スクロース、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）（３０ｍＬ）で菌体を洗浄し、再び遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。ついで、０．５％リゾチームと０．００２％Ｎ−アセチルムラミダーゼ入りＴＳ緩衝液（１０ｍＬ）を菌体に加え、３７℃、６０分静置した。プロトプラスト状になった菌体溶液に、１０％ＳＤＳ水溶液（２．４ｍＬ）と２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ入りＴＳ緩衝液（０．４ｍＬ）を加え、ゆっくり撹拌した後、３７℃、６０分静置して、さらに５０℃、３０分静置した。ここに、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）と６５℃に加温した１０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイドの０．７Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１．６ｍＬ）を加え、ゆっくり撹拌した後、６５℃、２０分静置した。そして、クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２４：１、２０ｍＬ）を加え、ピペットで撹拌した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、上層に上層の０．６倍量のイソプロピルアルコールを加え、生じた沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。真空乾燥後、沈殿は、Ｒｎａｓｅ（０．５ｍｇ）を加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ. ７１０株（または７２０株）の染色体溶液を調製した（４℃で保存）。

［染色体の部分分解］
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体溶液（４０．４μＬ）に１０×Ｈ緩衝液（タカラバイオ社製）（４．６μＬ）と０．２５ユニットの制限酵素Ｓａｕ３AＩを加え、４０分、３７℃で静置した。０．５ＭＥＤＴＡ水溶液（５０μＬ）を加え、０．５％低融点アガロースゲルで電気泳動して、２３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を含むアガロースゲル分画を切り出した。切り出したゲルブロックは、蒸留水（５０ｍＬ）に入れ、ゆっくりと１５分振とうし、もう一度同じ操作を繰り返した。ゲルブロックの重量に対し、最終濃度が１×になるように１０×β-アガラーゼの緩衝液を加え、６８℃で、融解するまで静置した。融解させた後、１０分、４０℃で静置して、β-アガラーゼ（ゲル０．５ｇあたり３ユニット）を加え、６０分、４０℃で静置した。そして、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を終濃度０．５Ｍになるように加え、氷上で１５分静置して、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後、上清に上清の３倍量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分静置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿を真空乾燥した後、蒸留水（８μＬ）に溶解した。ここに１０×アルカリフォスファターゼ緩衝液（１μＬ）とアルカリフォスファターゼ（１μＬ）を加え、６０分、３７℃で静置した。ついで蒸留水（９０μＬ）とフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１、１００μＬ）を加え、撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）した。上層に上層の３倍量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分静置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体の部分分解ＤＮＡ断片を含む沈殿を真空乾燥した後、蒸留水（５μＬ）に溶解した。

［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株（または７２０株）染色体のコスミドライブラリーの作製］
放線菌−大腸菌シャトルコスミドベクターｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ（尾仲宏康（ＨｉｒｏｙａｓｕＯｎａｋａ）ら、「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ.Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、２００３年、５６巻、９５０−９５６頁に記載）の１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで分解し、アガロースゲルで電気泳動し、８．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル分画を切り出した。切り出したゲルブロックから、ジンクリーンキット（Ｑバイオジーン社製）でＤＮＡ断片を精製し、蒸留水（２．５μＬ）に溶解した。ここに実施例で得たＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ. ＸＰ−７１０株およびＸＰ−７２０株の染色体の部分消化ＤＮＡ断片水溶液（５μＬ）を加え、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）（７．５μＬ）を加え、１７時間、１６℃で静置した。ついで、このライゲーション溶液中のプラスミドをギガパックIIIパッケージングエクストラクトキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で、接合性大腸菌に導入した。カルベニシリン入り（５０μｇ／Ｌ）のＬＢ寒天培地で３０℃、２日間、プラスミドの入った大腸菌を培養し、生育した形質転換体（大腸菌）から１，０００コロニーを釣菌して別のカルベニシリン入り（５０μｇ／Ｌ）のＬＢ寒天培地で３０℃、１日間、培養した。

［大腸菌コスミドライブラリーから放線菌へのプラスミドの導入］
実施例４で取得したコスミドプラスミドが入った大腸菌１，０００コロニーを、それぞれ１コロニーずつカナマイシン入り（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢ培地（５ｍＬ）で、吸光度６６０ｎｍが０．６になるまで、３０℃で培養した。この培養液（２ｍＬ）を滅菌済みのエッペンチューブに移し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。上清をデカンテーションした後、ＬＢ培地（１ｍＬ）を加えて激しく撹拌し、菌体を洗浄した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、上清をデカンテーションした後、さらにもう２回同じ操作を繰り返した。ＬＢ培地（０．５ｍＬ）を加えて菌体を懸濁した。別に容易した滅菌済みのエッペンチューブにストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５）の胞子懸濁液（１μＬ）とプラスミドの入った接合性大腸菌の懸濁液（０．１ｍＬ）をよく混合し、放線菌培地「ダイゴ」Ｎｏ．４（日本製薬社製）に広げた。３０℃で１８時間培養後、チオストレプトン（１６７μｇ／ｍＬ）とナリジキシン酸Ｎａ（６７μｇ／ｍＬ）入りニュートリエント・ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）寒天培地（寒天０．５％、３ｍＬ）を重層し、さらに３日間培養を続けた。生育してきたコロニーを取得した（１つの大腸菌に対して１コロニー取得した）。

［イソメラーゼ生産能を持つ組換え放線菌の取得］
実施例５で作製した１，０００コロニーを５００ｍＬバッフルフラスコに入れた上記で示した培地５０ｍＬにそれぞれ植菌し、２８℃、回転数１６０ｒｐｍの条件下で回転培養した。培養３日目にそれぞれの培養液を５０ｍＬ遠心管に回収した。ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。ＨＥＡＴＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）ＤＵＴＹＣＹＣＬＥ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９，０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収した。ザルトリウス社のＭｉｎｉｓａｒｔ１．２μｍで膜ろ過し、それぞれの粗酵素液（１，０００コロニー分）を得た。
これら粗酵素液の活性の確認を、上記記載の方法で行ったところ、１コロニーの粗酵素液で本活性が確認された。
本コロニーのコスミドライブラリーのＤＮＡ配列を解析した結果、機能が推定できない構造遺伝子配列が確認されたため、本構造遺伝子の発現を試みることにした。

本例では、接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４（特許文献８）を用いて、ＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＯＮＡ４に導入し、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５））に発現させ、図１に示す組換え型イソメラーゼの構成（制限酵素地図）を得た。
商品名「ＩｎｓｔａＧｅｎｅ（商標）Ｍａｔｒｉｘ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株および７２０株からそれぞれのゲノムＤＮＡを単離した。フォワードプライマー（配列番号５）およびリバースプライマー（配列番号６）を合成した。前記２つのプライマーを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７１０株ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。なお、前記ＰＣＲ反応は、商品名「ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）を用い、１サイクル（９８℃で１０秒間、５８℃で１０秒間、７２℃で２分間を順に行う）を３５サイクル行った。前記ＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ断片を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。また、前記接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４も制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。得られた２つの断片を互いにライゲーションした後、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５））に導入し、ＸＧＰ−７１０株を得た。得られたＰＣＲ断片は、ＤＮＡシークエンサーで分析し、塩基配列を決定し、配列番号３と全く同じであることを確認した。
また、フォワードプライマー（配列番号７）およびリバースプライマー（配列番号８）を合成した。前記２つのプライマーを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.７２０株ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、以下、上記と同様の操作を行い、ＸＧＰ−７２０株を得た。得られたＰＣＲ断片は、ＤＮＡシークエンサーで分析し、塩基配列を決定し、配列番号４と全く同じであることを確認した。配列番号５〜８のプライマーを表３に示す。

次に、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培養して粗酵素液を得た。
５００ｍＬバッフルフラスコに入れたＴＳＢ培地５０ｍＬ２本にＸＧＰ−７１０株およびＸＧＰ−７２０株をそれぞれ植菌し、２８℃、回転数１６０ｒｐｍの条件下で回転培養した。培養３日目にそれぞれの培養液を５０ｍＬ遠心管に回収した。ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。ＨＥＡＴＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）ＤＵＴＹＣＹＣＬＥ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収した。ザルトリウス社のＭｉｎｉｓａｒｔ１．２μｍで膜ろ過し、それぞれの粗酵素液（ＸＧＰ−７１０粗酵素液およびＸＧＰ−７２０粗酵素液）を得た。

Ｄ−アロースは、化学的または生物学的な方法により生産することができ、化学的には、Ｄ−リボースから生産したり(非特許文献５)、１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−リボヘキソフラノース−３−ウロースを還元することで得られ(非特許文献６)、酵素的には、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉｉＬＬ１７２からのＬ−リボースイソメラーゼ（Ｌ−ＲｈＩ）の利用により、Ｄ−プシコースから生産することができる(非特許文献７)。
本発明においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から得られたイソメラーゼの特性を調べることとした。

（１）本酵素の反応性
まず、本酵素の各基質に対する反応性を調べることとした。
基質として、アルドースであるＬ−ラムノース、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−アロースをそれぞれ用い、前述の酵素活性反応条件で反応させた後、得られたそれぞれの反応液をＣｙｓｔｅｉｎｅＣａｒｂａｚｏｌｅ法に従って酵素活性を測定した。その結果、Ｌ−ラムノースに対する基質活性が高く、次いで、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、およびＬ−アラビノースに対する基質反応活生が高かった（図５）。

（２）本酵素活性へ及ぼす金属の影響
次に、イソメラーゼ活性に対する金属イオンの影響を調べる目的で、酵素を一部透析して酵素活性を測定した。透析は、粗酵素液をセルロース膜に入れ、２０ｍＭＥＤＴＡを含むグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）に浸し、この緩衝液をゆっくりと１６時間かけて撹拌することにより行い、他の金属イオンの影響を取り除いた。こうして得られたアポ酵素の酵素活性を、各種二価イオン存在下（表４の反応条件下）で反応後、システインカルバゾール法により測定した。
その結果、ＭｎＣｌ_２は本酵素活性を著しく上昇させ、本酵素は金属依存性を示した一方、ＭｇＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２は、その活性をわずかに上昇させた。ＣａＣｌ_２、ＢａＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２、ＣｕＳＯ_４はその活性を阻害することがわかった(図２)。
Ｅ．ｃｏｌｉで発現するＬ−ＲｈＩは、その酵素活性を示すのにＭｎ^２＋またはＺｎ^２＋を要求することが報告されている(非特許文献８)。

（３）本酵素活性へ及ぼす温度の影響（至適温度）
次に、本酵素活性へ及ぼす温度の影響を調べた。
酵素活性は、表５の条件において反応温度を随時１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃と変えて酵素反応をさせた後に、システインカルバゾール法により測定することにより確認した。
その結果、本酵素活性の至適温度は６０℃であった(図３ａ)。

（４）本酵素活性の熱耐性
次に、本酵素活性の熱耐性を調べた。
各酵素液を、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）中で各温度条件（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）下で１時間保温し、その残存する酵素活性を、上記条件下で酵素反応させた後に、システインカルバゾール法により測定した。
その結果、６０℃における１時間の保温後にも、約８０〜９０％の酵素活性が残存していた(図３ｂ)。

（５）本酵素活性へ及ぼすｐＨの影響（至適ｐＨ）
次に、本酵素活性へ及ぼすｐＨの影響を調べた。
具体的には、各ｐＨ緩衝溶液（５０ｍＭクエン酸緩衝液 (ｐＨ３．０−６．０）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０−８．０）、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ７．０−９．０）、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(ｐＨ９．０−１１．０）)中に、酵素液を４℃で２４間置いた後、表６の反応条件下で酵素反応をさせ、残存する酵素活性をＣｙｓｔｅｉｎｅＣａｒｂａｚｏｌｅ法により測定した。この際のＤ−アロースからＤ−プシコースへの異性化反応条件は下表に示す。
その結果、本酵素の至適ｐＨはｐＨ９．０であることがわかり(図４ａ)、ｐＨ９．０のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中における酵素活性がより安定であった(図４ｂ)。

（６）本酵素が触媒する反応の平衡点における各希少糖の生成率
次に、本酵素が、アルドースであるＬ−ラムノース、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−アロースのそれぞれを基質とし、表７の反応条件で反応させ（ただし、反応時間は６〜４８時間）、平衡点に達したときに得られる反応液の糖組成をＨＰＬＣ法により調べた。

表８に、各アルドースに本酵素（ＸＧＰ−７２０酵素液）を作用させたときのケトースとアルドースの生成率を示す。

^a すべての場合において、はじめにケトースの生成がみられた。
^b生成率は、平衡点に達したときのアルドース（残存した基質）：ケトース（生成物）：アルドース（生成物）を示す。

（７）Ｄ−プシコースとＤ−アロース間のイソメラーゼ反応
次に、Ｄ−プシコースからＤ−アロースへのイソメラーゼ反応について調べた。
表９の反応条件下で酵素反応させ、ＨＰＬＣ法により糖組成を測定した。反応前(０時間、Ｄ−プシコース)と反応後（２４時間反応後のＤ−プシコース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−アロース混合液)のＨＰＬＣ分析結果を図６に示す。
その結果、Ｄ−プシコースを基質として酵素反応を開始したときにも、先の各アルドースを基質としたときの変換率に示したように、本酵素は、Ｄ−プシコース：Ｄ−アロース：Ｄ−アルトロース＝６６：３３：１の比率で、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生成するということが確認できた。

［結論］
両酵素ともＬ−ラムノースに対して高い親和性を示し、ＸＧＰ−７１０酵素に比較してＸＧＰ−７２０酵素のほうがやや高い活性を示した。これら酵素の至適温度および安定性は６０℃近辺にあり、微生物汚染を防ぐ効果が見込まれる。さらに、金属イオンとしてのＭｎＣｌ_２存在下、ｐＨ９．０のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い活性を示した。これらの結果から、同定された本ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌株の酵素はＤ−プシコースからＤ−アロースを生産するのに効果的な酵素であることを明らかに示唆している。

本発明の酵素は、Ｄ−プシコースを異性化してＤ−アロースを産生する能力を有すると共に、この酵素を産生する微生物は、ストレプトマイセス属に属する株であることを特徴とする。ストレプトマイセス属の微生物は、従来食品の製造に関わるものであり、安全性の高いとされる微生物である。本酵素を生産するストレプトマイセス株を食品産業で用いる最も大きな特徴としては、菌の安全性にある。これまで知られているＤ−アロースなどの希少糖の生産酵素としては、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シュードモナス属などによるものがあるが、これらは日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もあり、安全性を確認するには多くの労力を要する微生物であった。本発明で菌体あるいは菌体培養物の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩である。したがって、本発明の、Ｄ−プシコースを異性化してＤ−アロースを産生する酵素とその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きいものと考えられる。

Claims

Ｄ−プシコースに下記（１）または（２）のいずれかのタンパク質を作用させてＤ−アロースへと異性化することを特徴とする、Ｄ−アロースの生産方法。
（１）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（２）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、以下（ａ）および（ｄ）の活性を有するタンパク質。
（ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する活性を有する。
（ｄ）Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、およびＬ−アラビノースに対して反応性を有する。
前記（２）のタンパク質が、以下（ｂ）および（ｃ）の性質を有するタンパク質である、請求項１に記載のＤ−アロースの生産方法。
（ｂ）作用ｐＨは６．０〜１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ｃ）作用温度は１０〜８０℃であり、至適温度は６０℃である。
請求項１に記載の配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号３もしくは配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡを含むそれぞれの組換えベクターで、宿主細胞を形質転換して得られた組換えタンパク質である、請求項１に記載のＤ−アロースの生産方法。
Ｄ−プシコースが、Ｄ−フラクトースをエピ化して生産したものである請求項１に記載のＤ−アロースの生産方法。
Ｄ−プシコースが、Ｄ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産したものである請求項１に記載のＤ−アロースの生産方法。
Ｄ−プシコースが、未利用資源からＤ−グルコースを得て、そのＤ−グルコースを異性化してＤ−フラクトースへ導き、そのＤ−フラクトースをエピ化して生産したものである請求項１に記載のＤ−アロースの生産方法。
目的とするＤ−アロースがＤ−プシコースとＤ−アロースの混合物である請求項１ないし６のいずれかに記載のＤ−アロースの生産方法。