KR102069301B1

KR102069301B1 - 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법

Info

Publication number: KR102069301B1
Application number: KR1020150183246A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 한은진; 김정민; 김혜정; 박종진; 이강표; 최은수; 최정윤
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2020-01-22
Also published as: EP3401403A1; JP6638086B2; KR20170074120A; JP2019503711A; US20190017070A1; WO2017111339A1; EP3401403A4; US10689668B2; CN108473991A

Abstract

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주, 상기 균주를 포함하는 과당-함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법{Allose producing-strain using the fructose and method for producing allose using the same}

알로오스(D-allose)는 포도당(D-glucose)과 3번 탄소의 -OH 기 방향만 다른 에피머(epimer)로서, 사이코스(psicose)의 이성질체로 알려진 희소당 단당류이다. 알로오스는 혈전 형성, 장기이식수술 환자의 자가 면역 반응 및 암세포의 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 또한, 간과 뇌의 허혈 후 신경세포의 사멸을 연장시키는 효과도 있으며 백혈병 환자의 치료약으로도 연구가 진행되고 있다.

상기와 같은 특징으로 인해, 알로오스는 의약 분야에서 차세대 핵심 소재로서 높은 이용가치가 있으나, 자연계에 극히 드물게 존재하기 때문에 산업적으로 적용하기 위해서는 효율적인 생산 공정을 개발하는 것이 필요하다. 종래에 알로오스는 주로 화학적 합성 방법에 의해서만 생산되었으나, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생한다는 문제가 있다.

이에, 최근에는 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 알로오스를 대량 생산하는 방법이 제안되었다. 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 처음으로 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래의 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomerase)를 사용하여 사이코스에서 알로오스를 생산하여 보고하였으나 (Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(5); 539-541, 1998), 상기 효소는 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스(D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있었다.

따라서 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있는 효소의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 사이코스 에피머화 효소(psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 이들의 혼합물을 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는 과당-함유 원료로부터 알로오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 과당으로부터 알로오스 생산용 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 과당, 사이코스 및 알로오스를 포함하는 혼합당 조성물을 제공하는 것이다.

기존의 알로오스를 화학적 합성 방법에 의해 생산하는 경우, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생하고, 미생물을 이용한 방법은 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스(D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있는바, 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있는 알로오스의 제조방법을 제공하고자 한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

이에 본 발명의 하나의 양태는, 사이코스 에피머화 효소(psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스(Clostridiun scidens), 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens) 또는 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia)에서 유래된 것일 수 있다.

상기 클로스트리디움 신댄스 (Clostridiun scidens)에서 유래한 사이코스 에피머화 효소(이하, CDPE)는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이다. 예컨대, 상기 CDPE는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 CDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 서열번호 5의 염기서열 및/또는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 CDPE는 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 30 내지 37 kDa, 예컨대 30 내지 35 kDa인 것일 수 있다. 상기 CDPE의 최적 온도는 40 내지 65, 구체적으로 50 내지 65일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 7.0, 1mM Co² ⁺ 존재하에서 5분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 단백질의 최적 pH는 pH 6 내지 9, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 60, 1mM Co² ⁺ 존재하에서 5분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens)에서 유래한 사이코스 에피머화 효소는 (이하, EDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이다. 예를 들어, 상기 EDPE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 EDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 핵산서열, 예를 들어, 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia)에서 유래한 사이코스 에피머화 효소는 (이하, TDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이다. 예를 들어, 상기 TDPE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 TDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 서열번호 8의 염기서열 및/또는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 클로스트리디움 신댄스(Clostridiun scidens), 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens) 또는 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia)에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소의 암호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예를 들면, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

구체적으로, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소는 Persephonella marina EX-H1에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 알로오스 이성질화 효소일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소는 사이코스를 알로오스로 이성질화 활성이 유지되는 한, 서열번호 4의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 Persephonella marina EX-H1에서 얻어진 알로오스 이성질화 효소의 암호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 상기 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 효소의 아미노산 서열을 표 1에, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 하기 표 2 내지 3에 예시적으로 기재한다.

서열번호	명명	서열목록 (5'->3')
1	CDPE	MKHGIYYAYWEQEWAADYKRYVEKAAKLGFDILEVGAAPLPDYSAQEVKELKKCADDNGIQLTAGYGPAFNHNMGSSDPKIREEALQWYKRLFEVMAGLDIHLIGGALYSYWPVDFATANKEEDWKHSVEGMQILAPIASQYGINLGMEVLNRFESHILNTSEEGVKFVTEVGMDNVKVMLDTFHMNIEESSIGDAIRHAGKLLGHFHTGECNRMVPGKGRTPWREIGDALREIEYDGTVVMEPFVRMGGQVGSDIKVWRDISKGAGEDRLDEDARRAVEFQRYMLEWK
2	EDPE	MQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPAVDTAHTRALLEKNKLRAVCSLGLPERAWASVRPDAAIEHLKVAIDKTADLGGEALSGVIYGGIGERTGVPPTEAEYDNIARVLQAAAKHAKTRGIELGVEAVNRYENHLINTGWQAVDMIKRVGADNVFVHLDTYHMNIEEKGIGTGILDARDFIKYIHLSESDRGTPGYGNCAWDEIFATLAAIGFKGGLAMESFINMPPEVAYGLAVWRPVARDEEEVMGNGLPFLRNKARQYGLI
3	TDPE	MQYGIYFAYWTKEWQADYKKYIDKVSKLGFDILEISCAALKDQYVSDSQLFDLRDYAKEKGVTLTAGYGPAKGENLSSSDNRVVKNAKAFYKDVLGKLNKLDIRLLGGGLYSYWPVDYSLPIDKAGDWKRSVENIREIAAIAADRNVVLGMEVLNRFEGYLLNTCEEGIKFVDEVNHPNVKVMLDTFHMNIEEDNMAEAIRMAGDKLGHFHIGEQNRKVPGKGCIPWNAIGHALRDIRYNGTVVMEPFVMPGGTIGQDIKVWRNLLPETSETILDRDAKGALEFVKHVFGSTSVL
4	RPI	MKISIGSDHAGFELKEIIKDHLQKKGYEVVDKGTYSKESVDYPLFGEAVGRSVSEGETDRGIVICGTGIGISISANKIKGVRAALCTNEYMARMSRKHNDANVLALGSRVLGIDLALSIVDTFLSTDFEGGRHERRVHLIQNIEKINL

서열번호	명명	서열목록 (5'->3')
5	CDPE (Original)	ATGAAGCATGGTATTTATTACGCGTACTGGGAACAGGAATGGGCAGCAGATTACAAGCGGTATGTAGAGAAGGCGGCAAAGCTTGGATTCGATATACTGGAGGTTGGCGCGGCGCCACTGCCGGACTATTCTGCGCAGGAGGTAAAGGAACTGAAAAAATGCGCCGATGATAACGGTATCCAGCTGACCGCGGGATATGGTCCCGCCTTCAATCATAATATGGGTTCCTCAGATCCGAAGATCAGGGAAGAGGCGCTTCAATGGTATAAACGCCTGTTCGAGGTGATGGCAGGCCTTGATATTCATCTGATTGGCGGAGCGCTTTATTCATACTGGCCGGTGGACTTTGCCACAGCCAATAAGGAAGAGGACTGGAAGCACAGCGTGGAGGGAATGCAGATTCTGGCGCCCATCGCCAGCCAGTATGGCATCAATCTGGGAATGGAAGTCCTGAACCGCTTTGAGAGCCATATCTTAAATACTTCGGAAGAAGGCGTGAAGTTCGTGACGGAAGTAGGCATGGATAATGTGAAAGTCATGCTGGATACGTTCCATATGAACATCGAGGAATCGAGCATTGGCGACGCGATCCGCCATGCCGGGAAACTTCTTGGACACTTCCACACCGGCGAGTGCAACCGCATGGTACCCGGAAAGGGCCGCACCCCATGGAGGGAGATCGGGGATGCCTTGCGCGAGATTGAGTATGACGGAACCGTGGTTATGGAGCCATTTGTACGCATGGGCGGACAGGTAGGCTCTGATATCAAGGTCTGGAGAGACATCAGCAAGGGCGCGGGAGAGGACCGGCTGGATGAGGATGCAAGGCGCGCGGTAGAGTTCCAGAGATACATGCTTGAATGGAAGTAA
6	CDPE (E.coli)	ATGAAACACGGTATCTACTACGCGTACTGGGAACAGGAATGGGCGGCGGACTACAAACGTTACGTTGAAAAAGCGGCGAAACTGGGTTTCGACATCCTGGAAGTTGGTGCGGCGCCGCTGCCGGACTACTCTGCGCAGGAAGTTAAAGAACTGAAAAAATGCGCGGACGACAACGGTATCCAGCTGACCGCGGGTTACGGTCCGGCGTTCAACCACAACATGGGTTCTTCTGACCCGAAAATCCGTGAAGAAGCGCTGCAGTGGTACAAACGTCTGTTCGAAGTTATGGCGGGTCTGGACATCCACCTGATCGGTGGTGCGCTGTACTCTTACTGGCCGGTTGACTTCGCGACCGCGAACAAAGAAGAAGACTGGAAACACTCTGTTGAAGGTATGCAGATCCTGGCGCCGATCGCGTCTCAGTACGGTATCAACCTGGGTATGGAAGTTCTGAACCGTTTCGAATCTCACATCCTGAACACCTCTGAAGAAGGTGTTAAATTCGTTACCGAAGTTGGTATGGACAACGTTAAAGTTATGCTGGACACCTTCCACATGAACATCGAAGAATCTTCTATCGGTGACGCGATCCGTCACGCGGGTAAACTGCTGGGTCACTTCCACACCGGTGAATGCAACCGTATGGTTCCGGGTAAAGGTCGTACCCCGTGGCGTGAAATCGGTGACGCGCTGCGTGAAATCGAATACGACGGTACCGTTGTTATGGAACCGTTCGTTCGTATGGGTGGTCAGGTTGGTTCTGACATCAAAGTTTGGCGTGACATCTCTAAAGGTGCGGGTGAAGACCGTCTGGACGAAGACGCGCGTCGTGCGGTTGAATTCCAGCGTTACATGCTGGAATGGAAATGA
7	EDPE (Original)	ATGCAGGGTTTTGGCGTCCATACGAGCATGTGGACCATGAATTGGGATCGCCCCGGTGCGGAGCGCGCCGTTGCGGCGGCGGTAAAATACGCCGTCGACTTCATCGAGATCCCGATGCTCAATCCGCCGGCGGTTGATACTGCCCATACCAGGGCGCTGCTGGAGAAAAACAAGCTGCGCGCGGTCTGCTCGCTCGGCCTGCCGGAGCGCGCCTGGGCATCCGTCCGACCCGATGCCGCGATCGAGCATCTGAAGGTGGCGATCGACAAGACGGCCGATCTCGGCGGCGAGGCGCTGTCCGGCGTCATCTACGGCGGCATCGGCGAGCGCACCGGCGTGCCGCCGACTGAAGCCGAATACGACAACATTGCCCGTGTGCTGCAGGCCGCCGCCAAGCACGCCAAAACCCGCGGCATCGAACTGGGTGTCGAGGCGGTCAACCGCTACGAGAACCACCTGATCAACACCGGTTGGCAAGCGGTCGACATGATCAAGCGGGTGGGCGCCGACAATGTCTTCGTGCATCTCGATACCTACCACATGAACATCGAGGAAAAGGGCATCGGCACCGGCATCCTCGATGCACGCGACTTCATCAAATACATCCACCTGTCCGAAAGCGACCGCGGCACGCCCGGCTATGGCAATTGCGCCTGGGACGAGATCTTCGCGACGCTGGCCGCGATCGGTTTCAAGGGTGGGCTGGCGATGGAAAGCTTCATCAACATGCCGCCGGAAGTGGCCTATGGCCTTGCGGTCTGGCGGCCGGTCGCCAGGGACGAAGAGGAAGTGATGGGCAACGGCCTGCCGTTCCTTAGGAACAAGGCCCGGCAATACGGATTGATCTAG

서열번호	명명	서열목록 (5'->3')
8	TDPE (Original)	ATGCAATAGGTATTTATTTTGCCTATTGGACAAAGGAATGGCAGGCGGATTACAAAAAGTATATCGATAAAGTATCAAAACTGGGTTTTGATATACTGGAGATATCCTGTGCAGCCTTGAAGGATCAATATGTTTCGGATTCCCAACTTTTTGATTTGCGGGATTATGCGAAAGAGAAGGGTGTCACCCTGACCGCTGGCTACGGCCCGGCTAAGGGCGAAAATCTTAGTTCTTCCGATAACCGGGTTGTCAAAAATGCAAAAGCCTTTTATAAGGATGTGCTGGGAAAGCTCAACAAACTCGACATAAGGCTGCTGGGCGGGGGGTTATACTCATACTGGCCGGTTGACTATTCTCTGCCCATTGATAAGGCGGGGGACTGGAAACGGTCAGTTGAAAATATCAGGGAAATTGCCGCAATCGCCGCAGACCGCAACGTGGTATTGGGGATGGAGGTATTAAACCGCTTCGAAGGGTATTTGCTTAACACCTGTGAGGAAGGAATTAAGTTTGTCGATGAAGTTAATCACCCGAATGTAAAAGTCATGCTGGATACTTTTCACATGAATATTGAGGAAGATAATATGGCTGAAGCCATCCGCATGGCGGGGGATAAGCTTGGGCATTTTCATATTGGCGAACAGAACCGCAAGGTTCCCGGGAAAGGATGCATCCCCTGGAATGCAATTGGTCATGCCCTGCGGGACATACGGTACAATGGGACGGTGGTGATGGAGCCCTTTGTCATGCCCGGGGGAACCATAGGGCAGGATATAAAAGTCTGGAGAAATTTACTTCCCGAGACAAGCGAAACGATACTGGATCGTGATGCCAAGGGAGCGTTGGAATTTGTGAAGCATGTGTTTGGTAGTACTTCTGTTTTATAA
9	TDPE (E.coli)	ATGCAGTACGGTATCTACTTCGCGTACTGGACCAAAGAATGGCAGGCGGACTACAAAAAATACATCGACAAAGTTTCTAAACTGGGTTTCGACATCCTGGAAATCTCTTGCGCGGCGCTGAAAGACCAGTACGTTTCTGACTCTCAGCTGTTCGACCTGCGTGACTACGCGAAAGAAAAAGGTGTTACCCTGACCGCGGGTTACGGTCCGGCGAAAGGTGAAAACCTGTCTTCTTCTGACAACCGTGTTGTTAAAAACGCGAAAGCGTTCTACAAAGACGTTCTGGGTAAACTGAACAAACTGGACATCCGTCTGCTGGGTGGTGGTCTGTACTCTTACTGGCCGGTTGACTACTCTCTGCCGATCGACAAAGCGGGTGACTGGAAACGTTCTGTTGAAAACATCCGTGAAATCGCGGCGATCGCGGCGGACCGTAACGTTGTTCTGGGTATGGAAGTTCTGAACCGTTTCGAAGGTTACCTGCTGAACACCTGCGAAGAAGGTATCAAATTCGTTGACGAAGTTAACCACCCGAACGTTAAAGTTATGCTGGACACCTTCCACATGAACATCGAAGAAGACAACATGGCGGAAGCGATCCGTATGGCGGGTGACAAACTGGGTCACTTCCACATCGGTGAACAGAACCGTAAAGTTCCGGGTAAAGGTTGCATCCCGTGGAACGCGATCGGTCACGCGCTGCGTGACATCCGTTACAACGGTACCGTTGTTATGGAACCGTTCGTTATGCCGGGTGGTACCATCGGTCAGGACATCAAAGTTTGGCGTAACCTGCTGCCGGAAACCTCTGAAACCATCCTGGACCGTGACGCGAAAGGTGCGCTGGAATTCGTTAAACACGTTTTCGGTTCTACCTCTGTTCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
10	RPI	ATGAAAATCTCTATCGGTTCTGACCACGCGGGTTTCGAACTGAAAGAAATCATCAAAGACCACCTGCAGAAAAAAGGTTACGAAGTTGTTGACAAAGGTACCTACTCTAAAGAATCTGTTGACTACCCGCTGTTCGGTGAAGCGGTTGGTCGTTCTGTTTCTGAAGGTGAAACCGACCGTGGTATCGTTATCTGCGGTACCGGTATCGGTATCTCTATCTCTGCGAACAAAATCAAAGGTGTTCGTGCGGCGCTGTGCACCAACGAATACATGGCGCGTATGTCTCGTAAACACAACGACGCGAACGTTCTGGCGCTGGGTTCTCGTGTTCTGGGTATCGACCTGGCGCTGTCTATCGTTGACACCTTCCTGTCTACCGACTTCGAAGGTGGTCGTCACGAACGTCGTGTTCACCTGATCCAGAACATCGAAAAAATCAACCTGtAA

상기 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소는 링커 펩타이드로 연결된 하나의 융합 단백질인 것일 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드가 상기 아미노산 개수 미만이거나 초과이면 두 단백질을 연결할 때 서로의 단백질의 구조에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 상기 개수가 적당하다.

상기 하나의 융합된 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 융합된 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 하나의 융합된 뉴클레오타이드 서열이 암호화하는 것일 수 있으며, 상기 하나의 융합된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 서열일 수 있다.

서열번호	명명	서열목록 (5'->3')
22	EDPE_RPI_FUSION	atgcagggtt ttggcgtcca tacgagcatg tggaccatga attgggatcg ccccggtgcg gagcgcgccg ttgcggcggc ggtaaaatac gccgtcgact tcatcgagat cccgatgctc aatccgccgg cggttgatac tgcccatacc agggcgctgc tggagaaaaa caagctgcgc gcggtctgct cgctcggcct gccggagcgc gcctgggcat ccgtccgacc cgatgccgcg atcgagcatc tgaaggtggc gatcgacaag acggccgatc tcggcggcga ggcgctgtcc ggcgtcatct acggcggcat cggcgagcgc accggcgtgc cgccgactga agccgaatac gacaacattg cccgtgtgct gcaggccgcc gccaagcacg ccaaaacccg cggcatcgaa ctgggtgtcg aggcggtcaa ccgctacgag aaccacctga tcaacaccgg ttggcaagcg gtcgacatga tcaagcgggt gggcgccgac aatgtcttcg tgcatctcga tacctaccac atgaacatcg aggaaaaggg catcggcacc ggcatcctcg atgcacgcga cttcatcaaa tacatccacc tgtccgaaag cgaccgcggc acgcccggct atggcaattg cgcctgggac gagatcttcg cgacgctggc cgcgatcggt ttcaagggtg ggctggcgat ggaaagcttc atcaacatgc cgccggaagt ggcctatggc cttgcggtct ggcggccggt cgccagggac gaagaggaag tgatgggcaa cggcctgccg ttccttagga acaaggcccg gcaatacgga ttgatctcgg gctctggtat gaaaatctct atcggttctg accacgcggg tttcgaactg aaagaaatca tcaaagacca cctgcagaaa aaaggttacg aagttgttga caaaggtacc tactctaaag aatctgttga ctacccgctg ttcggtgaag cggttggtcg ttctgtttct gaaggtgaaa ccgaccgtgg tatcgttatc tgcggtaccg gtatcggtat ctctatctct gcgaacaaaa tcaaaggtgt tcgtgcggcg ctgtgcacca acgaatacat ggcgcgtatg tctcgtaaac acaacgacgc gaacgttctg gcgctgggtt ctcgtgttct gggtatcgac ctggcgctgt ctatcgttga caccttcctg tctaccgact tcgaaggtgg tcgtcacgaa cgtcgtgttc acctgatcca gaacatcgaa aaaatcaacc tg
23	EDPE_RPI_FUSION	MQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPAVDTAHTRALLEKNKLRAVCSLGLPERAWASVRPDAAIEHLKVAIDKTADLGGEALSGVIYGGIGERTGVPPTEAEYDNIARVLQAAAKHAKTRGIELGVEAVNRYENHLINTGWQAVDMIKRVGADNVFVHLDTYHMNIEEKGIGTGILDARDFIKYIHLSESDRGTPGYGNCAWDEIFATLAAIGFKGGLAMESFINMPPEVAYGLAVWRPVARDEEEVMGNGLPFLRNKARQYGLISGSGMKISIGSDHAGFELKEIIKDHLQKKGYEVVDKGTYSKESVDYPLFGEAVGRSVSEGETDRGIVICGTGIGISISANKIKGVRAALCTNEYMARMSRKHNDANVLALGSRVLGIDLALSIVDTFLSTDFEGGRHERRVHLIQNIEKINL

서열번호	명명	서열목록 (5'->3')
24	CDPE_RPI_FUSION	atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa ttccagcgtt acatgctgga atggaaatcg ggctctggta tgaaaatctc tatcggttct gaccacgcgg gtttcgaact gaaagaaatc atcaaagacc acctgcagaa aaaaggttac gaagttgttg acaaaggtac ctactctaaa gaatctgttg actacccgct gttcggtgaa gcggttggtc gttctgtttc tgaaggtgaa accgaccgtg gtatcgttat ctgcggtacc ggtatcggta tctctatctc tgcgaacaaa atcaaaggtg ttcgtgcggc gctgtgcacc aacgaataca tggcgcgtat gtctcgtaaa cacaacgacg cgaacgttct ggcgctgggt tctcgtgttc tgggtatcga cctggcgctg tctatcgttg acaccttcct gtctaccgac ttcgaaggtg gtcgtcacga acgtcgtgtt cacctgatcc agaacatcga aaaaatcaac ctgtaa
25	CDPE_RPI_FUSION	MKHGIYYAYWEQEWAADYKRYVEKAAKLGFDILEVGAAPLPDYSAQEVKELKKCADDNGIQLTAGYGPAFNHNMGSSDPKIREEALQWYKRLFEVMAGLDIHLIGGALYSYWPVDFATANKEEDWKHSVEGMQILAPIASQYGINLGMEVLNRFESHILNTSEEGVKFVTEVGMDNVKVMLDTFHMNIEESSIGDAIRHAGKLLGHFHTGECNRMVPGKGRTPWREIGDALREIEYDGTVVMEPFVRMGGQVGSDIKVWRDISKGAGEDRLDEDARRAVEFQRYMLEWKSGSGMKISIGSDHAGFELKEIIKDHLQKKGYEVVDKGTYSKESVDYPLFGEAVGRSVSEGETDRGIVICGTGIGISISANKIKGVRAALCTNEYMARMSRKHNDANVLALGSRVLGIDLALSIVDTFLSTDFEGGRHERRVHLIQNIEKINL

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 재조합 벡터는 pACYC, RSF, pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 바람직하게는 pACYC 또는 RSF 일 수 있다.

상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnB_T1, rrnB_T2, T7 terminator 등 일수 있으며, 바람직하게는 pET21a vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 구체적인 재조합 벡터의 개열지도를 도 1 내지 도 4에 예시적으로 기재하였다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환된 재조합 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소를 과발현할 수 있으며, 따라서 장기간 안정적으로 높은 알로오스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환된 재조합 균주는 알로오스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 알로오스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다. 인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 대응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작 시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 균체 및/또는 재조합 균주의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 과당-함유 원료로부터 알로오스를 제조하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포(cell-free) 형태일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 알로오스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체 및/또는 상기 균주의 배양물을 의미하는 것으로 사용된다.

상기 알로오스 생산용 조성물에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량% 기준으로, 과당 60 내지 63 중량%, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 혼합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.

상기 조성물은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어, 12 내지 15%, 12 내지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다. 과당으로부터 사이코스를 생산한 후, 사이코스로부터 알로오스를 생산하는 2단계의 공정을 통하는 경우에는 약 9% 정도의 전환율로 알로오스가 생산되며, 하나의 공정을 통해 생산하지 못하기 때문에 시간이 오래 걸리고 생산 비용이 증가하는 문제점이 생긴다. 그러나 상기 조성물을 이용하여 알로오스를 생산하는 경우에는, 1단계의 공정을 통해 알로오스를 생산할 수 있어 시간이 단축되며 생산 비용을 절감할 수 있으며, 특히 2단계의 공정을 통해 생산하는 경우보다 30% 이상 향상된 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.

상기 조성물은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 균체 및/또는 상기 재조합 균주의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 과당-함유 원료와 접촉하여 알로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 알로오스 생산 방법은 상기 재조합 균주를 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반응시키는 단계는, 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반응시키는 단계는, 상기 재조합 균주(균체 및/또는 균주의 배양물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예를 들어, 상기 재조합 균주를 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 재조합 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 재조합 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하고, 사이코스를 알로오스로 전환하여 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있다.

상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량% 기준으로, 과당 60 내지 63 중량%, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 혼합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.

또한, 상기 방법은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어, 12 내지 15%, 12 내지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 10 내지 80%(w/v), 20 내지 30%(w/v), 40 내지 80%(w/v), 10 내지 75%(w/v), 20 내지 75%(w/v), 30 내지 75%(w/v), 예컨대, 40 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 알로오스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9, 예를 들어, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30 이상, 예컨대 40 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 온도가 80 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 30 내지 80℃, 예를 들어, 35 내지 80℃, 40 내지 80℃, 35 내지 75℃, 40 내지 75℃, 35 내지 70℃ 또는 40 내지 70℃의 조건하에서 수행될 수 있다.

또한, 상기 생산방법에 있어서, 상기 반응 시간이 길수록 알로오스 전환률이 높아진다. 예를 들어, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 48시간을 넘어가면 알로오스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 알로오스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 사용되는 재조합 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 알로오스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 알로오스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 방법은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 첨가하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 사이코스 에피머화 효소(psicose epimerase) 및 알로오스 이성질화 효소가 링커 펩타이드로 연결된 융합 단백질을 포함하는 과당으로부터 알로오스 생산용 효소를 제공한다.

상기 효소는 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어, 12 내지 15%, 12 내지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것이다.

또한, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 방법으로 생산되며, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량% 기준으로, 과당 60 내지 63 중량%, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 혼합당 조성물을 제공한다.

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 포함하는 과당-함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 균주 및/또는 이를 이용한 알로오스의 제조방법을 이용하여, 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 벡터에 CDPE 또는 TDPE와RPI 유전자를 도입한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 벡터에 EDPE와 RPI 유전자를 도입한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-1 벡터에 CDPE 또는 TDPE와 RPI 유전자를 도입한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-1 벡터에 EDPE와 RPI 유전자를 도입한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주의 온도에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_TDPE_RPI 균주의 온도에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE_RPI 균주의 온도에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_TDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_TDPE_RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE_RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주의 세포 반응 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_TDPE_RPI 균주의 세포 반응 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE_RPI 균주의 세포 반응 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 15% 과당으로부터 알로오스 생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 50% 과당으로부터 알로오스 생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 벡터에 CDPE 또는 TDPE와RPI 유전자가 융합된 유전자를 도입한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 효소의 발현을 SDS-PAGE를 통해서 확인한 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 효소의 알로오스 전환율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 듀엣 플라스미드의 제조 및 형질전환

유전자 재조합을 통해, 사이코스에서 알로오스를 생산하는 RPI 효소와 함께 하나의 균주에서, 과당에서 사이코스를 생산하는 효소 CDPE, EDPE, 또는 TDPE 각각을 발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, RPI 암호화 서열을 도입한 벡터를 제조하고자, RPI 단백질인 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 11)를 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pACYC(NOVAGEN) 또는 RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.

그 다음, 사이코스 에피머라제 암호화 서열을 도입한 벡터를 제조하고자, 먼저 사이코스 에피머라제 암호화 서열를 제조하였다.

구체적으로, 크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (Gene bank: EDS06411.1), 엔시퍼 아드해렌스 (Ensifer adhaerens)로부터 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 트로포네마 프리미샤 (Treponema primitia)에서 유래한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 (Gene bank: WP_010256447), 발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 원래의 암호화 폴리뉴클레오타이드의 염기서열(각각 서열번호 5, 7 및 8) 및 이에 변형이 가해진 폴리뉴클레오타이드(각각 서열번호 6 및 9)를 바이오니아(Bioneer.Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

그 다음, 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여, 상기 합성된 각각의 사이코스 에피머라제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 RPI 유전자가 삽입된 발현벡터인 pACYC(NOVAGEN) 또는 RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여, RPI가 포함된 제조된 재조합 벡터에 TDPE, CDPE, EDPE를 각각 삽입하여 한 벡터에 두 개의 유전자 (RPI 효소 유전자 및 사이코스 에피머라제 효소 유전자)가 삽입 되도록 하였다. 상기 제한 효소는 하기 표 6에 나타내었다.

서열번호	Primer Name	Sequence (5' → 3')	제한 효소
11	CDPE_F_BamHI(Duet)	CGATCGGATCCGATGAAACACGGTATCTACTAC	BamHI
12	CDPE_R_HindIII(Duet)	GCGACCAAGCTTTTATTTCCATTCCAGCATG	HindIII
13	EDPE_F_BamHI(Duet)	CGATCGGATCCGATGCAGGGTTTTGGCGTC	BamHI
14	EDPE_R_NotI(Duet)	GCGACCGCGGCCGCTTAGATCAATCCGTATTGCCG	NotI
15	TDPE_F_BamHI(Duet)	CGATCGGATCCGATGCAGTACGGTATCTAC	BamHI
16	TDPE_R_HindIII(Duet)	GCGACCAAGCTTTTACAGAACAGAGGTAGAACC	HindIII
17	RPI_F_NdeI(Duet)	GCGTTGCATATGAAAATCTCTATCGGTTCTG	NdeI
18	RPI_R_XhoI(Duet)	GGCAGGCTCGAGTTACAGGTTGATTTTTTCGATG	XhoI
19	CDPE_F_NcoI(Duet)	CGCAAGCCATGGGCATGAAACACGGTATCTACTAC	NcoI
20	EDPE_F_NcoI(Duet)	CGCAAGCCATGGGCATGCAGGGTTTTGGCGTC	NcoI
21	TDPE_F_NcoI(Duet)	CGCAAGCCATGGGCATGCAGTACGGTATCTAC	NcoI

그 다음, heat shock방법 (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 각각의 재조합 벡터로 형질 전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하였다.

상기 제조된 재조합 대장균 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 그 다음, 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16℃ 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

실시예 2. 알로오스 생산 균주의 반응조건 확립

2-1. 온도에 따른 세포 반응 활성 분석

알로오스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여, 10%(v/v) 과당 1ml, 50mM PIPES buffer (pH 7.0) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml_DCW 범위에서, 60℃ 하에서 2시간 동안 반응시키고, 기질 반응 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료(정지)시키고 난 후에, 최대 활성을 나타내는 온도를 측정하였다. 그 다음, 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정하여, 최적 온도에서의 알로오스 전환율을 100%로 했을 때 각각의 온도에서의 알로오스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과를 하기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타내었다.

[계산식]

전환율(%) = (생산량 / 넣어준 기질 양) * 100

넣어준 기질양 = 잔여 과당 + 사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량

	전환율 (%)
온도 (℃)	RSF_CDPE_RPI (his tag X)	RSF_TDPE_RPI (his tag X)	RSF_EDPE_RPI (his tag X)
40	5.46	6.39	6.84
45	8.50	7.27	7.32
50	8.51	8.12	7.81
55	8.17	8.57	7.28
60	7.90	3.99	4.94
70	8.04	2.68	3.71

상기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타난 바와 같이, RSF_TDPE_RPI는 55℃에서(도 5)최적의 활성을 나타냄을, RSF_CDPE_RPI(도 6)와 RSF_EDPE_RPI(도 7)는 50℃에서 최적의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

2-2. pH에 따른 세포 반응 활성 분석

pH에 따른 세포 반응 활성을 분석하기 위하여, 실시예 1에서 분리된 균주의 균체농도 5mg/ml_DCW 및 과당농도 10%(v/v)의 완충용액 50 mM sodium citrate(pH 4 내지 5), 50 mM sodium phosphate(pH 6 내지 8), 50 mM glycine NaOH (pH 9 내지 10)을 각각 사용하여 각 pH 조건에서 50℃에서 2시간 반응시키고 기질 반응 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료(정지)시켜, 최대 활성을 나타내는 pH를 측정하였다. 그 다음, 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정하여, 최적 pH에서의 알로오스 전환율을 100%로 했을 때 각각의 pH에서의 알로오스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과를 하기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타내었다.

[계산식]

전환율(%) = (생산량 / 넣어준 기질 양) * 100

		전환율(%)
Buffer	pH	RSF_CDPE_RPI (his tag X)	RSF_TDPE_RPI (his tag X)	RSF_EDPE_RPI (his tag X)
Sodium citrate	5	0.4	0	0
Sodium citrate	6	6.5	8.8	8.3
Sodium Phosphate	6	4.1	5.9	6.8
	7	6.6	10.0	9.1
	8	7.4	8.9	9.6
Glycine -NaOH	9	4.4	5.2	6.5
Glycine -NaOH	10	2.8	1.3	2.7

상기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타난 바와 같이, RSF_TDPE_RPI는 pH7.0에서최적의 활성을 나타내었으며(도 8), RSF_CDPE_RPI(도 9)와 RSF_EDPE_RPI(도 10)는 pH8.0에서 최적의 활성을 나타내었다.

2-3. 효소의 금속 이온 요구성 분석

금속이온 요구성을 확인하기 위하여, 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상기 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도 5mg/ml_DCW, 및 50℃에서, 50mM PIPES 완충용액(pH7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행)에 녹인 1mM 금속이온 (CuCl₂, MnCl₂, FeSO₄, ZnSO₄, NiSO₄, 또는 CoCl₂) 용액을 각각 사용하여 2시간 동안 반응시키고, 기질 반응 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료(정지)시키고 난 후에, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 알로오스 생산량을 측정하였다. 대조군(Non)으로는 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

그 결과를 하기 표 9 및 도 11 내지 13에 나타내었다.

	RSF_CDPE_RPI (his tag X)		RSF_TDPE_RPI (his tag X)		RSF_EDPE_RPI (his tag X)
	전환율(%)	RA(%)	전환율(%)	RA(%)	전환율(%)	RA(%)
Cu	0	0	1.5	18.	1.7	18
Mn	4.7	72	6.8	81	8.2	90
Ni	4.3	66	7.1	85	7.5	83
Fe	6.5	100	8.1	97	9.1	100
Co	4.9	76	8.3	98	7.6	84
Zn	0	0	1.9	22	1.2	14
Non	5.8	90	8.4	100	8.6	95

상기 표 9 및 도 11 내지 13에 나타난 바와 같이, CDPE_RPI의 경우, Fe 이온에 의해 약간 활성이 증가하였지만 (도 11), 세 효소 모두 크게 금속 이온에 의존하는 결과를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 11 내지 13).

즉, 기존의 CDPE, TDPE, EDPE를 단독으로 발현했을 경우에는 금속이 없으면 활성, 전환율, 열 안전성 등이 현저히 저하되나, 두 효소를 동시에 하나의 벡터에서 발현했을 때는, 기존의 각각의 효소와 달리 금속 이온이 없이도 전환반응이 일어남을 확인하였다.

2-4. 세포 반응 열 안정성 분석

세포 반응의 열 안정성을 확인하기 위해, 40 내지 50℃에서 24시간 동안 효소에 열을 가한 후, 열 충격이 가해진 균주를 반응에 사용하였다.

구체적으로, 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상기 열 충격이 가해진 균주의 균체 농도 5mg/ml_DCW, 및 50에서, 50mM PIPES 완충용액(pH7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행)을 각각 사용하여 2시간 동안 반응시키고, 기질 반응 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료(정지)시켰다. 하기의 계산식을 통해 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10 (40℃) 및 표 11 (50℃)에 나타내었으며, 도 14 내지 16에 전환율을 로그 값으로 변환시켜 나타내었다.

[계산식]

전환율(%) = (생산량 / 넣어준 기질 양) * 100

40℃	전환율(%)
시간(h)	RSF_CDPE_RPI (his tag X)	RSF_TDPE_RPI (his tag X)	RSF_EDPE_RPI (his tag X)
0	5.4	5.4	5.7
2	5.8	6.4	6.0
4	5.2	4.4	5.7
6	5.3	3.9	6.2
. . .	. . .	. . .	. . .
20	5.5	5.5	5.6

50℃	전환율(%)
시간(h)	RSF_CDPE_RPI (his tag X)	RSF_TDPE_RPI (his tag X)	RSF_EDPE_RPI (his tag X)
0	5.4	5.4	4.7
2	6.1	5.0	4.0
4	4.4	2.8	3.5
6	4.0	2.3	3.0
8	2.0	1.0	1.5
. . .	. . .	. . .	. . .
20	0	0	0

상기 표 10 내지 11 및 도 14 내지 16에 나타난 바와 같이, 40℃에서는 20시간 이상 어느 정도 열에 효소가 견디는 양상을 보였지만, 각 온도에서의 반감기(Half-life)를 비교해 볼 때, 50℃에서는 3시간 정도 열 충격이 가해졌을 때 활성이 반으로 줄어 들었음을 확인하였다.

실시예 3. 알로오스 생산

3-1. 15% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반응

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 15%(v/v) 과당 1 ml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml_DCW 범위에서, 50℃ 하에서 0 내지 20시간 동안 반응시키면서, 시간별 샘플링을 하여 하기의 계산식을 통해 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 12 및 도 17에 나타내었다.

[계산식]

전환율(%) = (생산량 / 넣어준 기질 양) * 100

Enzyme	Allose 전환율 (%)	Psicose 전환율 (%)
RSF_CDPE_RPI (Histag x)	11.3	24.9
RSF_TDPE_RPI (Histag x)	12.0	25.3
RSF_EDPE_RPI (Histag x)	12.6	25.3
RSF_CDPE_RPI (Histag O)	13.0	24.8
RSF_TDPE_RPI (Histag O)	11.5	25.3
RSF_EDPE_RPI (Histag O)	12.9	24.9
ACYC_CDPE_RPI (Histag x)	11.8	25.9
ACYC_TDPE_RPI (Histag x)	12.8	25.7
ACYC_TDPE_RPI (Histag x)	13.6	25.9
ACYC_CDPE_RPI (Histag O)	13.4	24.7
ACYC_TDPE_RPI (Histag O)	13.1	25.9
ACYC_EDPE_RPI (Histag O)	12.8	26.0

상기 표 12에서 확인할 수 있듯이, 12개의 효소 반응 전환 분석 결과, 효소마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다.

3-2. 50% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반응

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 50%(v/v) 과당 1ml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml_DCW 범위에서, 50 하에서 0 내지 20시간 동안 반응시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 13 및 도 18에 나타내었다.

Enzyme	Allose 전환율 (%)	Psicose 전환율 (%)
RSF_TDPE_RPI (Histag x)	10.3	25.6
RSF_CDPE_RPI (Histag O)	13.1	25.1
RSF_EDPE_RPI (Histag O)	11.4	25.4
ACYC_CDPE_RPI (Histag x)	13.3	26.5
ACYC_TDPE_RPI (Histag x)	13.0	25.3
ACYC_TDPE_RPI (Histag x)	13.9	25.6
ACYC_CDPE_RPI (Histag O)	12.7	25.6
ACYC_TDPE_RPI (Histag O)	11.8	26.0
ACYC_EDPE_RPI (Histag O)	13.2	26.0

상기 표 13에서 확인할 수 있듯이, 12개의 효소 반응 전환 분석 결과, 효소마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 융합 효소 플라스미드의 제조 및 형질전환

엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드(서열번호 6)로 합성하고 EDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드, Persephonella marina EX-H1의 gDNA에서 확보한 PRI의 암호화 유전자 (서열번호 10)을 PCR을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 PCR 법으로 하나의 주형으로 연결하였다 (서열번호 22).

상기 하나의 주형으로 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 NdeI과 XhoI을 사용하여 발현벡터인 pET21a의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터의 개열지도를 도 19에 개시하였다.

그 다음, heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 재조합 벡터로 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.

상기 제조된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16℃ 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다. 이후 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고, 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척한 다음 알로오스 생산 및 효소 정제에 사용하였다.

실시예 5. 융합 효소를 이용한 알로오스 생산 반응 (효소 반응)

5-1: 융합 효소의 정제

상기 실시예 4에서 회수된 균체를 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.0 300mM NaCl)에 혼탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 미리 lysis buffer로 평형 시킨 Ni-NTA컬럼 (Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris-HCl 300mM NaCl, pH 7.0에 20mM imidazol과 250mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 용출된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다. 상기 방법으로 부분 정제된 효소를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 47 kDa임을 확인하였다 (도 20).

5-2: 과당으로 부터 알로오스 생산

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 50%(v/v) 과당 1 ml와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 6에서 정제된 효소의 농도를 1.0mg/ml 범위에서, 50℃에서 24시간 동안 반응시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 14 및 도 21에 나타내었다.

시간	EDPE_RPI (%)	CDPE_RPI (%)
3	7.2	7.8
8	11.7	11.3
24	13.4	13.1

상기 표 14 및 도 20에서 확인할 수 있듯이, 두 효소 반응 분석 결과, 24시간 동안 EDPE_RPI_FUSION은 약 13.4%, CDPE_RPI_FUSION은 약 13.1%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 확인하였다. 즉, 융합 효소의 경우 발현율은 감소하였지만, 두 효소를 각각 발현시켜 반응할 때와 전환율에 있어서는 유사한 평형 값인 13%에 도달함을 확인하였다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Allose producing-strain using the fructose and method for producing allose using the same <130> DPP20153346KR <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys <210> 2 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EDPE <400> 2 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Ala Val 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Ala 35 40 45 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Thr Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Met Ile Lys Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ile Gly Thr Gly Ile 180 185 190 Leu Asp Ala Arg Asp Phe Ile Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Cys Ala Trp Asp Glu Ile Phe Ala 210 215 220 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Arg Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Arg Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 3 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TDPE <400> 3 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Ala Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asn Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 4 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RPI <400> 4 Met Lys Ile Ser Ile Gly Ser Asp His Ala Gly Phe Glu Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ile Ile Lys Asp His Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Glu Val Val Asp Lys 20 25 30 Gly Thr Tyr Ser Lys Glu Ser Val Asp Tyr Pro Leu Phe Gly Glu Ala 35 40 45 Val Gly Arg Ser Val Ser Glu Gly Glu Thr Asp Arg Gly Ile Val Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ser Ala Asn Lys Ile Lys Gly 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Leu Cys Thr Asn Glu Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg 85 90 95 Lys His Asn Asp Ala Asn Val Leu Ala Leu Gly Ser Arg Val Leu Gly 100 105 110 Ile Asp Leu Ala Leu Ser Ile Val Asp Thr Phe Leu Ser Thr Asp Phe 115 120 125 Glu Gly Gly Arg His Glu Arg Arg Val His Leu Ile Gln Asn Ile Glu 130 135 140 Lys Ile Asn Leu 145 <210> 5 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE(Original) <400> 5 atgaagcatg gtatttatta cgcgtactgg gaacaggaat gggcagcaga ttacaagcgg 60 tatgtagaga aggcggcaaa gcttggattc gatatactgg aggttggcgc ggcgccactg 120 ccggactatt ctgcgcagga ggtaaaggaa ctgaaaaaat gcgccgatga taacggtatc 180 cagctgaccg cgggatatgg tcccgccttc aatcataata tgggttcctc agatccgaag 240 atcagggaag aggcgcttca atggtataaa cgcctgttcg aggtgatggc aggccttgat 300 attcatctga ttggcggagc gctttattca tactggccgg tggactttgc cacagccaat 360 aaggaagagg actggaagca cagcgtggag ggaatgcaga ttctggcgcc catcgccagc 420 cagtatggca tcaatctggg aatggaagtc ctgaaccgct ttgagagcca tatcttaaat 480 acttcggaag aaggcgtgaa gttcgtgacg gaagtaggca tggataatgt gaaagtcatg 540 ctggatacgt tccatatgaa catcgaggaa tcgagcattg gcgacgcgat ccgccatgcc 600 gggaaacttc ttggacactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggtacc cggaaagggc 660 cgcaccccat ggagggagat cggggatgcc ttgcgcgaga ttgagtatga cggaaccgtg 720 gttatggagc catttgtacg catgggcgga caggtaggct ctgatatcaa ggtctggaga 780 gacatcagca agggcgcggg agaggaccgg ctggatgagg atgcaaggcg cgcggtagag 840 ttccagagat acatgcttga atggaagtaa 870 <210> 6 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE(E.coli) <400> 6 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaatga 870 <210> 7 <211> 849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EDPE(Original) <400> 7 atgcagggtt ttggcgtcca tacgagcatg tggaccatga attgggatcg ccccggtgcg 60 gagcgcgccg ttgcggcggc ggtaaaatac gccgtcgact tcatcgagat cccgatgctc 120 aatccgccgg cggttgatac tgcccatacc agggcgctgc tggagaaaaa caagctgcgc 180 gcggtctgct cgctcggcct gccggagcgc gcctgggcat ccgtccgacc cgatgccgcg 240 atcgagcatc tgaaggtggc gatcgacaag acggccgatc tcggcggcga ggcgctgtcc 300 ggcgtcatct acggcggcat cggcgagcgc accggcgtgc cgccgactga agccgaatac 360 gacaacattg cccgtgtgct gcaggccgcc gccaagcacg ccaaaacccg cggcatcgaa 420 ctgggtgtcg aggcggtcaa ccgctacgag aaccacctga tcaacaccgg ttggcaagcg 480 gtcgacatga tcaagcgggt gggcgccgac aatgtcttcg tgcatctcga tacctaccac 540 atgaacatcg aggaaaaggg catcggcacc ggcatcctcg atgcacgcga cttcatcaaa 600 tacatccacc tgtccgaaag cgaccgcggc acgcccggct atggcaattg cgcctgggac 660 gagatcttcg cgacgctggc cgcgatcggt ttcaagggtg ggctggcgat ggaaagcttc 720 atcaacatgc cgccggaagt ggcctatggc cttgcggtct ggcggccggt cgccagggac 780 gaagaggaag tgatgggcaa cggcctgccg ttccttagga acaaggcccg gcaatacgga 840 ttgatctag 849 <210> 8 <211> 887 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDPE(Original) <400> 8 atgcaatagg tatttatttt gcctattgga caaaggaatg gcaggcggat tacaaaaagt 60 atatcgataa agtatcaaaa ctgggttttg atatactgga gatatcctgt gcagccttga 120 aggatcaata tgtttcggat tcccaacttt ttgatttgcg ggattatgcg aaagagaagg 180 gtgtcaccct gaccgctggc tacggcccgg ctaagggcga aaatcttagt tcttccgata 240 accgggttgt caaaaatgca aaagcctttt ataaggatgt gctgggaaag ctcaacaaac 300 tcgacataag gctgctgggc ggggggttat actcatactg gccggttgac tattctctgc 360 ccattgataa ggcgggggac tggaaacggt cagttgaaaa tatcagggaa attgccgcaa 420 tcgccgcaga ccgcaacgtg gtattgggga tggaggtatt aaaccgcttc gaagggtatt 480 tgcttaacac ctgtgaggaa ggaattaagt ttgtcgatga agttaatcac ccgaatgtaa 540 aagtcatgct ggatactttt cacatgaata ttgaggaaga taatatggct gaagccatcc 600 gcatggcggg ggataagctt gggcattttc atattggcga acagaaccgc aaggttcccg 660 ggaaaggatg catcccctgg aatgcaattg gtcatgccct gcgggacata cggtacaatg 720 ggacggtggt gatggagccc tttgtcatgc ccgggggaac catagggcag gatataaaag 780 tctggagaaa tttacttccc gagacaagcg aaacgatact ggatcgtgat gccaagggag 840 cgttggaatt tgtgaagcat gtgtttggta gtacttctgt tttataa 887 <210> 9 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDPE(E.coli) <400> 9 atgcagtacg gtatctactt cgcgtactgg accaaagaat ggcaggcgga ctacaaaaaa 60 tacatcgaca aagtttctaa actgggtttc gacatcctgg aaatctcttg cgcggcgctg 120 aaagaccagt acgtttctga ctctcagctg ttcgacctgc gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa actgaacaaa 300 ctggacatcc gtctgctggg tggtggtctg tactcttact ggccggttga ctactctctg 360 ccgatcgaca aagcgggtga ctggaaacgt tctgttgaaa acatccgtga aatcgcggcg 420 atcgcggcgg accgtaacgt tgttctgggt atggaagttc tgaaccgttt cgaaggttac 480 ctgctgaaca cctgcgaaga aggtatcaaa ttcgttgacg aagttaacca cccgaacgtt 540 aaagttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaagaag acaacatggc ggaagcgatc 600 cgtatggcgg gtgacaaact gggtcacttc cacatcggtg aacagaaccg taaagttccg 660 ggtaaaggtt gcatcccgtg gaacgcgatc ggtcacgcgc tgcgtgacat ccgttacaac 720 ggtaccgttg ttatggaacc gttcgttatg ccgggtggta ccatcggtca ggacatcaaa 780 gtttggcgta acctgctgcc ggaaacctct gaaaccatcc tggaccgtga cgcgaaaggt 840 gcgctggaat tcgttaaaca cgttttcggt tctacctctg ttctgctcga gcaccaccac 900 caccaccact ga 912 <210> 10 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPI <400> 10 atgaaaatct ctatcggttc tgaccacgcg ggtttcgaac tgaaagaaat catcaaagac 60 cacctgcaga aaaaaggtta cgaagttgtt gacaaaggta cctactctaa agaatctgtt 120 gactacccgc tgttcggtga agcggttggt cgttctgttt ctgaaggtga aaccgaccgt 180 ggtatcgtta tctgcggtac cggtatcggt atctctatct ctgcgaacaa aatcaaaggt 240 gttcgtgcgg cgctgtgcac caacgaatac atggcgcgta tgtctcgtaa acacaacgac 300 gcgaacgttc tggcgctggg ttctcgtgtt ctgggtatcg acctggcgct gtctatcgtt 360 gacaccttcc tgtctaccga cttcgaaggt ggtcgtcacg aacgtcgtgt tcacctgatc 420 cagaacatcg aaaaaatcaa cctgtaa 447 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE_F_BamHI(Duet) <400> 11 cgatcggatc cgatgaaaca cggtatctac tac 33 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE_R_HindIII(Duet) <400> 12 gcgaccaagc ttttatttcc attccagcat g 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EDPE_F_BamHI(Duet) <400> 13 cgatcggatc cgatgcaggg ttttggcgtc 30 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EDPE_R_NotI(Duet) <400> 14 gcgaccgcgg ccgcttagat caatccgtat tgccg 35 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EDPE_RPI_FUSION <400> 22 atgcagggtt ttggcgtcca tacgagcatg tggaccatga attgggatcg ccccggtgcg 60 gagcgcgccg ttgcggcggc ggtaaaatac gccgtcgact tcatcgagat cccgatgctc 120 aatccgccgg cggttgatac tgcccatacc agggcgctgc tggagaaaaa caagctgcgc 180 gcggtctgct cgctcggcct gccggagcgc gcctgggcat ccgtccgacc cgatgccgcg 240 atcgagcatc tgaaggtggc gatcgacaag acggccgatc tcggcggcga ggcgctgtcc 300 ggcgtcatct acggcggcat cggcgagcgc accggcgtgc cgccgactga agccgaatac 360 gacaacattg cccgtgtgct gcaggccgcc gccaagcacg ccaaaacccg cggcatcgaa 420 ctgggtgtcg aggcggtcaa ccgctacgag aaccacctga tcaacaccgg ttggcaagcg 480 gtcgacatga tcaagcgggt gggcgccgac aatgtcttcg tgcatctcga tacctaccac 540 atgaacatcg aggaaaaggg catcggcacc ggcatcctcg atgcacgcga cttcatcaaa 600 tacatccacc tgtccgaaag cgaccgcggc acgcccggct atggcaattg cgcctgggac 660 gagatcttcg cgacgctggc cgcgatcggt ttcaagggtg ggctggcgat ggaaagcttc 720 atcaacatgc cgccggaagt ggcctatggc cttgcggtct ggcggccggt cgccagggac 780 gaagaggaag tgatgggcaa cggcctgccg ttccttagga acaaggcccg gcaatacgga 840 ttgatctcgg gctctggtat gaaaatctct atcggttctg accacgcggg tttcgaactg 900 aaagaaatca tcaaagacca cctgcagaaa aaaggttacg aagttgttga caaaggtacc 960 tactctaaag aatctgttga ctacccgctg ttcggtgaag cggttggtcg ttctgtttct 1020 gaaggtgaaa ccgaccgtgg tatcgttatc tgcggtaccg gtatcggtat ctctatctct 1080 gcgaacaaaa tcaaaggtgt tcgtgcggcg ctgtgcacca acgaatacat ggcgcgtatg 1140 tctcgtaaac acaacgacgc gaacgttctg gcgctgggtt ctcgtgttct gggtatcgac 1200 ctggcgctgt ctatcgttga caccttcctg tctaccgact tcgaaggtgg tcgtcacgaa 1260 cgtcgtgttc acctgatcca gaacatcgaa aaaatcaacc tg 1302 <210> 23 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EDPE_RPI_FUSION <400> 23 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Ala Val 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Ala 35 40 45 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Thr Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Met Ile Lys Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ile Gly Thr Gly Ile 180 185 190 Leu Asp Ala Arg Asp Phe Ile Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Cys Ala Trp Asp Glu Ile Phe Ala 210 215 220 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Arg Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Arg Gln Tyr Gly Leu Ile Ser Gly Ser Gly Met Lys 275 280 285 Ile Ser Ile Gly Ser Asp His Ala Gly Phe Glu Leu Lys Glu Ile Ile 290 295 300 Lys Asp His Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Glu Val Val Asp Lys Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Glu Ser Val Asp Tyr Pro Leu Phe Gly Glu Ala Val Gly 325 330 335 Arg Ser Val Ser Glu Gly Glu Thr Asp Arg Gly Ile Val Ile Cys Gly 340 345 350 Thr Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ser Ala Asn Lys Ile Lys Gly Val Arg 355 360 365 Ala Ala Leu Cys Thr Asn Glu Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg Lys His 370 375 380 Asn Asp Ala Asn Val Leu Ala Leu Gly Ser Arg Val Leu Gly Ile Asp 385 390 395 400 Leu Ala Leu Ser Ile Val Asp Thr Phe Leu Ser Thr Asp Phe Glu Gly 405 410 415 Gly Arg His Glu Arg Arg Val His Leu Ile Gln Asn Ile Glu Lys Ile 420 425 430 Asn Leu <210> 24 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE_RPI_FUSION <400> 24 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaatcg ggctctggta tgaaaatctc tatcggttct 900 gaccacgcgg gtttcgaact gaaagaaatc atcaaagacc acctgcagaa aaaaggttac 960 gaagttgttg acaaaggtac ctactctaaa gaatctgttg actacccgct gttcggtgaa 1020 gcggttggtc gttctgtttc tgaaggtgaa accgaccgtg gtatcgttat ctgcggtacc 1080 ggtatcggta tctctatctc tgcgaacaaa atcaaaggtg ttcgtgcggc gctgtgcacc 1140 aacgaataca tggcgcgtat gtctcgtaaa cacaacgacg cgaacgttct ggcgctgggt 1200 tctcgtgttc tgggtatcga cctggcgctg tctatcgttg acaccttcct gtctaccgac 1260 ttcgaaggtg gtcgtcacga acgtcgtgtt cacctgatcc agaacatcga aaaaatcaac 1320 ctgtaa 1326 <210> 25 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPE_RPI_FUSION <400> 25 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys Ser Gly Ser Gly Met Lys Ile Ser Ile Gly Ser Asp His Ala Gly 290 295 300 Phe Glu Leu Lys Glu Ile Ile Lys Asp His Leu Gln Lys Lys Gly Tyr 305 310 315 320 Glu Val Val Asp Lys Gly Thr Tyr Ser Lys Glu Ser Val Asp Tyr Pro 325 330 335 Leu Phe Gly Glu Ala Val Gly Arg Ser Val Ser Glu Gly Glu Thr Asp 340 345 350 Arg Gly Ile Val Ile Cys Gly Thr Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ser Ala 355 360 365 Asn Lys Ile Lys Gly Val Arg Ala Ala Leu Cys Thr Asn Glu Tyr Met 370 375 380 Ala Arg Met Ser Arg Lys His Asn Asp Ala Asn Val Leu Ala Leu Gly 385 390 395 400 Ser Arg Val Leu Gly Ile Asp Leu Ala Leu Ser Ile Val Asp Thr Phe 405 410 415 Leu Ser Thr Asp Phe Glu Gly Gly Arg His Glu Arg Arg Val His Leu 420 425 430 Ile Gln Asn Ile Glu Lys Ile Asn Leu 435 440

Claims

사이코스 에피머화 효소(psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
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제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 내지 9로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소는 링커 펩타이드로 연결된 하나의 융합 단백질인 것인, 재조합 벡터.
삭제
제6항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22 또는 24의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제1항, 제4항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 과당-함유 원료로부터 알로오스 생산용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 과당으로부터 12 내지 15%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량% 기준으로, 과당 60 내지 63 중량%, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 혼합당 조성물의 형태인 것인, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 포함하지 않는 것인, 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는 과당-함유 원료로부터 알로오스를 생산하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 과당으로부터 12 내지 15%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량% 기준으로, 과당 60 내지 63 중량%, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 혼합당 조성물의 형태인 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 반응에 사용되는 과당의 농도는 10 내지 80%(w/v)인 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9의 조건하에서 수행되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 반응은 30 내지 80 ℃온도의 조건하에서 수행되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 첨가하는 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
사이코스 에피머화 효소(psicose epimerase) 및 알로오스 이성질화 효소가 링커 펩타이드로 연결된 융합 단백질을 포함하는 과당으로부터 알로오스 생산용 효소로서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
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제22항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
제22항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
제22항에 있어서, 상기 효소는 과당으로부터 12 내지 15%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
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