BR112019013853A2 - produção de açúcares isentos de células - Google Patents

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Abstract

são proporcionados neste documento, em algumas modalidades, sistemas, métodos e composições (por exemplo, células e lisados celulares) para converter enzimaticamente um carboidrato de glicose polimérico (por exemplo, amido) em açúcar.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade, sob 35 U.S.C. § 119(e), aos pedidos provisórios U.S. U.S.S.N. 62/443.447, depositado em 6 de janeiro de 2017, e U.S.S.N. 62/538.181, depositado em 28 de julho de 2017, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES [0002] As tecnologias existentes para a conversão de amido em açúcares simples empregam múltiplas reações de biotransformação, com extensos processos de purificação após cada biotransformação. Embora os processos de biotransformação sejam relativamente baratos, devido à aplicação de enzimas imobilizadas e sistemas de produção contínuos, os impactos do processamento à jusante custam dramaticamente.
SUMÁRIO [0003] São proporcionados neste documento sistemas, métodos, composições e kits isentos de células para a conversão enzimática de glicose polimérica, tal como amido (p.ex., amilose e/ou amilopectina), glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado, tal como maltodextrina ou celodextrina (que pode ser usada de modo trocável com o termo celulose), em açúcares de pentose (p.ex., ribose, arabinose ou xilulose) ou hexose (p.ex., alulose, glicose ou frutose). Os métodos da presente descrição efetuam as vias de produção de açúcar em reações isentas de células (p.ex., uma reação isenta de células de um pote (único)), para converter amido e/ou celulose/celodextrina em açúcares de hexose e/ou pentose. Ao contrário dos processos que tipicamente envolvem a fosforilação de substratos, tais como glicose em glicose 6-fosfato, e empregam fontes de fosfato de alta energia, tais como
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ATP e fosfato de fosfoenoíla, os processos descritos neste documento tipicamente substituem as fontes de fosfato de alta energia com, por exemplo, fosfato inorgânico (Pi) barato. Em algumas modalidades, uma α-glucano fosforilase (também referida como uma amido fosforilase) (EC 2.4.1.1) é usada para converter o amido em glicose 1-fosfato, que é então convertido em glicose 6~fosfato através de uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6). Em outras modalidades, uma celodextrina fosforilase (também referida como celulose fosforilase ou β(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.49) é usada para converter celulose/celodextrina em glicose 1-fosfato, que é então convertido em glicose 6-fosfato por meio de uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6). A(s) reação(ões) enzimática(s) subsequente(s) de uma via particular de produção de açúcar, como proporcionada neste documento, é(são) largamente específica(s) para o produto. Uma açúcar fosfatase (EC 3.1.3.-) é usada para converter o produto. Assim, as termodinâmicas da reação - fosforilação do substrato para desfosforilação do produto - favorecem o produto.
[0004] Além disso, as reações de conversão enzimáticas descritas neste documento são essencialmente irreversíveis, suportando assim altos rendimentos dos açúcares de hexose e pentose desejados. Em contraste, os métodos de biotransformação típicos para converter amido ou celulose/celodextrina em alulose, por exemplo, empregam três processos distintos, dois dos quais são reversíveis, com a concentração final do produto sendo governada pela termodinâmica das enzimas que estão sendo usadas. O amido, por exemplo, é convertido em glicose, a glicose é isomerizada em frutose e a frutose é epimerizada em alulose. A isomerização de glicose em frutose tem um rendimento de aproximadamente 45%, assim, é necessário um processamento significativo à jusante para produzir um produto puro e reciclar o substrato não catali
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3/154 sado. Similarmente, a epimerização de frutose em alulose tem um rendimento de -20%, necessitando novamente um processamento substancial à jusante para produzir um produto purificado e reciclar o substrato não catalisado. A capacidade de transformar diretamente o amido no produto de interesse nos sistemas isentos de células descritos neste documento reduz o custo reduzindo o processamento à jusante e a perda de substrato.
[0005] Vantajosamente, muitas das enzimas usadas nos processos proporcionados neste documento são termoestáveis, o que (1) permite a inativaçâo térmica das atividades deletérias contidas nos Hsados celulares nos quais é realizado o processo de conversão, e (2) diminui as chances de contaminação microbiana que impactam negativamente as etapas de produção. As enzimas destas vias de conversão podem ser isoladas de organismos termofilicos, mesofílicos ou psicrofílicos e/ou, em algumas modalidades, podem ser manipuladas para aumentar (ou diminuir) a termoestabilidade das enzimas. Um organismo termofílico (termófilo) desenvolve-se em altas temperaturas, entre 41°C e 122°C (106 °F e 252 °F). Um organismo mesofílico (mesófilo) desenvolve-se em temperaturas moderadas, entre 20°C e 45°C (68 °F e 113 °F). Um organismo psicrofílico (psicrófilo) desenvolve-se em temperaturas frias, entre -20°C e 10°C (-4 °F e 50 °F).
[0006] Assim, alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos para a produção de um açúcar (p.ex., alulose, glicose, frutose, sorbitol, ribulose, ribose e/ou arabinose), o método compreendendo (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima termoestável de uma via de produção de açúcar descrita neste documento, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois
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4/154 lisados celulares, (c) a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende enzimas termoestáveis da via de produção de açúcar, (d) o aquecimento da mistura de Hsados celulares até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor, e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um substrato (p.ex., amido, glicogênio, ou qualquer seu derivado parcialmente hidroHsado) e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir o açúcar.
[0007] Em algumas modalidades, um método isento de células para a produção de um açúcar (p.ex., alulose, glicose, frutose, sorbitol, ribulose, ribose e/ou arabinose) compreende (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima de uma via de produção de açúcar descrita neste documento, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas da via de produção de açúcar é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares, (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos Hsados celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor, (d) a combinação dos Hsados celulares das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende as enzimas da via de produção de açúcar, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um substrato (p.ex., amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente
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5/154 hidrolisado) e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir o açúcar.
[0008] Em algumas modalidades, um método isento de células para a produção de um açúcar (p.ex., alulose, glicose, frutose, sorbitol, ribulose, ribose e/ou arabinose) compreende (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima termoestável de uma via de produção de açúcar descrita neste documento, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, (b) a líse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares, (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares, (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas in~ desejadas, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor, (e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada da via de produção de açúcar e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um substrato (p.ex., amido, glicogênio, ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado) e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir o açúcar.
[0009] Em algumas modalidades, um método isento de células para a produção de um açúcar (p.ex., alulose, glicose, frutose, sorbitol, ribulose, ribose e/ou arabinose) compreende (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima de uma via de produção de açúcar descrita neste documento, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas
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6/154 para produzir pelo menos dois lisados celulares, (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos lisados celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor, (d) a combinação dos Hsados celulares das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de lisados celulares, (e) a adição à mistura de lisados celulares de pelo menos uma enzima purificada da via de produção de açúcar e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um substrato (p.ex., amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado) e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir o açúcar.
[00010] Alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos isentos de células para a produção de alulose, os métodos compreendendo (a) o cultivo das células manipuladas para expressar uma aglucano fosforilase (também referida como uma amido fosforilase), uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular, (c) o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzíma(s) termoestável(ls) da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor e (d) a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de amido, glicogênio, ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato Inorgânico), para produzir a alulose. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima purificada é adicionada ao lisado celular antes ou depois da etapa (c). Deve ser entendido que as células podem ser Hsadas por qualquer melo, incluindo a Hse mecânica, química, enzimática, osmótica ou térmica. Assim, a etapa de Hse e a etapa de aquecimento (inativação pelo calor)
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7/154 podem ser combinadas como uma única etapa de aquecimento das células até uma temperatura que lise as células e inative a atividade enzimática nativa.
[00011] Em algumas modalidades, os métodos isentos de células compreendem (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforílases, fosfoglícomutases, fosfoglícoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Usados celulares, (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir a alulose.
[00012] Em outras modalidades, os métodos isentos de células compreendem (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforílases, fosfoglícomutases, fosfoglícoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes
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8/154 enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares, (c) a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor, (e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir a alulose.
[00013] Em alguns aspectos da presente descrição, pode ser preferível usar celulose/celodextrina como um substrato de partida. Assim, alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos isentos de células para a produção de alulose, os métodos compreendendo (a) o cultivo das células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular, (c) o aquecimento do Hsado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor e (d) a incubação do lisado inativado pelo
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9/154 calor na presença de celodextrina e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir a alulose.
[00014] Em algumas modalidades, os métodos isentos de células compreendem (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam enzimas diferentes, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor e (e) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzira alulose.
[00015] Em outras modalidades, os métodos isentos de células compreendem (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células expressando diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável, (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas
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10/154 para produzir pelo menos dois Hsados celulares, (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares, (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative a(s) enzima(s) termoestável(is) da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor, (e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada, selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoísomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglícomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase: (f) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e uma fonte de fosfato (p.ex., fosfato inorgânico) para produzir a alulose.
[00016] A produção isenta de células de outros açúcares, tais como glicose, frutose, manose, sorbitol, ribulose, ribose e arabinose, é também incluída pela presente descrição.
[00017] Em algumas modalidades, as vias de açúcar apresentadas requerem o equilíbrio de cofatores energéticos, tais como NADH, NADPH, NAD+ ou NADP+. Isso pode ser feito através de sistemas de regeneração de cofator. Nesses casos, o NADH e o NADPH são referidos como cofatores reduzidos ou agentes redutores, e o NAD* e o NADP+ são referidos como cofatores oxidados ou agentes oxidantes. Para casos com agentes redutores em excesso, uma NAD(P)H oxidase (EC no. 1.6.3.1,1.6.3.2,1.6.2.3 ou 1.6.3.4) pode ser usada para queimar cofatores reduzidos em excesso, produzindo H2O2, O 2 ou H2O, dependendo do tipo de oxidase. Ao produzir H2O2 e Of, que podem causar danos prejudiciais ao lisado, a superóxido dismutase (EC no. 1.15.1.1) e/ou a catalase (EC no. 1.11.1.6) podem ser usadas juntas para conver
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11/154 ter as espécies nocivas em H2O e O2. Para casos com agentes oxidantes em excesso, um sistema de regeneração de cofator pode ser usado para reduzir os cofatores oxidados de volta para as suas formas reduzidas. Alguns exemplos incluem 0 uso de formiato desidrogenase (EC no. 1.2.1.2) para oxidar 0 formiato para CO2 enquanto reduz 0 NAD(P)+ para NAD(P)H, ou 0 uso de fosfonato desidrogenase (EC no. 1.20.1.1) ou suifito oxidorredutase (EC no. 1.8.1.2) para oxidar os respectivos sais inorgânicos para fosfato e sulfato, resultando em NAD(P)H reduzido [00018] Também são proporcionadas nestes documentos as células manipuladas, os lisados celulares e as misturas de reação compreendendo enzimas, tais como enzimas termoestáveis, usadas para a produção de um açúcar particular de interesse (p.ex., alulose, glicose, frutose, sorbitol, ribulose, ribose e/ou arabinose).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00019] A Figura 1 é uma representação esquemática de uma via enzimática para a conversão de amido em alulose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P ~ glicose 1-fosfato, G6P ™ glicose 6fosfato, F6P “· frutose 6-fosfato, A6P · alulose 6-fosfato e PO4 ™ fosfato inorgânico.
[00020] A Figura 2 é uma representação esquemática de duas vias enzimáticas para a conversão de amido em glicose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P = glicose 1-fosfato, G6P = glicose 6-fosfato e PO4 ” fosfato inorgânico.
[00021] A Figura 3 é uma representação esquemática de duas vias enzimáticas para a conversão de amido em frutose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P “ glicose 1-fosfato, G6P ™ glicose 6-fosfato, F6P = frutose 6-fosfato e PO4 ~ fosfato inorgânico.
[00022] A Figura 4 é uma representação esquemática de uma via enzimática para a conversão de amido em sorbitol. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P = glicose 1-fosfato, G6P = glicose 6
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12/154 fosfato, S6P “· sorbitol-6-fosfato, F6P frutose 6-fosfato, NADPH fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida), NADP+ ™ fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina e PO4 ·· fosfato inorgânico.
[00023] A Figura 5 é uma representação esquemática de uma via enzimática para a conversão de amido em ribulose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P = glicose 1-fosfato, G6P = glicose 6fosfato, 6PGL = 6-fosfogliconoiactona, 6PG = 6 fosfogliconato, Ru5P = ribulose 5-fosfato, NADPH ™ fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida), NADP+ = fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina, CO2 = dióxido de carbono e PO4 ~ fosfato inorgânico. [00024] A Figura 6 é uma representação esquemática de uma via enzimática para a conversão de amido em ribose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P - glicose 1-fosfato, G6P ™ glicose 6fosfato, 6PGL = 6-fosfogliconolactona, 6PG “· 6-fosfogliconato, Ru5P · ribulose 5-fosfato, R5P = ribose 5-fosfato, NADPH = fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida), NADP* = fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina, CO2 ™ dióxido de carbono e PO4 = fosfato inorgânico.
[00025] A Figura 7 é uma representação esquemática de uma via en~ zimática para a conversão de amido em arabinose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P = glicose 1-fosfato, G6P = glicose 6~fosfato, 6PGL ·· 6-fosfogliconolactona, 6PG ™ 6-fosfogliconato, Ru5P ™ ribulose 5-fosfato, Ar5P - arabinose 5-fosfato, NADPH · fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida), NADP+ = fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina, CO2 “ dióxido de carbono e PO4 = fosfato inorgânico.
[00026] A Figura 8 é uma representação esquemática de uma via enzimática para a conversão de amido em manose. O significado das abreviaturas é como se segue: G1P = glicose 1-fosfato, G6P = glicose
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6-fosfato, F6P = frutose 6-fosfato, M6P ™ manose 6-fosfato e PO4 fosfato inorgânico.
DESCRIÇÃO DETALHADA [00027] São descritas neste documento as vias enzimáticas usadas para a conversão de amido (p.ex., amilose ou amilopectina) ou celulose/celodextrina em açúcares de pentose (p.ex., ribose, arabinose ou xilulose) e/ou hexose (p.ex., alulose, glicose ou frutose). As vias enzimáticas utilizam pelo menos uma α-glucano fosforilase (também referida como uma amido fosforilase) (CE 2.4.1.1) ou pelo menos uma celodextrina fosforilase (também referida como celulose fosforilase) (CE 2.4.1.49), pelo menos uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6) e qualquer número de isomerases, epimerases e/ou açúcar fosfatases, dependendo do produto final. Em algumas modalidades, as enzimas, ou uma parte das enzimas, são termoestávels. Estas enzimas termoestáveis podem suportar a etapa de aquecimento do processo de produção de açúcar que inativa as atividades prejudiciais contidas nos lisados celulares nos quais são realizados os processos de conversão. Esta etapa de inativação pelo calor diminui as chances de contaminação microbiana que impacta negativamente as etapas de produção.
[00028] Assim, a presente descrição proporciona, em algumas modalidades, métodos, composições e sistemas altamente eficientes e de custos compensadores para produzir açúcares, tais como os açúcares de hexose e pentose. Os exemplos não limitativos das vias de produção de açúcares e das enzimas das vias são proporcionados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Sumário das Enzimas Ilustrativas das Vias
Via Substrato Enzimas
produção de glicose a(1-4) ou β(1-4) glucanos a- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), glicose 6-fosfafo fosfatase (EC 3.1.3.9, 3,1,3.58)
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produção de glicose α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), glicose 1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.10)
produção de frutose α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2,4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9), e frutose 6-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
produção de alulose α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9), alulose 6-fosfato epimerase (EC 5.1.3.-), e alulose 6-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
produção de sorbitol α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), aldose desidrogenase (EC 1.1.1.200), e sorbitol-6-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.50, 3.1.3.58)
produção de sorbitol α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9) sorbitol-6-fosfato 2-desidrogenase (EC 1.1.1.140) sorbitol-6-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.50, 3.1.3.58)
produção de ribulose α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363), 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351), e ribulose 5-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
produção de ribose α(1-4) ou β(1-4) glucanos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2.4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363),
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6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351), e ribose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6), e ribose 5-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
produção de arabinose α(1-4) ou β(1-4) glu canos o- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2,4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49, 1.1.1.388, 1.1.1.363), 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44, 1.1.1.343, 1.1.1.351), e arabinose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.13), e arabinose 5-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
produção de manose 0(1-4) ou β(1-4) g lu canos α- ou β-(1-4) glucano fosforilase (EC 2,4.1.1, 2.4.1.49), fosfoglicomutase (EC 5,4.2,2, 5.4.2.5, 5.4.2.6), fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9), manose 6-fosfato isomerase (EC 5.3.1.8), e manose 6-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-, 3.1.3.58)
Produção de Aiulose [00029] Alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a aiulose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma fosfoglicoisomerase, pelo menos uma aiulose 6-fosfato epimerase, pelo menos uma aiulose 6-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas (p.ex., pelo menos três ou pelo menos quatro) das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (qulmérica) única ou uma proteína bifuncional.
[00030] Uma proteína de fusão pode ser criada unindo dois ou mais
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16/154 genes ou segmentos de genes que codificam para proteínas separadas. A tradução deste gene de fusão resulta em um único polipeptídeo ou polipeptídeo múltiplos com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais. Uma proteína polifuncional é uma proteína única que tem pelo menos duas atividades diferentes, em que essa funcionalidade é uma função biológica nativa ou o resultado de uma fusão enzimática manipulada. Outras enzimas podem também ser expressas como uma única proteína de fusão ou uma proteína polifuncional. Assim, uma proteína de fusão pode conter múltiplas funcionalidades de quaisquer das enzimas das vias descritas neste documento.
[00031] As enzimas das vias de produção de alulose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrína em alulose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00032] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., células de Escherichia coll), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
[00033] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celulose/celodextrina em alulose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas (p.ex., pelo menos três ou pelo menos quatro) das enzimas são
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17/154 enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas sâo enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo de células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicolsomerase termoestável, pelo menos uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável, pelo menos uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfogllcomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicolsomerase termoestável, pelo menos uma alulose 6fosfato epimerase termoestável, pelo menos uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00034] Em algumas modalidades, os métodos de produção de alulose incluem a Use (p.ex., a lise térmica, osmótlca, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, por exemplo, do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e/ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de alulose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de alulose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada
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18/154 para expressar peto menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de peto menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma fosfoglicoisomerase, o cultivo de peto menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma alulose 6-fosfato epimerase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma alulose 6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de peto menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicoisomerase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma alulose 6-fosfato epimerase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar peto menos uma alulose 6-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00035] Deve ser entendido que, em qualquer um dos métodos descritos neste documento, as células podem ser lisadas por qualquer meto, incluindo a lise mecânica, química, enzimática, osmótica e/ou térmica. Assim, uma etapa de lise e uma etapa de aquecimento (inativação peto calor) podem ser combinadas como uma única etapa de aquecimento das células até uma temperatura que lise as células e inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas.
[00036] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de li
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19/154 sados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimaticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C. Uma enzima nativa (ou outra enzima não termoestável) é considerada inativa, em algumas modalidades, quando o seu nível de atividade for reduzido em pelo menos 50%. Em algumas modalidades, uma enzima nativa (ou outra enzima não termoestável) é considerada inativa quando o seu nível de atividade for reduzido em pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%.
[00037] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas nâo termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido^) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade de pelo menos algumas das enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00038] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada (ou enzima parcialmente purificada) é adicionada à mistura de lisados celulares/reaçâo. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode
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20/154 ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases.
[00039] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico para produzir a alulose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a alulose. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3, 4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Por exemplo, a reação pode incluir a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto (p.ex., parte da biomassa). Por exemplo, em algumas modalidades, o(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor (p.ex., os lisados de células microbianas) é(são) incubado(s) na presença de polpa de milho e fosfato inorgânico para produzir a alulose (ou qualquer outro açúcar descrito neste documento).
[00040] Também são proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de alulose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana, célula de levedura e/ou célula de planta) ou (um) Hsado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro) enzima selecionada a partir do grupo que
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21/154 consiste em α-glucano fosforilase, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana, célula de levedura e/ou célula de planta) ou (um) Hsado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) Hsado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6fosfato fosfatases termoestáveis.
Tabela 2. Enzimas Ilustrativas da Via de Alulose
Etapa da Via Nome da En- zima EC No. Organismo Nativo NCBI No.
1 α-glucano fosfo- riiase 2.4.1.1 Aquifex aeolicus WP_010880430
Thermocrínis minervae WP..079S54205
Thermosulfidibacter takaii WP_06S550435
Thermosulfunmonas dismutans WP.068671361
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Thermococcus litoraiis WP_004066514
Palaeococcus pacificus WP.048164525
Thermotoga neapolitana WP_015919877
Ruminiclostrídium thermocellum WP..003512623
Pyroooccus abyssí WP_048146597
Thermococcus thioredu- cens WP.055429034
Deinococcus radiodurans NP__295917
Sulfolobus acidocaldaríus WP..011277212
Thermus caldophilus AAV68178
Meiothermus silvanus ADH63988
Oceanithermus profundus WP_013457575
Ardenticatena marítima WPJ354491617
Thermococcus barophi- lus VVP..013466486
Pseudothermotoga ther- marum WP_013931760
Hydrogenobacter thermophilus WP_012962737
Thermus oshimai AFV76231
Meiothermus ruber WP..013013285
Marínitoga piezophila WP_014295659
Celodextrina fosforilase (também referida como celodextrina fosforilase) 2.4.2.49 Clostridium thermocellum BAB71818
Clostridium straminisolvens GAE90338
Thermotoga RQ2 WP_011943512
Ignisphaera aggregans ADM28607
Thermotoga marítima WP_004082399
Spirochaeta thermophila WP...013314871
Caldicellulosiruptor bescii WP_015907054
Dictyoglomus thermophi- lum WP_012548338
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Thermoanaerobacterium therrnosaccharolyticum WP_013297089
Thermosípho afrícanus ACJ76363
Caldisalinibacter kiritimatiensis WP„006313788
Defluviitalea phaphyphila WP..058486419
Caldicellulosiruptor kro- notskyensis WP_013429146
Thermococcus sibiricus WP_015848606
Thermosphaera aggre- gates WP_013129904
2 Fosfoglicomu- íase 5.4.2.6 Thermococcus kodakara- ensis BAD42440
Pyrococcus kukulkanii WP-068320630
Ammonífex degensii WP_015738524
Methanothermobacter wolfeii WP_074359679
Methanothermus fervídus WP...013413625
Sulfolobus acidocaldarius WP_011277678
Archaeoglobus fulgidus WP_010877965
Ferroglobus placidus WP_012964640
Geoglobus ahangarí WP..048096365
Archaeoglobus veneficus WP_013683858
Archaeoglobus sulfatícallidus WP_015589873
Acíduliprofundum boonie WP_012997480
Clostridium thermocellum WP..0Q3517493
Defluviitalea phaphyphila WP_058485855
Caminicella sporogenes WP„072968430
Caloranaerobacter fer- ríreducens WP„069650396
Thermosípho malanesíensis WP_012056981
Fervídobacterium penni- vorans WP_014451812
Symbiobacteríum thermophilum WP_011196853
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Spirochaeta thermophila ADN02136
Thermoanaerobacter wi- egelii AEM79998
3 Fosfoglicoiso merase 5.3.1.9 Thermus thermophilus WP___041443619
Meiothermus timidus WP_018467230
Thermus filiformis WP„038061840
Marinithermus hydrothermalis WP_013704730
Thermosipho africanas VVP..0Q4103575
Sulfurihydrogenibium azorense WP_012674892
Persephonella marina WP_012675923
Marinitoga piezophila WP_014295589
Kosmotoga olearia WP..012744692
Thermotoga marítima WP_004081585
Geobacillus stearothermophilus KZE97846
Anoxybacillus flavither- mus WP„041638934
Thermosulfídíbacter takaii BAT72177
Fervidobacterium nodo- sum WP_011994042
Clostridium thermocellum WP„003512317
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum WP_013297353
Methanococcus jannaschii WP_010871130
Methanotorris igneus WP...013799854
Methanocaldococcus villosus WP_004589908
Methanothermococcus okinawensis WP_013867340
Pseudothermotoga ther- marum WP_013931655
Deferribacter desulfuri- cans VVP..013007743
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Thermovibrío ammonifi- cans WP-013537727
4 Alulose 6-fosfato epimerase 5.3.1,- Thermobacteríum thermosaccharolyticum WP..013298194
Thermoanaerobacter brockii WP_003868217
Caldanaerobacter subter- râneos WP_011025758
Deferribacter desulfuri- oans WP_013008817
Thermocrínis ruber WP_025305325
Hydrogenivirga sp. 128- 5-R1-1 WP..0Q8287078
Brevibacillus thermoruber WP_029098887
Thermosípho atlantícus WP„073071389
Thermosulfídibacter takaií WPJ368550718
5 Alulose 6-fosfato fosfatase 3.1.3,- Thermoanaerobacter wi- egeíii WP.014063120
Thermoanaerobacter ethanolious WP„003870772
Thermus islandicus WP___022799086
Deinococous geothermalisDSM 11300 ABF44399
Thermosphaera aggre- gans WP_013129214
Crenarchaeota archaeon 13_1_40CM_3_53_5 WP_013335457
Pyrococcus horikoshií Ot3 WPJ310884566
Aquifex aeolicus WP_010880861
Ruminiclostridium ther- mocellum WP.003512401
Desulfotomaculum kuz- netsovií AEG14852
Caldanaerobacter subter- raneus WP„009610632
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Acidothermus cellulolyti- cus WP_011718939
Methanothermobacter thermautotrophicus WP.010877362
Thermobífída fusca AAZ54262
Thermotoga neapolitana ACM23496
Petrotoga mobilis WP_012207996
Thermodesulfatator indi- ces WP_013908370
Thermus thermophílus AAS81813
Bacteroides vulgatus ABR41712
Bacteroides fragilus CAH06673
[00041] Deve ser entendido que a via para a produção de alulose pode incluir qualquer combinação de enzimas selecionadas a partir de cada uma das Etapas da Via 1~5 da Tabela 2. Por exemplo, a α-glucano fosforilase da Etapa da Via 1 pode ser selecionada a partir de qualquer uma das α-glucano fosforilases de Aquifex aeolicus, Thermocrínis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurímonas dismutans, Thermococeus iitoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostrídium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaidaríus, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena marítima, Thermococcus barophiius, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacterthermophiius, Thermusoshímaí, Meiothermus ruber, e Marínitoga piezophila e combinada com uma fosfoglicomutase da Etapa da Via 2 selecionada a partir de qualquer uma das fosfoglicomutases de Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaidaríus, Archaeoglobus fuigidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangarí, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduiiprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter fer
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27/154 rireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobactehum thermophilum, Spirochaeta thermophila, e Thermoanaerobacter wiegelii.
Produção de Glicose [00042] Outros aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a glicose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma glicose 6-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a a-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional. Em algumas modalidades, estes métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma oglucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma glicose 1-fosfato fosfatase ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a o-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional.
[00043] As enzimas das vias de produção de glicose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em glicose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima
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28/154 (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00044] As células hospedeiras podem ser células procariótlcas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia coii), ou células eucariótlcas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células sâo descritos abaixo.
[00045] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em glicose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma glicose 1-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma glicose 1-fosfato fosfatase termoestável, ou
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29/154 uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00046] Em algumas modalidades, os métodos de produção de glicose incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, assim, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de glicose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de glicose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ceiodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma a-glucano fosforilase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células
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30/154 manipulada para expressar pelo menos uma glicose 1-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 1-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00047] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inatíve as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido^) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C.
[00048] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00049] Após a Inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma
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31/154 mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases e glicose 6-fosfato fosfatases. Alternativamente, pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases e glicose 1fosfato fosfatases.
[00050] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inatívado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzira glicose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a glicose. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3, 4 ou 5 minutos). Por exemplo, os Hsados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos.
[00051] O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto. [00052] Também são proporcionados neste documento as células e os Hsados celulares usados para a produção de glicose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) Hsado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo
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32/154 que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases e glicose 6fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celulares) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases e glicose 6-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilase e glicose 1-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases e glicose 1-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lísado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e glicose 6fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas) enzima selecionada a partir do grupo que con
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33/154 siste em α-glucano fosforilases termoestáveis e glicose 1-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) Hsado(s) celulares) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos dois) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis e glicose 1-fosfato fosfatases termoestáveis.
Produção de Frutose [00053] Ainda outros aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a frutose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma fosfoglicoisomerase, pelo menos uma frutose 6-fosfato fosfatase ou uma combinação de menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional.
[00054] As enzimas das vias de produção de frutose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam serendógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em frutose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas são endógenas à célula hospedeira.
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34/154 [00055] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia ccii), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
[00056] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em frutose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelo menos três das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00057] Em algumas modalidades, os métodos de produção de frutose incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) Usado celular. Deve ser entendido que múltiplos Usados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode
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35/154 ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de frutose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de frutose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicoisomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma frutose 6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicoisomerase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma frutose 6-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00058] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que Inative as atividades enzlmáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) Hsado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de
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36/154 pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C. [00059] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas nâo termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00060] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, peio menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases e frutose 6-fosfato fosfatases.
[00061 ] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a frutose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a frutose. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3, 4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante
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2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto.
[00062] Também são proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de frutose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases e frutose 6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatase termoestável. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatase termoestável.
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Produção de Manose [00063] Além disso, alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a manose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma fosfoglicoisomerase, pelo menos uma manose 6fosfato isomerase, pelo menos uma manose 6-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional· [00064] As enzimas das vias de produção de manose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em manose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00065] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia coii), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
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39/154 [00066] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em manose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma manose 6-fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma manose 6-fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00067] Em algumas modalidades, os métodos de produção de manose incluem a Hse (p.ex., a Hse térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos Hsados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produ
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40/154 ção de manose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de manose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicoisomerase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma manose 6-fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma manose 6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicoisomerase., o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma manose 6-fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma manose 6-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00068] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir o lisado inativado pelo
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41/154 calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) Hsado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C.
[00069] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas nâo termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(sâo) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas nâo termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00070] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira^) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerase, manose 6-fosfato isomerases e manose 6-fosfato fosfatases.
[00071] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido efosfato inorgânico, para produzira manose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a manose. Em algumas modalidades, os lisados inativados
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42/154 peto calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante peto menos 2 minutos (p.ex., peto menos 3, 4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados peto calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto.
[00072] São também proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de manose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., peto menos duas, peto menos três, peto menos quatro, peto menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforllases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, manose 6-fosfato isomerases e manose 6-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir peto menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, peto menos cinco ou peto menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, manose 6-fosfato isomerases e manose 6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) peto menos uma (p.ex., pelo menos duas, peto menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou peto menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases
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43/154 termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato isomerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato isomerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis.
Produção de Sorbitol [00073] Ainda outros aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir o sorbitol. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma aldose desldrogenase, pelo menos uma sorbitol 6-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma fosfoglicoisomerase, pelo menos uma sorbitol 6-fosfato 2~desidrogenase, pelo menos uma sorbitol 6-fos~ fato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional.
[00074] As enzimas das vias de produção de sorbitol, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula
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44/154 diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em sorbitol é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00075] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia coli), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
[00076] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em sorbitol é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro das enzimas sâo enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma a-glu~ cano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma aldose desidrogenase termoestável, pelo menos uma sorbitol 6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma aldose desidrogenase termoestável, pelo menos uma sorbitol6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos
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45/154 duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma sorbitol 6-fosfato 2-desidrogenase termoestável, pelo menos uma sorbitol-6-fosfato 2~desidrogenase termoestável, pelo menos uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma fosfoglicoisomerase termoestável, pelo menos uma sorbitol 6-fosfato 2-desidrogenase termoestável, pelo menos uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00077] Em algumas modalidades, os métodos de produção de sorbitol incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de sorbitol, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de sorbitol. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos
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46/154 uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma aldose desidrogenase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma sorbitol-6-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma aldose, desidrogenase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma sorbitol-6-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00078] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimaticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) Hsado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C.
[00079] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es)
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47/154 é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(sâo) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00080] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, sorbitol~6~fosfato 2-desidrogenases, aldose desldrogenases e sorbitol-6-fosfato fosfatases.
[00081 ] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3, 4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente
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48/154 de um composto.
[00082] Também sâo proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de sorbitol. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, aldose desidrogenases e sorbitol-6-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, aldose desidrogenases e sorbitol-6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) Hsado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que con
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49/154 siste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, sorbitol-6-fosfato 2-desidrogenases e sorbítol-6-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, sorbitol-6-fosfato 2-desidrogenases e sorbitol-6-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, sorbitol~6~fosfato aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fos~ fato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, sorbitol-6-fosfato 2-desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis.
Produção de Ribulose [00083] Outros aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a ribulose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase, pelo menos uma ribulose
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5-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-glucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncional.
[00084] As enzimas das vias de produção de ribulose, como proporcionadas neste documento, sâo tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em ribulose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00085] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia coli), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
[00086] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em ribulose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo me
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51/154 nos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6~fosfogllconolactonase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogllconolactonase termoestável, pelo menos uma 6fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma ribulose 5fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00087] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ribulose incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de ribulose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de ribulose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população
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52/154 de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactona, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6fosfogliconato desidrogenase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribulose 5-fosfato fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribulose 5-fosfato fosfatase. Após a Hse das células, os Hsados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de Hsados celulares/reação.
[00088] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um Hsado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido^) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) Hsado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de
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53/154 pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C. [00089] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) aquecldo(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas nâo termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[00090] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases e ribulose 5-fosfato fosfatases.
[00091 ] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido efosfato inorgânico, para produzira ribulose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3, 4 ou 5 minutos). Por
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54/154 exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto.
[00092] Também são proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de ribulose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases e ribulose 5-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactona~ ses, 6-fosfogliconato desidrogenases e ribulose 5-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura)
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55/154 ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfogiicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis e ribulose 5~fosfato fosfatases termoestáveis.
Produção de Ribose [00093] Mais ainda, alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para produzir a ribose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, pelo menos uma 6fosfogliconolactonase, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase, pelo menos uma ribose 5-fosfato isomerase, pelo menos uma ribose 5-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a α-giucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase sâo expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bi~ funcionai.
[00094] As enzimas das vias de produção de ribose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (inicialmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam serendógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em ribose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são heterólogas à célula
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56/154 hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[00095] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia colí), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células são descritos abaixo.
[00096] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em ribose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos Incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, pelo menos uma 6fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma ribose 5
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57/154 fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[00097] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ribose incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., peto menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) lisado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de ribose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de ribose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfoglíconato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribose 5-fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribose 5-fosfato fosfatase. Em algumas mo
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58/154 dalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribose 5-fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma ribose 5-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[00098] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) Hsado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C.
[00099] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante peto menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es)
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59/154 é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(sâo) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[000100] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases, ribose 5-fosfato isomerases e ribose 5-fosfato fosfatases.
[000101] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribose. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor é(são) inoubado(s) a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3,4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas
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60/154 modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto.
[000102] Também são proporcionados neste documento as células e os Hsados celulares usados para a produção de ribose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desídrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desídrogenases, ribose 5-fosfato isomerases e ribose 5-fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desídrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogl icon ato desídrogenases, ribose 5-fosfato isomerases e ribose 5-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) IIsado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desídrogenases termoestáveis, 6~fosfo~ gliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desídrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis. Em aigumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um)
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61/154 lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis.
Produção de Arabinose [000103] Além disso, alguns aspectos da presente descrição proporcionam métodos, composições e sistemas para a produção de arabinose. Estes métodos, em algumas modalidades, incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase e/ou pelo menos uma celodextrina fosforilase, pelo menos uma fosfoglicomutase, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase, pelo menos uma arabinose 5-fosfato Isomerase, pelo menos uma arabinose 5-fosfato fosfatase, ou uma combinação de pelo menos duas das enzimas precedentes. Em algumas modalidades, a aglucano fosforilase (e/ou a celodextrina fosforilase) e a fosfoglicomutase são expressas como uma proteína de fusão (quimérica) única ou uma proteína bifuncionaL [000104] As enzimas das vias de produção de arabinose, como proporcionadas neste documento, são tipicamente heterólogas à célula hospedeira (iniclalmente clonadas ou obtidas a partir de um tipo de célula diferente), embora algumas das enzimas possam ser endógenas (nativas) à célula hospedeira. Assim, em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) usada para converter o amido e/ou a celodextrina em arabinose é heteróloga à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três,
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62/154 pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são heterólogas à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) é endógena (nativa) à célula hospedeira. Em algumas modalidades, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis enzimas são endógenas à célula hospedeira.
[000105] As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como as células bacterianas (p.ex., as células de Escherichia coli), ou células eucarióticas, tais como as células de levedura ou as células de plantas. Os outros tipos de células sâo descritos abaixo.
[000106] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas usadas para converter o amido e/ou a celodextrina em arabinose é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconolacto~ nase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma arabinose 5-fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma arabinose 5-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células manipuladas para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase termoestável, pelo menos uma fosfoglicomutase termoestável, pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, pelo menos uma
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63/154 arabinose 5-fosfato isomerase termoestável, pelo menos uma arabinose 5-fosfato fosfatase termoestável, ou uma combinação de pelo menos duas ou mais das enzimas termoestáveis precedentes.
[000107] Em algumas modalidades, os métodos de produção de arabinose incluem a lise (p.ex., a lise térmica, mecânica, química ou enzimática) das células cultivadas para produzir pelo menos um (p.ex., pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro) Usado celular. Deve ser entendido que múltiplos lisados celulares (e, desse modo, múltiplas populações de células, p.ex., do mesmo organismo (p.ex., bactérias) ou de diferentes organismos (p.ex., bactérias, leveduras e ou células de plantas)) podem ser usados em uma reação enzimática como proporcionada neste documento. Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de arabinose, enquanto outra população de células (ou diversas outras populações de células) pode ser manipulada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de arabinose. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma α-glucano fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6~fosfogliconato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma arabinose 5fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma arabinose 5-fosfato
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64/154 fosfatase. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma celodextrina fosforilase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma fosfoglicomutase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma glicose 6-fosfato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconolactonase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma 6-fosfogliconato desidrogenase, o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma arabinose 5-fosfato isomerase, e/ou o cultivo de pelo menos uma população de células manipulada para expressar pelo menos uma arabinose 5-fosfato fosfatase. Após a lise das células, os lisados celulares são combinados de modo tal que as enzimas estejam presentes em uma única mistura de lisados celulares/reação.
[000108] Em algumas modalidades, os métodos incluem adicionalmente o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) até uma temperatura que inative as atividades enzimáticas nativas indesejadas, porém não inative nenhuma das enzimas termoestáveis da via de produção, para produzir lisado inativado pelo calor. O(s) lísado(s) celular(es), em algumas modalidades, é(são) aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 50°C. Por exemplo, o(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) até uma temperatura de pelo menos 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°C.
[000109] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) durante um período suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celulares) pode(m) ser aquecido(s) durante pelo menos 2, 3, 4 ou pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es)
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65/154 é(são) aquecido(s) por mais do que 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é(sâo) aquecido(s) durante um período suficiente para reduzir a atividade das enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) em pelo menos 50% (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).
[000110] Após a inativação pelo calor, em algumas modalidades, pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas ou pelo menos três) enzima purificada é adicionada à mistura de lisados celulares/reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, inclui uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressas pela(s) célula(s) hospedeira(s) manipulada(s)) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases ou celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases, arabinose 5-fosfato isomerases e arabinose 5-fosfato fosfatases.
[000111] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados a uma temperatura de pelo menos 50 C. Em algumas modalidades, os lisados inativados pelo calor são incubados durante pelo menos 2 minutos (p.ex., pelo menos 3,4 ou 5 minutos). Por exemplo, os lisados inativados pelo calor podem ser incubados durante 2-5 minutos ou 2-10 minutos. O amido pode ser, por exemplo, a amilose, a amilopectina ou uma mistura de amilose e amilopectina. Em algumas modalidades, a biomassa é usada em vez do amido. Nestas
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66/154 modalidades, a reação inclui a(s) celodextrina fosforilase(s). Em algumas modalidades, o amido ou a celodextrina está presente como um componente de um composto.
[000112] Também são proporcionados neste documento as células e os lisados celulares usados para a produção de arabinose. Assim, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforílases, fosfoglícomutases, glicose 6-fosfato desídrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases, arabinose 5-fosfato isomerases e arabinose 5fosfato fosfatases. Uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição pode(m) incluir pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglícomutases, glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desidrogenases, arabinose 5-fosfato isomerases e arabinose 5-fosfato fosfatases. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilase termoestável, fosfoglícomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6~fosfo~ gliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis. Em algumas modalidades, uma célula manipulada (p.ex., célula bacteriana e/ou célula de levedura) ou
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67/154 (um) lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui(em) pelo menos uma (p.ex., pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis) enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6fosfogliconolactonases termoestáveis, 6~fosfogHconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis.
Flexibilidade do Substrato e Enzimas Removedoras de Ramificação [000113] Para todas as vias descritas neste documento, pode ser usada uma multiplicidade de substratos polímérícos de glicose. Os exemplos não limitativos de substratos poliméricos de glicose incluem o amido, o glicogênio e a celodextrina. Em algumas modalidades, o substrato é o amido. Em outras modalidades, o substrato é o glicogênio. Ainda em outras modalidades, o substrato é a celodextrina. Em algumas modalidades, é usada uma versão parcialmente hidrolisada de um substrato polimérico de glicose (p.ex., amido, glicogênio ou celulose/celodextrina). O amido e o glicogênio incluem uma pluralidade de monômeros de glicose ligados principalmente por ligações a(1-4), enquanto a celodextrina inclui os mesmos monômeros de glicose ligados por ligações β(1 -4). Outra diferença importante entre a celodextrina e os outros dois substratos é a existência de ramificações a(1-6) das cadeias a(1-4). Tanto o amido quanto o glicogênio contêm esses pontos de ramificação, embora o glicogênio seja substancialmente mais ramificado do que o amido. Para os polímeros a(1-4), as α-glucano fosforilases, também referidas como α-glucano fosforilases ou glicogênio fosforilases, dependendo da preferência do substrato, consomem os polímeros uma glicose de cada vez, liberando o glicose 1-fosfato. Para a celodextrina, a celodextrina fosforilase realiza a mesma reação, liberando também o glicose 1-fosfato.
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68/154 [000114] Os polímeros longos de amido e celulose/celodextrina são frequentemente insolúveis em soluções aquosas e, além de precipitar, podem causar gelificação e retrogradação da solução. Quando o amido e a celulose/celodextrina forem parcialmente hidrolisados para polímeros de menor comprimento de cadeia, através de métodos químicos (p.ex., hidrólise ácida) ou enzimáticos (p.ex., a-amilase), os produtos resultantes sâo as maltodextrinas e as celodextrinas para o amido e a celulose, respectivamente. Estes derivados hidrolisados frequentemente solubilizam-se e misturam-se melhor do que as suas moléculas de origem e, assim, em algumas modalidades, são usados nas vias proporcionadas neste documento.
[000115] Para o glicogênio, o amido ou as maltodextrinas hidrolisadas, as ramificações a(1-6) reduzirão substancialmente os rendimentos de qualquer via de açúcar, uma vez que a glucano fosforilase mastiga os polímeros até o final de suas ramificações, deixando não convertido um grande núcleo central de glicose disponível. Para estes substratos/vias, as enzimas removedoras de ramificação podem ser usadas para aumentar a disponibilidade de substratos para a glucano fosforilase. Existem duas classes ilustrativas de enzimas removedoras de ramificação que podem ser usadas - isoamilases e pululanases (ver, p.ex., a Tabela 3). Enzimaticamente, ambas as classes executam a mesma função, porém diferem na especificidade para o substrato. Embora o uso da enzima removedora de ramificação aumente o rendimento, o tempo certo de uso dependerá do processo e dos substratos que estão sendo usados. Em algumas modalidades, um α-glucano é pré-tratado com a-amilase e uma enzima removedora de ramificação e, então, a(s) maltodextrina(s) removedora(s) de ramificação resultante(s) é(são) alimentada(s) a um reator com as outras enzimas da via. Em outras modalidades, a remoção de ramificação ocorre em simultâneo com a via e os a-glucanos ramificados são alimentados à reação contendo todas as enzimas
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69/154 da via, assim como a enzima removedora de ramificação. Tabela 3. Enzimas Removedoras de Ramificação Ilustrativas
Nome da Enzima EC No. Organismo Nativo NCB! No.
Pululanase 3.2.1.41 Fervidobacteríum pennavorans AAD30387
Thermotoga sp. RQ5 WP_012310857
Bacillus flavocaldarius BAB18516
Thermosipho afrícanus WP..004100450
Kosmotoga olearia WP.015868997
Isoamilase 3.2.1.68 Sulfolobus tokodaii BAB65940
Metallosphaera hakonensis AAS00512
Sphaerobacter thermophílus WP...012873143
Bacillus lentus AGL34022
Produção Isenta de Células [000116] A produção isenta de células é o uso de processos biológicos para a síntese de uma biomolécula ou composto químico sem o uso de células vivas. Em vez disso, as células são Usadas e as partes não purificadas (brutas), contendo enzimas, são usadas para a produção de um produto desejado. Como um exemplo não limitative, as células são cultivadas, coletadas e lisadas por homogeneização a alta pressão. A reação isenta de células pode ser conduzida em um modo batelada ou batelada alimentada. Em alguns casos, as redes de reação biológica preenchem o volume de trabalho do reator e podem ser mais diluídas do que o ambiente intracelular. Ainda, substancialmente todos os catalisadores celulares são proporcionados, incluindo os catalisadores que sejam associados à membrana. A membrana Interna é fragmentada durante a lise celular, e os fragmentos dessas membranas formam vesículas de membrana funcionais. Assim, as biotransformações complexas são efetuadas por catálise. Ver, p.ex., Swartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13, incorporado neste documento por referência.
[000117] Os métodos e os sistemas isentos de células da presente descrição, em algumas modalidades, utilizam lisados celulares (p.ex., lisados celulares brutos ou parcialmente purificados), discutidos em
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70/154 maior detalhe neste documento. Os lisados celulares podem ser preparados, por exemplo, por meios mecânicos (p.ex., corte ou esmagamento). Em algumas modalidades, os lisados celulares são distintos das células quimicamente permeabilizadas. Como discutido aqui, em algumas modalidades, durante a lise celular (p.ex., lise celular mecânica), a membrana celular interna é fragmentada de modo tal que as vesículas de membrana invertidas sejam formadas nos lisados das células. As células que são lisadas (p.ex., pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%) não mais estão intactas.
[000118] Em algumas modalidades, são usadas células permeabilizadas. As células permeabilizadas são células intactas contendo perfurações (pequenos orifícios). Em algumas modalidades, as células podem ser permeabilizadas para libertar o conteúdo celular para utilização em uma reação como proporcionada neste documento.
[000119] Em algumas modalidades, são usadas frações celulares parcialmente purificadas. Uma fração celular parcialmente purificada é um Usado celular do qual um ou mais componentes celulares (p.ex., membranas celulares) tenham sido parcial ou completamente removidos. Enzimas Termostáveis [000120] Uma enzima é considerada termoestável se a enzima (a) conservar uma parte substancial de sua atividade após a exposição a altas temperaturas, que desnaturam as outras enzimas nativas ou (b) funcionar a uma taxa relativamente alta após a exposição a uma temperatura média a alta, onde as enzimas nativas funcionam a baixas taxas.
[000121] Em algumas modalidades, uma enzima termoestável conserva mais do que 50% de atividade após a exposição a uma temperatura relativamente alta que, de outro modo, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável). Em algumas modalidades, uma enzima termoestável conserva 50-100% de atividade após a exposição
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71/154 a uma temperatura relativamente alta que, de outro modo, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável). Por exemplo, uma enzima termoestável pode conservar 50-90%, 50-85%, 50-80%, 5075%, 50-70%, 50-65%, 50-60% ou 50-55% da sua atividade após a exposição a uma temperatura relativamente alta que, de outro modo, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável). Em algumas modalidades, uma enzima termoestável conserva 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade após a exposição a uma temperatura relativamente alta que, de outro modo forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável).
[000122] Em algumas modalidades, a atividade de uma enzima termoestável, após a exposição a uma temperatura média a alta, é maior do que (p.ex., 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% maior do que) a atividade de uma enzima nativa semelhante (não termoestável).
[000123] As enzimas termoestáveis (p.ex., fosfatases ou fosforilases) podem permanecer ativas (capazes de catalisar uma reação), por exemplo, a temperaturas de 45°C a 80°C, ou superiores. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis permanecem ativas a uma temperatura de 45-80°C, 45-70°C, 45-60°C, 45-50°C, 50-80°C, 50-70°C, 5060°C, 60-80°C, 60-70°C ou 70-80°C. Por exemplo, as enzimas termoestáveis podem permanecer ativas a uma temperatura de 45°C, 46°C,
47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 55°C,56°C,
57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C,67°C,
68°C, 69°C, 70°C, 71 °C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C,78°C,
79°C ou 80°C. As enzimas termoestáveis podem permanecer ativas a temperaturas relativamente altas durante 15 minutos a 48 horas, ou mais, após a exposição a temperaturas relativamente altas. Por exem
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72/154 pio, as enzimas termoestáveis podem permanecer ativas a temperaturas relativamente altas durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42 ou 48 horas.
Células Manipuladas [000124] As células manipuladas da presente descrição, em algumas modalidades, compreendem pelo menos uma ou todas as atividades enzimáticas requeridas para converter um amido e/ou celulose/celodextrina em um açúcar. As células manipuladas são células que compreendem pelo menos um ácido nucleico manipulado (p.ex., recombinante ou sintético), ou são de outra forma modificadas de modo tal que elas sejam estrutural e/ou funcionalmente distintas das suas correspondentes que ocorrem naturalmente. Assim, uma célula que contém um ácido nucleico manipulado é considerada uma célula manipulada.
[000125] As células manipuladas da presente descrição, em algumas modalidades, compreendem uma α-glucano fosforilase (p.ex., uma aglucano fosforilase termoestável) e/ou uma celodextrina fosforilase (p.ex., uma celodextrina fosforilase termoestável), uma fosfoglicomutase (p.ex., uma fosfoglicomutase termoestável) e pelo menos uma enzima (p.ex., enzima termoestável) selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases.
[000126] As células manipuladas, em algumas modalidades, expressam marcadores selecionáveis. Os marcadores selecionáveis são tipicamente usados para selecionar as células manipuladas que tenham absorvido e expressam um ácido nucleico manipulado após a transfecção da célula (ou após outro procedimento usado para introduzir ácido nucleico exógeno na célula). Assim, um ácido nucleico que codifica um produto pode também codificar um marcador selecionável. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem, sem limitação, os genes que co
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73/154 dificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou a sensibilidade a antibióticos (p.ex., genes de resistência à amplcilina, genes de resistência à canamicina, genes de resistência à neomicina, genes de resistência à tetraciclina e genes de resistência ao cloranfenicol) ou outros compostos. Outros marcadores selecionáveis podem ser usados de acordo com a presente descrição.
[000127] Uma célula manipulada expressa um produto se o produto, codificado por um ácido nucleico (p.ex., um ácido nucleico manipulado), for produzido na célula. É conhecido na técnica que a expressão gênica se refere ao processo pelo qual as instruções genéticas na forma de um ácido nucleico sâo usadas para sintetizar um produto, tal como uma proteína (p.ex., uma enzima).
[000128] As células manipuladas podem ser células procarióticas ou células eucarióticas. Em algumas modalidades, as células manipuladas são células bacterianas, células de levedura, células de inseto, células de mamífero ou outros tipos de células.
[000129] As células bacterianas manipuladas úteis na presente descrição incluem, sem limitação, Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymonas spp., Acetobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Xanthomonas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcallgenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Comamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp., Gluconobacterspp., Ralstonia spp., Acidlthiobacillus spp., Mlcrolunatus spp., Geobacter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Serratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotrophomonas spp., Chromobacterium spp., Sinorhizobium spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp., Vibrio spp., e Pantoea spp manipuladas.
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74/154 [000130] As células de levedura manipuladas úteis na presente descrição incluem, sem limitação, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces, Hansen u!a, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia e Pichia manipuladas.
[000131] Em algumas modalidades, as células manipuladas úteis na presente descrição são células de Escherichia coll, células de Bacillus subtilis, células de Pseudomonas putida, células de Saccharomyces cerevisiae e/ou células de Lactobacillus brevis manipuladas. Em algumas modalidades, as células manipuladas úteis na presente descrição são células de Escherichia coli manipuladas.
Ácidos Nucleicos Manipulados [000132] Um ácido nucleico é pelo menos dois nucleotídeos ligados covalentemente e, em alguns casos, pode conter ligações de fosfodiéster (p.ex., uma cadeia principal de fosfodiéster). Os ácidos nucleicos (p.ex., componentes, ou partes, de ácidos nucleicos) podem ser de ocorrência natural ou manipulados. Os ácidos nucleicos de ocorrência natural estão presentes em uma célula que existe na natureza na ausência de Intervenção humana. Os ácidos nucleicos manipulados” incluem os ácidos nucleicos recombinantes e os ácidos nucleicos sintéticos. Um ácido nucleico recombinante refere-se a uma molécula que é construída pela união de moléculas de ácido nucleico (p.ex., da mesma espécie ou de espécies diferentes) e, tipicamente, pode se replicar em uma célula viva. Um ácido nucleico sintético refere-se a uma molécula que é biologicamente sintetizada, quimicamente sintetizada ou sintetizada ou amplificada por outros meios. Um ácido nucleico sintético inclui os ácidos nucleicos que são quimicamente modificados ou de outro modo modificados, porém podem emparelhar por bases com as moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural. Os ácidos nucleicos recombinantes e sintéticos incluem também aquelas moléculas que resultam da replicação de qualquer um dos precedentes. Os ácidos nucleicos
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75/154 manipulados podem conter partes de ácidos nucleicos que são de ocorrência natural, porém, como um todo, os ácidos nucleicos manipulados não ocorrem naturalmente e requerem intervenção humana. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um produto da presente descrição é um ácido nucleico recombinante ou um ácido nucleico sintético. Em outras modalidades, um ácido nucleico que codifica um produto é de ocorrência natural.
[000133] Um ácido nucleico manipulado que codifica enzimas, como proporcionado neste documento, pode estar operavelmente ligado a um promotor, que é uma região de controle de um ácido nucleico na qual a iniciação e a taxa de transcrição do restante de um ácido nucleico são controladas. Um promotor conduz a expressão ou conduz a transcrição do ácido nucleico que ele regula.
[000134] Um promotor pode estar um associado naturalmente com um gene ou sequência, como pode ser obtido isolando as sequências não codificadores em 5’, localizadas a montante do segmento de codificação de um dado gene ou sequência. Esse promotor pode ser referido como endógeno.
[000135] Em algumas modalidades, uma sequência codificadora de ácido nucleico pode ser posicionada sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente associado com a sequência codificada no seu ambiente natural. Tais promotores podem incluir os promotores de outros genes; os promotores isolados de qualquer outra célula; e os promotores ou os reforçadores sintéticos que não sejam de ocorrência natural, tais como, por exemplo, aqueles que contenham diferentes elementos de diferentes regiões reguladoras transcricionais e/ou mutações que alteram a expressão através de métodos de engenharia genética que são conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e reforçadores sinteticamente, as sequências podem
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76/154 ser produzidas utilizando tecnologia de clonagem recombinante e/ou amplificação de ácido nucleico, incluindo a reação em cadeia por polimerase (PCR).
[000136] Um promotor é considerado estar operavelmente ligado quando ele estiver em uma localização e uma orientação funcionais corretas em relação ao ácido nucleico que ele regula para controlar (conduzir) a iniciação transcricional e/ou a expressão desse ácido nucleico. [000137] Os ácidos nucleicos manipulados da presente descrição podem conter um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Um promotor constitutivo refere-se a um promotor que está constantemente ativo em uma célula. Um promotor induzível refere-se a um promotor que inicia ou aumenta a atividade transcricional quando na presença de, influenciado por, ou contatado por, um indutor ou agente indutor, ou ativado na ausência de um fator que cause a repressão. Os promotores induzíveis para utilização de acordo com a presente descrição incluem qualquer promotor induzível descrito neste documento ou conhecido por um especialista na técnica. Os exemplos de promotores induzíveis incluem, sem limitação, os promotores regulados química/bioquimicamente e regulados fisicamente, tais como os promotores regulados por álcoois, os promotores regulados portetraciclina, os promotores regulados por esteroides, os promotores regulados por metais, os promotores regulados por patogênese, os promotores induzíveis por temperatura/calor, regulados por fosfato (p.ex., PhoA) e regulados por luz.
[000138] Um indutor ou agente indutor pode ser endógeno ou uma condição normalmente exógena (p.ex., luz), um composto (p.ex., composto químico ou não químico) ou uma proteína que entre em contato com um promotor induzível de forma tal a ser ativa na regulação da atividade transcricional do promotor induzível. Assim, um sinal que regula a transcrição de um ácido nucleico refere-se a um sinal indutor que atua sobre um promotor induzível. Um sinal que regula a transcrição pode
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77/154 ativar ou inativar a transcrição, dependendo do sistema regulador usado. A ativação da transcrição pode envolver atuar diretamente sobre um promotor para conduzir a transcrição ou atuar indiretamente sobre um promotor por inativação de um repressor que esteja impedindo o promotor de conduzir a transcrição. Inversamente, a desativação da transcrição pode envolver atuar diretamente sobre um promotor para impedir a transcrição ou atuar indiretamente sobre um promotor por ativação de um repressor que então atua sobre o promotor.
[000139] Os ácidos nucleicos manipulados podem ser introduzidos nas células hospedeiras utilizando qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, a transformação, a transfecção (p.ex., química (p.ex., fosfato de cálcio, polímeros catiônicos ou lipossomas) ou não química (p.ex., eletroporação, sonoporação, impalefecção, transfecção ótica, hidrodinâmica)) e a transdução (p.ex., transdução viral).
[000140] As enzimas ou as outras proteínas codificadas por um ácido nucleico intracelular de ocorrência natural podem ser referidas como enzimas endógenas ou proteínas endógenas.
ÃJveia mento da Protease [000141] As células manipuladas da presente descrição podem expressar (p.ex., expressar endogenamente) as enzimas necessárias para a saúde das células que podem ter um impacto negativo sobre a produção de um açúcar de interesse (p.ex., a alulose). Tais enzimas são referidas neste documento como enzimas-alvo. Por exemplo, as enzimas-alvo expressadas pelas células manipuladas podem competir pelos substratos ou cofatores com uma enzima que aumenta a taxa de precursor fornecida a uma via de produção de açúcar. Como outro exemplo, as enzimas-alvo expressadas pelas células manipuladas podem competir pelos substratos ou cofatores com uma enzima que é uma enzima-chave de entrada da via de uma via de produção de açúcar. Como ainda outro exemplo, as enzimas-alvo expressadas pelas células
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78/154 manipuladas podem competir pelos substratos ou cofatores com uma enzima que fornece um substrato ou cofator de uma via de produção de açúcar.
[000142] Para anular, ou reduzir, este impacto negativo, as enzimasalvo podem ser modificadas para incluir uma sequência de reconhecimento de protease específica do sítio na sua sequência proteica, de forma tal que a enzima-alvo possa ser alvejada e clivada para a inativação durante a produção de açúcar (ver, p.ex., a Publicação U.S. No. 2012/0052547 A1, publicada em 1 de março de 2012, e a Publicação Internacional No. WO 2015/021058 A2, publicada em 12 de fevereiro de 2015, cada uma das quais é incorporada por referência neste documento).
[000143] A divagem de uma enzima-alvo contendo uma sequência de reconhecimento de protease específica do sítio resulta do contato com uma protease específica do sítio cognata que é sequestrada no periplasma da célula (separada da enzima-alvo) durante a fase de crescimento celular (p.ex., à medida que as células manipuladas são cultivadas) e é posta em contato com a enzima-alvo durante a fase de conversão (p.ex., após a lise celular para produzir um lisado celular). Assim, as células manipuladas da presente descrição compreendem, em algumas modalidades, (i) um ácido nucleico manipulado que codifica uma enzima-alvo que impacta negativamente a taxa de conversão e inclui uma sequência de reconhecimento de protease específica do sítio na sequência proteica da enzima-alvo e (ii) um ácido nucleico manipulado que codifica uma protease específica do sítio que diva a sequência de reconhecimento de protease específica do sítio da enzima-alvo e inclui uma sequência de alvejamento periplasmático. Esta sequência de alvejamento periplasmático é responsável por sequestrar a protease específica do sítio para o espaço periplasmático da célula até que a célula seja lisada. Os exemplos de sequências de alvejamento periplasmático
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79/154 são proporcionados abaixo.
[000144] Os exemplos de proteases que podem ser usadas de acordo com a presente descrição incluem, sem limitação, a alanina carboxipeptidase, a astacina, a leucil aminopeptidase bacteriana, o pró-coagulante de câncer, a catepsina B, a clostripaína, a alanll aminopeptidase do cltosol, a elastase, a endoproteinase Brg~C, a enteroquinase, a gastricsina, a gelatinase, a Gly-X carboxipeptidase, a glicil endopeptidase, a protease de rinovírus humano 3C, a hipodermina C, a serina endopeptidase específica de Iga, a leucil aminopeptidase, a leucil endopeptidase, a lysC, a pró-X carboxipeptidase lisossômica, a lisil aminopeptidase, a metionil aminopeptidase, a mixobactéria, a nardilisina, a endopeptidase E pancreática, a picornaína 2B, a picornaína 3C, a pró-endopeptidase, a prolil aminopeptidase, a pró-proteína convertase I, a próproteína convertase II, a russelisina, a sacaropepsina, a semenogelase, o ativador de plasminogênio T, a trombina, a calicreína tecidual, o vírus etch do fumo (TEV), a togavirina, a triptofanII aminopeptidase, o ativador de plasminogênio U, a V8, a venombina B, a venombina BB e a Xaa-pro aminopeptidase.
Aíveiamento Perípiasmático [000145] As enzimas de uma via de produção de açúcar podem incluir pelo menos uma enzima que tenha um impacto negativo sobre a saúde (p.ex., viabilidade) de uma célula. Para anular ou reduzir esse impacto negativo, uma enzima pode ser modificada para incluir uma sequência de relocação, de modo tal que a enzima seja relocada para um compartimento celular ou extracelular, onde ela não esteja naturalmente localizada e onde a enzima não impacte negativamente a saúde da célula (ver, p.ex., a Publicação No. US-2011-0275116-A1, publicada em 10 de novembro de 2011, incorporada por referência neste documento). Por exemplo, uma enzima de uma via de produção de açúcar pode ser relocada para o espaço perípiasmático de uma célula.
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80/154 [000146] Assim, em algumas modalidades, as células manipuladas da presente descrição compreendem pelo menos uma enzima de uma via de produção de açúcar que está ligada a uma sequência de alvejamento periplasmático. Uma sequência de alvejamento periplasmático é uma sequência de aminoácidos que alveja para o perlplasma de uma célula onde a proteína está ligada a ela. Uma proteína que está ligada a uma sequência de alvejamento periplasmático será sequestrada no perl·plasma da célula na qual a proteína é expressa.
[000147] As sequências de alvejamento periplasmático podem ser derivadas da extremidade de N da proteína secretora bacteriana, por exemplo. As sequências variam em comprimento de cerca de 15 a cerca de 70 aminoácidos. As sequências de aminoácidos primárias das sequências de alvejamento periplasmático variam, porém, em geral, possuem uma estrutura comum, incluindo os seguintes componentes: (i) a parte N terminal tem um comprimento variável e, em geral, transporta uma carga positiva líquida; (ii) segue-se um núcleo hidrofóbico central de cerca de 6 a cerca de 15 aminoácidos; e (iíi) o componente final inclui quatro a seis aminoácidos que definem o sítio de divagem para as peptidases de sinal.
[000148] As sequências de alvejamento periplasmático da presente descrição, em algumas modalidades, podem ser derivadas de uma proteína que é secretada em uma bactéria Gram-negativa. A proteína secretada pode ser codificada pela bactéria ou por um bacteriófago que infecta a bactéria. Os exemplos de fontes bacterianas Gram-negativas de proteínas secretadas Incluem, sem limitação, os membros dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Salmonella, Caulobacter, Methylomonas, Acetobacter, Achromobacter, Acinetobacter, Aero monas, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Burkholderia, Citrobacter, Comamonas, Enterobacter, Erwinia, Rhizoblum, Vibrio, eXanthomonas.
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81/154 [000149] Os exemplos de sequências de alvejamento periplasmático para utilização de acordo com a presente descrição incluem, sem limitação, as sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em: MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (SEQ ID NO: 1);
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (SEQ ID NO: 2); MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (SEQ ID NO: 3); MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA (SEQ ID NO: 4); MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 5); MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 6);
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA (SEQ ID NO: 7); MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO: 8);
MRVLLFLLLSLFMLPAFS (SEQ ID NO: 9); e MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 10)
Culturas Celulares e Lisados Celulares [000150] Tipicamente, as células manipuladas são cultivadas. O cultivo refere-se ao processo pelo qual as células são cultivadas sob condições controladas, tipicamente fora de seu ambiente natural. Por exemplo, as células manipuladas, tais como as células bacterianas manipuladas, podem ser cultivadas como uma suspensão de células em caldo nutriente líquido, também referido como meio de cultura líquido.
[000151] Em algumas modalidades, o amido não convertido é usado como uma alimentação de substrato para as células em crescimento.
[000152] Os exemplos dos meios de crescimento de Escherichia coll bacterianos comumente usados incluem, sem limitação, o caldo LB (Luria Bertani) Miller (NaCI a 1%): 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 1% de NaCI; o Caldo LB (Luria Bertani) Lennox (NaCI a 0,5%); 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 0,5% de NaCI; o meio SOB (Super Optimal Broth): 2% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCI, 2,5 mM de KCI, 10 mM de MgCL, 10 mM de
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MgSCA: o meio SOC (Super Optimal Broth with Catabolic repressor): SOB + 20 mM de glicose; 2x caldo YT (2x Extrato de levedura e Triptona): 1,6% de peptona, 1% de extrato de levedura e 0,5% de NaCI; o meio TB (Terrific Broth): 1,2% de peptona, 2,4% de extrato de levedura, 72 mM de K2HPO4, 17 mM de KH2PO4 e 0,4% de glicerol; e o meio SB (Super Broth): 3,2% de peptona, 2% de extrato de levedura e 0,5% de NaCI e ou o meio de Korz (Korz, DJ et al. 1995).
[000153] Os exemplos dos meios de crescimento de Escherichia coli bacterianos de alta densidade incluem, porém não estão limitados ao, meio DNAGro®, meio ProGro®, meio AutoX®, meio DetoX®, meio InduX® e meio SecPro®.
[000154] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas sob condições que resultam na expressão de enzimas ou ácidos nucleicos. Tais condições de cultivo podem depender do produto particular que está sendo expresso e da quantidade desejada do produto.
[000155] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas a uma temperatura de 30°C a 40°C. Por exemplo, as células manipuladas podem ser cultivadas a uma temperatura de 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C ou 40°C. Tipicamente, as células manipuladas, tais como as células bacterianas manipuladas, são cultivadas a uma temperatura de 37°C.
[000156] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas durante um período de 12 horas a 72 horas, ou mais. Por exemplo, as células manipuladas podem ser cultivadas durante um período de 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 ou 72 horas. Tipicamente, as células manipuladas, tais como as células bacterianas manipuladas, são cultivadas durante um período de 12 a 24 horas. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas durante 12 a 24 horas a uma temperatura de 37°C.
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83/154 [000157] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas (p.ex., em meio de cultura celular líquido) até uma densidade óptica, medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD600), de 5 a 25. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas até uma OD600 de 5, 10, 15, 20 ou 25.
[000158] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas até uma densidade de 1 x 104 a 1 x 108 células viáveis/ml de meio de cultura celular. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas até uma densidade de 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5x 105, 6x 105, 7x 105, 8 x 105, 9x 105, 1 x 10®, 2 x 106, 3 x 10®, 4 x 106, 5x 10®, 6x 10®, 7x 106, 8x 106, 9x 10®, 1 x 107, 2x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 1 x 109, ou 1 x 1O10 células viáveis/ml. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas até uma densidade de 1 x 108 a 1 x 1O10 células viáveis/ml. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas até uma densidade de 2 x 105 a 3 x 107 células viáveis/ml.
[000159] Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas em um biorreator. Um biorreator refere-se simplesmente a um recipiente no qual as células são cultivadas, como um frasco de cultura, uma placa ou um saco que pode ser de uso único (descartável), pode ser aquecido em autoclave ou esterilizável. O biorreator pode ser feito de vidro, ou pode ser baseado em polímero, ou pode ser feito de outros materiais.
[000160] Os exemplos de biorreatores incluem, sem limitação, os biorreatores de tanque agitado (p.ex., bem misturado) e os biorreatores tubulares (p.ex., com escoamento pistonado), os biorreatores air-lift, os tanques agitados de membrana, os tanques agitados de filtro de rotação, os vibromisturadores, os reatores de leito fluidizado e os biorreatores de membrana. O método de operação do biorreator pode ser um
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84/154 processo em batelada ou contínuo e dependerá das células manipuladas que estão sendo cultivadas. Um biorreator é contínuo quando as correntes de alimentação e de produto estão continuamente sendo alimentadas e retiradas do sistema. Um biorreator de batelada pode ter um fluxo contínuo de recirculação, porém sem alimentação contínua de nutrientes ou coleta do produto. Para as culturas de coleta intermitente e batelada alimentada (ou alimentação em batelada), as células são inoculadas a uma densidade de célula viável menor, em um meio que é similar na composição a um meio de batelada. As células são deixadas desenvolver exponencialmente, com essencialmente nenhuma manipulação externa até que os nutrientes estejam um pouco esgotados e as células estejam se aproximando da fase estacionária de crescimento. Neste ponto, para um processo de coleta intermitente e batelada alimentada, uma parte das células e o produto podem ser coletados, e o meio de cultura removido é reabastecido com meio novo. Este processo pode ser repetido várias vezes. Para a produção de proteínas e anticorpos recombinantes, pode ser usado um processo de batelada alimentada. Enquanto as células estão se desenvolvendo exponencialmente, porém os nutrientes estão se esgotando, o meio de alimentação concentrada (p.ex., 10-15 vezes o meio basal concentrado) é adicionado contínua ou intermitentemente para fornecer nutrientes adicionais, permitindo um aumento adicional na concentração de células e na duração da fase de conversão. O meio novo pode ser adicionado proporcionalmente à concentração celular, sem a remoção do meio de cultura (caldo). Para adaptar a adição do meio, uma cultura de batelada alimentada é iniciada em um volume muito menor que a capacidade total do biorreator (p.ex., aproximadamente 40% a 50% do volume máximo).
[000161] Alguns métodos da presente descrição são dirigidos para a produção em grande escala de açúcar. Para os métodos de produção em grande escala, as células manipuladas podem ser cultivadas em
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85/154 meio de cultura líquido, em um volume de 5 litros (L) a 50 L, ou mais. Em algumas modalidades, as células manipuladas podem ser cultivadas em meio de cultura líquido, em um volume de mais do que (ou igual a) 10 L. Em algumas modalidades, as células manipuladas são cultivadas em meio de cultura líquido, em um volume de 5 L, 10 L, 15. L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L ou mais. Em algumas modalidades, as células manipuladas podem ser cultivadas em meio de cultura líquido, em um volume de 5 L a 10 L, 5 L a 15 L, 5 L a 20 L, 5 L a 25 L, 5 L a 30 L, 5 L a 35 L, 5 L a 40 L, 5 L a 45 L, 10 L a 15 L, 10 L a 20 L, 10 L a 25 L, 20 L a 30 L, 10 L a 35 L, 10 L a 40 L, 10 L a 45 L, 10 L a 50 L, 15 L a 20 L, 15 L a 25 L, 15 L a 30 L, 15 L a 35 L, 15 L a 40 L, 15 L a 45 L, ou 15 a 50 L.
[000162] Tipicamente, o cultivo das células manipuladas é seguido pela lise das células. A lise refere-se ao processo pelo qual as células são rompidas, por exemplo, por mecanismos virais, enzimáticos, mecânicos, químicos, térmicos ou osmóticos. Um lisado celular refere-se a um fluido contendo os conteúdos das células lisadas (p.ex., células manipuladas lisadas), incluindo, por exemplo, as organelas, os lipídios de membrana, as proteínas, os ácidos nucleicos e as vesículas de membrana invertidas. Os lisados celulares da presente descrição podem ser produzidos por lise de qualquer população de células manipuladas, como proporcionada neste documento. Um lisado celular pode excluir as células permeabilizadas/perfuradas.
[000163] Os métodos de lise celular, referidos como lise”, são conhecidos na técnica, e qualquer um deles pode ser usado de acordo com a presente descrição. Tais métodos de lise celular incluem, sem limitação, a lise física/mecânica, tal como a homogeneização, bem como a lise química, térmica e/ou enzimática.
[000164] A lise celular pode perturbar os ambientes celulares cuidadosamente controlados, resultando em degradação e modificação das
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86/154 proteínas por proteases endógenas e fosfatases não reguladas. Assim, em algumas modalidades, os inibidores de proteases e/ou os inibidores de fosfatases podem ser adicionados ao lisado celular ou às células antes da Hse, ou estas atividades podem ser removidas por inativação do gene ou alvejamento da protease.
[000165] Os Hsados celulares, em algumas modalidades, podem ser combinados com pelo menos um nutriente. Por exemplo, os Hsados celulares podem ser combinados com feHPCU KH2PO4, NH4CI, NaCI, MgSO4, CaCh. Os exemplos de outros nutrientes incluem, sem limitação, 0 sulfato de magnésio, 0 cloreto de magnésio, 0 orotato de magnésio, 0 citrato de magnésio, 0 fosfato de potássio monobásico, 0 fosfato de potássio dibásico, 0 fosfato de potássio tribásico, 0 fosfato de sódio monobásico, 0 fosfato de sódio dibásico, 0 fosfato de sódio tribásico, 0 fosfato de amônio monobásico, 0 fosfato de amônio dibásico, 0 sulfato de amônio, 0 cloreto de amônio, 0 hidróxido de amônio.
[000166] Em algumas modalidades, os Hsados celulares podem consistir em suspensões de células rompidas que são ainda modificadas por meios químicos, térmicos, enzimáticos ou mecânicos para enriquecer ou purificar ou reduzir ou eliminar componentes específicos. Por exemplo, após a ruptura por meios mecânicos, térmicos, químicos ou enzimáticos, como descrito acima, 0 material resultante pode ser submetido à separação mecânica, p.ex., filtração por membranas, centrifugação ou outras, para enriquecer parcialmente uma atividade enzimatica seleta ou para eliminar uma atividade enzimática ou um componente de lisado indesejado. Os outros exemplos podem incluir a adição de sais ou solventes a uma suspensão de células rompidas ou a alteração do pH ou da temperatura da suspensão de células rompidas, resultando na precipitação das atividades desejadas, seguida por separação mecânica destes componentes precipitados, como descrito acima. Inversamente, a adição de sais ou solventes ou a alteração do pH ou da
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87/154 temperatura pode ser alavancada para eliminar as atividades indesejadas através da inativação dessas enzimas ou da precipitação e da subsequente separação mecânica da atividade ou das atividades enzimática indesejadas.
[000167] Os lisados celulares, em algumas modalidades, podem ser combinados com pelo menos um cofator. Por exemplo, os lisados celulares podem ser combinados com o difosfato de adenosina (ADP), o trifosfato de adenosina (ATP), o dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+), ou outros compostos químicos não proteicos necessários para a atividade de uma enzima (p.ex., íons inorgânicos e coenzimas). [000168] Em algumas modalidades, os lisados celulares são incubados sob condições que resultam na conversão de amido ou celulose/celodextrina em açúcar.
[000169] O volume de lisado celular usado para uma única reação pode variar. Em algumas modalidades, o volume de um lisado celular é 1 a 150 m3. Por exemplo, o volume de um lisado celular pode ser 1 m3, 5 m3, 10 m3, 15 m3, 20 m3, 25 m3, 30 m3, 35 m3, 40 m3, 45 m3, 50 m3, 55 m3, 60 m3, 65 m3, 70 m3, 75 m3, 80 m3, 85 m3, 90 m3, 95 m3, 100 m3, 105 m3, 110 m3, 115 m3, 120 m3, 125 m3, 130 m3, 135 m3, 140 m3, 145 m3 ou 150 m3. Em algumas modalidades, o volume de um lisado celular é 25 m3 a 150 m3, 50 m3 a 150 m3, ou 100 m3 a 150 m3.
Enzimas purificadas [000170] Em algumas modalidades da presente invenção, as enzimas podem ser purificadas antes da adição à reação de produção. A purificação das enzimas deve ser entendida como significando qualquer enriquecimento ou extração de uma enzima ou atividade enzimática ou grupos de enzimas ou atividades enzimáticas específicas a partir de uma mistura complexa de materiais, os exemplos incluindo, porém não limitados às, suspensões de células rompidas ou meios de crescimento
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88/154 cultivados. Assim, uma enzima ou proteína purificada deve ser entendida como sendo uma enzima ou proteína que tenha sido separada ou enriquecida de uma matriz complexa, em que a sua concentração relativa, em comparação com os outros componentes da matriz, é aumentada. Os métodos para purificar uma enzima incluem, porém não estão limitados aos, meios mecânicos, cromatográficos, químicos, de pH ou temperatura. Por exemplo, a adição de um sal a uma suspensão de células rompidas, que resulta na precipitação da enzima ou da proteínaalvo, seguida por separação mecânica da enzima ou da proteína precipitada, p.ex., filtração por membrana ou centrifugação. Os outros exemplos podem incluir a separação de uma enzima de uma matriz complexa através de métodos cromatográficos baseados na afinidade (por exemplo, purificação baseada em marca de hexa-histidina ou em estreptavidina).
Especificidade Enzimática [000171] A especificidade enzimática deve ser entendida como uma característica inerente a uma enzima, em que ela demonstra cinética, termodinâmica ou taxas de enzimas de reação melhoradas para um substrato, em comparação com um outro substrato. As enzimas com alta especificidade são mais bem exemplificadas por terem uma alta razão de taxa catalítica (definida como número de turnover ou Kcat) para a constante de Michaelis (Km) ou Kcat/Km. É vantajoso ter uma enzima com alta especificidade para um substrato, pois isso melhora a taxa de uma reação e melhora o rendimento diminuindo a produção de produtos que não sejam alvo. Por exemplo, a via descrita neste documento para a produção de alulose tem vários intermediários que são semelhantes na estrutura química, a saber, a glicose 1-fosfato, a glicose 6-fosfato, a frutose 6-fosfato e a alulose 6-fosfato. A última etapa enzimática neste processo é a desfosforiiação da alulose 6-fosfato no produto alulose
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89/154 através de uma alulose 6-fosfato fosfatase. É vantajoso utilizar uma enzima com uma especificidade muito alta para a alulose 6-fosfato e uma especificidade relativamente baixa para os outros intermediários da via, a saber, a glicose 1- fosfato, a glicose 6-fosfato e a frutose 6-fosfato. A desfosforilação catalítica destes intermediários resultaria na produção de glicose ou frutose, diminuindo assim o rendimento e aumentando a complexidade do produto.
Modalidades Adicionais [000172] 1. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de células manipuladas para expressar uma aglucano fosforilase termoestável (também referida como uma amido fosforilase), uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
(b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
(c) o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (d) a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
[000173] 2. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis,
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90/154 fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
(b) a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
(c) a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável;
(d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
[000174] 3. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
(b) a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
(c) a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para
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91/154 produzir uma mistura de lisados celulares;
(d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
(e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfogllcomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir um mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfogiicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase; e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
[000175] 4. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 1-3, em que a(s) α-glucano fosforilase(s) termoestável(is) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases de Aquifex aeoiicus, Thermocrinis minervae, Thermosuifidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoraiis, PaJaeococcus pacificus, Thermotoga neapoiitana, Ruminidostridium thermoceilurn, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophiius, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritime, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber, e Marinitoga piezophila.
[000176] 5. O método Isento de células de qualquer uma das modalidades 1-4, em que a(s) fosfoglicomutase(s) termoestável(is) é(são) selecionada^) a partir do grupo que consiste em fosfogllcomutases de
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Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, SulfoIobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminiceila sporogenes, Caloranaerobacterferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila, e Thermoanaerobacter wiegelii.
[000177] 6. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 1-5, em que a(s) fosfoglicomutase(s) termoestável(is) é(são) selecionada^) a partir do grupo que consiste em fosfoglicomutases de Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marínitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacilius fiavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans, e Thermovibrio ammonificans.
[000178] 7. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 1-6, em que a(s) alulose 6-fosfato epimerase(s) termoestável(is) é(são) selecíonada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato epimerases de Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus, e Thermosulfidibacter takaii.
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93/154 [000179] 8. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a(s) alulose 6-fosfato fosfatase(s) termoestável(is) é(são) seleoionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato fosfatases de Thermoanaerobacter wiegelü, Thermoanaerobacter ethanolícus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus honkoshii Ot3, Aquifex aedícus, Rumínidostrídium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Ad~ dothermus ceduioryticus. Methanothermobacter thermautotrophícus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis, e Thermodesulfatator indicus, e Thermus thermophilus.
[000180] 9. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de células manipuladas para expressar uma aglucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
(b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
(c) o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (d) a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
[000181] 10. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em oglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e
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94/154 glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
(b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
(c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável;
(d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que ínatíve a atividade enzimática nativa, porém não inatlve as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
[000182] 11. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
(a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população sâo manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
(b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
(c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
(d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que ínatíve a atividade enzimática nativa, porém não inatlve
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95/154 as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
(e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase; e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
[000183] 12. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicolsomerase termoestável e uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a frutose.
[000184] 13. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fos
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96/154 foglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável e uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um Usado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a frutose.
[000185] 14. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
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97/154 o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em a-gluoano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma agluoano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a frutose.
[000186] 15. Um método isento de células para a produção de sorbitol, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aldose desidrogenase termoestável e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol.
[000187] 16. Um método isento de células para a produção de sorbitol, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que
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98/154 as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aldose desidrogenase termoestável e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol.
[000188] 17. Um método isento de células para a produção de sorbitol, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em o-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol~6~fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
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99/154 a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que Inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol.
[000189] 18. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma o-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolacto~ nase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável e uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose.
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100/154 [000190] 19. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam enzimas diferentes;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma a-glu~ cano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável e uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose.
[000191] 20. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glu
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101/154 cano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desídrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desídrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir peio menos duas populações cultivadas de células que expressam enzimas diferentes;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares;
o aquecimento da mistura de Hsados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em a-giucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desídrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desídrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose.
[000192] 21. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glucano fosforilase termoestávei, uma fosfoglicomutase termoestável, uma
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102/154 glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável e uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000193] 22. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforílases termoestáveis, fosfoglícomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma o-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável,
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103/154 uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável e uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000194] 23. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato Isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inatlve a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em o-glu
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104/154 cano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma o-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5-fosfato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000195] 24. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glu~ cano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma arabinose 5-fosfato isomerase termoestável e uma arabinose 5fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose.
[000196] 25. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 115/186
105/154 as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma o-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolacto~ nase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma arabinose 5-fosfato isomerase termoestável e uma arabinose 5fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose.
[000197] 26. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases
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106/154 termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfog licon ato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogiiconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato Inorgânico, para produzir a arabinose.
[000198] 27. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicolsomerase termoestável, uma manose 6-fosfato epimerase
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107/154 termoestável e uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a manose.
[000199] 28. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma manose 6-fosfato epimerase termoestável e uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de Hsados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido
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108/154 e fosfato inorgânico, para produzir a manose.
[000200] 29. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em a-glucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir a manose.
[000201] 30. O método de qualquer uma das modalidades 1-26, em
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109/154 que as células compreendem células bacterianas, [000202] 31. O método de qualquer uma das modalidades 1-26, em que as células compreendem células de levedura.
[000203] 32. O método para qualquer uma das modalidades 1-31, em que pelo menos uma das enzimas é heteróloga às células.
[000204] 33. O método de qualquer uma das modalidades 1-32, em que a etapa de Hse (b) compreende Hsar mecânica, química ou enzimaticamente as células cultivadas.
[000205] 34. O método para qualquer uma das modalidades 1-33, em que a etapa de aquecimento (c) compreende o aquecimento do Hsado celular até uma temperatura de pelo menos 50°C.
[000206] 35. O método para qualquer uma das modalidades 1-34, em que o amido compreende a amilose, a amilopectina ou tanto a amilose quanto a amilopectina.
[000207] 36. O método para qualquer uma das modalidades 1-35, em que a α-glucano fosforilase termoestável e a fosfoglicomutase termoestável são expressas como uma proteína de fusão única ou uma proteína bifuncional.
[000208] 37. Um Hsado celular produzido pelo método para qualquer uma das modalidades 1~36.
[000209] 38. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000210] 39. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000211] 40. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano
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110/154 fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000212] 41. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000213] 42. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000214] 43. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5-fosfato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000215] 44. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000216] 45. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
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111/154 [000217] 46. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 38-45, em que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.
[000218] 47. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável. [000219] 48. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000220] 49. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000221] 50. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase, opcionalmente em pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000222] 51. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfo
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112/154 glicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000223] 52. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5-fosfato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000224] 53. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000225] 54. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000226] 55. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável,
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113/154 uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a alulose. [000227] 56. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população sâo manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e
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114/154 a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
[000228] 57. Um método isento de células para a produção de alulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
(d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
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115/154 [000229] 58. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 55-57, em que a(s) celodextrina fosforilase(s) termoestável(is) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases de Aquifex aeolicus, Thermocrínis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Rumínicíostrídium thermocelium, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Suifolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena marítima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophiius, Thermus oshimai, Meiothermus ruber, e Mart nitoga piezophlla.
[000230] 59. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 55-58, em que a(s) fosfoglicomutase(s) termoestável(is) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicomutases de Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphlla, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacterferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila, e Thermoanaerobacter wiegelii.
[000231] 60. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 55-59, em que a(s) fosfoglicomutase(s) termoestável(is) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicomutases de Thermus thermophiius, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfuríhydrogeni
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116/154 bium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga marítima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosuifidibacter takaii, Fervidobactenum nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans, e Thermovibrio ammonificans.
[000232] 61. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 55-60, em que a(s) alulose 6-fosfato epimerase(s) termoestável(is) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato epimerases de Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R11, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus, e Thermosuifidibacter takaii.
[000233] 62. O método isento de células de qualquer uma das modalidades 55-61, em que a(s) alulose 6-fosfato fosfatase(s) termoestável(ls) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato fosfatases de Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermoceilum, Desulfotomacuium kuznetsovii, Caldanaerobactersubterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophícus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis, e Thermodesulfatator indicus, e Thermus thermophilus.
[000234] 63. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 127/186
117/154 o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado Inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
64. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 128/186
118/154 a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
[000235] 65. Um método isento de células para a produção de glicose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforílases termoestáveis, fosfoglícomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforílases termoestáveis, fosfoglícomutases termoestáveis e glicose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a glicose.
[000236] 66. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 129/186
119/154 o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável e uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a frutose. [000237] 67. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável e uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 130/186
120/154 peto calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a frutose.
[000238] 68. Um método isento de células para a produção de frutose, o método compreendendo:
o cultivo de peto menos duas populações de células, em que as células de cada população sâo manipuladas para expressar peto menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares;
o aquecimento da mistura de Hsados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado peto calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em cetodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis e frutose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a frutose.
[000239] 69. Um método isento de células para a produção de sorbitol,
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121/154 o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aldose desidrogenase termoestável e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um Hsado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do Hsado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol. [000240] 70. Um método isento de células para a produção de sorbitol, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população sâo manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a Hse das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aldose desidrogenase termoestável e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém nâo inative as
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122/154 enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol.
[000241] 71. Um método isento de células para a produção de sorbitol, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, aldose desidrogenases termoestáveis e sorbitol-6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir o sorbitol.
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123/154 [000242] 72. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável e uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do Hsado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose. [000243] 73. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois Hsados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável,
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124/154 uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogiiconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável e uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose.
[000244] 74. Um método isento de células para a produção de ribulose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população sâo manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desídrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desídrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma
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125/154 enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis e ribulose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogHconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribulose.
[000245] 75. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogHconato desidrogenase termoestável, uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável e uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000246] 76. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que
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126/154 as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfoglicono~ lactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável e uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000247] 77. Um método isento de células para a produção de ribose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis,
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127/154 glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, ribose 5-fosfato isomerases termoestáveis e ribose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5-fosfato isomerase, e uma ribose 5-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a ribose.
[000248] 78. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável,
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128/154 uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma arabinose 5~fosfato isomerase termoestável e uma arabinose 5-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimátíca nativa, porém não Inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose. [000249] 79. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfogllcomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam enzimas diferentes;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma arabinose 5-fosfato isomerase termoestável e uma arabinose
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5-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose.
[000250] 80. Um método isento de células para a produção de arabinose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactona~ ses termoestáveis, 6-fosfogllconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam enzimas diferentes;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis,
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130/154 glicose 6-fosfato desidrogenases termoestáveis, 6-fosfogliconolactonases termoestáveis, 6-fosfogliconato desidrogenases termoestáveis, arabinose 5-fosfato isomerases termoestáveis e arabinose 5-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase; e a Incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a arabinose.
[000251] 81. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma manose 6-fosfato epimerase termoestável e uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a manose. [000252] 82. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis,
Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 141/186
131/154 fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termostáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicolsomerase termoestável, uma manose 6-fosfato epimerase termoestável e uma manose 6-fosfato fosfatase termoestável;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a manose.
[000253] 83. Um método isento de células para a produção de manose, o método compreendendo:
o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para
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132/154 produzir uma mistura de lisados celulares;
o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, manose 6-fosfato epimerases termoestáveis e manose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir uma mistura de reação que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase; e a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico, para produzir a manose. [000254] 84. O método de qualquer uma das modalidades que as células compreendem as células bacterianas. [000255] 85. O método de qualquer uma das modalidades que as células compreendem as células de levedura. [000256] 86. O método de qualquer uma das modalidades que pelo menos uma das enzimas é heteróloga às células. [000257] 87. O método de qualquer uma das modalidades que a etapa de Hse (b) compreende Hsar mecânica, química ou enzimaticamente as células cultivadas.
1-80,
1-80,
1-85,
1-86, em em em em [000258] 88. O método para qualquer uma das modalidades 1-87, em que a etapa de aquecimento (c) compreende aquecer o lisado celular até uma temperatura de pelo menos 50°C.
[000259] 89. O método para qualquer uma das modalidades 1-88, em que a celodextrina compreende a amilose, a amilopectina ou tanto a amilose quanto a amilopectina.
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133/154 [000260] 90. O método para qualquer uma das modalidades 1-89, em que a celodextrina fosforilase termoestável e a fosfoglicomutase termoestável são expressas como uma proteína de fusão única ou uma proteína bifuncional.
[000261] 91. Um lisado celular produzido pelo método para qualquer uma das modalidades 1-90.
[000262] 92. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000263] 93. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000264] 94. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000265] 95. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000266] 96. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6~fosfogliconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000267] 97. Uma célula manipulada compreendendo uma celodex
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134/154 trina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5-fosfato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000268] 98. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000269] 99. Uma célula manipulada compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000270] 100. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 35-41, em que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.
[000271] 101. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase e uma glicose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000272] 102. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fos
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135/154 fatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000273] 103. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000274] 104. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000275] 105. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogl icon ato desidrogenase e uma ribulose 5fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000276] 106. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogl icon ato desidrogenase, uma ribose 5-fos~ fato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável. [000277] 107. Um único lisado celular, uma mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma
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136/154 mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogllconolactonase, uma 6-fosfogHconato desidrogenase, uma arabinose 5fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000278] 108. Um único lisado celular, uma mistura de Hsados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma manose 6-fosfato epimerase e uma manose 6-fosfato fosfatase, opcíonalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
[000279] 109. Um método isento de células para a produção de um açúcar, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma o-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e pelo menos uma enzima termoestável selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas;
a lise das células cultivadas da etapa (a), para produzir um lisado celular;
o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e a incubação do Hsado inativado pelo calor na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o açúcar.
[000280] 110.0 método para a modalidade 109, em que a pelo menos uma enzima termoestável é uma Isomerase selecionada a partir do grupo que consiste em: fosfoglicoisomerase, ribose 5-fosfato isomerase e arabinose 5-fosfato isomerase.
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137/154 [000281] 111.0 método para a modalidade 109 ou 110, em que a pelo menos uma enzima termoestável é a alulose 6-fosfato epimerase.
[000282] 112. O método para qualquer uma das modalidades 109-
111, em que a pelo menos uma enzima termoestável é uma desidrogenase selecionada a partir do grupo que consiste em aldose desidrogenase, glicose 6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogliconato desidrogenase.
[000283] 113. O método para qualquer uma das modalidades 109-
112, em que a pelo menos uma enzima termoestável é uma açúcar fosfatase selecionada a partir do grupo que consiste em glicose 6-fosfato fosfatase, frutose 6-fosfato fosfatase, alulose 6-fosfato fosfatase, sorbitol-6-fosfato fosfatase, ribulose 5-fosfato fosfatase, ribose 5-fosfato fosfatase e arabinose 5-fosfato fosfatase.
[000284] 114. O método para a modalidade 109, em que o açúcar é selecionado a partir do grupo que consiste em glicose, frutose, alulose, sorbitol, ribulose, ribose e arabinose.
[000285] 115. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é a glicose e a pelo menos uma enzima termoestável compreende a glicose 6-fosfato fosfatase.
[000286] 116. O método da modalidade 115, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável.
[000287] 117.0 método para a modalidade 114, em que o açúcar é a frutose e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de fosfoglicoisomerases e frutose 6-fosfato fosfatases.
[000288] 118. O método para a modalidade 117, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável e uma frutose 6-fosfato fosfatase termoestável.
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138/154 [000289] 119. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é a alulose e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases.
[000290] 120. O método para a modalidade 119, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfogllcomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável.
[000291] 121. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é o sorbitol e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de aldose desídrogenases e sorbitol-6-fosfato fosfatases.
[000292] 122. O método para a modalidade 121, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aidose desidrogenase termoestável e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase termoestável.
[000293] 123. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é a ribulose e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de glicose 6-fosfato desídrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6-fosfogliconato desídrogenases e ribulose 5-fosfato fosfatases.
[000294] 124. O método para a modalidade 123, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável e uma ribulose 5-fosfato fosfatase termoestável.
[000295] 125. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é a ribose e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de glicose 6-fosfato desídrogenases, 6-fosfogiiconolactonases, 6-fosfo
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139/154 gliconato desidrogenases, ribose 5-fosfato isomerases e ribose 5-fosfato fosfatases.
[000296] 126. O método para a modalidade 125, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma ribose 5-fosfato isomerase termoestável e uma ribose 5-fosfato fosfatase termoestável.
[000297] 127. O método para a modalidade 114, em que o açúcar é a arabinose e a pelo menos uma enzima termoestável é selecionada a partir de glicose 6-fosfato desidrogenases, 6-fosfogliconolactonases, 6fosfogliconato desidrogenases, arabinose 5-fosfato isomerases e arabinose 5-fosfato fosfatases.
[000298] 128. O método para a modalidade 127, em que as células são manipuladas para expressar uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase termoestável, uma 6-fosfogliconolactonase termoestável, uma 6-fosfogliconato desidrogenase termoestável, uma arabinose 5-fosfato isomerase termoestável e uma arabinose 5-fosfato fosfatase termoes tável.
[000299] 129. O método para qualquer uma das modalidades 109128, em que as células são células bacterianas.
[000300] 130. O método para qualquer uma das modalidades 109128, em que as células são células de levedura.
[000301] 131. O método para qualquer uma das modalidades 109-
130, em que a α-glucano fosforilase termoestável, a fosfoglicomutase termoestável e/ou a pelo menos uma enzima termoestável é/são heteróloga(s) às células.
[000302] 132. O método para qualquer uma das modalidades 109-
131, em que a etapa de Hse (b) compreende Hsar mecânica, química ou
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140/154 enzimaticamente as células cultivadas.
[000303] 133. O método para qualquer uma das modalidades 109-
132, em que a etapa de aquecimento (c) compreende aquecer o lisado celular até uma temperatura de pelo menos 50°C.
[000304] 134. O método para qualquer uma das modalidades 109-
133, em que o amido compreende a amilose, a amilopectina ou tanto a amilose quanto a amilopectina.
[000305] 135. O método para qualquer uma das modalidades 109-
134, em que a α-glucano fosforilase termoestável e a fosfoglicomutase termoestável são expressas como uma proteína de fusão única.
[000306] 136. Um método isento de células para a produção de um açúcar, o método compreendendo:
[000307] o cultivo de células manipuladas para expressar uma a-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase e pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas;
[000308] a lise das células cultivadas da etapa (a) para produzir um lisado celular; e [000309] a incubação do lisado na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o açúcar.
[000310] 137. Um método isento de células para a produção de um açúcar, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar (ii) uma proteína de fus que compreende uma α-glucano fosforilase fundida a uma fosfoglicomutase e (ii) pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas;
a lise das células cultivadas da etapa (a) para produzir um
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141/154 lisado celular; e a incubação do lisado na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o açúcar.
[000311] 138. Um método isento de células para a produção de um açúcar, o método compreendendo:
o cultivo de células manipuladas para expressar uma proteína de fusão que compreende uma α-glucano fosforilase fundida a uma fosfoglicomutase;
o cultivo de células manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas;
a lise das células cultivadas da etapa (a) e da etapa (b) para produzir lisados celulares; e a incubação dos lisados na presença de um amido e fosfato inorgânico, para produzir o açúcar.
[000312] 139. O método para a modalidade 137 ou 138, em que as enzimas das etapas (a) e/ou (b) são enzimas termoestáveis.
[000313] 140. O método para a modalidade 139, em que o método compreende ainda o aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis, para produzir lisado(s) inativado(s) pelo calor.
[000314] 141. Um lisado celular produzido pelo método para qualquer uma das modalidades 109-138.
[000315] 142. Uma célula manipulada compreendendo uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável e pelo menos uma enzima termoestável selecionada a partir do grupo que consiste em isomerases, epimerases, desidrogenases e açúcar fosfatases.
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142/154 [000316] 143. A célula manipulada da modalidade 142 compreendendo:
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfogllcomutase termoestável e uma glicose 6-fosfato fosfatase termoestável;
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase e uma frutose 6-fosfato fosfatase;
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase;
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma aldose desidrogenase e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase;
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase e uma ribulose 5-fosfato fosfatase;
uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6-fosfogliconolactonase, uma 6~fosfogliconato desidrogenase, uma ribose 5fosfato isomerase e uma ribose 5-fosfato fosfatase; ou uma α-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma glicose 6-fosfato desidrogenase, uma 6~fosfo~ gliconolactonase, uma 6-fosfogliconato desidrogenase, uma arabinose 5-fosfato isomerase e uma arabinose 5-fosfato fosfatase.
[000317] 144. A célula manipulada da modalidade 142 ou 143, em que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Conversão isenta de células de amido em alulose [000318] Este exemplo descreve a conversão de amido em alulose.
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As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em alulose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9), uma alulose 6-fosfato epimerase (EC 5.3.1.-) e uma alulose 6fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimaticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em alulose (Fig. 1).
Exemplo 2. Conversão isenta de células de amido em glicose [000319] Este exemplo descreve a conversão de amido em glicose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em glicose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas he~ terólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6) e uma glicose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido
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144/154 até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de amido em glicose (Fig. 2A).
[000320] Este exemplo também descreve outra via para a conversão de amido em glicose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em glicose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1) e uma glicose 1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.10). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em glicose (Fig. 2B).
Exemplo 3. Conversão isenta de células de amido em frutose [000321] Este exemplo descreve a conversão de amido em frutose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em frutose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes
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145/154 termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9) e uma frutose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em frutose (Fig. 3).
Exemplo 4. Conversão isenta de células de amido em sorbitol [000322] Este exemplo descreve a conversão de amido em sorbitol. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em sorbitol, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma aldose desidrogenase (EC 1.1.1.200) e uma sorbitol-6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzlma(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao
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Hsado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em sorbitol (Fig. 4).
Exemplo 5. Conversão isenta de células de amido em ribulose [000323] Este exemplo descreve a conversão de amido em ribulose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo que codifica pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em ribulose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44) e uma ribulose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-), e uma ribulose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então Usada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O Hsado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em ribulose (Fig. 5).
Exemplo 6. Conversão isenta de células de amido em ribose [000324] Este exemplo descreve a conversão de amido em ribose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo que codifica pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em ribose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas hete
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147/154 rólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), uma ribose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma ribose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em ribose (Fig. 6).
Exemplo 7. Conversão isenta de células de amido em arabinose [000325] Este exemplo descreve a conversão de amido em arabinose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de amido em arabinose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma α-glucano fosforilase (EC 2.4.1.1), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou 5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6~fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), uma arabinose 5fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma arabinose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos,
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148/154 químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de amido, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão do amido em arabinose (Fig. 7).
Exemplo 8. Conversão isenta de células de celulose/celodexthna em alulose [000326] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em alulose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em alulose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9), uma alulose 6-fosfato epimerase (EC 5.3.1.-), e uma alulose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcíonalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celulose/celodextrina em alulose.
Exemplo 9. Conversão Isenta de células de celulose/celodextrina em glicose [000327] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina
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149/154 em glicose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em glicose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6) e uma glicose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celulose/celodextrina em glicose.
[000328] Este exemplo também descreve outra via para a conversão de celulose/celodextrina em glicose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em glicose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49) e uma glicose 1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.10). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então
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150/154 aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matériaprima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celulose/celodextrina em glicose.
Exemplo 10. Conversão isenta de células de celulose/celodextrina em frutose [000329] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em frutose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo que codifica pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em frutose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma fosfoglicoisomerase (EC 5.3.1.9) e uma frutose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matériaprima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celulose/celodextrina em frutose.
Exemplo 11. Conversão isenta de células de celulose/celodextrina em sorbitol [000330] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em sorbitol. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo codificando
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151/154 peto menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em sorbitol, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma aldose desidrogenase (EC 1.1.1.200) e uma sorbitol-6fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heterótoga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celutose/cetodextrina em sorbitol.
Exemplo 12. Conversão isenta de células de celulose/celodextrina em ribulose [000331 ] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em ribulose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterótogo que codifica peto menos uma enzima, para a conversão de celutose/cetodextrina em ribulose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44) e uma ribulose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-) e uma ri-
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152/154 bulose 6-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado peio calor para permitir a conversão de celuiose/ceiodextrina em ribulose.
Exemplo 13. Conversão isenta de células de celulose/celodextrina em ribose [000332] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em ribose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo que codifica pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em ribose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fosfogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), uma ribose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma ribose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma
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153/154 matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitira conversão de celulose/celodextrina em ribose. Exemplo 14. Conversão isenta de células de celulose/celodextrina em arabinose [000333] Este exemplo descreve a conversão de celulose/celodextrina em arabinose. As células (p.ex., células bacterianas ou de levedura) manipuladas para expressar pelo menos um gene heterólogo que codifica pelo menos uma enzima, para a conversão de celulose/celodextrina em arabinose, são cultivadas em culturas líquidas para alta densidade celular. Os exemplos de enzimas heterólogas que podem ser usadas neste exemplo Incluem as variantes termoestáveis de uma celodextrina fosforilase (EC 2.4.1.49), uma fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5 ou
5.4.2.6), uma glicose 6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), uma 6-fos~ fogliconolactonase (EC 3.1.1.31), uma 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), uma arabinose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma arabinose 5-fosfato fosfatase (EC 5.3.1.-). No final do estágio de crescimento, a expressão da(s) enzima(s) heteróloga(s) é induzida e a biomassa celular é subsequentemente coletada. A biomassa coletada é então lisada através de meios mecânicos, químicos ou enzimáticos. O lisado celular é então aquecido até uma temperatura que inativa as atividades enzimáticas nativas, porém não inativa a(s) enzima(s) heteróloga(s). Uma matéria-prima de celulose/celodextrina, o fosfato inorgânico e opcionalmente outros nutrientes adicionais são adicionados ao lisado inativado pelo calor para permitir a conversão de celulose/celodextrina em arabinose.
[000334] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes divulgados neste documento são incorporados por referência no que diz respeito ao assunto para o qual cada um é citado, o qual, em alguns casos, pode incluir a totalidade do documento.
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154/154 [000335] Os artigos indefinidos um e uma, como usados neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que claramente indicado em contrário, devem ser entendidos para significar pelo menos um(a).
[000336] Também deve ser entendido que, a menos que claramente indicado em contrário, em quaisquer métodos reivindicados neste documento que incluam mais do que uma etapa ou ação, a ordem das etapas ou das ações do método não está necessariamente limitada à ordem na qual as etapas ou as ações do método são descritas.
[000337] Nas reivindicações, bem como no relatório descrito acima mencionado, todas as expressões de transição, tais como compreendendo, incluindo, transportando, tendo, contendo, envolvendo”, segurando, composto de e similares, devem ser entendidas serem ilimitadas, isto é, significar incluindo, porém não Hitadas a. Apenas as expressões de transição consistindo em e consistindo essencialmente em serão expressões de transição fechadas ou semifechadas, respectivamente, conforme estabelecido no United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.

Claims (68)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produzir um composto de alulose, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    conversão de um carboidrato de glicose polimérico em glicose 1-fosfato (G1P) catalisada por um α-glucano ou uma celodextrina fosforilase; conversão do dito glicose 1-fosfato (G1P) para produzir a glicose 6-fosfato (G6P) catalisada por uma fosfoglicomutase; conversão do dito glicose 6-fosfato (G6P) em frutose 6-fosfato (F6P) catalisada por uma fosfoglicoisomerase; conversão da dita frutose 6-fosfato (F6P) para produzir a alulose 6-fosfato (A6P) catalisada por uma alulose 6-fosfato epimerase (A6PE); e conversão da dita alulose 6-fosfato epimerase (A6P) em alulose catalisada por uma alulose 6-fosfato fosfatase (A6PP).
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o carboidrato de glicose polimérico é o amido, a celodextrina ou o glicogênio.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a α-glucano fosforilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: α-glucano fosforilases de Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Therrnosuifurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Paiaeococcus pacificus, Thermotoga neapoiitana, Ruminiclostrídium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Suifoiobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena marítima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophiius, Thermus oshi mai, Meiothermus ruber, e Marinitoga piezophila.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a celodextrina fosforilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: celodextrina fosforilases de Clostridium thermocellum, Clostridium straminisolvens, Thermotoga
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    RQ2: ígnisphaera aggregans, Thermotoga marítima, Spirochaeta thermophila, Caldicellulosiruptor bescii, Dlctyoglomus thermophilum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus, Caldisalinibacter kiritimatiensis, Defluviitalea phaphyphila, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Thermococcus sibiricus, e Thermosphaera aggregans.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a fosfoglicomutase é selecionada a partir do grupo que consiste em: fosfoglicomutases de Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgldus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangarí, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferríreducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacteríum pennivorans, Symbiobacteríum thermophilum, Spirochaeta thermophila, e Thermoanaerobacter wiegeIii.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fosfoglicoisomerase é selecionada a partir do grupo que consiste em: fosfoglicoisomerases de Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azoreuse, Persephonella marina, Marinitoga plezophlla, Kosmotoga olearia, Thermotoga marítima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacteríum nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacteríum thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermo
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    3/20 toga thermarum, Deferribacter desulfuricans, e Thermovibrio ammonificans.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a alulose 6-fosfato epimerase é selecionada a partir do grupo que consiste em: alulose 6-fosfato epimerases de Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus, e Thermosulfidibacter takaii.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a alulose 6-fosfato fosfatase é selecionada a partir do grupo que consiste em: alulose 6-fosfato fosfatases de Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus Islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horlkoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomacuturn kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus ceilulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolltana, Petrotoga mobilis, e Thermodesulfatator Indlcus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus, e Bacteroides fragilus.
  9. 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a alulose 6-fosfato fosfatase é específica para o alulose 6-fosfato.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas é termoestável ou pelo menos duas das enzimas são termoestáveis.
  11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    2 a 10, caracterizado pelo fato de que o amido ou o glicogênio é prétratado com a α-amilase e uma enzima removedora de ramificação para
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    4/20 produzir a maltodextrina com a ramificação removida.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a enzima removedora de ramificação é selecionada a partir de isoamilases e pululanases.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as isoamilases são selecionadas a partir de isoamilases de Suifolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles, e Bacillus lentus.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que as pululanases são selecionadas a partir de pululanases de Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldaríus, Thermosipho africanus, e Kosmotoga olearia.
  15. 15. Método isento de células para a produção de aiulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de células manipuladas para expressar uma aglucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma aiulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma aiulose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas termoestáveis;
    (b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
    (c) o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (d) a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e fosfato inorgânico, para produzir a aiulose.
  16. 16. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o amido ou o glicogênio é pré-tratado
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    5/20 com a α-amilase e uma enzima removedora de ramificação para produzir uma maltodextrina com a ramificação removida.
  17. 17. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o amido ou o glicogênio é pré-tratado com uma a-amilase para produzir uma maltodextrina ramificada e uma enzima removedora de ramificação é adicionada à etapa (d).
  18. 18. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que uma enzima removedora de ramificação é adicionada à etapa (d).
  19. 19. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a enzima removedora de ramificação é selecionada a partir de isoamilases e pululanases.
  20. 20. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as isoamilases são selecionadas a partir de isoamilases de Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles, e Bacillus lentus.
  21. 21. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as pululanases são selecionadas a partir de pululanases de Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarius, Thermosipho africanus, e Kosmotoga olearia.
  22. 22. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em oglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir
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    6/20 peto menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
    (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) a combinação dos pelo menos dois Hsados celulares para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende uma a-glucano fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável;
    (d) o aquecimento da mistura de Hsados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um Hsado inativado pelo calor; e (e) a incubação da mistura de reação na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  23. 23. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado peto fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que peto menos uma das enzimas precedentes é termoestável;
    (b) a Hse das células das peto menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos Hsados
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    7/20 celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
    (d) a combinação dos Hsados celulares das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de Hsados celulares que compreende uma aglucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável; e (e) a incubação da mistura de Hsados celulares na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  24. 24. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações celulares, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
    (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
    (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um Hsado inativado pelo calor;
    (e) a adição ao lisado inativado pelo calor de pelo menos
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    8/20 uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase; e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
  25. 25. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações celulares, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em aglucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável;
    (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos lisados celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
    (d) a combinação dos lisados celulares das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de lisados celulares;
    (e) a adição à mistura de lisados celulares de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em
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    9/20 α-glucano fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação compreendendo uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase; e (f) a incubação da mistura de reação na presença de um amido, glicogênio ou qualquer seu derivado parcialmente hidrolisado e fosfato inorgânico, para produzir a alulose.
  26. 26. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, caracterizado pelo fato de que a(s) a-glucano fosforilase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em α-glucano fosforilases de Aquifex aeoiicus, Thermocrínis minervae, Thermosulfidibactertakaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus padficus, Thermotoga neapolitana, RuminiClostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducans, Deinococcus radiodurans, Sulfoiobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardent!catena marítima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber, e Marinitoga piezophila.
  27. 27. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 26, caracterizado pelo fato de que a(s) fosfoglicomutase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicomutases de Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervldus, Sulfoiobus acidocaldarius, Archaeoglobus fuigidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermoceilum, Defluvlitalea phaphyphila, Caminlcella sporogenes, Calora
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 174/186
    10/20 naerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobactenum pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophiia, e Thermoanaerobacter wiegelii.
  28. 28. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizado pelo fato de que a(s) fosfoglicoisomerase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicoisomerases de Thermus thermophilus, Meiothermus tlmidus, Thermus flilformls, Mahnithermus hydrothermalis, Thermosipho africanos, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephoneiia marina, Marínitoga piezophiia, Kosmotoga olearia, Thermotoga marítima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervido bacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus viilosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans, e Thermovibrio ammonificans.
  29. 29. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 28, caracterizado pelo fato de que a(s) alulose 6-fosfato epimerase(s) é(sâo) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato epimerases de Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterrâneos, Deferribacter desulfurícans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus, e Thermosulfidibacter takaii.
  30. 30. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, caracterizado pelo fato de que a(s) alulose 6-fosfato fosfatase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato fosfatases de Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanoiicus, Thermus islandicus, Deinococcus ge
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 175/186
    11/20 othermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota arch aeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminidostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterrâneos, Addothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thennobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis, e Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus, e Bacteroides fragilus.
  31. 31. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 16 a 30, caracterizado pelo fato de que o amido ou o gllcogênlo é prétratado com a a-amilase e uma enzima removedora de ramificação para produzir uma maltodextrina com a ramificação removida.
  32. 32. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 16 a 30, caracterizado pelo fato de que o amido ou o glicogênio é prétratado com a a-amilase para produzir uma maltodextrina ramificada e a mistura de reação é Incubada na presença de uma enzima removedora de ramificação.
  33. 33. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 16 a 30, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação é incubada na presença de uma enzima removedora de ramificação.
  34. 34. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a enzima removedora de ramificação é selecionada a partir de isoamilases e pululanases.
  35. 35. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as isoamilases são selecionadas a partir de isoamilases de Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles, e Bacillus lentus.
  36. 36. Método isento de células, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que as pululanases são seleciona
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 176/186
    12/20 das a partir de pululanases de Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarlus, Thermoslpho africanus, e Kosmotoga olearia.
  37. 37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 36, caracterizado pelo fato de que as células compreendem as células bacterianas.
  38. 38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 37, caracterizado pelo fato de que as células compreendem as células de levedura.
  39. 39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 38, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas é heteróloga para as células.
  40. 40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 39, caracterizado pelo fato de que a etapa de lise (b) compreende lisar mecânica, química, enzimática, osmótica ou termicamente as células cultivadas.
  41. 41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 40, caracterizado pelo fato de que a etapa de aquecimento (c) ou (d) compreende o aquecimento do lisado celular até uma temperatura de pelo menos 50 °C.
  42. 42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 41, caracterizado pelo fato de que o amido compreende a amilose, a amilopectina ou tanto a amilose quanto a amilopectina.
  43. 43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 42, caracterizado pelo fato de que duas ou mais enzimas de uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase, uma alulose 6-fosfato fosfatase e/ou uma enzima removedora de ramificação são expressas como uma proteína de fusão única, proteína bifuncional ou multifuncional.
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 177/186
    13/20
  44. 44. Lisado celular, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 43.
  45. 45. Célula manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase, uma alulose 6-fosfato fosfatase e opcionalmente uma enzima removedora de ramificação, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
  46. 46. Célula manipulada, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.
  47. 47. Lisado unicelular, mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou mistura de reação, caracterizados pelo fato de que compreendem uma α-glucano fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6fosfato epimerase, uma alulose 6-fosfato fosfatase e opcionalmente uma enzima removedora de ramificação, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
  48. 48. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de células manipuladas para expressar uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável, para produzir células cultivadas que expressam as enzimas;
    (b) a lise das células cultivadas para produzir um lisado celular;
    (c) o aquecimento do lisado celular até uma temperatura que
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 178/186
    14/20 inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (d) a incubação do lisado inativado pelo calor na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  49. 49. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases termoestáveis, fosfoglicomutases termoestáveis, fosfoglicoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
    (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase termoestável, uma fosfoglicomutase termoestável, uma fosfoglicoisomerase termoestável, uma alulose 6-fosfato epimerase termoestável e uma alulose 6-fosfato fosfatase termoestável;
    (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (c), para produzir um lisado inativado pelo calor; e (e) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  50. 50. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 179/186
    15/20 que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglícomutases, fosfoglícoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir pelo menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável;
    (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos lisados celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative a atividade en~ zimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
    (d) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de lisados celulares que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fos~ fato fosfatase, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável; e (e) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  51. 51. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforílases termoestáveis, fosfoglícomutases termoestáveis, fosfoglícoisomerases termoestáveis, alulose 6-fosfato epimerases termoestáveis e alulose 6-fosfato fosfatases termoestáveis, para produzir
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 180/186
    16/20 peto menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas;
    (b) a lise das células das peto menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) a combinação dos pelo menos dois lisados celulares para produzir uma mistura de lisados celulares;
    (d) o aquecimento da mistura de lisados celulares até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
    (e) a adição ao lisado inativado pelo calor de peto menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase; e (f) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a alulose.
  52. 52. Método isento de células para a produção de alulose, caracterizado peto fato de que o método compreende:
    (a) o cultivo de pelo menos duas populações de células, em que as células de cada população são manipuladas para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, alulose 6-fosfato epimerases e alulose 6-fosfato fosfatases, para produzir peto menos duas populações cultivadas de células que expressam diferentes enzimas, em que pelo menos uma das enzimas precedentes é termoestável e
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 181/186
    17/20 (b) a lise das células das pelo menos duas populações cultivadas para produzir pelo menos dois lisados celulares;
    (c) opcionalmente o aquecimento de um ou mais dos lisados celulares da etapa (b) até uma temperatura que inative a atividade enzimática nativa, porém não inative as enzimas termoestáveis da etapa (a), para produzir um lisado inativado pelo calor;
    (d) a combinação do lisado celular das etapas (b) e (c) para produzir uma mistura de lisados celulares;
    (e) a adição à mistura de lisados celulares de pelo menos uma enzima purificada selecionada a partir do grupo que consiste em celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases e glicose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação compreendendo celodextrina fosforilases, fosfoglicomutases, fosfoglicoisomerases, aiulose 6-fosfato epimerases e aiulose 6-fosfato fosfatases, para produzir uma mistura de reação compreendendo uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma aiulose 6-fosfato epimerase e uma aiulose 6-fosfato fosfatase, (f) a incubação da mistura de reação na presença de uma celodextrina e fosfato inorgânico para produzir a aiulose.
  53. 53. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a(s) celodextrina fosforilase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: celodextrina fosforilases de Clostridium thermocellum, Clostridium straminisolvens, Thermotoga RQ2; Ignisphaera aggregans, Thermotoga marítima, Spirochaeta thermophila, Caldicellulosiruptor bescii, Dictyoglomus thermophilum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolytl· cum, Thermosipho africanus, Caldisalinibacterkirítimatiensis, Defluviitalea phaphyphila, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Thermococcus sl· birícus, e Thermosphaera aggregans.
  54. 54. Método isento de células, de acordo com qualquer uma
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 182/186
    18/20 das reivindicações 48 a 53, caracterizado pelo fato de que a(s) fosfoglk comutase(s) é(sâo) seiecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicomutases de Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldaríus, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangarL Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicelia sporogenes, Caloranaerobacter ferríreducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophiium, Spirochaeta thermophila, e Thermoanaerobacter wiegelii.
  55. 55. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizado pelo fato de que a(s) fosfoglicoisomerase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em fosfoglicoisomerases de Thermus thermophiius, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfuríhydrogenibium azorense, Persephonella marina, Mahnitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga marítima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacteríum nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorrís igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfurícans, e Thermovibrio ammonificans.
  56. 56. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizado pelo fato de que a(s) alulose 6-fosfato epimerase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato epimerases de Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfurícans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga
    Petição 870190074830, de 05/08/2019, pág. 183/186
    19/20 sp. 128-5-R1-1, BrevibacWus thermoruber, Thermosipho atlanticus, e Thermosulfidibacter takaii.
  57. 57. Método isento de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que a(s) alulose 6-fosfato fosfatase(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em alulose 6-fosfato fosfatases de Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus isiandícus, Deínococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota ar~ chaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolícus, Rumínídostrídíum thermoceiiurn, Desulfotomaculum kuznetsovíi, Caldanaerobacter subterraneus, Addothermus cellukdyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobífída fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis, e Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Baderol· des vdgatus, e Bacteroides fragilus.
  58. 58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 57, caracterizado pelo fato de que as células compreendem as células bacterianas.
  59. 59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 58, caracterizado pelo fato de que as células compreendem as células de levedura.
  60. 60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 59, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas é heteróloga para as células.
  61. 61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de lise (b) compreende lisar mecânica, química ou enzimaticamente as células cultivadas.
  62. 62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61, caracterizado pelo fato de que a etapa de aquecimento (c) ou (d) compreende o aquecimento do lisado celular até uma temperatura de pelo menos 50 °C.
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    20/20
  63. 63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 62, caracterizado pelo fato de que a celodextrina fosforilase compreende a amilose, a amilopectina ou tanto a amilose quanto a amilopectina.
  64. 64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 63, caracterizado pelo fato de que duas ou mais enzimas de uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase, uma alulose 6-fosfato fosfatase e/ou uma enzima removedora de ramificação são expressas como uma proteína de fusão única, proteína bifuncional ou multifuncional.
  65. 65. Lisado celular, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 48 a 64.
  66. 66. Célula manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase
  67. 67. Célula manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6-fosfato epimerase e uma alulose 6-fos~ fato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
  68. 68. Lisado unicelular, mistura de lisados celulares obtida a partir de pelo menos duas populações de células ou mistura de reação, caracterizados pelo fato de que compreendem uma celodextrina fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma fosfoglicoisomerase, uma alulose 6fosfato epimerase e uma alulose 6-fosfato fosfatase, opcionalmente em que pelo menos uma das enzimas precedentes é uma enzima termoestável.
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