JP5755884B2

JP5755884B2 - 第一級アルコールを産生する生物

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Publication number: JP5755884B2
Application number: JP2010549897A
Authority: JP
Inventors: ジュンサン，; プリティファルキヤ，; アンソニーピー．バーガード，
Original assignee: ジェノマティカ，インコーポレイテッド
Priority date: 2008-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2015-07-29
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Description

本発明は、一般には生合成プロセスに関し、およびより具体的には第一級アルコール生合成能を有する生物に関する。

第一級アルコールは、様々なバイオ燃料および特殊化学物質を含む様々な工業用途を有する化合物の品種である。第一級アルコールは、ポリマーおよび界面活性剤をはじめとする多数のさらなる工業製品を製造するために使用することもできる。例えば、高級第一級アルコール（Ｃ_４〜Ｃ_２０）およびそれらのエトキシラートは、洗濯粉および液、食器洗浄液ならびに硬質表面用洗浄剤などの多くの消費者洗剤、清浄用品およびパーソナルケア製品において界面活性剤として世界中で使用されている。それらはまた、様々な工業化学物質の製造におよび潤滑油添加剤に使用される。オクタノールおよびヘキサノールなどの長鎖第一級アルコールは、有用な感覚刺激特性を有し、長く香水および着香剤として利用されてきた。より短鎖（Ｃ４〜Ｃ８）の高級第一級アルコール（例えば、ブタノール）は、ペイント、塗料および接着剤用途に使用されるアクリラートなどの誘導体の生産のために化学物質中間体として使用される。

第一級アルコールは、例えば、脂肪酸の水素化、末端オレフィンのヒドロホルミル化、ｎ−パラフィンの部分酸化およびエチレンのＡｌ触媒重合から、現在、生産されている。残念なことに、石油系直鎖炭化水素（ｎ−パラフィン）の酸化からの直接的な第一級アルコールの生産は、商業的に成功する見込みがない。これは、非現実的である。ｎ−パラフィンの酸化は、主として第二級アルコール、第三級アルコールもしくはケトンまたはこれらの化合物の混合物を生成するが、高い第一級アルコール収量を生じさせないからである。加えて、現在公知の第一級アルコール生産方法は、石油の熱分解によって生産される比較的高価である供給原料、特にエチレンに限定されるという欠点を有する。さらに、現在の方法は、幾つかの段階および幾つかの触媒タイプを必要とする。

微生物によるＬＣＡ生産は、脂肪酸合成、その後のアシル還元段階を含む。大部分の細胞において見出される一般的脂肪酸生合成経路が、ＬＣＡおよび他の脂肪酸誘導体の生産のため研究されてきた。有意に高い理論上の生成物およびエネルギー収量を伴うＬＣＡ生産のためのより効率的な生合成経路をもたらすために果たすことができる多くの改良が現在は存在する。

それ故、工業用の第一級アルコールの商業的な量を有効に生産するために代替手段が求められている。本発明は、この要求を満たし、関連した利点も提供する。

一部の態様において、本明細書に開示する実施形態は、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌｏｒｇａｎｉｓｍ）を有し、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを有し、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを有する、天然に存在しない微生物に関する。

他の態様において、本明細書に開示する実施形態は、第一級アルコールを生産するための方法に関する。この方法は、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現するマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する、天然に存在しない微生物を、実質的に嫌気性の条件下、第一級アルコールを生産するために十分な期間、培養することを含み、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路は、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを有し、前記アシル還元経路は、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを有する。

一部の態様において、本明細書に開示する実施形態は、酵素をコードする遺伝子において発生する１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物に関し、この酵素は、長鎖アルコール（ＬＣＡ）生産をこの天然に存在しない微生物の増殖に連動させる（ｃｏｕｐｌｅ）ものである。他の実施形態では、同じ破壊戦略を用いて非増殖期中にＬＣＡ生産を遂行することができる。前記１つ以上の遺伝子破壊は、前記酵素の活性を低下させ、それによって、遺伝子破壊は、天然に存在しない微生物にＬＣＡの生産をもたらす。

他の態様において、本明細書に開示する実施形態は、１つ以上の遺伝子破壊を有する天然に存在しない微生物の培養を含むＬＣＡの生産方法に関する。前記１つ以上の遺伝子破壊は、生物におけるＬＣＡ生産をもたらす酵素をコードする遺伝子において発生する。

一部の態様において、本明細書に開示する実施形態は、１つ以上の遺伝子破壊を含む、天然に存在しない真核生物に関する。前記１つ以上の遺伝子破壊は、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼなどの酵素をコードする遺伝子において発生する。これらの破壊は、前記生物のサイトゾルにおける長鎖アルコールの生産をもたらす。

一部の態様において、本明細書に開示する実施形態は、１つ以上の遺伝子破壊を含む、天然に存在しない真核生物に関する。前記１つ以上の遺伝子破壊は、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼなどの酵素をコードする遺伝子において発生する。これらの破壊により、生物のミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産がもたらされる。

他の態様において、本明細書に開示する実施形態は、これらの天然に存在しない真核生物の培養を含む、長鎖アルコールの生産方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目２）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７）
アシル還元経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目９）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１１）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目１０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１２）
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種コード核酸をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１３）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする前記外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１４）
実質的に嫌気性の培養基をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１５）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１６）
４〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目１５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１７）
第一級アルコールを生産するために十分な量で発現される、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路をコードする外因性核酸とアシル還元経路をコードする外因性核酸とを含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニルＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性核酸を含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする１つ以上の外因性核酸を含む、天然に存在しない微生物。
（項目１８）
前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１９）
前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２０）
アシル還元経路をコードする前記１つ以上の外因性核酸が、２つの外因性核酸を含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２１）
アシル還元経路をコードする１つの外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードし、およびアシル還元経路をコードする第二の外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、項目２０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２２）
アシル還元経路をコードする前記１つ以上の外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む酵素をコードする、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２３）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目２２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２４）
前記外因性核酸の少なくとも１つが、異種コード核酸をさらに含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２５）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸およびアシル還元経路をコードする外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２６）
実質的に嫌気性の培養基をさらに含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２７）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２８）
４〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール（ｎａｎａｎｏｌ）、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目２７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２９）
第一級アルコールを生産するための方法であって、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現される、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する天然に存在しない微生物を、実質的に嫌気性の条件下で、前記第一級アルコールを生産するために十分な期間にわたって培養することを含み、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、方法。
（項目３０）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記微生物が、アシル還元経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種コード核酸をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目４１）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする前記外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、項目２９に記載の方法。
（項目４２）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目２９に記載の方法。
（項目４３）
２〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール（ｎａｎａｎｏｌ）、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第一級アルコールを単離することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目４５）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、酵素（前記酵素は、前記遺伝子破壊が前記酵素の活性を低下させたときに、前記天然に存在しない微生物の増殖に長鎖アルコール（ＬＣＡ）生産を連動させるものである）をコードする遺伝子において生じ、それによって前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの生産を付与するものである、天然に存在しない微生物。
（項目４６）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４９）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目４８に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５０）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目４９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、表Ｉにおける設計Ｉ〜ＸＸＩによってもたらされる、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５２）
ＬＣＡを生産するための方法であって、１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物を培養することを含み、前記１つ以上の遺伝子破壊が、酵素（前記酵素は、前記遺伝子破壊が前記酵素の活性を低下させたときに、前記微生物の増殖にＬＣＡ生産を連動させるものである）をコードする遺伝子において生じ、それによって、前記１つ以上の遺伝子破壊が前記微生物にＬＣＡの生産を付与するものである、方法。
（項目５３）
前記培養が、実質的に嫌気性の培養基において行われる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、表Ｉにおける設計Ｉ〜ＸＸＩによってもたらされる、項目５２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５９）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない真核生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子において生じ、前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記生物のサイトゾルにおける長鎖アルコールの生産を付与する、天然に存在しない真核生物。
（項目６０）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目５９に記載の生物。
（項目６１）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目５９に記載の生物。
（項目６２）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＮＬ０７１Ｗ、ＹＥＲ１７８Ｗ、ＹＢＲ２２１Ｃ、ＹＧＲ１９３Ｃ、ＹＦＬ０１８Ｃ、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目５９に記載の生物。
（項目６３）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目５９に記載の生物。
（項目６４）
株が、微好気性培養基中に存在する、項目５９に記載の生物。
（項目６５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目５９に記載の生物。
（項目６６）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目５９に記載の生物。
（項目６７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目６６に記載の生物。
（項目６８）
アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をサイトゾル内にさらに含む、項目５９に記載の生物。
（項目６９）
サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をさらに含む、項目６８に記載の生物。
（項目７０）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない真核生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子において生じ、前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記生物のミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産をもたらすものである、天然に存在しない真核生物。
（項目７１）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目７０に記載の生物。
（項目７２）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目７０に記載の生物。
（項目７３）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目７０に記載の生物。
（項目７４）
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目７０に記載の生物。
（項目７５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目７４に記載の生物。
（項目７６）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリガーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目７０に記載の生物。
（項目７７）
サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための増強されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムをさらに含む、項目７６に記載の生物。
（項目７８）
トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸オキシダーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目７６に記載の生物。
（項目７９）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目７０に記載の生物。
（項目８０）
株が、微好気性培養基中に存在する、項目７０に記載の生物。
（項目８１）
酵母または真菌である、項目５９または７０のいずれか一項に記載の生物。
（項目８２）
前記酵母が、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓを含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、ならびにＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを含むＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、項目８１に記載の生物。
（項目８３）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目８２に記載の生物。
（項目８４）
前記真菌が、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅを含むＲｈｉｚｏｐｕｓ種からなる群より選択される、項目８１に記載の生物。
（項目８５）
項目５９に記載の天然に存在しない真核生物を培養することを含む、長鎖アルコールの生産方法。
（項目８６）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＮＬ０７１Ｗ、ＹＥＲ１７８Ｗ、ＹＢＲ２２１Ｃ、ＹＧＲ１９３Ｃ、ＹＦＬ０１８Ｃ、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＱＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
株が、実質的に嫌気性の培地において培養される、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
株が、微好気性培地において培養される、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９２）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
（項目９３）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をサイトゾル内にさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目９５）
サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をさらに含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
項目７０に記載の天然に存在しない真核生物を培養することを含む、長鎖アルコールの生産方法。
（項目９７）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目９６に記載の生物。
（項目９８）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目９６に記載の生物。
（項目９９）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ，およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目９６に記載の方法。
（項目１００）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目１０１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリガーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目１０３）
サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための強化されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸オキシダーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記生物が、酵母または真菌である、項目８５または９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記酵母が、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓを含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、ならびにＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを含むＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記真菌が、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅを含むＲｈｉｚｏｐｕｓ種からなる群より選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
株が、実質的に嫌気性の培地において培養される、項目９６に記載の方法。
（項目１１０）
株が、微好気性培地において培養される、項目９６に記載の方法。
（項目１１１）
脂肪アシル−ＣｏＡを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目１１２）
脂肪酸エステルまたはワックスを生成するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とワックスエステルシンターゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目１１３）
脂肪酸エステルまたはワックスを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアルコールアセチルトランスフェラーゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。

図１は、ＬＣＡを生産するためのマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成および還元（ＭＩ−ＬＣＡ）経路を示す図である。図２は、典型的な増殖非連動生産株に対するＯｐｔＫｎｏｃｋ設計株の対比型仮説生産エンベロープを示す図である。ＯｐｔＫｎｏｃｋ株の可能性のある進化軌線は、高生産性表現型につながる。図３は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計Ｉの増殖連動ＬＣＡ生産特性（交互の点とダッシュでできた線）を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。図４は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計ＩＩ（交互の点とダッシュでできた線）、ＩＩＩ〜ＩＶ（破線）およびＶＩ〜ＸＩ（点線）の増殖連動ＬＣＡ生産特性を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。図５は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計ＸＩＩ（交互の点とダッシュでできた線）およびＸＩＩＩ〜ＸＶ（破線）の増殖連動ＬＣＡ生産特性を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。図６は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計ＸＶＩ〜ＸＶＩＩＩ（交互の点とダッシュでできた線）およびＸＩＸ〜ＸＸＩ（破線）の増殖連動ＬＣＡ生産特性を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。図７は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計Ｉ（交互の点とダッシュでできた線）、Ｖ（破線）およびＶ＿Ａ（点線）の増殖連動ＬＣＡ生産特性を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。点Ａは、設計Ｖ＿Ａに従って遺伝子工学で作り変えた株の最大増殖時のドデカノール生産速度を指し、および点Ｂは、増殖に必要な最低ドデカノール生産速度を指す。図８は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのもの（黒色）と比較して株設計Ｉ（交互の点とダッシュでできた線）、ＸＩＩ（個々のダッシュが長い破線）、ＸＩＩ＿Ａ（個々のダッシュが短い破線）およびＸＩＩ＿Ｂ（点線）の増殖連動ＬＣＡ生産特性を示す図である。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定している。点Ａは、設計ＸＩＩ＿Ｂに従って遺伝子工学で作り変えた株の最大増殖時のドデカノール生産速度を指し、および点Ｂは、増殖に必要な最低ドデカノール生産速度を指す。図９ａは、ドデカノール生産のためのアセチルＣｏＡの形成がＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼに依存することによるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図９ｂは、アセチルＣｏＡシンセターゼをサイトゾルにおけるアセチルＣｏＡ生産に使用するシナリオでのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるドデカノールの生産についての増殖連動生産エンベロープを示す図である。黒色曲線は、好気性条件下での野生型ネットワークについての生産エンベロープを示し、濃灰色曲線は、突然変異体ネットワークについての増殖連動生産特性を示す。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ・時のグルコース取り込み速度を仮定している。図１０ａは、ドデカノール生産のためのアセチルＣｏＡの形成がＡＤＰ形成性酢酸ＣｏＡリガーゼに依存することによるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素の付加を表す。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１０ｂは、酢酸ＣｏＡリガーゼをサイトゾルにおけるアセチルＣｏＡ生産に利用するシナリオでのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるドデカノールの生産についての増殖連動生産エンベロープを示す図である。黒色曲線は、好気性条件下での野生型ネットワークについての生産エンベロープを示す。薄灰色曲線は、酢酸ＣｏＡリガーゼを付加した後の蓋然性の高い空間の増加を示し、濃灰色曲線は、酸素の存在下での突然変異体ネットワークについての増殖連動生産特性を示す。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ・時のグルコース取り込み速度を仮定している。図１１ａは、ドデカノール生産のためのアセチルＣｏＡの形成がアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼに依存することによるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素を示す。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１１ｂは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるドデカノールの嫌気性生産についての増殖連動生産エンベロープを示す図である。黒色曲線は、野生型ネットワークについての生産能を示し、薄灰色曲線は、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをそのネットワークに付加したときの生産特性を示し、および濃灰色曲線は、その増加したネットワークからアルコールデヒドロゲナーゼを欠失させたときの増殖連動を示す。アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが機能性であるときの理論最大値の増加に留意すること。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ・時のグルコース取り込み速度を仮定している。図１２は、アセチルＣｏＡおよびＮＡＤＨ生産がサイトゾルピルビン酸デヒドロゲナーゼに依存することによるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。これは、異種サイトゾル酵素の導入（灰色で示す）によって、またはサイトゾルへの天然ミトコンドリア酵素の再ターゲッティングによって遂行することができる。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１３は、アセチルＣｏＡおよびＮＡＤＨ生産がサイトゾルピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼに依存することによるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。これは、サイトゾルへの異種酵素の導入（灰色で示す）によって遂行することができる。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１４は、サイトゾルへの異種ピルビン酸ギ酸リアーゼの導入（灰色で示す）によるサイトゾルにおけるドデカノールの形成を示す図である。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１５ａは、アセチル−ＣｏＡの形成にピルビン酸デヒドロゲナーゼを使用することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１５ｂは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅミトコンドリアにおけるドデカノールの生産についての増殖連動生産エンベロープを示す図である。黒色曲線は、嫌気性条件下での野生型ネットワークについての生産能を示し、および濃灰色曲線は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをそのネットワークから欠失させたときの酸素不在状態での生産特性を示す。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ・時のグルコース取り込み速度を仮定している。図１６は、アセチルＣｏＡの形成にピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼを使用することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素を示し、および点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１７は、アセチルＣｏＡの形成にピルビン酸ギ酸リアーゼを使用することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素を示し、および点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１８は、ミトコンドリアアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを付加することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素（単数または複数）を示し、および点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１９ａは、アセチルＣｏＡの形成にアセチルＣｏＡシンセターゼを使用することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素（単数または複数）を示し、および点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。図１９ｂは、アセチル−ＣｏＡがミトコンドリアアセチル−ＣｏＡシンセターゼによって形成されるときのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅミトコンドリアにおけるドデカノールの生産についての増殖連動生産エンベロープを示す図である。黒色曲線は、好気性条件下での野生型ネットワークについての生産エンベロープを示し、薄灰色曲線は、そのネットワークに欠失を与えたときの生産特性を示す。ペントースリン酸経路の酸化部分を通るフラックスを減少させると、増殖連動は、さらに増進し得る（濃灰色曲線）。１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ・時のグルコース取り込み速度を仮定している。図２０は、アセチルＣｏＡの形成に酢酸ＣｏＡリガーゼを使用することによるミトコンドリアにおけるドデカノールの形成を示す図である。灰色矢印は、異種酵素（単数または複数）を示し、および点線矢印は、この生産シナリオにおける炭素フラックスの大部分の流れを図示するものである。

本発明は、１つには、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成および還元経路を用いて第一級アルコールを合成することができる組み換え微生物に関する。本発明の修飾微生物は、結果として生ずる第一級アルコールをさらなる操作または単離のために培養基または発酵ブロスに分泌することもできる。本発明の組み換え微生物は、商業的な量の、炭素原子数４（Ｃ４）と２４（Ｃ２４）の間またはそれ以上の異なる鎖長を有する様々な異なる第一級アルコールを生産するように遺伝子工学で作り変えることができる。本発明の修飾経路による第一級アルコールの生産は、十分に文献に記載されているマロニル−ＣｏＡ依存性脂肪酸合成経路などの自然に発生する生合成経路によるより高い産物およびＡＴＰ収量をもたらす結果となるので、特に有用である。マロニル−アシル担体タンパク質（マロニル−ＡＣＰ）ではなくアセチル−ＣｏＡをＣ２延長単位として使用することにより、伸長サイクルに入るアセチル−ＣｏＡの単位フラックスあたり１個のＡＴＰ分子が節約される。この伸長サイクルは、アシル−ＡＣＰではなくアシルＣｏＡを生じさせる結果となり、ならびにオクタノールおよび他の第一級アルコールの生産のためのＡＴＰ消費性アシル−ＣｏＡシンターゼ反応の必要を無くす。加えて、本発明の第一級アルコール生産性生物は、生合成プロセスを用いて化学製品の製造に低コストで再生可能な供給原料を転用することを可能にすることができる。

１つの特別な実施形態において、本発明は、アシル−ＣｏＡ還元経路と連動した異種マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成経路を利用して、第一級アルコール種を形成する。これら２つの経路の連動により、炭素またはエネルギー源は、生合成伸長サイクルにおいてプライマーとしても延長単位としても使用されるアセチル−ＣｏＡに変換されることとなる。この伸長サイクルは、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（またはケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む。それぞれのサイクルが、その伸長サイクルに入るアシル−ＣｏＡ基質と比較して１個だけＣ２単位が延長されたアシル−ＣｏＡを形成する結果となる。第一級アルコールの炭素鎖長は、鎖長特異的エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよび／またはアシル−ＣｏＡレダクターゼによって制御することができる。所望の鎖長を有するアシル−ＣｏＡ生成物を還元経路に送り込み、アシル−ＣｏＡレダクターゼとアルコールデヒドロゲナーゼの組み合わせまたは脂肪酸形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼによって還元して所望の第一級アルコールを形成する。これらの還元段階は、例えば鎖長特異的アシル−ＣｏＡレダクターゼの使用により、もう１つの鎖長制御メカニズムとして役立つ。

本明細書において用いられる場合、本発明の微生物または微生物に関して用いられるときの用語「天然に存在しない」は、その微生物が当該種の野生型株を含めて当該種の自然に発生する株において通常は見つけられない少なくとも１つの遺伝子改変を有することを意味する。遺伝子改変としては、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失および／またはその微生物遺伝物質の他の機能破壊が挙げられる。そのような修飾は、例えば、当該種の非相同ポリペプチド、相同ポリペプチド、または非相同ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方についてのコード領域およびその機能的フラグメントを含む。追加の修飾は、例えば、修飾により遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コード調節領域を含む。例示的代謝性ポリペプチドとしては、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸生合成経路内の酵素およびアシル還元経路内の酵素が挙げられる。

本明細書において用いられる場合、微生物に関して用いられるときの用語「単離された」は、当該微生物が自然界で見つけられる場合の少なくとも１つの成分が実質的に無い生物を意味すると解釈される。この用語は、それがその天然の環境において見つけられる場合の一部のまたはすべての成分から取り出される微生物を含む。この用語は、その微生物が天然に存在しない環境において見つけられる場合の一部のまたはすべての成分から取り出される微生物も含む。従って、単離された微生物は、それが自然界で見つけられる場合、またはそれが自然には存在しない環境で増殖される、保管されるもしくは生存させられる場合、他の物質から軽度にまたは完全に分離されている。単離された微生物の具体的な例としては、軽度に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、および天然に存在しない培地で培養された微生物が挙げられる。

本明細書において用いられる場合、用語「微生物の」、「微生物」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に含まれる微視的細胞として存在する任意の生物を意味すると解釈される。従って、この用語は、微視的サイズを有する原核もしくは真核細胞または生物を包含すると解釈され、すべての種の細菌、古細菌および真性細菌、ならびに真核微生物、例えば酵母および真菌を含む。この用語は、生化学物質の生産のために培養することができる任意の種の細胞培養物も含む。

本明細書において用いられる場合、用語「第一級アルコール」は、第一級炭素原子に結合したヒドロキシルラジカルを有するアルコールを意味すると解釈される。この用語は、酸化されて、同じ炭素原子数を有する対応するアルデヒドおよび酸を形成することができる基−ＣＨ_２ＯＨを有するアルコールを含む。アルコールは、一連のヒドロキシル化合物の任意のものを含み、それらのうちの最も単純なものは、飽和炭化水素から誘導され、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＨを有し、ならびにエタノールおよびメタノールを含む。例示的第一級アルコールとしては、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール（ｎａｎａｎｏｌ）、デカノール、ドデカノール、テトラデカノール、およびヘキサデカノールが挙げられる。

本明細書において用いられる場合、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するために多くの酵素（アポ酵素）の活性にその存在が必要とされる、有機補因子または補欠分子団（酵素の非タンパク質部分）を意味すると解釈される。補酵素Ａは、例えば、一定の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基転移の際にならびに脂肪酸合成および酸化の際に作用する。

本明細書において用いられる場合、培養または増殖条件に関して用いられるときの用語「実質的に嫌気性の」は、酸素の量が、液体培地中の溶解酸素について飽和の約１０％未満であることを意味すると解釈される。この用語は、酸素約１％未満の雰囲気で維持されている液体または固体培地の密閉チャンバも含むと解釈される。

「外因性」は、それが本明細書において用いられる場合、当該分子または当該活性が宿主微生物に導入されることを意味すると解釈される。従って、この用語は、コード核酸の発現に関してそれが用いられる場合、コード核酸の発現可能な形態での微生物への導入を指す。生合成活性に関して用いられるとき、この用語は、宿主参照生物に導入される活性を指す。その源は、例えば、宿主微生物への導入後に当該活性を発現する同種または異種コード核酸であり得る。従って、用語「内因性」は、宿主中に存在する当該分子または活性を指す。類似して、コード核酸の発現に関して用いられるときのこの用語は、微生物中に含まれているコード核酸の発現を指す。用語「異種の」は、当該種以外の源に由来する分子または核酸を指し、これに対して「同種の」は、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。従って、本発明のコード核酸の外因性発現は、異種または同種コード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。

本明細書において用いられる場合、生化学物質の生産に関して用いられるときの「増殖に連動している」は、当該生化学物質の生合成が、微生物の増殖中に生産される産物であることを意味すると解釈される。生化学物質の生産に関して用いられるときの「増殖に連動していない」は、当該生化学物質の生合成が、微生物の非増殖基中に生産される産物であることを意味すると解釈される。生化学産物の生産は、場合により、その生物の増殖に必須であることがある。

本明細書において用いられる場合、用語「代謝修飾」は、その自然に発生する状態から改変される生化学反応を指すと解釈される。代謝修飾としては、例えば、その反応に関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の機能破壊による生化学反応活性の除去を挙げることができる。例示的代謝修飾のセットを表１に示す。そのような代謝修飾によって特徴づけられる個々の反応およびそれらの対応する遺伝子補体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉについて表２に例示する。これらの反応に用いられる反応物および生成物を表３に例示する。

本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子破壊」またはその文法的同義語は、コードされた遺伝子産物を不活性にする遺伝子改変を意味すると解釈される。遺伝子改変は、例えば、全遺伝子の欠失、転写もしくは翻訳に必要な調節配列の欠失、切断した遺伝子産物を生じさせる結果となるまたはコードされた遺伝子産物を不活性化する様々な突然変異戦略のいずれかによる遺伝子の一部の欠失であり得る。１つの特に有用な遺伝子破壊方法は、完全遺伝子欠失である。それは、本発明の天然に存在しない微生物における遺伝子復帰変異の発生を減少させるまたは無くすからである。用語「遺伝子破壊」は、野生型生物におけるその活性を基準にして所与の遺伝子産物の活性を低下させる遺伝子改変を意味するとも解釈される。活性のこの減弱は、例えば、切断した遺伝子産物を生じさせる結果となる遺伝子の一部分の欠失、またはコードされた遺伝子産物をその天然形より低い活性にする様々な突然変異戦略のうちのいずれか、より少ないもしくはより低効率の遺伝子発現をもたらすプロモーター配列の置換もしくは突然変異、遺伝子が通常の培養条件下ほど高度に発現されない条件下での生物の培養、または遺伝子の相補ｍＲＮＡ分子と相互作用し、その発現を改変するアンチセンスＲＮＡ分子の導入に起因し得る。

本明細書において用いられる場合、生化学産物の増殖連動生産に関して用いられるときの用語「安定した」は、増殖と生化学合成との連動を喪失することなく５世代より長い間培養することができる微生物を指すと解釈される。一般に、安定した増殖連動生化学的生産は、１０世代より長く、特に、安定した増殖連動生化学的生産は、約２５世代より長く、およびさらに特に、安定した増殖連動生化学的生産は、無期限を含めて、５０世代より長いであろう。例えば、１セットの代謝修飾の中のそれぞれの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の破壊によって、生化学産物の安定した増殖連動生産を遂行することができる。多数の破壊を通して生化学産物の増殖連動生産の安定性を増強することができ、その結果、それぞれの破壊される活性について発生する多数の代償復帰変異の尤度を有意に低下させることができる。

本明細書において例示する代謝修飾が、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅ遺伝子ならびにそれらの対応する代謝反応に関して説明されていることは、当業者には理解されるであろう。しかし、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシングおよびゲノミクス分野の高い技術レベルを考慮すれば、当業者は、本明細書に提供する技術およびガイダンスを本質的にすべての他の生物に容易に適用できるであろう。例えば、本明細書において例示するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ代謝改変を、他の種の同じまたは類似した遺伝子破壊を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような破壊としては、例えば、種、一般には種ホモログの遺伝的改変、および詳細にはオーソログ、パラログまたは非オーソログ遺伝子置換を挙げることができる。

本明細書において用いられる場合、用語「生産をもたらす」は、ＬＣＡの生産に使用できる代謝経路を欠く生物にばかりでなく、多少のＬＣＡ生産レベルを有し得る生物にもあてはまる。例えば、ＬＣＡを既に生成する生物は、１つ以上の遺伝子の破壊によってその生物にもたらされる生産向上からの恩恵を受けることができる。

本明細書において用いられる場合、用語「真核生物」は、細胞質中の分化した細胞小器官と染色体に構成される遺伝物質を封入する膜結合核とを有する細胞タイプを有する任意の生物を指す。この用語は、真核微生物、例えば酵母および真菌を含むすべての真核生物を包含すると解釈される。この用語は、真核性の種が微生物である必要がない生化学製品の生産のために培養することができる任意の真核性の種の細胞培養物を含むとも解釈される。「真核微生物」、「微生物」または「微生物」は、真核生物界の領域内に含まれる微視的細胞として存在する任意の真核生物を意味すると解釈される。

オーソログは、垂直系統によって関連づけられるおよび異なる生物において実質的に同じまたは同一の機能に責任を負う遺伝子（単数または複数）である。例えば、マウスエポキシドヒドラーゼおよびヒトエポキシドヒドラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能についてのオーソログとみなすことができる。遺伝子は、例えば、それらが相同であることを示すために十分な量の配列類似性を共有するとき、垂直系統によって関連づけられ、または共通の祖先からの進化によって関連づけられる。遺伝子は、必ずしも配列類似性を共有しないが、一次配列類似性が特定できない程度に共通の祖先から進化したことを示す十分な量の三次元構造を共有する場合も、オーソログとみなすことができる。オーソログである遺伝子は、約２５％から約１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、それらの三次元構造も類似性を示す場合、垂直系統によって発生したとみなすことができる。組織プラスミノゲンアクチベーターおよびエラスターゼをはじめとする、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通の祖先から垂直系統によって発生したとみなされる。

オーソログは、例えば進化により、構造または総合的活性の点で分岐した遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物を含む。例えば、１つの種が、２つの機能を示す遺伝子産物をコードする場合、およびそのような機能が、二代目の種において異なる遺伝子に分けられている場合、これら３つの遺伝子およびそれらの対応する産物は、オーソログとみなされる。生化学産物の増殖連動生産の場合、破壊される代謝活性を保有するオーソログ遺伝子が、天然に存在しない微生物の構築のために選択されることがあることは、当業者には理解されるであろう。分離可能な活性を示すオーソログの例は、２つ以上の種の間でまたは単一の種の中で異なる活性が異なる遺伝子産物に分けられている場合である。具体的な例は、エラスターゼタンパク質分解およびプラスミノゲンタンパク質分解（セリンプロテーゼ活性の２つのタイプ）の異なる分子へのプラスミノゲンアクチベーターおよびエラスターゼとしての分離である。第二の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。初代の種からのＤＮＡポリメラーゼは、二代目の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれかまたは両方とオーソログであるとみなすことができ、逆もまた同じである。

対照的に、パラログは、例えば、重複、その後の進化的分岐によって関連づけられるホモログであり、同一ではないが類似したまたは共通の機能を有する。パラログは、例えば、同じ種から生ずるもしくは同じ種に由来することもあり、または異なる種から生ずるもしくは異なる種に由来することもある。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性エポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種において異なる反応を触媒し異なる機能を有する共通の祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログとみなすことができる。パラログは、互いに有意な配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、これは、それらがホモログであること、または共通の祖先からの共進化によって関係づけられることを示唆している。パラログタンパク質ファミリーの群は、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチターゼなどを含む。

非オーソログ遺伝子置換は、ある種からの非オーソログ遺伝子であって、異なる種における当該遺伝子機能を置換することができるものである。置換は、例えば、起原の種において、異なる種における当該機能と比較して実質的に同じまたは類似した機能を行うことができることを含む。一般に、非オーソログ遺伝子置換は、当該機能をコードする公知遺伝子に構造的に関連しているものとして識別できるが、それにもかかわらず、然程構造的関連はないが、機能的に類似した遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、この用語の、それが本明細書において用いられる場合の、意味に入るであろう。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して非オーソログ遺伝子の活性部位または結合領域において少なくとも多少の構造的類似性を必要とする。従って、非オーソログ遺伝子は、例えば、パラログまたは非関連遺伝子を含む。

従って、生化学産物の増殖連動生産を有する本発明の天然に存在しない微生物を特定し構築する場合、代謝修飾の特定がオーソログの特定および破壊を含むという本明細書において提供する技術およびガイダンスの特定の種への適用は、当業者には理解されるであろう。類似したまたは実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする当該微生物にパラログおよび／または非オーソログ遺伝子置換が存在する程度に、当業者は、これらの進化的に関連した遺伝子を破壊して、酵素活性のいずれの機能的重複も設計代謝修飾を妨げることがないようにすることができる。

オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換は、当業者に周知の方法によって判定することができる。例えば、２つのポリペプチドの核酸またはアミノ酸配列の検査により、比較する配列間の配列同一性および類似性が明らかになるであろう。そのような類似性に基づいて、当業者は、その類似性が、それらのタンパク質が共通の祖先からの進化によって関連づけられることを示す十分な高さのものであるかどうかを決定することができる。当業者に周知のアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷなどは、未処理配列類似性または同一性を比較および決定し、およびまた、重量またはスコアに割り当てることができる配列内のギャップの存在または有意性を決定する。そのようなアルゴリズムは、当該技術分野においても公知であり、ヌクレオチド配列類似性または同一性の決定に同様に適用することができる。統計的類似性、またはランダムポリペプチドにおいて類似したマッチを見つける機会、および決定されたマッチの有意性を算出するための周知の方法に基づいて、関連性を決定するために十分な類似性についてのパラメータをコンピュータ計算する。当業者は、所望する場合には、２つ以上の配列のコンピュータ比較を目視により最適化することもできる。関連遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％から１００％の配列同一性を有すると予想することができる。関連のないタンパク質は、十分な大きさのデータベースをスキャンすると、偶然に発生することが予想されるのと本質的に同じである同一性を有し得る（約５％）。５％と２４％の間の配列は、比較する配列が関連していると結論づけるために十分な相同性を表す場合もあり、表さない場合もある。データセットの大きさを考慮してそのようなマッチの有意性を判定する追加の統計解析を行って、これらの配列の関連性を決定することができる。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的パラメータは、例えば、下に示すとおりであり得る。簡単に言うと、ＢＬＡＳＴＰのバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および次のパラメータを用いてアミノ酸配列アラインメントを行うことができる：Ｍａｔｒｉｘ：０ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐｏｐｅｎ：１１；ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；ｅｘｐｅｃｔ：１０．０；ｗｏｒｄｓｉｚｅ：３；ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および次のパラメータを用いて行うことができる：Ｍａｔｃｈ：１；ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２；ｇａｐｏｐｅｎ：５；ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；ｅｘｐｅｃｔ：１０．０；ｗｏｒｄｓｉｚｅ：１１；ｆｉｌｔｅｒ：ｏｆｆ。例えば、比較のストリンジェンシーを増加させるまたは減少させるために、および２つ以上の配列の関連性を決定するために、上のパラメータにどのような変更を加えることができるかは、当業者にはわかるであろう。

本発明の天然に存在しない微生物は、安定した遺伝子改変を有するものであり得、これは、その改変を喪失することなく５世代より長い間培養することができる微生物を指す。一般に、安定した遺伝子改変は、１０世代より長く持続する修飾を含み、特に、安定した修飾は、約２５世代より長く持続し、およびさらに特に、安定した修飾は、無期限を含めて、５０世代より長いであろう。

本明細書において例示する代謝修飾をはじめとする遺伝子改変が、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ならびにそれらの対応する代謝反応に関して説明されていることは、当業者には理解されるであろう。しかし、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシングおよびゲノミクス分野の高い技術レベルを考慮すれば、当業者は、本明細書に提供する技術およびガイダンスを本質的にすべての他の生物に容易に適用できるであろう。例えば、本明細書において例示するＥ．ｃｏｌｉ代謝改変を、当該種以外の種からの同じまたは類似したコード核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝子改変としては、例えば、一般には種ホモログの遺伝子改変、および詳細にはオーソログ、パラログまたは非オーソログ遺伝子置換が挙げられる。

一部の実施形態において、本発明は、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する微生物を含み、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物を提供する。

マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成は、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓなどの光合成鞭毛虫によって使用される代謝プロセスである（Ｉｎｕｉら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６：９３１−３４（１９８４））。これらの単細胞生物は、藻の特徴と原生動物の特徴の両方を示し、ならびに条件に依存して、生化学プロセスに光エネルギー（光合成）利用することもでき、化学エネルギー（摂食）を利用することもできる。嫌気性条件下では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、付随してＡＴＰを生成しながらパラミロン、予備ベータ−１，２−グルカン多糖類をワックスエステル（ｗａｘｅｓｔｅｒ）に変換する（ワックスエステル発酵という名の現象）（Ｉｎｕｉら、上記文献、１９８２；Ｉｎｕｉら、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４７：２６６９−２６７１（１９８３））。マロニル−ＣｏＡ非依存性経路による脂肪酸合成は、ＡＴＰの正味の増加をもたらす結果となるが、他の脂肪酸合成系は、ＡＴＰの正味の増加を支援することができない。好気性条件下でもＡＴＰを生産することができる（Ｉｎｕｉら、ＡｒｃｈｉｖｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２３７：４２３−２９（１９８５））。

酸素不在下では、アセチル−ＣｏＡは、酸素感受性ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼによってピルビン酸塩から生成され（Ｉｎｕｉら、上記文献、１９８４；Ｉｎｕｉら、上記文献、１９８５；Ｉｎｕｉら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２８０：２９２−９８（１９９０）；Ｉｎｕｉら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６２：９１３０−３５（１９８７））、ワックスエステルを形成するためのマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成によるグルコース酸化の末端電子受容体として役立つ（Ｉｎｕｉら、上記文献、１９８５））。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、異なるコンパートメントに位置する４つの脂肪酸合成系と嫌気性ワックスエステル発酵に関与するミトコンドリアマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ系とを含む、脂肪酸合成の５つの異なる系を含有する（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２８０：４３２９−３８（２００５））。前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ系がＣ８〜Ｃ１８脂肪酸を生産することは証明されている。脂肪酸は、アルコールに還元され、別の脂肪酸でエステル化され、サイトゾル内にワックスとして堆積される（Ｉｎｕｉら、ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ１５０：８９−９３（１９８２）；Ｉｎｕｉら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４２：１２１−１２６（１９８４））。このワックスは、暗所増殖細胞（ｄａｒｋｇｒｏｗｎｃｅｌｌｓ）における全脂質のおおよそ５０％を構成し得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２：１１４８（１９６３））。本発明の特に有用な実施形態は、本明細書に記載する修飾生合成経路を用いて大量のアルコールを生産するために、嫌気性条件下でマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）系を活用する。

前記マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成経路は、脂肪酸酸化を逆にしたものに類似しており、およびミトコンドリアでの脂肪酸合成または当該技術分野において公知であるようなアシル・キャリア・タンパク質（ＡＣＰ）非依存性脂肪酸合成と呼ばれる。マロニル−ＣｏＡ依存性脂肪酸合成（ＡＣＰ依存性脂肪酸合成としても公知；Ｓｍｉｔｈら、ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ４２：２８９−３１７（２００３）；Ｗｈｉｔｅら、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７４：７９１−８３１（２００５））と比較すると、幾つかの相違がある。第一に、アセチル−ＣｏＡがマロニル−ＡＣＰの代わりに延長単位として用いられる。マロニル−ＣｏＡ非依存性経路における伸長基質としてのアセチル−ＣｏＡの利用は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換するアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体（ＡＣＣ）の必要を無くし、従って、伸長サイクルに入るアセチル−ＣｏＡの単位フラックスあたり１個のＡＴＰ分子を節約する。第二に、伸長サイクルにおける中間体のすべてが、ＡＣＰではなくＣｏＡに連結される。この伸長サイクルは、（ｉ）ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（またはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、ＥＣ２．３．１．１６）、（ｉｉ）３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５および１．１．１．２１１）、（ｉｉｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７および４．２．１．７４）、および（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．４４および１．３．１．３８）を含み得る。第三に、伸長サイクルからの産物は、アシル−ＣｏＡであり、これは、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、続いてデヒドロゲナーゼによってアルコール変換のために直接利用されることがあり、またはアシル−ＣｏＡを直接アルコールに変換する脂肪酸形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）によって利用されることがある。従って、チオエステラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンターゼは、第一級アルコールの生産に必要とされないが、マロニル−ＣｏＡ依存性経路での場合は必要とされる。

例えば、本発明の微生物は、図１に示すように、脂肪酸の還元と連動するマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成経路を利用して、第一級アルコールを形成する。加えて、例えば、再生可能な供給原料をアセチル−ＣｏＡに変換するように、微生物を修飾することができる。本発明の生物工学によって作られる経路では、アセチル−ＣｏＡを、上で説明した伸長サイクルにおいてプライマーとしても延長単位としても使用することができる。それぞれの伸長サイクルの最後に、伸長サイクルに入るアシル−ＣｏＡよりＣ２単位が１個長いアシル−ＣｏＡが形成される。上記合成経路を還元経路に連動させることにより、本発明の第一級アルコール産物は得られる。所望の第一級アルコールを形成するために長鎖特異的アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）とアルコールデヒドロゲナーゼ（１．１．１．１）の組み合わせまたは脂肪酸アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ、ＥＣ１．１．１）を使用する還元経路への所望の鎖長を有するアシル−ＣｏＡの連動が、特に有用である。鎖長特異的エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよび／またはアシル−ＣｏＡレダクターゼによって第一級アルコールの炭素鎖長を制御することができる。

上で説明した連動生合成経路を有する本発明の微生物は、第一級アルコールを非常に高レベルで生産することができる。例えば、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸生合成経路および付随するエネルギー特性を用いるオクタノールについての最大理論収量は、当該技術分野においてＳｉｍＰｈｅｎｙ（商標）として公知のインシリコ代謝モデリングシステムを用いて、予測Ｅ．ｃｏｌｉ代謝化学量論的ネットワークにマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成、アシル−ＣｏＡおよびアルコールデヒドロゲナーゼを加えることによって算出された（例えば、２００２年６月１４日出願の米国特許出願番号１０／１７３，５４７号、および２００３年６月１３日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８を参照のこと）。このモデルは、オクタノールの分泌がエネルギーを必要としないと仮定している。表４は、好気性条件と嫌気性条件の両方のもとでのオクタノールについての最大理論収量を示すものである。マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸生合成経路は、マロニル−ＣｏＡ依存性脂肪酸合成経路よりはるかにエネルギー効率がよく、ならびに好気性条件下でも嫌気性条件下でも０．５ｍｏｌｅオクタノール／（グルコース１ｍｏｌｅ）の最大理論収量および２．１２５ｍｏｌｅ／（グルコース１ｍｏｌｅ）の最大ＡＴＰ収量を可能にする。

本発明の天然に存在しない微生物は、本発明のターゲット第一級アルコールまたは第一級アルコールのターゲット混合物を生合成により生産するために代謝反応の組み合わせを利用する。第一級アルコールを生産するために十分な量でのマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路の外因性発現を達成するように前記代謝反応の組み合わせを遺伝子操作することができる。前記天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を発現するであろう。一定の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ合成酵素の完全経路についての酵素の一部またはすべてをコードする、すべてを含めて１つより多くの核酸を外因的に発現するように、遺伝子工学で作り変えられるであろう。アシル還元用の酵素の一部またはすべても外因的に発現させることができる。外因的発現は、代謝利用可能な遺伝子産物を生産するために十分なレベルであるはずであり、ターゲット第一級アルコールまたはアルコールセットの生産をもたらす結果となるはずである。

マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路による炭素または他のエネルギー源からの第一級アルコールの形成のための生化学反応を図１に示す。マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路は、アシル−ＣｏＡを生産する。アシル還元経路によりターゲット第一級アルコールを生産するためのこの中間生成物の併用も図１に示す。

本発明を、一般には代謝反応、その反応物もしくは生成物に関して、または詳細には当該代謝反応、反応物もしくは生成物に関連したもしくはそれらを触媒する酵素をコードする１つ以上の核酸もしくは遺伝子に関して本明細書に記載する。本明細書において特に別様に述べられていない限り、反応への言及が、その反応の反応物および生成物への言及も構成することは、当業者には理解されるであろう。類似して、本明細書において特に別様に述べられていない限り、反応物または生成物への言及は、その反応への言及でもあり、これらの代謝成分のいずれかへの言及は、当該反応、反応物または生成物を触媒する酵素をコードする遺伝子（単数または複数）への言及でもある。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知分野を考慮すると、遺伝子またはコード核酸への本明細書における言及は、対応するコードされた酵素およびそれを触媒する反応ならびにその反応の反応物および生成物への言及も構成する。

Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ以外の微生物には、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路によってアシル−ＣｏＡを合成する能力が一般にはない。さらに、本明細書に記載する酵素および例示する生化学的経路からアシル−ＣｏＡを生産するために必要な代謝酵素能力のすべてを有する生物は、知られていない。むしろ、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路の酵素成分を有する微生物は、短、中および長鎖脂肪−アシル−ＣｏＡ化合物をアセチル−ＣｏＡに分解するように作用する。マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路を有するＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、この経路を利用して、アシルグリセロール、三価糖アルコール、リン脂質、ワックスエステルおよび／または脂肪酸を生産する。対照的に、本発明の天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路の産物としてアシル−ＣｏＡを生成し、この産物を好適な熱力学特性によってアシル還元経路に送り込む。本発明の天然に存在しない微生物を使用する産物生合成は、第一級アルコールの生産に特に有用であるばかりでなく、それにより、アシル−ＣｏＡおよび／または第一級アルコールを中間反応物として使用する化合物のさらなる生合成が可能にもなる。

本発明の天然に存在しない第一級アルコール生産性微生物は、宿主微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸生合成経路の完全生化学合成のための機能能力および本発明のアシル還元経路のための機能能力を確実に含むようにすることによって産生される。両方の経路についての完全な機能能力の確保は、その宿主微生物に第一級アルコール生合成能をもたらすであろう。マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路に関与する酵素としては、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。アシル還元経路に関与する酵素としては、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、またはレダクターゼとデヒドロゲナーゼの二重活性を有する酵素が挙げられる。

本発明の天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路に関与する酵素の１つ以上をコードする発現可能な核酸を導入することによって生産することができる。生合成のために選択される宿主微生物に依存して、これらの生合成経路の一部またはすべてのための核酸を発現させることができる。例えば、選択された宿主にマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路における酵素のすべてが欠如している場合には、４つの酵素ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼのそれぞれについての発現可能な核酸を後の外因性発現のためにその宿主に導入する。あるいは、例えば、選択された宿主に４つすべてよりは少ない上記酵素の欠如がある場合には、欠如している酵素をコードする核酸を発現させるだけでよい。例えば、宿主に３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが欠如している場合、これら２つの酵素をコードする核酸の導入により、機能的に完全なマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路を遺伝子工学で作ることができる。

同様に、内因性宿主生合成機械がアシル還元経路について完全である場合には、遺伝子修飾は不必要である。しかし、宿主の能力にアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性のいずれかまたは両方が欠如している場合には、欠如している活性の外因性コード核酸の発現による導入が必要である。従って、選択された宿主微生物のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路成分に依存して、本発明の天然に存在しない微生物は、少なくとも１つの外因的に発現されたマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする核酸と、６つすべてまでのマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路をコードする核酸を含むであろう。

本明細書に提供する技術およびガイダンスを考慮すれば、発現可能な形態で導入するコード核酸の数が、選択された宿主微生物のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路欠如に匹敵するであろうことは、当業者には理解されるであろう。従って、本発明の天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路、アシル還元経路、またはマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳとアシル還元生合成経路の両方を構成する上記酵素をコードするコード核酸１、２、３、４、５または６つを有する場合がある。一部の実施形態において、前記天然に存在しない微生物は、アシル−ＣｏＡおよび／または第一級アルコール生合成を助長するもしくは最適化するまたは他の有用な機能を宿主微生物にもたらす、他の遺伝子修飾も含む場合がある。１つのそのような他の機能性としては、例えば、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路前駆体、例えばアセチル−ＣｏＡ、β−ケトアシル−ＣｏＡ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡおよび／または脂肪アルデヒド、のうちの１つ以上の合成の増加を挙げることができる。

一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路によってアシル−ＣｏＡを合成する酵素能力を含有する、またはマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／もしくはアシル還元経路内の酵素的段階のうちの１つ以上を触媒する能力を有する、宿主から産生される。これらの特定の実施形態において、例えばマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路反応を第一級アルコール生産に有効に向かわせるために、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路産物またはアシル還元経路産物の合成または蓄積を増加させることが有用であり得る。合成または蓄積増加は、例えば、上記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路酵素のうちの１つ以上をコードする核酸の過発現によって遂行することができる。所望の経路酵素（単数または複数）の過発現は、例えば、内因性遺伝子（単数もしくは複数）の外因性発現によって、または異種遺伝子（単数もしくは複数）の外因性発現によって、行うことができる。従って、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路酵素をコードする１、２、３、４、５または６つすべての核酸を過発現させることによって、自然に発生する生物を本発明の天然に存在しない第一級アルコール生産性微生物になるように産生させることが容易にできる。加えて、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元生合成経路における酵素の活性を増加させる結果となる内因性遺伝子の突然変異誘発によって、天然に存在しない微生物を産生させることができる。

特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現を利用する。外因性発現は、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成するために、発現および／または調節要素を注文に合わせて作る能力を宿主およびアプリケーションに付与する。しかし、他の実施形態では、例えば、負の調節エフェクターの除去、または誘導プロモーターもしくは他の調節要素に連結されているときにはその遺伝子のプロモーターの誘導により、内因性発現も利用することができる。例えば、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性に対応するマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ活性を有するＥ．ｃｏｌｉ遺伝子、ｆａｄＢの活性化は、負のレギュレーター、ｆａｄＲの遺伝子ノックアウトおよび異種ケトチオラーゼ（ＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａからのｐｈａＡ；Ｓａｔｏら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１０３：３８−４４（２００７））の共発現によって遂行することができる。従って、適切な誘導剤を供給することによって自然に発生する誘導プロモーターをアップレギュレートすることができ、または内因性遺伝子の調節領域を遺伝子工学で作り変えて誘導性調節要素を組み込むことができ、それによって、所望の時点での内因性遺伝子の発現増加の調節が可能となる。類似して、天然に存在しない微生物に導入される外因性遺伝子のための調節要素として誘導プロモーターを含めることができる。

加えて、例えば、内因性酵素（単数または複数）が、所望のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路とは逆方向に働く場合、そのような活性を減弱するまたは除去するように遺伝子修飾を行うことができる。例えば、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路内で、ケトチオラーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ段階は、可逆的であり、これに対してエノイル−ＣｏＡレダクターゼ段階は、生理条件下で主として酸化力がある（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２８０：４３２９−４３３８（２００５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．およびＪ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ，Ｊｒ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：３７５９−３７６４（２００２））。２−エノイル−ＣｏＡ中間体の還元を遂行するために、遺伝子修飾を導入して逆酸化反応を減弱または除去することができる。

マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路酵素のためのコード核酸源としては、例えば、コードされた遺伝子産物が当該反応を触媒できる任意の種を挙げることができる。そのような種は、古細菌および真性細菌をはじめとする細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物および哺乳動物（ヒトを含む）をはじめとする真核生物を含む（しかしこれらに限定されない）、原核生物と真核生物の両方を含む。例えば、第一級アルコール生合成生産を有する微生物を、本明細書では、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に関して例示する。しかし、３９５の微生物ゲノムならびに様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムを含めて現在５５０を超える種について入手できる完全ゲノム配列（これらの半分より多くがＮＣＢＩなどの公的データベースで入手できる）を用いる、例えば、公知遺伝子の相同体、オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換、ならびに生物間の遺伝子改変の相互交換をはじめとする、類縁または遠縁種における１つ以上の遺伝子についての必要マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元生合成活性をコードする遺伝子の特定は、当該技術分野において常例的であり、周知である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の生物に関して本明細書において説明する本発明の第一級アルコールの生合成を可能にする代謝改変を、同様に原核生物および真核生物を含む他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供する技術およびガイダンスを考慮すれば、ある生物において例示する代謝改変を他の生物に同等に適用できることは、当業者にはわかるであろう。

代替マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ成分酵素または経路が非類縁種に存在するときなどの一部の事例では、例えば、当該反応に代わる類似しているが同一でない代謝反応を触媒する非類縁種からのパラログ（単数または複数）の外因性発現によって、宿主種に第一級アルコール生合成をもたらすことができる。異なる生物間には代謝ネットワーク間の一定の相違が存在するので、異なる生物間で実際の遺伝子利用が異なることがあることは、当業者には理解されるであろう。しかし、本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、本発明の第一級アルコール産物を合成するであろう対象となる種内の微生物を構築するために、本明細書において例示するものへのコグネイト代謝改変を用いて、本発明の技術および方法をすべての微生物に適用することができることも、当業者には理解されるであろう。

マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路能力を宿主微生物に付与するための源として使用することができるコード核酸および種を下でさらに例示する。１つの例示的実施形態において、遺伝子ｆａｄＡおよびｆａｄＢは、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路の３つの成分活性、すなわち、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を示す多酵素複合体をコードする（Ｎａｋａｈｉｇａｓｈｉ，Ｋ．およびＨ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：４９３７（１９９０）；Ｙａｎｇら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７３：７４０５−７４０６（１９９１）；Ｙａｎｇら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６５：１０４２４−１０４２９（１９９０）；Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：６７８８−６７９５（１９９０））。ｆａｄＩおよびｆａｄＪ遺伝子は、遺伝子ｆａｄＡおよびｆａｄＢをもたらす上記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳの代わりに用いることができる類似の活性をコードする。これらの遺伝子は、嫌気性条件下で自然に発現される（ＣｏｍｐｇｅｌｌおよびＣｒｏｎａｎ、上記文献、（２００２））。上記ｆａｄ遺伝子のそれぞれについての核酸配列は、当該技術分野において周知であり、以下のアクセッション番号を用いてＧｅｎｂａｎｋなどの公的データベースにおいて入手することができる。
ｆａｄＡＹＰ＿０２６２７２．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｆａｄＢＮＰ＿４１８２８８．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｆａｄＩＮＰ＿４１６８４４．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｆａｄＪＮＰ＿４１６８４３．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｆａｄＲＮＰ＿４１５７０５．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ケトチオラーゼ段階についての他の例示的遺伝子としては、２つのアセチル−ＣｏＡ分子の可逆的縮合を触媒することができるａｔｏＢ（Ｓａｔｏら、上記文献、２００７）およびそのホモログｙｑｅＦが挙げられる。使用することができる非Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子としては、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａからのｐｈａＡ（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｌ．Ｓ．およびＷ．Ｄ．Ｎｕｎｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６９：４２−５２（１９８７））、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの２つのケトチオラーゼ、ｔｈｉＡおよびｔｈｉＢ（Ｗｉｎｚｅｒら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２：５３１−５４１（２０００））が挙げられる。これらの遺伝子についての配列は、以下のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号で見つけることができる：
ａｔｏＢＮＰ＿４１６７２８．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｙｑｅＦＮＰ＿４１７３２１．２Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｐｈａＡＹＰ＿７２５９４１Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ
ｔｈｉＡＮＰ＿３４９４７６．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
ｔｈｉＢＮＰ＿１４９２４２．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ形質転換活性を付与するために使用することができるＥ．ｃｏｌｉからの例示的遺伝子は、ｐａａＨ（Ｉｓｍａｉｌら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７０：３０４７−３０５４（２００３））である。この活性を付与するために適用できる非Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子としては、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓからのＡＡＯ７２３１２．１（Ｗｉｎｋｉｅｒら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１３１：７５３−７６２（２００３））、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａからのｐａａＣ（Ｏｌｉｖｅｒａら、ＰＮＡＳＵＳＡ９５：６４１９−６４２４（１９９８））、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのｐａａＣ（ＤｉＧｅｎｎａｒｏら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１８８：１１７−１２５（２００７））、およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｈｂｄ（Ａｔｓｕｍｉら、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７）およびＢｏｙｎｔｏｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８：３０１５−３０２４（１９９６））が挙げられる。これらの例示的遺伝子のそれぞれについての配列を以下のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号で見つけることができる：
ｐａａＨＮＰ＿４１５９１３．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＡＡ０７２３１２．１Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ
ｐａａＣＮＰ＿７４５４２５．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ｐａａＣＡＢＦ８２２３５．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ｈｂｄＮＰ＿３４９３１４．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ段階をコードする例示的遺伝子としては、例えば、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ，ＪｏｕｒｎａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８５：５３９１−５３９７（２００３））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７０：３０４７−３０５４（２００３）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１３−１１６：３３５−３４６（２００４）ならびにＰａｒｋおよびＹｕｐ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：６８１−６８６（２００４））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７０：３０４７−３０５４（２００３）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１３−１１６：３３５−３４６（２００４）およびＰａｒｋおよびＹｕｐ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：６８１−６８６（２００４））が挙げられる。この段階を触媒する遺伝子産物を生産するために使用することができる他の遺伝子、例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（Ｏｌｉｖｅｒａら、ＰＮＡＳＵＳＡ９５：６４１９−６４２４（１９９８））およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＤｉＧｅｎｎａｒｏら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１８８：１１７−１２５（２００７））からのｐａａＡ、ｐａａＢ、およびｐａａＮが挙げられる。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｃｒｔの遺伝子産物も使用することができる（Ａｔｓｕｍｉら、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７）およびＢｏｙｎｔｏｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８：３０１５−３０２４（１９９６））。これらの例示的遺伝子のそれぞれについての配列を以下のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号で見つけることができる：
ｍａｏＣＮＰ＿４１５９０５．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｐａａＦＮＰ＿４１５９１１．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｐａａＧＮＰ＿４１５９１２．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｐａａＡＮＰ＿７４５４２７．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ｐａａＡＡＢＦ８２２３３．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ｐａａＢＮＰ＿７４５４２６．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ｐａａＢＡＢＦ８２２３４．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ｐａａＮＮＰ＿７４５４１３．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ｐａａＮＡＢＦ８２２４６．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ｃｒｔＮＰ＿３４９３１８．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を付与するために本発明の天然に存在しない微生物に導入することができる例示的遺伝子は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓからのミトコンドリアエノイル−ＣｏＡレダクターゼである（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、上記文献（２００５））。そのミトコンドリアターゲッティングリーダー配列の除去後にこの配列から得られる構築物をＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニングし、発現させた。膜をターゲットにするポリペプチドの可溶性形態での異種発現のためのこのアプローチは、原核生物において真核遺伝子、特に、遺伝子産物を特定の細胞内コンパートメントにターゲッティングすることができるリーダー配列を有するものを発現させることについて、当業者には周知である。原核生物Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａからのこの遺伝子の近縁ホモログ、ＴＤＥ０５９７も、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を付与するために利用することができる（ＴｕｃｃｉおよびＭａｒｔｉｎ，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ５８１：１５６１−１５６６（２００７））。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｂｃｄによってコードされるブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、本発明の宿主微生物にエノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を付与するために使用することができるさらなる例示的酵素である（Ａｔｓｕｍｉら、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７）およびＢｏｙｎｔｏｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８：３０１５−３０２４（１９９６））。あるいは、当該技術分野において周知の方法を用いて、この活性を示すＥ．ｃｏｌｉ遺伝子を得ることができる（例えば、Ｍｉｚｕｇａｋｉら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ３０：２０６−２１３（１９８２）およびＮｉｓｈｉｍａｋｉら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９５：１３１５−１３２１（１９８４）参照）。上記例示的遺伝子のそれぞれのついての配列を以下のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号で見つけることができる：
ＴＥＲＱ５ＥＵ９０．１Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ
ＴＤＥ０５９７ＮＰ＿９７１２１１．１Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ
ｂｃｄＮＰ＿３４９３１７．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
少なくとも３つのミトコンドリアエノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素がＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓに存在し、それらを本発明での使用に同様に利用することができる。それぞれのエノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、ユニークな鎖長選好を有し（Ｉｎｕｉら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４２：１２１−１２６（１９８４））、これは、本発明の所望の第一級アルコール産物の鎖長の指図に特に有用である。ＥＳＴのＥＬＬ００００２１９９、ＥＬＬ００００２３３５、およびＥＬＬ００００２６４８（すべてにミトコンドリアｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼとの注釈が付いている）を使用して、下でさらに詳細に説明するように、これらの追加のエノイル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を単離することができる。

当業者は、利用できる源からの公知配列を使用してクローニングすることにより、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路またはアシル還元経路のいずれかまたはすべてをコードする核酸を得ることもできる。例えば、当該技術分野において周知の方法を用いて、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路についてのコード核酸のいずれかまたはすべてをＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓから容易に得ることができる。この経路は、この生物において十分に特性づけされているからである。配列がわかっているプローブを使用して、例えばＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓｃＤＮＡライブラリから、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓコード核酸を単離することができる。前記プローブは、公的に利用できる配列データベースＴＢｅｓｔＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｔｂｅｓｔｄｂ．ｂｃｍ．ｕｍｏｎｔｒｅａｌ．ｃａ）からの以下のＥＳＴ配列からの全または部分ＤＮＡ配列を用いて設計することができる。このプロセスから生ずる核酸を適切な発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の微生物に形質転換させて、本発明の第一級アルコール生産生物を産生させることができる。
ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（またはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ）
ＥＬＬ００００２５５０
ＥＬＬ００００２４９３
ＥＬＬ０００００７８９
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
ＥＬＬ０００００２０６
ＥＬＬ００００２４１９
ＥＬＬ００００６２８６
ＥＬＬ００００６６５６
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
ＥＬＬ００００５９２６
ＥＬＬ００００１９５２
ＥＬＬ００００２２３５
ＥＬＬ００００６２０６
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ
ＥＬＬ００００２１９９
ＥＬＬ００００２３３５
ＥＬＬ００００２６４８
あるいは、上記ＥＳＴ配列を使用して、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＬＡＳＴ検索により相同ポリペプチドを特定することができる。結果として得られた相同ポリペプチドおよびそれらの対応する遺伝子配列により、本発明の第一級アルコール生産性生物を産生させるＥ．ｃｏｌｉまたは他の微生物への形質転換のための追加のコード核酸が得られる。本発明の天然に存在しない生物における使用に利用できる例示的相同ポリペプチドおよびＧｅｎＢａｎｋにおけるそれらの遺伝子アクセッション番号を下に列挙する。
ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（またはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ）
ＹＰ＿００１５３００４１ＤｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓＨｘｄ３
ＺＰ＿０２１３３６２７ＤｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓＡＫ−０１
ＺＰ＿０１８６０９００Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＳＧ−１
ＹＰ＿００１５１１８１７ＡｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｏｒｅｍｌａｎｄｉｉＯｈＩＬＡｓ
ＮＰ＿７８１０１７ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉＥ８８
ＹＰ＿００１６４６６４８ＢａｃｉｌｌｕｓｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓＫＢＡＢ４
ＹＰ＿００１３２２３６０ＡｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓＱＹＭＦ
ＹＰ＿００１３９７０５４ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉＤＳＭ５５５
ＮＰ＿０７００２６ＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓＤＳＭ４３０４
ＹＰ＿００１５８５３２７ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓＡＴＣＣ１７６１６
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
ＡＡ０７２３１２Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ
ＸＰ＿００１６５５９９３Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ
ＮＰ＿００１０１１０７３Ｘｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
ＮＰ＿００１００３５１５Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ
ＸＰ＿９７３０４２Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ
ＸＰ＿００１６３８３２９Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａｖｅｃｔｅｎｓｉｓ
ＣＡＧ１１４７６Ｔｅｔｒａｏｄｏｎｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ
ＸＰ＿７８７１８８Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ
ＸＰ＿００１７４９４８１ＭｏｎｏｓｉｇａｂｒｅｖｉｃｏｌｌｉｓＭＸ１
ＮＰ＿５０９５８４Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ
ＸＰ＿５７２８７５Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓｖａｒ
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
ＸＰ＿８４４０７７Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｈｒｕｃｅｉ
ＸＰ＿８０２７１１Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ株ＣＬＢｒｅｎｅｒ
ＸＰ＿８０６４２１Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ株ＣＬＢｒｅｎｅｒ．
ＹＰ＿００１６６９８５６ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧＢ−１
ＹＰ＿６４１３１７Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＭＣＳ
ＹＰ＿９５９４３４ＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒａｑｕａｅｏｌｅｉＶＴ８
ＡＢＫ２４４４５Ｐｉｃｅａｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ
ＸＰ＿６４０３１５Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ
ＹＰ＿６３３９７８ＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓｘａｎｔｈｕｓＤＫ１６２２
ＹＰ＿４６７９０５ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉＣＦＮ４２
ＹＰ＿４１９９９７ＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｍａｇｎｅｔｉｃｕｍＡＭＢ−１
ＹＰ＿００１１７２４４１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉＡ１５０１
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ．
ＸＰ＿６４２１１８ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍＡＸ４
ＸＰ＿００１６３９４６９Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａｖｅｃｔｅｎｓｉｓ
ＸＰ＿００１６４８２２０Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ
ＸＰ＿９７４４２８Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ
ＸＰ＿５３５３３４Ｃａｎｉｓｌｕｐｕｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）
ＮＰ＿００１０１６３７１Ｘｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
ＸＰ＿３２０６８２Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅｓｔｒ．ＰＥＳＴ
ＺＰ＿０１６４５６９９Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ
ＸＰ＿００１６７９４４９ＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｂｒｉｇｇｓａｅＡＦ１６
ＺＰ＿０１４４３６０１Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ種ＨＴＣＣ２６０１
ＸＰ＿３９５１３０Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ
ＸＰ＿００１１１３７４６Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ
ＺＰ＿０１４８５５０９ＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅＶ５１
ＺＰ＿０２０１２４７９ＯｐｉｔｕｔａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＴＡＶ２
ＺＰ＿０１１６３０３３Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＳＫＡ３４
ＹＰ＿２６７４６３Ｃｏｌｗｅｌｌｉａｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ３４Ｈ
ＺＰ＿０１１１４２８２Ｒｅｉｎｅｋｅａ種ＭＥＤ２９７
ＺＰ＿０１７３２８２４ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍＢＡＬ３８
前に説明したように、マロニル−ＣｏＡ非依存性伸長サイクル後、結果として得られるアシル−ＣｏＡを、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示す単一の酵素または１対の酵素のいずれかによって還元して、第一級アルコールを生産することができる。アシル−ＣｏＡのその対応するアルデヒドへの還元を触媒するための酵素をコードする例示的遺伝子としては、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓａｃｒ１（ＲｅｉｓｅｒおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７９：２９６９−２９７５（１９９７））、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種Ｍ−１脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１１９２−１１９５（２００２））、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉからのｓｕｃＤ遺伝子（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，ＪｏｕｒｎａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８：８７１−８８０１９９６））が挙げられる。
ａｃｒｌＹＰ＿０４７８６９．１Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
ＡＡＣ４５２１７Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉ
ＢＡＢ８５４７６．１Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、株Ｍ−１
ｓｕｃＤＰ３８９４７．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ
アルデヒドのアルコールへの変換を触媒する酵素（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼまたは等価にアルデヒドレダクターゼ）をコードする例示的遺伝子としては、Ｃ２〜Ｃ１４のための中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ（Ｔａｎｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５２３１−５２３５（２０００））、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＤＨ２（Ａｔｓｕｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ４５１：８６−８９（２００８））、およびＣ３＿より長い分子に対する選好を有するＥ．ｃｏｌｉからのｙｑｈＤ（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３４２：４８９−５０２（２００４））が挙げられる。
ａｌｒＡＢＡＢ１２２７３．１Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、株Ｍ−１
ＡＤＨ２ＮＰ＿０１４０３２．１Ｓａｃｃｈａｒｙｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｙｑｈＤＮＰ＿４１７４８４．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
あるいは、脂肪酸形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼによって、またはアシル−ＣｏＡレダクターゼとアルコールデヒドロゲナーゼの二重活性を有する任意の他の酵素によって、脂肪アシル−ＣｏＡを一段階で還元することができる。例えば、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＦＡＲは、アルコール形成性脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードし、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその過発現は、ＦＡＲ活性および脂肪アルコール蓄積を生じさせる結果となった（Ｍｅｔｚら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１２２：６３５−６４４（２０００））。狭い基質鎖長特異性を有するレダクターゼは、産物の鎖長についての追加の制御手段としての機能も果たす。追加の遺伝子候補としては、アセチル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡをそれぞれエタノールおよびブタノールに還元することができる、Ｅ．ｃｏｌｉａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２８１：５９−６３（２０００））ならびにＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：７１４９−７１５８（１９９２））が挙げられる。
ＦＡＲＡＡＤ３８０３９．１Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
ａｄｈＥＮＰ＿４１５７５７．１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ｂｄｈＩＮＰ＿３４９８９２．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
ｂｄｈＩＩＮＰ＿３４９８９１．１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
加えて、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路コード核酸について前に説明したように、還元段階のための酵素をコードするＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ核酸配列を得て宿主に形質転換することができる。前に説明したように、ＴＢｅｓｔＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｔｂｅｓｔｄｂ．ｂｃｍ．ｕｍｏｎｔｒｅａｌ．ｃａ）からの以下のＥＳＴ配列からの全または部分ＤＮＡ配列を用いて設計したプローブを使用して、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓｃＤＮＡライブラリからの単離を行うことができる。

アルデヒドデヒドロゲナーゼ
ＥＬＬ００００２５７２
ＥＬＬ００００２５８１
ＥＬＬ０００００１０８
上の例示的コード核酸に加えて、本発明のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路内のもの以外の核酸も、第一級アルコールのさらなる生産のために宿主生物に導入することができる。例えば、ＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａＢｋｔＢおよびＰｈｂＢ遺伝子は、β−ケト−ヘキサノイル−ＣｏＡを形成するブチリル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの縮合、およびβ−ケト−ヘキサノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの還元を触媒する（Ｆｕｋｕｉら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ３：６１８−６２４（２００２））。第一級アルコールの生産を増進させるために、これらの特異的酵素をコードする外因性ＤＮＡ配列を対象となる生産宿主において発現させることができる。さらに、上で説明した酵素を指向進化させて、高い活性および高い基質特異性を有するこれらの酵素の改良変種を産生させることができる。類似のアプローチを本発明の第一級アルコール生産経路における任意のまたはすべての他の段階と共に用いて、例えば、酵素活性および／もしくは特異性を向上させることもでき、ならびに／または所定の鎖長（単数もしくは複数）の長鎖アルコールを生成することもできる。

加えて、上で説明したように生成させた脂肪アシル−ＣｏＡおよび脂肪アルコールを様々な長さのエステルの生産に利用することができる。これらのエステルは、以下の反応式に示すように、１）脂肪アシル−ＣｏＡと、短鎖アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノールなどとで；２）脂肪アルコールと、短鎖アシル−ＣｏＡ、例えばホルミル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、およびプロピオニル−ＣｏＡなどとで；３）脂肪アシル−ＣｏＡと脂肪アルコールとで形成することができる。

脂肪アシル−ＣｏＡ＋短鎖アルコール → 脂肪酸エステル＋ＣｏＡ
脂肪アルコール＋短鎖アシル−ＣｏＡ → 脂肪酸エステル＋ＣｏＡ
脂肪アシル−ＣｏＡ＋脂肪アルコール＝ワックス → ＣｏＡ
脂肪（または長鎖）アルコールは、本明細書に記載する経路によって細胞内で合成することができ、または培地に添加し、遺伝子工学で作り変えられた微生物に取り込ませることができる。類似して、短鎖アルコールを培地に添加することができ、または内因的に生産することができる。エタノールは、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉおよびＳａｃｃａｈｙｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをはじめとする多くの微生物によって自然に生産される例示的短鎖アルコールである。例示的脂肪酸エステルとしては、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）、アセチルエステル、およびワックスが挙げられるが、これらに限定されない。そのような分子は、食品、パーソナルケア、塗料、界面活性剤およびバイオディーゼルをはじめとする広い用途を有する（ＧｅｒｈａｒｄＫｎｏｔｈｅ，Ｅｎｅｒｇｙ＆Ｆｕｅｌｓ２００８、２２、１３５８−１３６４）。これに関連して、脂肪酸エステルは、エステル結合の両側の炭化水素鎖のサイズによってワックスとは区別される。ワックスは、エステル結合の両側に長鎖炭化水素を有し、これに対して脂肪酸エステルは、エステル結合の各側にそれぞれ１つの短鎖炭化水素と１つの長鎖炭化水素とを有する。

これらのエステルを生成する反応を、アシル−ＣｏＡ：アルコールトランスアシラーゼ活性を有する酵素によって触媒することができる。脂肪酸エステルの形成を触媒するための例示的酵素としては、アシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ、ＷＳ、ＥＣ２．３．１．７５）およびアセチル−ＣｏＡ：アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）が挙げられる。これらの酵素をコードする例示的遺伝子としては、ワックスエステルシンターゼ（ＷＳ）活性とアシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性の両方を有する二機能性酵素をコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰ１ａｔｆＡ（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、ＡＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００３，２７８：８０７５−８０８２．）；ホホバ種子におけるワックスの蓄積に必要なＷＳをコードするＳｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ遺伝子ＡＡＤ３８０４１（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２０００，１２２：６４５−６５５．）；二機能性ＷＳ／ＤＧＡＴ酵素をコードするＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓａｔｆＡ１およびａｔｆＡ２（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ２００７，１８９：９１８−９２８．）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＦｒａｇａｒｉａｘａｎａｎａｓｓａＡＡＴ（Ｎｏｉｃｈｉｎｄａら、ＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌＲｅｓ１９９９，５：２３９−２４２．）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするバラ属ハイブリッド栽培品種ＡＡＴ１（Ｇｕｔｅｒｍａｎら、ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ２００６，６０：５５５−５６３．）；ならびにアルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＴＦ１およびＡＴＦ２（Ｍａｓｏｎら、Ｙｅａｓｔ２０００，１６：１２８７−１２９８）が挙げられる。
ａｔｆＡＱ８ＧＧＧ１Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰ１
ＡＡＤ３８０４１Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
ａｔｆＡ１ＹＰ＿６９４４６２ＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓＳＫ２
ａｔｆＡ２ＹＰ＿６９３５２４ＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓＳＫ２
ＡＡＴＡＡＧ１３１３０Ｆｒａｇａｒｉａｘａｎａｎａｓｓａ
ＡＡＴ１Ｑ５Ｉ６Ｂ５バラハイブリッド栽培品種
ＡＴＦ１Ｐ４０３５３Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＴＦ２Ｐ５３２９６Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに利用できる様々な他の微生物から宿主微生物を選択することができ、かつ細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに利用できる様々な他の微生物において天然に存在しない微生物を産生させることができる。例示的細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａおよびＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓから選択される種が挙げられる。例示的酵母または真菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒａｎｄＰｉｃｈｉｏｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が挙げられる。

天然に存在しない第一級アルコール生産性宿主の構築方法および発現レベル試験方法は、例えば、当該技術分野において周知の組み換え方法および検出方法によって行うことができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＴｈｉｒｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記載されているのを見つけることができる。例えば、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路における酵素をコードする核酸は、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換をはじめとする（しかしこれらに限定されない）当該技術分野において周知の技術を用いて、宿主細胞に安定的にまたは一過的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞における外因性発現については、例えば、ミトコンドリア遺伝子は、宿主細胞への形質転換前に除去することができるＮ末端ターゲッティングシグナルをコードするであろう。酵母またはたの真核細胞における外因性発現については、遺伝子を、ターゲッティング配列の付加なしでサイトゾルにおいて発現させることができ、または代替的に、宿主生物において機能し得るミトコンドリアターゲッティングシグナルを付加させてミトコンドリアにターゲッティングすることができる。さらに、当該技術分野において周知の技術でのコドン最適化に遺伝子を付して、１つ以上のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路遺伝子産物の最適な発現を達成することができる。

宿主生物において機能し得る発現制御配列に作動可能に連結された１つ以上のマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路コード核酸を有するように発現ベクター（単数または複数）を構築することができる。本発明の微生物宿主生物における使用に適用することができる発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクターおよび人工染色体が挙げられる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供する、栄養要求性欠損を補足する、または培養基中にない重要な栄養素を供給する、選択マーカー遺伝子も含めることができる。発現制御配列としては、当該技術分野において周知である、構成的および誘導プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターおよびこれらに類するものを挙げることができる。コードする２つ以上の外因性核酸を共発現させようとするとき、両方の核酸を、例えば、単一の発現ベクターに挿入することができ、または別個の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コード核酸を１つの共通の発現制御配列に動作可能に連結することができ、または異なる発現制御配列、例えば、１つの誘導プロモーターと１つの構成的プロモーターに連結させることができる。代謝または合成経路に関与する外因性ＤＮＡ配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認されるであろう。

当業者に周知の方法を用いて、第一級アルコール生産を検出および／またはモニターすることができる。例えば、第一級アルコールの最終産物および／または中間体、例えばアシル−ＣｏＡおよび有機酸を、ＨＰＬＣ、ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳによって分析することができる。例えば、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ５ＯＤＳ１カラムと７０％１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）および３０％メタノールの移動相とを使用するＨＰＬＣによって第一級アルコールを分離し、ＵＶ検出器を使用して２１５ｎｍで検出することができる（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、２００４，Ｊ．ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉ．４６（６）：１−９）。第一級アルコールの培養基または発酵ブロスへの放出または分泌も、これらの手順を用いて検出することができる。マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアシル還元経路における１つ以上の酵素の活性も、当該技術分野において周知の方法を用いて測定することができる。

上に例示したような当該技術分野において周知の方法を用いて本発明の天然に存在しない微生物を構築して、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸を、第一級アルコール生産するために十分な量で、外因的に発現させる。本明細書に提供する教示およびガイダンスに従って、本発明の天然に存在しない微生物は、自然に発生する生物において合成され得るものより多くの生合成を達成することができる。一般に、例えばオクタノールの細胞内濃度は、約５４μｇ／Ｌであり、デカノールは、約１４８μｇ／Ｌである。

さらに下で説明するように、第一級アルコールの生合成を達成するための１つの例示的増殖条件は、嫌気性培養または発酵条件である。一定の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物は、嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で維持する、培養するまたは発酵させることができる。簡単に言うと、嫌気性条件は、酸素が全く無い環境を指す。実質的に嫌気性の条件は、例えば、培地中の溶解酸素濃度が、飽和の０％と１０％の間であり続けるような培養、回分発酵または連続発酵を含む。実質的に嫌気性の条件は、酸素１％未満の雰囲気で維持される密封チャンバ内の液体培地中または寒天上での細胞の増殖または休止も含む。この酸素のパーセントは、例えば、Ｎ_２／ＣＯ_２混合物または他の適する非酸素ガス（単数もしくは複数）を培養物に散布することによって、維持することができる。

本発明は、第一級アルコールの生産方法をさらに提供する。この方法は、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現される、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する天然に存在しない微生物を、実質的に嫌気性の条件下で、前記第一級アルコールを生産するために十分な期間にわたって培養することを含み、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路は、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路は、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む。

前に説明したいずれの天然に存在しない微生物も、培養して本発明の生合成産物を生産することができる。例えば、それらの第一級アルコール生産体を、その遺伝子工学で作られるターゲット第一級アルコールの生合成生産のために培養することができる。その第一級アルコールを単離することができ、または単離して多種多様な製品および手順においてさらに利用することができる。

一部の実施形態において、培養条件は、嫌気性または実質的に嫌気性の増殖または維持条件を含む。例示的嫌気性条件は、前に説明したものであり、当該技術分野において周知である。発酵プロセスのための例示的嫌気性条件は、下で説明するものであり、当該技術分野において周知である。これらの条件のいずれも、天然に存在しない微生物、ならびに当該技術分野において周知の他の嫌気性条件と共に用いることができる。

培養条件としては、例えば、液体培養手順ならびに発酵および他の大規模培養手順を挙げることができる。下の実施例においてさらに説明するように、本発明の生合成産物の特に有用な収量を嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件下で得ることができる。例示的増殖手順としては、例えば、流加発酵および回分分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらのプロセスのすべてが当該技術分野において周知である。

発酵手順は、第一級アルコールの商業的な量の生合成生産に特に有用である。一般に、および非連続培養手順でのように、第一級アルコールの連続および／または準連続生産は、指数期における増殖を持続するおよび／またはほぼ持続するために十分な栄養および培地で本発明の天然に存在しない第一級アルコール生産性生物を培養することを含むであろう。そのような条件下での連続培養を、例えば、１日、２、３、４、５、６または７日以上含むことができる。加えて、連続培養は、１週間、２、３、４または５週間以上、および数か月以下を含むことができる。あるいは、特定の用途に適する場合には、本発明の生物を数時間培養することができる。前記連続および／または準連続培養条件がこれらの例示期間の間のすべての時間間隔も含み得ることは理解されるはずである。

発酵手順は、当該技術分野において周知である。簡単に言うと、本発明の第一級アルコール産物の生合成生産のための発酵は、例えば、流加発酵および回分分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で用いることができる。当該技術分野において周知の回分および連続発酵手順の例を下の実施例でさらに例示する。

さらなる実施形態において、本発明の第一級アルコール生産性微生物は、再生可能な供給原料と、増殖のための炭素源としての炭素含有ガスとを利用する。これらの代替材料の供給原料としての利用は、環境的観点からおよび本発明の第一級アルコールなどのバイオプロセス由来の産物のより低い生産コストから利益を受けるので、特に有用である。

本発明の修飾生物での発酵プロセスを含めて、本発明の第一級アルコール生産性生物の増殖に有用な再生可能な供給原料は、炭素または他のエネルギー源の補給物として細胞が利用できる任意の再生原料を含むことができる。一般に、再生可能な供給原料は、もみ殻などの十分に活用されない成分から多くの場合成る、バイオマスに由来する材料を含む、生きている生物またはそれらの代謝副産物から得られる。再生可能な供給原料として使用するために特に育成されるおよび本発明の方法において有用な農産物としては、例えば、トウモロコシ、大豆および綿；亜麻仁および菜種；サトウキビおよびパーム油が挙げられる。従って、使用することができる再生可能な供給原料としては、本発明の第一級アルコール生産性生物が炭素源として活用できる農業物質および／または動物質から得られる数多くの炭水化物、脂肪およびタンパク質が挙げられる。

持続可能にエネルギー源として利用できる植物由来のバイオマスとしては、例えば、草質および木質エネルギー作物、農産食品および飼料作物、農産物廃棄物および残渣、木材廃棄物および残渣、水生植物、ならびに都市廃棄物をはじめとする他の廃材が挙げられる（例えば、バイオマス源の１５０より多くの例示的種類を記載しているデータベースを含む、ＵＲＬｌ．ｅｅｒｅ．ｅｎｅｒｇｙ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ＿ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｈｔｍｌを参照のこと）。本発明の方法において供給原料として使用することができるバイオマスの例示的タイプとしては、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマスおよびリグニン供給原料または供給原料の一部が挙げられる。そのようなバイオマス供給原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有する。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、上に例示したもの以外の再生可能な供給原料およびバイオマスも多種多様な第一級アルコールの生産のために本発明の微生物を培養するために使用できることは、当業者には理解されるであろう。

上に例示したものなどの再生可能な供給原料に加えて、本発明の第一級アルコール生産性微生物を、その炭素源としてシンガスを用いる増殖用に修飾することもできる。この特定の実施形態では、第一級アルコール生産性生物において１つ以上のタンパク質または酵素を発現させて、シンガスまたは他の気体炭素源の利用のための代謝経路を提供する。

シンガスまたは発生炉ガスとしても公知である合成ガスは、石炭の気化、および農産物および残渣をはじめとする、バイオマス材料などの炭質材料の気化の主生成物である。シンガスは、主としてＨ_２とＣＯの混合物であり、ならびに石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび有機廃棄物をはじめとする（しかしこれらに限定されない）任意の有機供給原料の気化から得ることができる。気化は、一般に、高燃料対酸素比のもとで行われる。大部分はＨ_２およびＣＯだが、シンガスは、より少ない量でＣＯ_２および他のガスを含むこともある。従って、合成ガスは、ＣＯおよび、その上、ＣＯ_２などの、費用効率のよい気体炭素源をになる。

Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、アセチル−ＣｏＡおよび他の産物、例えば酢酸塩へのＣＯおよびＨ_２の変換を触媒する。ＣＯおよびシンガスを利用することができる生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含される酵素と形質転換の同じ基本セットにより、ＣＯ_２およびＣＯ_２／Ｈ_２混合物を利用する能力も一般に有する。微生物による酢酸塩へのＣＯ_２のＨ_２依存性変換は、同じ生物によってＣＯも用いられることがあることおよび同じ経路が関与することが明らかになるずっと以前から認知されていた。多くの酢酸生成細菌がＣＯ_２の存在下で増殖し、水素が存在する限り酢酸塩などの化合物を生産して必要還元等価物を補充することは証明されている（例えば、Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｐ．３−６０ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９４）参照）。これは、次の反応式によって要約することができる：
２ＣＯ_２＋４Ｈ_２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ →ＣＨ_３ＣＯＯＨ＋２Ｈ_２Ｏ＋ｎＡＴＰ
従って、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈ１経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチル−ＣｏＡおよび他の所望の産物の生産のためにもＣＯ_２とＨ_２の混合物を利用することができる。

Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、当該技術分野において周知であり、１２の反応から成り、それらの反応を２つのブランチ：（１）メチルブランチおよび（２）カルボニルブランチに分けることができる。メチルブランチは、シンガスをメチル−テトラヒドロ葉酸塩（メチル−ＴＨＦ）に変換するのに対して、カルボニルブランチは、メチル−ＴＨＦをアセチル−ＣｏＡに変換する。メチルブランチにおける反応は、次の酵素により順を追って触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニルブランチにおける反応は、次の酵素により順を追って触媒される：コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼ。マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよび／またはアセチル還元経路のいずれかまたは両方を完了するために十分な数のコード核酸を導入するための上に提供した技術およびガイダンスに従って、宿主生物に不在のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路をコードする遺伝子を少なくとも導入することに関しても同じ工学設計を行うことができることは、当業者には理解されるであろう。従って、修飾された生物が完全Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有するような、本発明の微生物への１つ以上のコード核酸の導入は、シンガス利用能力をもたらすであろう。

本発明は、１つには、ＬＣＡの増殖連動生産を有する細胞および生物の設計および産生にも関する。１つの実施形態において、本発明は、ＬＣＡの最適な生産のための代謝設計を特定するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ代謝のインシリコ化学量論的モデルに基づく最適化ベースのアプローチを利用する。二層プログラミングフレームワーク、ＯｐｔＫｎｏｃｋ、は、ＬＣＡの増殖連動生産を共同でもたらす遺伝子破壊の多数のセットを予想する反復的アルゴリズムである。本明細書に記載する結果は、戦略的に配置された遺伝子欠失または遺伝子の機能破壊の組み合わせが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉおよび他の細胞もしくは微生物のＬＣＡ生産能力を有意に向上させることを示している。前記株設計戦略は、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の生物が生産宿主として選ばれる場合にも、破壊に指定される遺伝子産物のサブセットの活性をその生物が生来欠く場合または低い活性を示す場合でさえ、同等に利用できる。これらの場合、選択された生産宿主に生来存在する遺伝子産物の酵素活性を除去または減少させるためにしか破壊を導入してはならない。インシリコ設計のためのＬＣＡの増殖連動生産は、設計された代謝遺伝子型を有する株の構築によって確認される。代謝経路が遺伝子工学で作り変えられたこれらの細胞または微生物を適応進化させて、増殖連動産物生産をさらに増加させることもできる。

本発明は、１つには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ代謝のインシリコ化学量論的モデルに基づく長鎖アルコール、つまりＬＣＡを生産する細胞および生物の設計および産生にも関する。例えば、非生産性増殖期、その後、非増殖生産期をもたらすことによる非増殖連動生産によってもＬＣＡを生産できることが当業者にはわかるであろう。本明細書に記載する結果は、遺伝子破壊または遺伝子の機能破壊の組み合わせが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｉｅのならびに真核生物および真核微生物の他の細胞のＬＣＡ生産能力を有意に向上させることを示している。前記株設計経路は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の真核微生物が生産宿主として選ばれる場合にも、破壊に指定される遺伝子産物のサブセットの活性をその生物が生来欠く場合または低い活性を示す場合でさえ、同等に適用できる。後者の場合、選ばれた生産宿主に生来存在する遺伝子産物の酵素活性を除去または減少させるために破壊を導入することができる。一部の実施形態において、インシリコで決定された代謝経路についてのＬＣＡの増殖連動生産は、設計された代謝遺伝子型を有する株の構築によって確認される。代謝経路が遺伝子工学で作り変えられたこれらの細胞または生物を適応進化させて、増殖連動産物生産をさらに増加させることもできる。一部の実施形態では、遺伝子工学で作り変えられた細胞または生物に、特定の代謝経路を通るフラックスを増加させるために有益な遺伝子の追加のコピーを組み込むこともできる。あるいは、別の生物からの外因性遺伝子挿入を用いて、その宿主生物に存在しない機能性を持たせることができる。

一部の実施形態において、設計されたＬＣＡ生産経路は、図１に示すように、脂肪酸の還元と連動するマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成経路を利用して第一級アルコールを形成する。前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＬＣＡ生産経路（ＭＩ−ＬＣＡ経路）は、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成段階およびアシル−ＣｏＡ還元段階を含む。ＭＩ−ＬＣＡ経路を有する遺伝子工学で作り変えた微生物は、グルコースおよびスクロースなどの低コストで再生可能な供給原料を解糖によってアセチル−ＣｏＡに変換するであろう。その後、アセチル−ＣｏＡは、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む伸長サイクルにおいてプライマーとしても延長単位としても用いられる。それぞれの伸長サイクルの終わりに、その伸長サイクルに入るアシル−ＣｏＡよりＣ_２単位が１個長いアシル−ＣｏＡが形成される。その後、所望の鎖長を有するアシル−ＣｏＡが、アシル−ＣｏＡレダクターゼとアルコールデヒドロゲナーゼの組み合わせまたは脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼによって還元されて、所望の第一級アルコールを形成する。鎖長特異的エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、および／またはアシル−ＣｏＡレダクターゼによってそのＬＣＡの炭素鎖長は制御することができる。

前記ＭＩ−ＬＣＡ経路は、ＬＣＡ生産のための典型的なエネルギー集約的脂肪酸合成経路によるものより良好な産物およびＡＴＰ収量という利点を有する。例えば、ＭＩ−ＬＣＡ経路を用いるドデカノール（Ｃ_１２）の最大理論収量は、好気性条件下でも嫌気性条件下でも消費されるグルコース１ｍｏｌにつき０．３３３ｍｏｌである：
３Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６ → Ｃ_１２Ｈ_２６Ｏ＋６ＣＯ_２＋５Ｈ_２Ｏ
加えて、ＭＩ−ＬＣＡ経路のエネルギーおよびレドックス特性が、それを、ＯｐｔＫｎｏｃｋアルゴリズムを用いてＬＣＡ生産を増殖に連動させる株の産生に適するものにする（Ｂｕｒｇａｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ｐ．Ｐｈａｒｋｙａ，ａｎｄＣ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，Ｏｐｔｋｎｏｃｋ：ａｂｉｌｅｖｅｌｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｒａｉｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，２００３．８４（６）：ｐ．６４７−５７；Ｐｈａｒｋｙａ，Ｐ．，Ａ．Ｐ．Ｂｕｒｇａｒｄ，ａｎｄＣ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，ＥｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｓｉｎｇｔｈｅｂｉｌｅｖｅｌｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｒａｍｅｗｏｒｋＯｐｔＫｎｏｃｋ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，２００３．８４（７）：ｐ．８８７−９９；Ｐｈａｒｋｙａ，Ｐ．，Ａ．Ｐ．Ｂｕｒｇａｒｄ，ａｎｄＣ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，ＯｐｔＳｔｒａｉｎ：ａｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｒｅｄｅｓｉｇｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２００４．１４（１１）：ｐ．２３６７−７６）。結果として得られる増殖連動生産株は、本質的に安定しており、自己最適化性であり、回分、流加、および連続プロセス設計に適するであろう。

一部の実施形態において、本発明は、ＬＣＡ生産特性の向上を有する代謝的に改変された微生物株を発生させるためのコンピュータ計算と工学処理の統合プラットフォームに関する。このプラットフォームのコンピュータ計算コンポーネントによって特定された株を、ＬＣＡの生産増進をもたらす予測代謝改変の遺伝子操作により、実際の生産に移す。所望の産物の生産をその微生物の最適増殖と連動させて、発酵中のこの産物の収量を最適化する。さらにもう１つの実施形態では、ＬＣＡの増殖連動生産を示す株をさらに適応進化させて産物の生合成をさらに増加させる。適応進化後の増殖連動産物生産レベルもこのシステムのコンピュータ計算コンポーネントによって予測することができ、この特定の実施形態では、産物レベル上昇は進化後にのみ実現する。

一部の実施形態において、本発明は、１つ以上の遺伝子破壊を含む、天然に存在しない微生物を提供する。前記破壊は、酵素をコードする遺伝子において生じ、この酵素は、前記遺伝子破壊がその酵素の活性を低下させると前記生物の増殖にＬＣＡ生産を連動させるので、前記遺伝子破壊は、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの安定した増殖連動生産をもたらす。

特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の遺伝子破壊を含む、天然に存在しない真核生物を提供する。前記１つ以上の遺伝子破壊は、例えば、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼまたはミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素をコードする遺伝子において発生する。これらの遺伝子破壊は、前記生物のサイトゾルまたはミトコンドリアでの長鎖アルコールの生産をもたらす（下記参照）。

さらに、本発明は、ＬＣＡの安定した増殖連動生産を有するそのような天然に存在しない微生物を生産する方法を提供する。ＬＣＡ生産のために、例えば、この方法は、（ａ）細胞増殖中にＬＣＡ生産を必要とする代謝修飾１セットをインシリコで特定すること、および（ｂ）ＬＣＡ生産を必要とするその代謝修飾セットを含有するように微生物を遺伝子修飾することを含む。

バイオプロセッシングについての１つの考慮事項は、回分発酵スキームを用いるのか、または連続発酵スキームを用いるのか、である。生産される産物の量に影響を及ぼすであろうこれら２つのスキームの間の１つの違いは、指数増殖期に加えて回分スキームについての準備、誘導および定常期の存在である。対照的に、連続プロセスは、一定した指数増殖状態で保たれ、適切に稼働されれば一回で何か月にもわたって操業し続けることができる。増殖関連および混合増殖関連産物形成の場合、その準備、誘導および定常期が省かれるため、連続プロセスのほうがはるかに高い生産性（すなわち、希釈率×細胞質量）をもたらす。例えば、次の合理的仮定：
Ｍｏｎｏｄ動力学（すなわち、μ＝μ_ｍ・Ｓ／（Ｋ_ｓ＋Ｓ））
μ_ｍ＝１．０時^−１
最終細胞濃度／初期細胞濃度＝２０
ｔ_準備＋ｔ_誘導＋ｔ_定常＝５時間
制限栄養の供給濃度＞＞Ｋｓ
を考慮して、連続プロセスからの生産性増加は８倍と概算された；Ｓｈｕｌｅｒら、ＰｒｅｎｔｉｃｅＨａｌｌ，Ｉｎｃ．：ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅＲｉｖｅｒ，ＮＪ．，２４５−２４７。

生産性の長所にもかかわらず、多数の理由のために連続プロセスよりはるかに多くの回分プロセスが稼働されている。第一に、非増殖関連産物形成（例えば、ペニシリン）の場合、回分システムの生産性は、連続プロセスのものを有意に上回ることがある。後者は、非常に低い希釈率で稼働させなければならないからである。次に、生産株は、それらの生化学的またはタンパク質生産能力を向上させるために、一般に、それらの遺伝物質に修飾を受けている。これらの特殊化された株は、それらの親の補体ほど急速に増殖しない可能性が高いが、ケモスタット（連続モードで稼働する発酵槽）を利用するものなどの連続プロセスは、最速増殖細胞についての大きな選択圧をかける。所望の過剰生産表現型をもたらす組み換えＤＮＡを含有するまたは点突然変異を有する細胞は、もとの低生産性親株への復帰突然変異を受けやすい。単一の遺伝子欠失を有する株が、野生型増殖表現型を回復する傾向がある代償突然変異を発現する可能性もある。より速く増殖する細胞は、通常、制限栄養についてそれらのより生産性の相対物と競合してそれらに勝り、その結果、生産性を劇的に低下させる。一方、回分プロセスは、それぞれのサイクルの最後に細胞を再使用しない、従って、その野生型の表現型に復帰変異する生産株の確率を低下させることで、利用できる世代の数を制限する。最後に、連続プロセスのほうが、装置故障および外来生物汚染などの潜在的な工学的障害のため、長期可動が難しい。そのような不首尾の結果も、回分培養でより連続プロセスのほうがはるかに顕著である。

特殊化学物質および／またはタンパク質の少量生の場合、連続プロセスの生産性増加が、株の安定性および信頼性に関連したリスクに勝ることはめったにない。しかし、大量、増殖関連産物、例えばＬＣＡの生産の場合、連続プロセスの生産性の増加は、回分プロセスと比較したとき、有意な経済的利得をもたらす結果となり得る。連続バイオプロセス稼働に付随する工学的障害は常に存在するが、指数増殖期中、負の選択圧を減少または回避してターゲット産物の生産に好適であるように代謝経路を変更する、代謝経路を遺伝子工学で作り変える戦略によって、株の安定性の問題を克服することができる。

産物の増殖連動生産に好適である代謝改変を特定および設計するための１つのコンピュータ計算方法が、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークである、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４，６４７−５７（２００３）。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、ターゲット産物を過剰生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす結果となる遺伝子破壊戦略を示唆する代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、このフレームワークは、微生物の完全代謝および／または生化学的ネットワークを調査して、所望の生化学物質を細胞増殖の副産物になるように強いる遺伝子操作を示唆する。戦略的に配置された遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊によって細胞増殖と生化学的生産を連動させることにより、バイオリアクターでの長い期間の後、遺伝子工学で作り変えられた株にかけられる増殖選択圧が、その強制的増殖連動生化学的生産の結果として性能の向上をもたらす。

増殖連動生化学的生産の概念は、インシリコモデルを用いて算出される典型的な代謝ネットワークの生化学的生産エンベロープに関連して視覚化することができる。これらの限界は、制限基質（単数または複数）の取り込み速度（単数または複数）をそれらの実験測定値（単数または複数）に固定すること、ならびにそれぞれの達成可能な増殖レベルでの生化学的生産の最大および最小速度を算出することによって得られる。例外は存在するが、概して、所望の生化学物質の生産は、バイオマス形成と細胞内資源について直接競合する。従って、生化学的生産速度向上は、最大下増殖速度を必然的に生じさせる結果となるだろう。図２に描くように、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって示唆された破壊を、許容解範囲を制限して野生型株から代謝挙動を強制的に変化させるように設計する。所与の株についての実解範囲は、基質取り込み速度（単数または複数）が増加または減少するにつれて拡大または縮小するであろうが、それぞれの実験ポイントは、その算出解範囲内にあるはずである。これらのようなプロットは、株がそれらの性能限界のどれ程近くにあるのか、言い換えると、改善に利用できる余地がどれ程あるかの視覚化を可能にする。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、生化学的過剰生産のための有望な遺伝子破壊戦略を既に特定できており（Ｂｕｒｇａｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ｐ．Ｐｈａｒｋｙａ，ａｎｄＣ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４（６）：６４７−６５７（２００３）；Ｐｈａｒｋｙａ，Ｐ．，Ａ．Ｐ．Ｂｕｒｇａｒｄ，ａｎｄＣ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４（７）：８８７−８９９（２００３））、代謝および調節モデリングフレームワークの将来の改善を当然包含する系統的フレームワークを確立する。

最後に、遺伝子欠失を構成するとき、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子は、ゲノムから完全に除去されることとなるので、設計した株がそれらの野生型状態に復帰変異する可能性は無視してよい。

簡単に言うと、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、細胞の代謝をモデリングするためのコンピュータ計算方法およびシステムを指すために本明細書において用いる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、フラックス均衡解析（ＦＢＡ）モデルに特定の制約を組み込むモデルおよび方法のフレームワークに関係する。これらの制約としては、例えば、定性的動態情報、定性的調節情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが挙げられる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えば、フラックス均衡モデルによって得られるフラックス範囲を狭め、その後、遺伝子付加または破壊が存在する状態で代謝ネットワークの性能限界を精査することにより、様々な代謝の問題に対する解も推定する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の有効な照会を可能するモデル式の作成を可能にし、結果として得られる混合整数線形計画問題の解法を提供する。本明細書においてＯｐｔＫｎｏｃｋと呼ぶ代謝モデリングおよびシミュレート方法は、例えば、２００２年１月１０日出願の米国特許出願第１０／０４３，４４０号に、および２００２年１月１０日出願の国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０に記載されている。

物質の増殖連動生産に好適である代謝改変を特定および設計するためのもう１つのコンピュータ計算方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ計算方法は、例えば、２００２年６月１４日出願の米国特許出願第１０／１７３，５４７号に、および２００３年６月１３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。

ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを生成するために使用することができる、および生体系の化学反応による質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートするために使用して、その系における化学反応の任意のおよびすべての可能な機能性を含む解空間を定義し、それによってその生態系についての許容活性の範囲を決定することができる、コンピュータ計算システムである。このアプローチは、制約に基づくモデリングと呼ばれる。解空間が、制約、例えば、含まれる反応の公知化学量論、ならびに反応による最大フラックスに関連した反応熱力学および容量の制約によって定義されるからである。これらの制約によって定義される空間を質問して、その生体系のまたはその生化学成分の表現型の能力および挙動を決定することができる。例えば、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２０３：２２９−２４８（２０００）；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１：２８６−３０６（２０００）およびＳｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．１５：２８８−２９５（１９９９）に記載されているものなどの解析方法、例えば、凸解析、線形計画、および極限経路の算出を用いて、そのような表現型の能力を決定することができる。

上で説明したように、本発明に適用することができるコンピュータ計算プログラムにおいて用いられる、制約に基づく１つの方法は、フラックス均衡解析である。フラックス均衡解析は、定常状態条件で均衡するフラックスに基づくものであり、例えば、ＶａｒｍａおよびＰａｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２：９９４−９９８（１９９４）に記載されているとおり行うことができる。フラックス均衡アプローチは、例えば、ＦｅｌｌおよびＳｍａｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：７８１−７８６（１９８６）に記載されているように脂肪細胞代謝の、ＭａｊｅｗｓｋｉおよびＤｏｍａｃｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３５：７３２−７３８（１９９０）に記載されているようにＡＴＰ最大化条件下でのＥ．ｃｏｌｉからの酢酸塩分泌の、またはＶａｎｒｏｌｌｅｇｈｅｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．１２：４３４−４４８（１９９６）に記載されているように酵母によるエタノール分泌の、全身性をシミュレートするまたは予測するために、反応ネットワークに適用されている。加えて、このアプローチは、様々な単一炭素源でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖、ならびにＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５５２８−５５３３（２０００）、ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７４１０−１７４１６（１９９９）およびＥｄｗａｒｄｓら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１９：１２５−１３０（２００１）に記載されているようにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの代謝を予想またはシミュレートするために用いることができる。

解空間が定義されれば、それを解析して、様々な条件下で可能な解を決定することができる。生体系は順応性があり、多くの異なる方法で同じ結果に達することができるので、このコンピュータ計算アプローチは、生物学的現実との矛盾がない。生体系は、生きているすべての系が直面する基本的制約による拘束を受けた進化メカニズムによって設計される。従って、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約をきつくすることによりネットワークモデルにさらなる制限を連続的に課すことができることによって、解空間のサイズが減少され、その結果、生理的性能または表現型を予測することができる精度が向上する。

本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのために様々なコンピュータ計算フレームワークを利用して、生化学製品の増殖連動生産を設計するおよび実行することができるであろう。そのような代謝モデリングおよびシミュレーション方法としては、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋとして上で例示したコンピュータ計算システムが挙げられる。本発明の例証の簡略化のために、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークに関して方法および株を説明することにする。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝改変の特定、設計および実行を、当該技術分野において周知の任意のそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータ計算フレームワークおよび方法に適用する方法を知っているだろう。

生化学製品の生産に増殖を連動させる細胞または生物の能力は、インシリコモデルを用いて算出される典型的な代謝ネットワークの生化学的生産の限界に関連して例証することができる。これらの限界は、限界基質（単数または複数）の取り込み速度（単数または複数）をそれらの実験測定値（単数または複数）に固定することならびにそれぞれの達成可能な増殖レベルでの生化学的生産の最大および最小速度を算出することによって得られる。図２に示すように、所望の生化学製品の生産は、一般に、バイオマス形成と細胞内資源について直接競合する。これらの状況のもとで、生化学的生産速度向上は、最大下増殖速度を必然的に生じさせる結果となるだろう。図２に描くように、ＯｐｔＫｎｏｃｋなどの上記代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムによって示唆された破壊を、許容解範囲を制限して野生型株から代謝挙動を強制的に変化させるように設計する。所与の株についての実解範囲は、基質取り込み速度（単数または複数）が増加または減少するにつれて拡大または縮小するであろうが、それぞれの実験ポイントは、その算出解範囲内にあるだろう。これらのものなどのプロットは、設計された株がそれらの性能限界にどれ程近くにあるか（これは、改善に利用できる余地がどれ程あるかも示す）ということの正確な予測を可能にする。

図２に示すような増殖連動生化学的生産をもたらす遺伝子破壊の位置を正確に示すために、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的フレームワークを本明細書において例示する。この手順は、物理化学的制約の規制を逐次的に課すことによって細胞系を表示することができる、可能な表現型の範囲を狭くする制約に基づく代謝モデルに基づく、Ｐｒｉｃｅら、ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２：８８６−９７（２００４）。上で説明したように、制約に基づくモデルおよびシミュレーションは、当該技術分野において周知であり、および一般に、特定の細胞目的物の最適化を発動して、ネットワーク化学量論に従って、可能性の高いフラックス分布を示唆する。

簡単に言うと、１セットＮ＝｛１、・・・、Ｎ｝の代謝産物と１セットＭ＝｛１、・・・、Ｍ｝の代謝反応とを含む定常状態代謝ネットワークについての集合体反応フラックスとして定量される細胞目的物の最大化は、数学的に次のように表される：

この場合、Ｓ_ｉｊは、反応ｊにおける代謝産物ｉの化学量論係数であり、ν_ｊは、反応ｊのフラックスであり、ν_{ｓｕｂｓｔｒａｔｅ＿ｕｐｔａｋｅ}は、制限基質（単数または複数）の仮のまたは測定された取り込み速度（単数または複数）を表し、およびν_{ａｔｐ＿ｍａｉｎ}は、非増殖関連ＡＴＰ維持要件である。速度νは、内部フラックスと外部フラックスの両方を含む。この研究において、細胞目的物は、バイオマス形成に必要とされる比率での生合成前駆体のドレーンであると仮定されることが多い、Νｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら、２ｎｄｅｄ．１９９６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭＰｒｅｓｓ．２ｖ．（ｘｘ，２８２２，ｌｘｘｖｉ）。これらのフラックスは、一般に、１ｇＤＷ・時（乾燥重量のグラム×時間）あたりで報告されるので、バイオマス形成は、生成されるバイオマスのｇ／ｇＤＷ・時または１／時として表される。

遺伝子欠失の、およびそれによる反応削除のモデリングは、先ず、制約に基づくアプローチフレームワークへの２値変数の組み込みを用いる、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，７４：３６４−３７５（２００１）、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，１７：７９１−７９７（２００１）。これらの２値変数、

は、反応ｊが活性である場合には１の値およびそれが不活性である場合には０の値を取る。次の制約、

は、変数ｙ_ｊが０に等しい場合にのみ反応フラックスν_ｊが０に設定されることを保証する。あるいは、ｙ_ｊが１に等しいとき、ν_ｊは、自由であって、下限ν_ｊ ^ｍｉｎと上限ν_ｊ ^ｍａｘの間の任意の値を取る。ここで、ν_ｊ ^ｍｉｎおよびν_ｊ ^ｍａｘは、上で説明したネットワーク制約に従ってすべての反応フラックスを、それぞれ、最小化および最大化することによって特定される、Ｍａｈａｄｅｖａｎら、ＭｅｔａｂＥｎｇ，５：２６４−７６（２００３）。

最適な遺伝子／反応破壊は、結果として得られるネットワークについての最適な増殖の解が対象となる化学物質を過剰生産するように活性反応のセット（ｙ_ｊ＝１）を選択する二層最適化問題を解くことによって特定される。化学量論的には、この二層最適化問題は、図２で示される。数学的には、この二層最適化問題は、次の二層混合整数最適化問題として表される：

この場合、ν_{ｃｈｅｍｉｃａｌ}は、所望のターゲット産物、例えばＬＣＡまたは他の生化学製品の生産であり、およびＫは、許容可能なノックアウトの数である。Ｋを０に等しいと設定することにより、完全ネットワークの最大バイオマスの解が返される一方で、Ｋを１に等しいと設定することにより、結果として得られるネットワークがその最大バイオマス収量を仮定して最大の過剰生産を伴うような、単一遺伝子／反応ノックアウト（ｙ_ｊ＝０）が特定されることに留意しなければならない。この最後の制約は、結果として得られるネットワークが最低バイオマス収量を満たすことを保証する。Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４：６４７−５７（２００３）は、モデルの式および解の手順のより詳細な説明を提供している。ＩＢＭＲＳ６０００−２７０ワークステーションで環境をモデリングする、ＧＡＭＳ、Ｂｒｏｏｋｅら、ＧＡＭＳＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９８）経由で入手できるＣＰＬＥＸ８．０、ＧＡＭＳ：ＴｈｅｓｏｌｖｅｒＭａｎｕａｌｓ．２００３：ＧＡＭＳＤｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを使用して、何百もの２値変数を含む問題をおおよそ数分から数時間で解くことができる。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、生化学的過剰生産のための有望な遺伝子破壊戦略を既に特定できており、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４：６４７−５７（２００３）、Ｐｈａｒｋｙａら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，８４：８８７−８９９（２００３）、代謝および調節モデリングフレームワークの将来の改善を当然包含する系統的フレームワークを確立する。

上で説明した二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のいずれの解も、破壊すべき１セットの代謝反応をもたらすであろう。そのセットの中のそれぞれの反応または代謝修飾の除去によって、その生物の増殖期中にＬＣＡを産物として得ることができる。これらの反応は公知であるので、二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する解は、その反応セットの中のそれぞれの反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子（単数または複数）ももたらすであろう。１セットの反応の特定およびそれぞれの反応に関与する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の特定は、一般に、酵素とコード遺伝子との関係を有する反応データベースとそれらの反応の相関によって遂行される自動プロセスである。

特定されると、増殖連動ＬＣＡ生産を達成するために破壊されることとなる反応のセットが、ターゲット細胞または生物において、そのセットの中のそれぞれの代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能破壊によって実行される。前に説明したように、この反応セットの機能破壊を達成するために特に有用な１つの手段は、それぞれのコード遺伝子の欠失によるものである。しかし、場合により、例えば、突然変異、調節領域、例えばプロモーター、もしくは調節因子のための結合部位の欠失を含む他の遺伝子異常によって、または多数の位置のいずれかでのコード配列のトランケーションによって、反応を破壊することが有益であることがある。遺伝子セットの完全に満たない欠失を生じさせるこれらの後者の異常は、例えば、産物連動の迅速な評価が望まれるとき、または遺伝子復帰変異が発生する可能性が低いとき、有用であり得る。

破壊すべき反応のさらなるセット、またはＬＣＡ、もしくは他の生化学物質の増殖連動生産を生じさせることができる代謝修飾のさらなるセットをもたらす、上で説明した二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する追加の生成解を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化方法を実行することができる。この方法は、整数カットと呼ばれる追加の制約をそれぞれの反復時に組み込みながら、上に例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復的に解くことによって行われる。整数カット制約は、産物の生合成を増殖に連動させる任意の前の反復において特定された反応のまさに同じセットをその解の手順が選択するのを有効に防止する。例えば、前に特定された増殖連動代謝修飾が、破壊に反応１、２および３を指定する場合には、次の制約が、同じ反応が後続の解において同時に考慮されることを防止する：ｙ_１＋ｙ_２＋ｙ_３≧１。この整数カット法は、当該技術分野において周知であり、例えば、参考文献、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，１７：７９１−７９７（２００１）に記載されているのを見つけることができる。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークとそれらの併用に関して本明細書に記載するすべての方法と同様に、反復コンピュータ計算解析における重複を減少させる整数カット法も、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙをはじめとする当該技術分野において周知の他のコンピュータ計算フレームワークと共に利用することができる。

上の形態の制約は、前に特定されたセットを含む、より大きな反応セットの特定を除外する。例えば、さらなる反復における上記整数カット最適化法の利用は、破壊に反応１、２および３を指定する四重反応セットの特定を、これらの反応は前に特定されているので、除外する。産物の増殖連動生産をもたらすすべての可能な反応セットを確実に特定するために、整数カット法の改良法を利用した。

簡単に言うと、この改良整数カット手順は、野生型ネットワークについての最適な増殖時の所望の生化学物質の最大生産を算出する反復「ゼロ」で開始する。このコンピュータ計算は、０に等しいＫを有するＯｐｔＫｎｏｃｋの解に対応する。次に、単一破壊を考え、２つのパラメータセット、ｏｂｊｅｓｔｏｒｅ_ｉｔｅｒおよびｙｓｔｏｒｅ_{ｉｔｅｒｊ}を導入して、それぞれの反復、ｉｔｅｒ、時に目的機能（ν_{ｃｈｅｍｉｃａｌ}）および反応オン−オフ情報（ｙ_ｊ）をそれぞれ蓄積する。その後、ＯｐｔＫｎｏｃｋ情報に次の制約をそれぞれの反復時に逐次的に加える：

上の方程式において、εおよびＭは、それぞれ、小さな数および大きな数である。一般に、εは、約０．０１に設定することができ、およびＭは、約１０００に設定することができる。しかし、これらの数より小さいおよび／または大きい数も用いることができる。Ｍは、その制約が、前に特定された破壊戦略についてしか拘束されないことを保証する一方で、εは、前に特定された戦略への破壊の追加が、最適な増殖時の生化学的生産の少なくともεの増加をもたらさなければならないことを保証する。このアプローチは、単一破壊が野生型株に対する改良に失敗すると必ず二重破壊に進む。いずれの二重破壊戦略も野生型株に改良を加えないときなどには三重破壊を考慮する。最終結果は、互いの破壊が少なくとも１つは異なる別個の破壊戦略の、最適増殖時の所望の生化学的生産として表される、ランク付けされたリストである。この最適化手順、ならびに破壊されると生化学物質の増殖連動生産をもたらす多種多様な反応セットの特定を、さらに下で、より詳細に例示する。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、本明細書に例示する方法および代謝経路が遺伝子工学で作り変えられる設計が、任意の生化学物質への細胞または微生物増殖の連動に適用できることは、当業者には理解されるであろう。

上に例示した方法を用いて、本発明の方法は、特定された遺伝子改変を有するように遺伝子工学で作り変えられた細胞または微生物の増殖にターゲット生化学物質の生産を連動させる細胞および微生物の構築を可能にする。これに関して、微生物増殖にＬＣＡの生産を強制的に連動させる代謝改変を特定した。特定された代謝改変を有する構築された微生物株は、指数増殖期中に高レベルのＬＣＡを生産する。これらの株は、前に説明した負の選択圧を受けない連続発酵プロセスでのＬＣＡの商業生産に有益に使用することができる。

従って、本発明の方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋから選択されたインシリコ法により特定される代謝修飾１セットを提供する。この代謝修飾セットは、例えば遺伝子欠失による破壊を含む、１つ以上の代謝反応の機能破壊を含む場合がある。ＬＣＡ生産についての代謝修飾は、表１に列挙する代謝修飾のセットから選択することができる。

ＬＣＡの安定した増殖連動生産を有する天然に存在しない微生物を生産する方法も提供する。この方法は、（ａ）指数増殖中にＬＣＡ生産を必要とする代謝修飾１セットをインシリコで特定すること；（ｂ）産物生産を必要とする代謝修飾のセットを有するように微生物を遺伝子修飾し、その遺伝子修飾された生物を培養することを含む。培養は、産物生産を必要とする条件下でその遺伝子修飾生物を適応進化させることを含み得る。本発明の方法は、細菌、酵母および真菌、ならびに様々な他の細胞および微生物に適用することができる。例示的細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａから選択される種が挙げられる。例示的真核生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ、およびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が挙げられる。

本発明の方法によって生産される微生物をさらに提供する。加えて、本発明は、ＬＣＡの増殖連動生産に関連した酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊を含む、およびこれらの産物の安定した増殖連動生産を示す、天然に存在しない微生物を提供する。本発明の天然に存在しない微生物は、酵素をコードする遺伝子において発生する１つ以上の遺伝子破壊を含み、この酵素は、前記遺伝子破壊がその酵素の活性を低下させると前記微生物の増殖にＬＣＡ生産を強制的に連動させるものであり、それによって、前記１つ以上の遺伝子破壊は、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの安定した増殖連動生産をもたらす。

前記天然に存在しない微生物は、表１に列挙する代謝修飾に含まれる１つ以上の遺伝子破壊を有し得る。前記１つ以上の遺伝子破壊は、欠失である場合がある。本発明の天然に存在しない微生物は、表１に列挙する代謝修飾を有する微生物の群から選択することができる。本発明の天然に存在しない微生物としては、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに利用できる様々な他の微生物の任意のものが挙げられる。例示的細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒ．ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰ．ｐｕｔｉｄａから選択される種が挙げられる。例示的真核生物としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が挙げられる。

増殖連動ＬＣＡ生産を有する微生物を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ遺伝的バックグラウンドに関して本明細書では例示する。しかし、３９５の微生物ゲノムならびに様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムを含めて、現在５５０を超える種について入手できる完全ゲノム配列（これらの半分より多くがＮＣＢＩなどの公的データベースで入手できる）を用いる、例えば、オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換をはじめとする１つ以上の遺伝子について代替種ホモログの特定、ならびに生物間の遺伝子改変の相互交換は、当該技術分野において常例的であり、周知である。従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどの特定の生物に関連して本明細書に記載するＬＣＡの増殖連動生産を可能にする代謝改変を、他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供する技術およびガイダンスを考慮すれば、ある生物において例示する代謝改変を他の生物に同等に適用できることは、当業者にはわかるであろう。

前に説明したように、相同体は、オーソログおよび／または非オーソログ遺伝子置換を含む場合がある。場合により、例えば、代替代謝経路が対象となる種に存在するとき、機能破壊を、例えば当該反応に取って代わる同一でないが類似した代謝反応を触媒するパラログの欠失によって、遂行することができる。異なる生物間での代謝ネットワーク間の一定の相違のため、異なる生物間で破壊される実際の遺伝子が異なり得ることは、当業者には理解されるであろう。しかし、本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、本発明の方法を、生物間のコグネイト代謝改変を特定するためにおよび増殖へのＬＣＡ生合成の連動を増進するであろう対象となる種の生物を構築するためにすべての生物に適用できることも当業者には理解されるであろう。

本明細書では、本発明を、一般には代謝反応、その反応物もしくは生成物に関して、または具体的には当該代謝反応、反応物もしくは生成物に関連した１つ以上の遺伝子に関して説明することとする。本明細書において別様にはっきりと述べられていない限り、反応への言及が、その反応の反応物および生成物への言及も構成することは、当業者には理解されるであろう。類似して、本明細書において別様にはっきりと述べられていない限り、反応物または生成物への言及は、その反応への言及でもあり、これらの代謝成分のいずれかへの言及は、当該反応、反応物または生成物を触媒する酵素をコードする遺伝子（単数または複数）への言及でもある。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知分野を考慮すれば、遺伝子への本明細書における言及は、対応するコードされた酵素およびそれを触媒する反応ならびにその反応の反応物および生成物への言及も構成する。前に説明したおよび下でさらに説明するように、ＬＣＡの増殖連動生産に関与する例示的反応、反応名、反応物、生成物、補因子、および反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を表２および３に示す。

本発明は、ＬＣＡの増殖連動生産を有する天然に存在しない微生物を提供する。細胞の代謝経路を遺伝子改変することにより、その微生物の指数増殖期に製品生産を強制的に連動させる。遺伝子改変が、所望の産物をその増殖期中の産物にする。高レベルのＬＣＡ生合成を生じさせる結果となる代謝改変または形質転換のセットをそれぞれ表１に例示する。セットの中のそれぞれの改変は、機能破壊されることとなる必要代謝反応に対応する。それぞれのセットの中のすべての反応の機能破壊は、遺伝子工学で作り変えられた株による増殖期中のＬＣＡの生産を生じさせる結果となる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおける当該改変に対応する反応およびそれらをコードする可能性がある遺伝子（単数または複数）を表２に示す。様々な代謝産物、それらの略語および位置を表３に示す。

例えば、表１に例示するそれぞれの株について、増殖連動ＬＣＡ生産のために起こすことができる遺伝子改変をそれぞれの列に示す。これらの改変は、１つから６つ以上の反応についての機能破壊を含む。詳細には、天然に存在しない代謝遺伝子型を有する９９５の株を表１に例示する。これらの天然に存在しない改変のそれぞれが、適切な培養条件下で、その微生物の指数増殖期中に野生型株と比較して向上したレベルのＬＣＡ生産を生じさせる結果となる。適切な条件としては、例えば、下の実施例Ｉにおいてさらに例示するもの、例えば特定の炭素源もしくは反応物の利用率および／または適応進化、が挙げられる。

本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、酵素反応を破壊するために、その反応に関与する１つ以上の酵素の触媒活性を破壊することが必要であることは、当業者には理解されるであろう。例えば、コード遺伝子の破壊またはコード遺伝子配列の１つ以上への遺伝子改変の組み込みをはじめとする様々な手段によって破壊を行うことができる。破壊のターゲットにされるコード遺伝子は、触媒活性に関与する酵素をコードする遺伝子の１つ、一部またはすべてであり得る。例えば、単一の酵素がターゲットの触媒活性に関与する場合、コードされた遺伝子産物の触媒活性を低下させるまたは破壊する遺伝子改変によって破壊を行うことができる。類似して、単一の酵素が、ヘテロマーのものを含めて多量体のものである場合、コードされた遺伝子産物の１つまたはすべてのサブユニットの機能を低下させるまたは破壊する遺伝子改変によって破壊を行うことができる。活性の破壊は、活性複合体を形成するための１つ以上のサブユニットの結合活性の喪失によって、多量体複合体の触媒サブユニットの破壊によって、または両方によって遂行することができる。多量体タンパク質会合および活性の他の機能をターゲットにして、本発明の代謝反応を破壊することもできる。そのような他の機能は、当業者には周知である。さらに、単一ポリペプチドまたは多量体複合体の機能の一部またはすべてを本発明に従って破壊して、本発明の反応または代謝修飾に関与する１つ以上の酵素の触媒活性を低下させるまたは無効にすることができる。類似して、ターゲットとする反応を低下させさえすればまたは破壊しさえすれば、本発明の反応または代謝修飾に関与する酵素の一部またはすべてを破壊することができる。

本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、共通の遺伝子によっておよび／または類似したまたは実質的に同じ活性を示すその遺伝子の１つ以上のオーソログによってコードされた反応を低下させるまたは除去することにより、酵素反応を破壊することができることも、当業者には理解されるであろう。共通遺伝子とすべてのオーソログの両方の減少が、ターゲット反応の任意の触媒活性の完全無効につながることもある。しかし、共通遺伝子または１つ以上のオーソログのいずれかの破壊が、増殖の産物生合成への連動を促進するために十分なターゲット反応の触媒活性の低下につながることもある。様々な代謝修飾についての触媒活性をコードする共通遺伝子とそれらのオーソログの両方を本明細書において例示する。ターゲット代謝反応の酵素をコードする遺伝子の一部またはすべての破壊を、本発明の方法において実施することができること、および本発明の天然に存在しない微生物に組み込んで増殖連動産物生産を達成することができることは、当業者には理解されるであろう。

ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおけるＬＣＡ生産の増加のために特定された設計を本明細書において下で説明する。ＯｐｔＫｎｏｃｋアルゴリズムによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ代謝の化学量論的モデルに基づく設計が特定された。仮定条件は、（ｉ）１０ｍｍｏｌ／ｇｄｗ／時のグルコース取り込み速度；（ｉｉ）嫌気性または微好気性条件；および（ｉｉｉ）３ｍｍｏｌ／ｇｄｗ／時の最小非増殖関連維持要件を含む。本発明の教示に従ってその生産を増殖に連動させることができる例示的長鎖アルコールとして、ドデカノール、Ｃ_１２分子を選択した。グルコースを増殖基質であると仮定したが、前記戦略をグルコース、スクロース、キシロース、アラビノースまたはグリセロールをはじめとする任意の基質に適用できることは理解される。増殖連動ＬＣＡ生産設計の完全セットを表１に列挙する。酵素名、それらの略語、および対応する反応化学量論を表２に列挙する。最後に、反応式中の略語に対応する代謝産物名を表３に列挙する。Ｅ．ｃｏｌｉ代謝の代謝モデルを用いてこれらの設計を特定し、表２に列挙する遺伝子名は、Ｅ．ｃｏｌｉに特有のものであるが、これらの代謝経路を遺伝子工学で作り変える戦略を選択する方法およびまた設計それら自体を任意のＬＣＡ生産性生物に適用することができる。従って、これらの設計は、長鎖アルコールの増殖連動生産を可能にするためにその活性を除去しなければならない、減弱しなければならない、または最初から微生物に不在でなければならない酵素的形質転換体の本質的なリストである。

設計の最終選択に優先順位をつけるための１つの基準は、ドデカノールの増殖連動収量であった。これを調査するために、（前の段落で説明したように）異なるバイオマス形成速度でドデカノール収量を先ず最大にし、その後、最小にすることによりそれぞれの戦略について生産コーンを構成した。突然変異体ネットワークのすべての可能な表現型の右端境界が単一の点である場合、それは、そのネットワークにおいて可能な最大バイオマス形成速度でその産物の独特の最適収量があることを含意する。他の場合、実現可能な表現型の右端境界が垂線であり、これは、最大バイオマスの点で、そのネットワークが、その垂線の最も下の点での最低量を含む算出範囲内のドデカノールの任意の量を作ることができることを意味する。そのような設計は、低位の優先順位となる。ここで、最高優先順位のＯｐｔＫｎｏｃｋ設計の短いリストを、表１の設計の部分集合を表す表Ｉに提供する。

本書類におけるすべての増殖連動設計は、エタノールおよび乳酸塩の形成をそれぞれ減少させるために、アセチルアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）活性の同時破壊を要する設計Ｉに基づく。０．２０Ｌ／時の最大増殖速度を達成すると、０．１４ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースのドデカノール収量に達すると予測される（設計Ｉ、図３）。設計ＩＩは、ＡＤＨＥｒ、ＬＤＨ＿Ｄおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＨＬｉ）の除去、減弱または不在を指定しており、図４に示すように最大増殖時に０．２８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースのドデカノール収量をもたらすと予測される。増殖へのＬＣＡ生産のより緊密な連動は、図４の設計ＩＩＩ〜Ｖの解の範囲によって示されるように、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ２）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）活性のさらなる破壊によって達成される。増殖への生産のさらにいっそう緊密な連動は、図４の設計ＶＩ〜ＸＩの解の範囲で示されるように、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）またはＮＡＤＰトランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）のさらなる破壊によって達成される。設計ＶＩ〜ＸＩは、最低量の細胞増殖を可能にするためにＬＣＡの有意でない収量、具体的には０．０５ｍｏｌドデカノール／ｍｏｌグルコースを事実上必要とする。

設計ＸＩＩは、酢酸塩、エタノールおよび乳酸塩の生産をそれぞれ防止するまたは減少させるために、ＡＤＨＥｒおよびＬＤＨ＿Ｄに加えてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）および／または酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）の破壊を要する。図５に示すように、１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／時のグルコース取り込み速度を仮定すると０．１６Ｌ／時の最大増殖速度に達するために０．２８ｍｏｌ／ｍｏｌのドデカノール収量を必要とする。設計ＸＩＩＩ〜ＸＶの解の範囲によって示されるように、ＦＲＤ２、ＦＵＭ、またはＭＤＨのさらなる破壊によって、増殖へのＬＣＡ生産のより緊密な連動が達成される。図６に示すように、設計ＸＶＩ〜ＸＶＩＩＩは、ＡＤＨＥｒおよびＬＤＨ＿Ｄに加えてＦＲＤ２、ＦＵＭまたはＭＤＨ活性の破壊が、設計Ｉと比較して、細胞増殖へのドデカノールのより緊密な連動をもたらす結果となることを明記する。設計ＸＩＸ〜ＸＸＩにおけるＡＴＰシンターゼ活性のさらなる破壊は、図６に示すように、０．１３Ｌ／時の最大増殖速度で０．３０ｍｏｌ／ｍｏｌのドデカノール収量を生じさせる結果となると予測される。この活性の破壊は、微生物をエネルギー生成について強制的にＭＩ−ＬＣＡ経路に依存させる。従って、設計ＸＩＸ〜ＸＸＩでは生物が列挙する活性を欠くと仮定するといずれの増殖を達成するにも０．０５ｍｏｌ／ｍｏｌの最低ドデカノール収量が必要とされる。

以下の実施例において例証するように、設計Ｉ〜ＸＸＩによって列挙されるものに加えて一定の活性の破壊がさらにいっそう高い生産収量をもたらすことができることは理解される。設計Ｖ＿Ａは、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）、Ｌ−アスパルターゼ（ＡＳＰＴ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨｙ）、およびジヒドロキシアセトンホスホトランスフェラーゼ（ＤＨＡＰＴ）の破壊を含む。ＭＩ−ＬＣＡ経路を追加すると、これらの活性の破壊を有する遺伝子工学で作り変えられた株は、０．０２Ｌ／時の最大増殖速度で０．３２７ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースの増殖連動ドデカノール収量を有すると予測される（図７、点Ａ）。これは、０．３３３ｍｏｌドデカノール／ｍｏｌグルコースの最大理論収量の９８％に相当する。そのような株の最大増殖速度は、野生型株のおおよそ１０％であると予測されるが、増殖には０．０９ｍｏｌ／ｍｏｌの最低ドデカノール収量が必要とされる（図７、点Ｂ）。これらの機能性の活性低下を有する組み換え株を一段階で構築することもでき、または後続の段階で例えば各段階で２〜３の活性を破壊することによって構築することもできる。例えば、ＡＤＨＥｒおよびＬＤＨ＿Ｄ活性をコードする遺伝子を先ず除去することによって増殖連動ＬＣＡ生産のためにＥ．ｃｏｌｉを遺伝子工学で作り変えることができ、これは、結果として設計Ｉになる。次に、ＭＤＨおよびＰＦＬｉ活性の原因となる遺伝子をさらに欠失させることによって設計Ｖを構成する。次に、ＡＳＰＴ、ＰＹＫ、Ｇ６ＰＤＨｙおよびＤＨＡＰＴ活性をコードする遺伝子を欠失させることによって設計Ｖ＿Ａを構成する。最後に、破壊のために幾つかの活性（すなわち、６−ホスホグルコノールアセトナーゼ（ＰＧＬ）、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ＰＧＤＨＹ）、または２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（ＥＤＡ））をＧ６ＰＤＨｙの代わりに用い、設計Ｖ＿Ａと同じ特徴を生じさせることができる。

設計ＸＩＩ＿Ａは、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）および／またはホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ）（ＧＬＵＤｙ）、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤＨ）、およびグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）の破壊を含む。設計ＸＩＩ＿Ｂは、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥｒ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ＿Ｄ）、酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）および／またはホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ）（ＧＬＵＤｙ）、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、およびＰＥＰ：ＰｙｒＰＴＳによるＤ−グルコース輸送（ＧＬＣｐｔｓ）の破壊を含む。ＭＩ−ＬＣＡ経路を加えると、設計ＸＩＩ＿Ｂによって指定される活性を欠く遺伝子工学で作り変えられた株は、０．０４Ｌ／時の最大増殖速度で０．３２２ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースの増殖連動ドデカノール収量を有すると予測される（図８、点Ａ）。これは、０．３３３ｍｏｌドデカノール／ｍｏｌグルコースの最大理論収量の９７％に相当する。そのような株の最大増殖速度は、野生型株のおおよそ２０％であると予測されるが、増殖には０．０５ｍｏｌ／ｍｏｌの最低ドデカノール収量が必要とされる（図８、点Ｂ）。これらの機能性の活性低下を有する組み換え株を一段階で構築することもでき、または後続の段階で例えば各段階で追加の活性を除去することによって構築することもできる。例えば、ＡＤＨＥｒおよびＬＤＨ＿Ｄ活性をコードする遺伝子を先ず除去することによって増殖連動ＬＣＡ生産のためにＥ．ｃｏｌｉを遺伝子工学で作り変えることができ、これは、結果として設計Ｉになる。次に、ＰＴＡｒおよびＡＣＫｒ活性をコードする遺伝子をさらに欠失させることによって設計ＸＩＩを構成する。次に、ＧＬＵＤｙ、ＰＧＤＨおよびＰＧＩ活性の原因となる遺伝子を欠失させることによって設計ＸＩＩ＿Ａを構成する。最後に、ＧＬＣｐｔｓ活性に必須の遺伝子をさらに欠失させることによってＸＩＩ＿Ｂを構成する。

従って、本発明は、天然に存在しない微生物であって、該生物の増殖にＬＣＡ生産を連動させる代謝修飾１セットを有する生物も提供し、前記代謝修飾のセットは、アセチルアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを含むタンパク質をコードする遺伝子のセットから選択される１つ以上の遺伝子の破壊を含む。

本発明は、上で設計Ｉについて列挙した活性を欠く株であって、次の活性のうちの少なくとも１つをさらに欠く、設計ＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩによって例示されるような株も提供する：ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬｉ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡｒ）、酢酸キナーゼ（ＡＣＫｒ）、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ２）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）。

さらなる実施形態において、本発明は、上で設計ＩＩについて列挙した活性を欠き、さらに次の活性のうちの少なくとも１つを欠く、設計ＩＩＩ、ＩＶおよびＶによって例示されるような株を提供する：フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ２）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）。

尚、さらなる実施形態において、本発明は、上で設計ＩＩＩ、ＩＶまたはＶについて列挙した活性を欠き、さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＵＤｙ）活性を欠く、設計ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩによって例示されるような株を提供する。

本発明は、上で設計ＩＩＩ、ＩＶまたはＶについて列挙した活性を欠き、さらに。ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（ＴＨＤ２）活性を欠く、設計ＩＸ、ＸおよびＸＩによって例示されるような株も提供する。

尚、さらなる実施形態において、本発明は、上で設計ＸＩＩについて列挙した活性を欠き、さらに次の活性のうちの少なくとも１つを欠く、設計ＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶによって例示されるような株を提供する：フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ２）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）。

最後に、本発明は、上で設計ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩについて列挙した活性を欠き、さらにＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰＳ４ｒ）活性を欠く、設計ＸＩＸ、ＸＸおよびＸＸＩによって例示されるような株を提供する。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＬＣＡ生産を増加させるために特定された経路を本明細書において下で説明する。本明細書において下でさらに説明するＯｐｔＫｎｏｃｋアルゴリズムによって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ代謝の化学量論的モデルに基づいて設計が特定された。仮定条件は、（ｉ）１０ｍｍｏｌ／ｇｄｗ／時のグルコース取り込み速度；（ｉｉ）嫌気性または微好気性条件；および（ｉｉｉ）３ｍｍｏｌ／ｇｄｗ／時の最小非増殖関連維持要件を含む。本発明の教示に従ってその生産を増殖に連動させることができる例示的長鎖アルコールとして、ドデカノール、Ｃ_１２分子を選択した。グルコースを増殖基質であると仮定したが、前記方法をグルコース、スクロース、キシロース、アラビノースまたはグリセロールをはじめとする任意の基質に適用できることは理解される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ代謝の代謝モデルを用いてこれらの設計を特定したが、遺伝子工学で作り変える代謝経路を選択する方法およびまた設計それら自体を任意のＬＣＡ生産性真核生物に適用することができる。従って、これらの設計は、長鎖アルコールの生産を可能にするためにその活性除去しなければならない、減弱しなければならない、またはその活性が最初から微生物に不在でなければならない酵素的形質転換体の本質的なリストである。

経路の最終選択に優先順位をつけるための１つの基準は、ドデカノールの収量である。これを調査するために、異なるバイオマス形成速度でドデカノール収量を先ず最大にし、その後、最小にすることによって経路のそれぞれのセットについて生産コーンを構成した。突然変異体ネットワークのすべての可能な表現型の右端境界が単一の点である場合、それは、そのネットワークにおいて可能な最大バイオマス形成速度でその産物の独特の最適収量があることを含意する。他の場合、実現可能な表現型の右端境界が垂線であり、これは、最大バイオマスの点で、そのネットワークが、その垂線の最も下の点での最低量を含む、算出範囲内のドデカノールの任意の量を作ることができることを意味する。そのような設計は、低位の優先順位となる。

本発明の生物は、本明細書において下でさらに詳述するような実質的に嫌気性の培養基または微好気性培養基において培養することができる。そのような生物は、一部の実施形態では完全な欠失を含むことがある１つ以上の遺伝子破壊、または完全遺伝子のフラグメントによってコードされた機能性部分の除去もしくは変更による破壊を有する。

一部の実施形態において、本発明は、サイトゾルにおいてＬＣＡを生産する天然に存在しない真核微生物を提供する。本明細書においてサイトゾルはミトコンドリアの外側の任意のコンパートメントを指すことに留意すること。そのような実施形態において、酵素をコードする真核生物における１つ以上の遺伝子破壊は、例えば、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼを含む。これらの酵素をコードする例示的遺伝子としては、例えば、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲＯ８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＮＬ０７１Ｗ、ＹＥＲ１７８Ｗ、ＹＢＲ２２１Ｃ、ＹＧＲ１９３Ｃ、ＹＦＬ０１８Ｃ、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗが挙げられる。

酵素をコードする他の遺伝子破壊は、例えば、同様に果たされ得るサイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を含む。後ろのほうのものの例示的遺伝子としては、例えば、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃが挙げられる。

これらの微生物は、例えばアセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ−形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化性アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼをはじめとする酵素をコードする外因性核酸またはそれらの対応する遺伝子調節領域もサイトゾルに含むことがある。サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸も組み込むことができる。一部の実施形態において、これらの遺伝子産物は、サイトゾルにおいて天然に発現されることがあるが、他の実施形態では、それらを、例えば、同じ源からのもしくは他の生物からの遺伝子のコピーを追加することによって、または遺伝子調節領域を導入するまたは変更することによって、過発現させることができる。そのような遺伝子調節領域としては、例えば、遺伝子発現を増進させるための代替プロモーター、誘導プロモーター、変異プロモーターまたはエンハンサーが挙げられる。リプレッサーおよび／またはサイレンサーなどの負の調節要素の機能破壊も、遺伝子発現の増進に利用することができる。類似の修飾を翻訳調節領域に対して行ってポリペプチド合成を増進させることができ、それらの修飾としては、例えば、リボソーム結合部位の最適もしくはコンセンサス配列での置換、および／または二次構造の除去が挙げられる。

これらの生物は、ドデカノール生産のためにアセチルＣｏＡ、ＡＴＰおよび還元等価物（ＮＡＤＨ）の利用率を最大にする。アセチルＣｏＡは、提案するＭＩ−ＬＣＡ経路によるＬＣＡの生産のための主炭素前駆体である。マロニル−ＣｏＡ非依存性経路によるドデカノールの形成を可能にする反応のすべてが、サイトゾルにおいて作動する。具体的には、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、およびエノイル−ＣｏＡレダクターゼが適切な方向に作用してアシルＣｏＡを形成し、その後、それが、アシルＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼによって脂肪アルデヒドおよびドデカノールに還元される。

サイトゾルにおけるＭＩ−ＬＣＡ経路の導入は、インシリコでは天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼによる一切のフラックスを防止した。嫌気性条件下、および培地中のグルコース濃度が高い状態では、このミトコンドリア酵素の能力は非常に制限され、それを通る有意なフラックスはない。しかし、一部の実施形態では、この酵素を欠失または減弱させてＬＣＡ生産を増加させることができる。

１つの実施形態において、サイトゾルにおけるＬＣＡ生産は、ＡＭＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンセターゼを用いる。サイトゾルにおけるドデカノール生産は、ＬＣＡ生産の際に必要とされる前駆体を供給するために天然細胞機械に依存する。解糖系によって生成されるピルビン酸塩フラックスの大部分は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびＡＭＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンセターゼから成るピルビン酸デヒドロゲナーゼバイパスを経由してアセチルＣｏＡの形成に向けられる（図９ａ）。このバイパスは、高いグルコース濃度で好気性条件下ででさえそれを通る有意なフラックスを有すると報告されている（Ｐｒｏｎｋら、Ｙｅａｓｔ１２：１６０７−１６３３（１９９６））。

酢酸塩をアセチル−ＣｏＡに変換するバイパスの最終段階は、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２遺伝子によってコードされるアセチル−ＣｏＡシンセターゼによって触媒される。ＡＣＳ２は、グルコースを用いて構成的に発現され、数あるコンパートメントの中でもサイトゾルに存在するので、一部の実施形態では、天然に存在しない真核生物を遺伝子工学で作り変えてＡＣＳ２を過発現させる。他の実施形態では、翻訳後修飾を受けない、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＡＣＳ１またはＡＣＳ２と比較して高い活性を有する、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｅｎｔｒｉｃａ（ＧｅｎｂａｎｋｉｄＮＰ＿８０７７８５．１）からの突然変異体ＡＣＳ（Ｓｈｉｂａら、ＭｅｔａｂＥｎｇ．９：１６０−１６８（２００７））を、ＡＣＳ２遺伝子の代わりに用いる。

ＡＭＰ生成性アセチルＣｏＡシンセターゼは、酢酸塩のそれぞれの分子のアセチルＣｏＡへの変換のために二ＡＴＰ当量を用いる（ＣｏＡ＋酢酸塩＋ＡＴＰ→アセチル−ＣｏＡ＋ＰＰｉ＋ＡＭＰ）。嫌気性条件下、エネルギーが、基質レベルリン酸化によってしか入手できないとき、ＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼによるドデカノールの生産は、エネルギー的に好適ではない。従って、そのエネルギー要求量を満たし、同時に酢酸塩のアセチルＣｏＡへの変換を増加させるために、細胞が少量の酸素を利用できるようにする。

エタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼを破壊してアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＨＤがエタノール生産に使用されることを防止することによって、ドデカノールの生産を向上させることができる。加えて、ＬＣＡの生産は、電子輸送呼吸鎖においてＮＡＤＨが使用されることを防止することから恩恵を受ける。従って、一部の実施形態では、ミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル（サイトゾルＮＡＤＨ結合グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび膜結合グリセロール−３−リン酸：ユビキノンオキシドレダクターゼから成る）（Ｂａｋｋｅｒら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２５：１５−３７（２００１））および外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの破壊を導入する。さらに、ドデカノール生産からＮＡＤＨをことによると引き離すことがあるサイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼも破壊する。これらの破壊を負わせた後の増殖連動生産エンベロープを図９ｂに濃灰色で示し、好気性条件下でのドデカノール生産の特徴と比較する。

一部の実施形態において、前記天然に存在しない真核生物には、ＡＤＰ形成性酢酸ＣｏＡリガーゼをコードする外因性遺伝子が組み込まれている。この実施形態において、サイトゾル中のＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼは、ＡＤＰ形成性酢酸ＣｏＡリガーゼによって置換される（ＣｏＡ＋酢酸塩＋ＡＴＰ→アセチル−ＣｏＡ＋Ｐｉ＋ＡＤＰ）（図１０ａ）。酢酸ＣｏＡリガーゼを導入するための外因性遺伝子としては、例えば、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのａｃｄＡおよびａｃｄＢが挙げられる（Ｇｌａｓｅｍａｃｈｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：５６１−５６７（１９９７））（ＭａｉおよびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５８９７−５９０３（１９９６））。（２ＡＴＰ当量とは対照的に）アセチルＣｏＡのそれぞれの分子の形成のために１当量のＡＴＰを使用するこの酵素の導入は、エネルギー的に中立であるドデカノールの生産を可能にする。この実施形態では、少量の酸素または他の電子受容体呼吸を用いてエネルギーを生じさせて増殖を支援する。下でさらに説明するように、そのような少量の酸素を微好気性条件と呼ぶ。一部の実施形態では、エタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼを破壊して、エタノール形成を防止する。ＣｏＡリガーゼを組み込む実施形態では、次のノックアウトのうちの１つ以上をＬＣＡ生産に導入することができる：サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。これらの破壊を負わせた後の増殖連動生産を図１０ｂに濃灰色で示す。黒色曲線は、好気性条件下での野生型株についての生産エンベロープを示し、および薄灰色曲線は、そのネットワークを酢酸−ＣｏＡリガーゼで増加させたときのエンベロープを示す。この酵素の導入後のドデカノールの最大理論収量の増加に留意すること。

一部の実施形態において、前記天然に存在しない真核生物には、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする外因性遺伝子が組み込まれている。ドデカノールプロセスのエネルギー特性の改善は、アセトアルデヒドのアセチルＣｏＡへの変換のためのアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの使用（アセトアルデヒド＋ＣｏＡ＋ＮＡＤ→アセチル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ）によって果たすことができる（図１１ａ）。この酵素を使用する利点は、（ｉ）アセチルＣｏＡの生産にエネルギーを一切費やさない点、および（ｉｉ）形成されるアセチルＣｏＡの分子ごとにＮＡＤＨの分子１個が形成される点である。従って、アセチルＣｏＡの生産に必要とされる還元等価物も生成され得る。この酵素の導入は、嫌気性条件下でＬＣＡの生産を可能にする。

アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｏｏｄｉｉ（ＭａｉおよびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５８９７−５９０３（１９９６））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ１０５：２１２８−２１３３（２００８）；ＳｍｉｔｈおよびＫａｐｌａｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０３：６６３−６７５（１９８０））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（Ｙａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ５６：２５９１−２５９９（１９９０））をはじめとする幾つかの細菌において、および株ＣＦ６００などのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種（Ｌｅｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４７：６８７０−６８８２（２００８）；Ｍａｎｊａｓｅｔｔｙら、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：５８２−５８５（２００１））において報告されている。遺伝子のＧｅｎｂａｎｋｉｄを下の表５に示す。

一部の実施形態において、上の株のそれぞれに追加の破壊を補足することができる。あるいは、増殖条件下で有意な活性を有することが知られていない一部の他の酵素が、適応進化またはランダム突然変異誘発のために活性になることがあり、ならびに破壊されることもある。

ドデカノール（または任意のＬＣＡ）の嫌気性増殖連動生産は、エタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼ活性を破壊することによって遂行することができる。アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの、その好適なエネルギー特性での、導入は、天然アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアセチル−ＣｏＡシンセターゼによる炭素フラックスを防止または減少させる。この生産エンベロープを図１１ｂに示す。野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（黒色）ネットワークは、嫌気性条件下での増殖の副産物としてほんの少量のドデカノールを形成することができる。アシル化性デヒドロゲナーゼでこのネットワークを増加させると、このネットワークの理論最大収量の増加はあるが、増殖連動は観察されない（薄灰色の点線の曲線）。しかし、増加されたネットワークからのエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼの破壊は、ドデカノール生産がそのネットワークにおける最大可能バイオマスで増殖に連動されることを示す（濃灰色曲線）。

一部の実施形態において、前記天然に存在しない真核生物は、ドデカノール生産にサイトゾルピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いる。ＭＩ−ＬＣＡ経路の前駆体を生成するためのサイトゾルピルビン酸デヒドロゲナーゼを図１２に示す。そのような実施形態では、（ｉ）ピルビン酸塩は、エネルギー消費を伴わずにサイトゾルにおいてアセチルＣｏＡに直接変換され、および（ｉｉ）細胞は、より多くの還元等価物を利用することができる。

一部の実施形態では、天然ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼをサイトゾルに再びターゲッティングするように、前記天然に存在しない真核生物を遺伝子工学で作り変える。他の実施形態では、異種サイトゾル酵素を前記生物に導入する。異なるコンパートメントへの酵素の再ターゲッティングは、そのタンパク質のターゲッティング配列を変更することによって遂行することができる（ｖａｎＬｏｏｎおよびＹｏｕｎｇ，ＥＭＢＯＪ．５：１６１−１６５（１９８６））。天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼの破壊によって、サイトゾルピルビン酸デヒドロゲナーゼによるプロセッシングのために炭素フラックスの大部分をサイトゾルに導入することができる。これは、嫌気性条件下でのドデカノールの生産も可能にする。この増殖連動生産エンベロープは、図１１ｂに示すものに類似している。このネットワークではアルコールデヒドロゲナーゼの代わりにピルビン酸デカルボキシラーゼを破壊して増殖連動を達成することに留意すること。

一部の実施形態において、前記天然に存在しない真核生物は、サイトゾルピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼを用いる。ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼは、図１３に示すようにサイトゾルにおけるアセチルＣｏＡおよび還元等価物の生産を可能にする。この酵素の付加によって、そうでなければアセチルＣｏＡシンターゼによって必要とされたであろうエネルギーを消費することなく、アセチルＣｏＡを生産することができる。この酵素は、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓのミトコンドリアから精製されたものであり、酸素感受性である（Ｉｎｕｉら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９６：９３１−９３４（１９８４）；Ｉｎｕｉら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２３７：４２３−４２９（１９８５）；Ｉｎｕｉら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２７４：４３４−４４２（１９８９）；Ｉｎｕｉら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２８０：２９２−２９８（１９９０））。それは、ピルビン酸塩からアセチルＣｏＡを生成し、同時にＮＡＤＰＨを生産するために用いられる。対応する遺伝子は、ｐｎｏであり、そのＧｅｎｂａｎｋｉｄは、ＣＡＣ３７６２８．１である。ミトコンドリアターゲッティング配列を除去することによって、それをサイトゾルにターゲッティングすることができる。一部の実施形態では、トランスヒドロゲナーゼも付加する。この酵素をＥ．ｃｏｌｉなどの生物から外因性遺伝子として導入して、生成されたＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換することができる（Ｎｉｓｓｅｎら、Ｙｅａｓｔ１８：１９−３２（２００１））。

その低いＡＴＰ必要量のため、この経路は、嫌気性条件下でさえエネルギー的に好適である。エタノール生産へのＮＡＤＨおよびピルビン酸塩の利用を防止または減少させるために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を破壊することができる。これは、図１１ｂに示すものに類似したドデカノールの増殖連動生産につながる。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、ピルビン酸ギ酸リアーゼを利用する。そのような実施形態では、図１４に示すように、異種サイトゾルピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）を用いて、アセチルＣｏＡとＮＡＤＨの両方を生成する。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの生物において典型的には嫌気性条件下で活性である。ピルビン酸塩のアセチルＣｏＡへの変換のためのエネルギー要求量の不足が、嫌気性条件下でのドデカノール生産を可能にする。

ピルビン酸塩のアセチルＣｏＡへの変換は、ギ酸塩の生産によって遂行される。これは、天然ギ酸デヒドロゲナーゼによって代謝され、その結果、化学量論量の還元等価物の追加の生成をもたらす。この株設計を用いる一部の実施形態では、３つのピルビン酸デカルボキシラーゼ、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６のうちの１つ以上を破壊することができる。ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする例示的遺伝子のＧｅｎｂａｎｋｉｄを下の表６に示す。

このネットワークにおける異種ピルビン酸ギ酸リアーゼの導入と共にピルビン酸デカルボキシラーゼの破壊が、ドデカノールの増殖連動生産をもたらす。その生産曲線は、図１１ｂに示すものに類似している。

上で説明した天然に存在しない真核生物は、サイトゾルにおいてＬＣＡを生産するが、ミトコンドリアにおいてＬＣＡを生産することも可能である。ドデカノール生産の方への炭素フラックスの分配のための例示的設計を本明細書において下で詳述する。ミトコンドリアにおいてＬＣＡを生産する生物は、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼなどの酵素をコードする遺伝子の１つ以上の破壊を含む。これらの遺伝子をコードする例示的遺伝子としては、例えば、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗが挙げられる。

他の遺伝子破壊としては、サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒される、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルなどの酵素をコードするものが挙げられる。後者の例示的遺伝子としては、例えば、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃが挙げられる。

ミトコンドリアにおいてＬＣＡを生産する生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリアーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼなどの酵素をコードする外因性核酸または上で説明したようなそれらの対応する遺伝子調節領域も含むことがある。加えて、そのような生物は、サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための増強されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムから恩恵を受ける。そのような生物に挿入することができる酵素をコードする他の外因性核酸としては、トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびピルビン酸オキシダーゼ（すべて、ミトコンドリアにおけるもの）、またはそれらの対応する遺伝子調節領域が挙げられる。

１つの実施形態では、前記天然に存在しない真核生物においてミトコンドリアピルビン酸デカルボキシラーゼが用いられる。これは、図１５ａに示すようにアセチルＣｏＡとＮＡＤＨの両方を生産する天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼである。この経路によるピルビン酸塩のアセチルＣｏＡへの変換にはエネルギー要求量がないので、デカノールの生産は、例えば、嫌気性条件下でさえエネルギー的に好適である。

ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて好気性条件においても嫌気性条件においても活性であることは公知である（Ｐｒｏｎｋら、Ｙｅａｓｔ１２：１６０７−１６３３（１９９６））。一部の実施形態において、この酵素をその天然形態でまたは異種形態で過発現される。より強いプロモーターを用いることにより、天然酵素を過発現させることができる。加えて、嫌気性条件下でのその活性を増加させる目的で突然変異を誘発することができる（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：３８５１−３８５８（２００８））。サイトゾルにおいて生成される還元等価物を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに存在するレドックスシャトルを使用することにより、ミトコンドリアにおけるドデカノール生産に利用することができる。これらのシャトルが呼吸条件下でのエネルギー生成のためにＮＡＤＨをミトコンドリアに輸送すること（Ｏｖｅｒｋａｍｐら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：２８２３−２８３０（２０００））に留意すること。増殖連動生産のために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を破壊して、ピルビン酸塩フラックスをピルビン酸デヒドロゲナーゼのほうに向けてエタノール形成を阻害することができる。この突然変異体ネットワークについての生産曲線を図１５ｂに示す。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、異種ピルビン酸：ＮＡＤＰ−オキシドレダクターゼを用いる。ミトコンドリアにおけるドデカノールの生産は、図１６に示すようにミトコンドリアにおけるピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼの導入によって達成することができる。この酵素は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓから精製される。この酵素は、ミトコンドリア中に自然に存在し、嫌気性条件下で活性であるので、嫌気性条件下でこの酵素の高い活性を得ることができる。この酵素の導入は、ドデカノール生産のための前駆体アセチルＣｏＡおよびまた還元等価物を生じさせる。この酵素によって生成されたＮＡＤＰＨは、トランスヒドロゲナーゼによってＮＡＤＨに変換され、それをミトコンドリアに導入することができる。追加の還元等価物ために、レドックスシャトルは、サイトゾルからミトコンドリアにＮＡＤＨを輸送する必要がある。この酵素を用いるＬＣＡの増殖連動生産は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの破壊によって達成することができる。その突然変異株の生産曲線は、図１５ｂに示すものに非常に類似している。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、異種ピルビン酸ギ酸リアーゼを用いる。ミトコンドリアにおけるピルビン酸ギ酸リアーゼを用いるドデカノールの生産を図１７に示す。これらの遺伝子は、本明細書において上で概説した。そのような実施形態では、天然ギ酸デヒドロゲナーゼをミトコンドリアに再びターゲッティングして、ギ酸塩のさらなる代謝およびさらなる還元等価物の生成を可能にする。この株を採用して、酸素不在の状態でミトコンドリアにおいてＬＣＡの高い収量および生産性を維持するために十分なフラックスを有することができる。

嫌気性増殖条件は、この株設計を用いるドデカノールの生産に適している。レドックスシャトルを過発現させて、サイトゾルにおいて生成されたＮＡＤＨをミトコンドリアに輸送することができる。このシナリオでの生産は、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を破壊することによって実行できる。この突然変異株の生産特性は、図１５ｂに示すものに類似している。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、異種アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化性）を用いる。そのような実施形態では、図１８に示すように、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをミトコンドリアに導入して、アセチル−ＣｏＡとＮＡＤＨの両方をＬＣＡの生産に供する。一部の実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイムをミトコンドリアに再びターゲッティングして、ピルビン酸塩をアセトアルデヒドに変換する。ミトコンドリアにおけるこれら２つの活性の発現は、ピルビン酸ヒドロゲナーゼの活性と等価である。その増殖連動生産曲線は、図１５ｂに示すものと同じである。一部の実施形態において、この増殖連動生産株は、破壊された天然ミトコンドリアアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｐｒｏｎｋら、Ｙｅａｓｔ１２：１６０７−１６３３（１９９６））およびサイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼを有する。他の実施形態では、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を防止するために、ミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼも破壊される。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、ミトコンドリアアセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ−形成性）を用いる。上で論じたように、この酵素の発現は、好適なエネルギー特性のために酸素を必要とする。アセチルＣｏＡシンセターゼのアイソザイムであるＡＣＳ１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて好気性条件下ではミトコンドリアにおいて発現されるが、グルコースによって抑制される。この酵素は、導入することができる対象となる条件下で発現される抑制または異種酵素を除去するように突然変異させることができる。加えて、ピルビン酸デカルボキシラーゼをミトコンドリアにおいて発現させて、酢酸塩を形成することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ミトコンドリアアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを既に有している（Ｐｒｏｎｋら、Ｙｅａｓｔ１２：１６０７−１６３３（１９９６））。あるいは、ピルビン酸オキシダーゼなどの酵素を異種発現させて、ピルビン酸塩を酢酸塩に変換することができる。１つのそのような酵素候補は、Ｅ．ｃｏｌｉからのピルビン酸オキシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋｉｄ：ＮＰ＿４５１３９２．１）である。この酵素は、酸素が存在する状態で自然に発現される。

この株設計を用いるＬＣＡの生産は、次の破壊される酵素の１つ以上から恩恵を受ける：サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。グリセロール−３−リン酸シャトルは、サイトゾルグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび膜結合グリセロール−３−リン酸：ユビキノンオキシドレダクターゼから成り、後者もミトコンドリアグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとして機能する。一部の実施形態にでは、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を防止するまたは減少させるために、ミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼも破壊する。このネットワークに加えられるミトコンドリアピルビン酸デカルボキシラーゼを有する野生型株についての生産曲線を図１９ｂに黒色で示す。この曲線は、好気性条件について示すものである。上述の破壊をこのネットワークに負わせたときの生産特性を薄灰色で示す。ペントースリン酸経路の酸化部分、特に委任段階、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのダウンレギュレーションは、そのネットワークのＬＣＡ生産特性をさらに向上させる。

一部の実施形態において、天然に存在しない真核生物は、ミトコンドリア酢酸ＣｏＡリガーゼ（ＡＤＰ形成性）を用いる。ミトコンドリアＬＣＡ生産は、図２０に示すように酢酸−ＣｏＡリガーゼを使用して酢酸塩をアセチル−ＣｏＡに変換することによっても遂行することができる。上で説明したように、この酵素の使用はエネルギー的に好適であり、ＬＣＡ生産は酸素が供給されない限りエネルギー的に中立である。そのような実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼのミトコンドリア発現が用いられる。ＬＣＡ生産は、サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、および内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの破壊を負わせることによって達成される。ペントースリン酸経路の酸化部分のダウンレギュレーションは、その増殖連動生産特性をさらに向上させて、図１９ｂに示すものに類似した生産曲線を生じさせる。一部の実施形態では、アルデヒドのエタノールへの変換を防止するまたは減少させるために、ミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼも破壊される。

本明細書に記載する設計戦略は、長鎖アルコールの生産をエネルギー生成および／またはレドックス均衡に結び付けるため、増殖連動生産の増進に有用であるばかりでなく、非増殖連動生産にもよく適する。

例示的非増殖連動生産方法は、好気性増殖期、その後の嫌気性生産期の実施を含む。例えば、Ｖｅｍｕｒｉら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（６）：３２５−３３２，（２００２）には、Ｅ．Ｃｏｌｉにおけるコハク酸塩の生産のための二相プロセスが記載されている。Ｏｋｉｎｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅｐ６．（２００８）［現在、オンライン版で入手可能］には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の株における類似の非増殖連動生産プロセスが記載されている。

もう１つのそのような方法は、増殖細胞培養物に必須栄養素を与えずにおき、それによって増殖を制限することを含むが、Ｄｕｒｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（８）：３４０８−３４１４（２０００）に記載されているような生産を含まない。生産から増殖を切り離すことを目的とするさらにもう１つの戦略は、Ａｌｔａｍｉｒａｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：３５１−３６０（２００１）に記載されているようなよりゆっくりと代謝することができる別の化合物での増殖基質の置換を含む。増殖を切り離した生産形式は、Ｂｌｏｍｂａｃｈら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：４７１−９（２００８）に記載されているような特定の遺伝子修飾によって行うこともできる。

ＬＣＡ生産が可能な一部の微生物をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ遺伝的バックグラウンドに関して本明細書では例示する。しかし、３９５の微生物ゲノムならびに様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムを含めて、現在５５０を超える種について入手できる完全ゲノム配列（これらの半分より多くがＮＣＢＩなどの公的データベースで入手できる）を用いる、例えば、オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換を含む１つ以上の遺伝子について代替種ホモログの特定ならびに真核生物間の遺伝子改変の相互交換は、当該技術分野において常例的であり、周知である。従って、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｉｅなどの特定の生物に関連して本明細書に記載するＬＣＡ生産を可能にする代謝改変を、他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、ある生物において例示する代謝改変を他の生物に同様に適用できることは、当業者にはわかるであろう。

本発明の方法は、酵母および真菌などの様々な真核生物に適用することができる。酵母としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＲｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓを挙げることができる。例示的真核種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、ＣａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓから選択されるものが挙げられる。加えて、より大きな真核生物からの選択細胞も本発明の方法に利用することができる。

幾つかの方法を用いて遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入することができ、これらの方法の一部は、プラスミドに基づくものであるが、他のものは、染色体における遺伝子の組み込みを可能にするものである。後者のアプローチは、組み込みプロモーターに基づく発現ベクター、例えば、ＧＡＰプロモーターに基づくｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαベクターを利用する。前記発現ベクターは、耐性マーカーの除去および再循環を可能にするｌｏｘＰ部位が隣接するＫａｎＭＸカセットに加えて、ＧＡＰプロモーター、組み込みのためのＨＩＳ４野生型対立遺伝子およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの３’ＡＯＸ転写末端領域を構成する。前記ベクターは、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎから市販されている。これについての詳細は、下の実施例において詳しく述べる。

遺伝子工学で作り変えた株を、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を測定することによって特性づけする。培養物を一晩増殖させ、新しい回分培養のための接種材料として使用し、指数増殖期中にそれらについての測定を行う。増殖速度は、分光光度計（Ａ６００）を使用して光学密度を測定することによって決定する。培養上清中のグルコース、アルコールおよび他の有機酸副産物の濃度は、ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳを含む分析法によって決定することとなり、それを用いて取り込みおよび分泌速度を算出する。すべての実験は、三重反復培養で行う。

本発明は、本明細書において上で説明した天然に存在しない真核生物を培養することによる長鎖アルコールの生産方法も提供する。１つ以上の遺伝子破壊が、酵素をコードする遺伝子において生じ、この酵素は、遺伝子破壊がその酵素の活性を低下させるとその生物の増殖に長鎖アルコール生産を連動させるものである。１つ以上の遺伝子破壊が、その生物に長鎖アルコールの安定した増殖連動生産をもたらす。代替実施形態において、前記遺伝子破壊は、増殖依存様式でＬＣＡ生産を増進させることができる。

予測された株設計がＬＣＡの形成とバイオマス形成を十分に連動させないと判定された場合、本明細書に提示する株のそれぞれにさらなる破壊を追加することができる。しかし、ここに提供する遺伝破壊セットのリストは、高収量増殖連動ＬＣＡ生産株の構築のための卓越した出発点として役立つ。

予測された株設計が産物の形成をバイオマス形成に十分に連動させないと判定された場合、提案する株のそれぞれにさらなる破壊を追加することができる。あるいは、増殖条件下で有意な活性を有することが知られていない何らかの他の酵素が、適応進化またはランダム突然変異誘発のため活性になることがあり、破壊されることもある。しかし、ここに提供する遺伝子破壊セットのリストは、高収量増殖連動ＬＣＡ生産株の構築のための卓越した出発点として役立つ。

本発明の天然に存在しない微生物をＬＣＡの増殖連動生産に利用することができる。本発明の増殖連動ＬＣＡ生産を用いて、商業的な量を含めて、本質的に任意の量を合成することができる。本発明の微生物は、連続増殖または準連続増殖プロセスにＬＣＡを強制的に連動させるので、ＬＣＡの生合成生産に特に有用である。そのような連続および／または準連続増殖プロセスは、上で説明しており、および下で実施例Ｉにおいて例示する。連続および／または準連続微生物増殖プロセスも当該技術分野において周知である。簡単に言うと、連続および／または準連続増殖プロセスは、微生物を指数増殖または対数期で維持することを含む。手法は、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）進化マシン（フロリダ州、ケインズヴィルのＥｖｏｌｕｇａｔｅＬＬＣ）、発酵槽およびこれらに類するものなどの装置の使用を含む。加えて、微好気性条件下での振盪フラスコ発酵および増殖も利用することができる。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、当該技術分野において周知の様々な異なるプロセスおよび／または装置を用いて、様々な異なる条件下、様々な異なる設定で、前記増殖連動ＬＣＡ生産性微生物を利用できることは、当業者には理解されるであろう。

一般に、ＣＬＡの連続および／または準連続生産は、増殖を指数期で維持するおよび／またはほぼ維持するために十分な栄養および培地で本発明の天然に存在しない増殖連動ＬＣＡ生産性微生物を培養することを含むであろう。そのような条件下での連続培養を、例えば、１日、２、３、４、５、６または７日以上、生じさせることができる。加えて、連続培養は、１週、２、３、４または５週以上、および数か月以下の継続期間を含むことができる。前記連続および／または準連続培養条件が、これらの例示的期間の間のすべての時間間隔も含み得ることは、理解されるはずである。特定の実施形態では、実質的に嫌気性の培養基において培養を行う。

上に例示した連続および／または準連続培養期間中の任意の時点でＬＣＡを回収または単離することができる。下で例示するように、連続および／または準連続増殖期での微生物の維持が長いほど、生産することができるＬＣＡの量は比例して多い。

従って、本発明は、１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物を培養することを含むＬＣＡの生産方法を提供する。前記破壊は、酵素をコードする遺伝子において生じ得、この酵素は、遺伝子破壊がその酵素の活性を低下させるとその微生物の増殖にＬＣＡ生産を連動させるものであるので、前記破壊が、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの安定した増殖連動生産をもたらす。

一部の実施形態において、前記遺伝子破壊は、完全遺伝子欠失を含む場合がある。一部の実施形態において、遺伝子を破壊するための他の手段は、例えば、オリゴヌクレオチドの欠損もしくは付加によるまたは遺伝子を作動不能にさせる突然変異によるフレームシフトを含む。しかし、それが前記天然に存在しない生物にその野生型に復帰変異しないようにもたらすことができる安定性のため、遺伝子欠失の利点が当業者にはわかるであろう。詳細には、遺伝子破壊は、本明細書において上で詳述した遺伝子を含む遺伝子セットから選択される。

本開示において列挙する代謝経路を遺伝子工学で作り変える戦略は、その生物がマロニル−ＣｏＡ非依存性経路によって長鎖アルコールを生産できることを仮定している。マロニル−ＣｏＡ非依存性経路によって長鎖アルコールを生産できる組み換え宿主生物の構築は、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とアシル還元経路とを有する、天然に存在しない微生物を遺伝子工学で作ることを含む。そのようなマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路は、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む。前記アシル還元経路は、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む。

本明細書に提示するコンピュータ計算予測を実証するために、それらの株を構築し、進化させ、試験しなければならない。ＭＩ−ＬＣＡ経路を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６５５は、破壊を導入することとなる株として役立つ。前記破壊は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒのλ Ｒｅｄリコンビナーゼ系による相同組み換え（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄＢ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ，Ｏｎｅ−ｓｔｅｐｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ｕｓｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００．９７（１２）：ｐ．６６４０−５）を用いてインフレーム欠失を組み込むことによって構成されることとなる。このアプローチは、染色体配列（すなわち、除去のターゲットにされた遺伝子）を選択可能な抗生物質耐性遺伝子（それ自体、後に除去される）で置換することを含む。ノックアウトを１つ１つ受容株に組み込む。それぞれの欠失後に抗生物質耐性遺伝子は残存せず、その結果、それぞれのターゲット株における多重突然変異の蓄積が可能となる。この欠失技術は、除去のターゲットにされた遺伝子を完全に除去して、構築された突然変異体が野生型に復帰変異する可能性を実質的に低下させる。

中間株が構築されることとなる場合、振盪フラスコ発酵を行うことより株の性能を定量することとなる。ゴムセプタムでフラスコを封止し、その後、窒素ガスを培地に散布することによって、嫌気性条件が得られるであろう。厳密な嫌気性条件下で増殖が観察されない株については、フラスコをホイルで覆い、制限通気用の小さな穴をあけることによって微好気性条件を適用することができる。別様に述べない限り、グルコースを補足したＭ９最小培地を使用してすべての実験を行う。予備培養物を一晩増殖させ、新しい回分培養のための摂取材料として使用し、指数増殖中にそれらについての測定を行う。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することにより増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによりグルコース取り込み速度を決定する。常例的手順を用いてＧＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣによりＬＣＡ、エタノール、および有機酸を分析する。三重反復培養物をそれぞれの株について増殖させる。

嫌気性、ｐＨ制御回分発酵での選択株の性能を試験する。これは、酸性発酵産物の蓄積が細胞増殖を制限しないことを保証するばかりでなく、すべての産物の増殖、グルコース取り込み、および形成速度の信頼できる定量を可能にする。加えて、それは、株の性能のベンチマーキングにおける２つの重要なパラメータであるＬＣＡ容積生産性および収量の正確な決定を可能にする。発酵は、温度およびｐＨ制御部が装備された６００ｍＬの使用容積を有する１Ｌバイオリアクターにおいて行う。そのリアクターにＮ_２をおおよそ０．５Ｌ／分で散布して、ＤＯレベルが確実に検出レベル未満のままであるようにする。培養基は、発酵容器内で達成できるいっそう高い細胞密度に合わせてグルコース濃度を上昇させることを除き、上で説明したものと同じである。

回分から連続への発酵モードの切り替えがＬＣＡ収量および容積生産性にどのように影響するかの直接測定を達成するためにケモスタット実験を行うこととなる。回分モードを用いる上で説明したバイオリアクターを、培地の連続供給および使用済み培地の除去によってケモスタットモードで動作させる。回分でそれぞれの株について観察された最大増殖速度の８０％の一定希釈率を維持するように入口流量を設定し、出口流量を制御してレベルを維持する。グルコースはその培地における制限栄養であり、その容器において所望の最適密度を達成するように設定する。

組み換え株は、それらの代謝ネットワークがそれらの失われた機能に順応するまで、最初は最適下増殖速度を示すと予測される。この順応を可能にするために、それらの株を適応進化させる。それらの株を適応進化に付すことにより、細胞増殖速度が主選択圧となり、突然変異細胞は、それらの増殖速度を向上させるために、それらの代謝フラックスに再び割り当てられることを余儀なくされる。この代謝再プログラミングは、インシリコモデルによりアプリオリに予測された増殖速度に達することが、様々な基質で適応進化させた幾つかのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体について最近実証されている（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｇｅｎｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｅｖｏｌｖｅｔｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄｇｒｏｗｔｈｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＮａｔＧｅｎｅｔ，２００４．３６（１０）：ｐ．１０５６−８）。他のものより優れた生産品質を有する１つの株をともすれば生じさせる結果となり得るＥ．ｃｏｌｉにおいて以前に目撃された進化パターンの相違（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｇｅｎｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｅｖｏｌｖｅｔｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄｇｒｏｗｔｈｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＮａｔＧｅｎｅｔ，２００４．３６（１０）：ｐ．１０５６−８；Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｊ．Ｙ．Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆａｄａｐｔｉｖｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６５５ｂｙｕｓｉｎｇａｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅｉｎｓｉｌｉｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｃｍｏｄｅｌ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３．１８５（２１）：ｐ．６４００−８；Ｉｂａｒｒａ，Ｒ．Ｕ．，Ｊ．Ｓ．Ｅｄｗａｒｄｓ，およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ｕｎｄｅｒｇｏｅｓａｄａｐｔｉｖｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｏａｃｈｉｅｖｅｉｎｓｉｌｉｃｏｐｒｅｄｉｃｔｅｄｏｐｔｉｍａｌｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２．４２０（６９１２）：ｐ．１８６−１８９）のため、ＯｐｔＫｎｏｃｋ生成株を（並行して実行する）三重反復で適応進化させる。達成される増殖速度向上に依存して、２〜６週間、またはそれ以上の間、進化を実行する。一般に、安定な表現型が得られたら進化を停止させる。このＯｐｔＫｎｏｃｋアプローチの背後の増殖連動生化学生産概念が、結果として、遺伝的に安定な過剰生産体を生じさせる。

遺伝子工学で作り変えられた株を、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を測定することによって特性づけすることができる。培養物を一晩増殖させ、新しい回分培養のための摂取材料として使用し、指数増殖中にその測定を行う。増殖速度は、分光光度計（Ａ６００）を使用して光学密度を測定することにより決定することができる。培地上清中のグルコースおよび他の有機酸副産物の濃度は、ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣによって決定し、それを用いて取り込みおよび分泌速度を算出する。すべての実験を三重反復培養で行う。

適応進化プロセス後、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を再び測定することによってそれらの新しい株を特性づけする。これらの結果とＯｐｔＫｎｏｃｋ予測とを、上の計算での生産エンベロープと共に実際の増殖および生産収量をプロットすることによって比較することとなる。最も成功したＯｐｔＫｎｏｃｋ設計／進化の組み合わせをさらに追跡するために選択し、実験室規模の回分および連続発酵で特性づけする。このＯｐｔＫｎｏｃｋアプローチの背後の増殖連動生化学生産概念は、結果として、遺伝的に安定した過剰生産体も生じさせる。それ故、それらの培養物を一か月間連続モードで維持して、長期安定性を評価する。この実験を通して収量および生産性が維持されることを保証するために定期的サンプルを採取する。

前に述べたように、所望の産物の生合成に好適である代謝改変を特定および設計するための１つのコンピュータ計算方法がＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワーク（Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））である。このフレームワークは、微生物の完全代謝および／または生化学ネットワークを調査して、所望の生化学物質を細胞増殖の副産物になるように強いる遺伝子操作を示唆する。戦略的に配置された遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊によって細胞増殖と生化学的生産を連動させることにより、バイオリアクターでの長い期間の後、遺伝子工学で作り変えられた株にかけられる増殖選択圧が、その強制的増殖連動生化学的生産の結果として性能の向上をもたらす。最後に、遺伝子欠失を構成するとき、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子はゲノムから完全に除去されることとなるので、設計した株がそれらの野生型状態に復帰変異する可能性は無視してよい。従って、このコンピュータ計算方法論は、所望の産物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いることができ、または所望の産物の生合成のさらなる最適化のために天然に存在しない微生物に関して用いることができる。

簡単に言うと、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、細胞の代謝をモデリングするためのコンピュータ計算方法およびシステムを指すために本明細書において用いる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、フラックス均衡解析（ＦＢＡ）モデルに特定の制約を組み込むモデルおよび方法のフレームワークに関係する。これらの制約としては、例えば、定性的動態情報、定性的調節情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが挙げられる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えば、フラックス均衡モデルによって得られるフラックス範囲を狭め、その後、遺伝子付加または破壊が存在する状態で代謝ネットワークの性能限界を精査することにより、様々な代謝の問題に対する解も推定する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の有効な照会を可能するモデル式の作成を可能にし、結果として得られる混合整数線形計画問題の解法を提供する。本明細書においてＯｐｔＫｎｏｃｋと呼ぶ代謝モデリングおよびシミュレート方法は、例えば、２００２年１月１０日出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号に、２００２年１月１０日出願の国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０に、および２００７年８月１０日出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。

産物の生合成生産に好適である代謝改変を特定するおよび設計するためのもう１つのコンピュータ計算方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ計算方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日出願の米国特許公開第２００３／０２３３２１８号に、および２００３年６月１３日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを生成するために使用することができる、および生体系の化学反応による質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートするために使用して、その系における化学反応の任意のおよびすべての可能な機能性を含む解空間を定義し、それによってその生態系についての許容活性の範囲を決定することができるコンピュータ計算システムである。このアプローチは、制約に基づくモデリングと呼ばれる。解空間が、制約、例えば、含まれる反応の公知化学量論、ならびに反応による最大フラックスに関連した反応熱力学および容量の制約によって定義されるからである。これらの制約によって定義される空間の情報を送り、その生体系のまたはその生化学成分の表現型の能力および挙動を決定することができる。

生体系は順応性があり、多くの異なる方法で同じ結果に達することができるので、これらのコンピュータ計算アプローチは、生物学的現実との矛盾がない。生体系は、生きているすべての系が直面する基本的制約による拘束を受けた進化メカニズムによって設計される。従って、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約をきつくすることによりネットワークモデルにさらなる制限を連続的に課すことができることによって、解空間のサイズが減少され、その結果、生理的性能または表現型を予測することができる精度が向上される。

本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのために様々なコンピュータ計算フレームワークを利用して、宿主微生物における所望の化合物の生合成を設計するおよび実行することができるであろう。そのような代謝モデリングおよびシミュレーション方法としては、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋとして上で例示したコンピュータ計算システムが挙げられる。本発明の例証のために、本明細書ではモデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークに関して一部の方法を説明する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝改変の特定、設計および実行を、当該技術分野において周知の任意のそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータ計算フレームワークおよび方法に適用する方法を知っているだろう。

上で説明した方法は、破壊すべき代謝反応の１セットをもたらすであろう。そのセットの中のそれぞれの反応または代謝修飾の除去によって、その生物の増殖期中に産物として所望の産物を得ることができる。これらの反応は公知であるので、二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する解は、その反応セットの中のそれぞれの反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子（単数または複数）ももたらすであろう。１セットの反応の特定およびそれぞれの反応に関与する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の特定は、一般に、酵素とコード遺伝子との関係を有する反応データベースとそれらの反応の相関によって遂行される自動プロセスである。

特定されると、所望の産物の生産を達成するために破壊されることとなる反応のセットが、ターゲット細胞または生物において、そのセットの中のそれぞれの代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能破壊によって実行される。この反応セットの機能破壊を達成するために特に有用な１つの手段は、それぞれのコード遺伝子の欠失によるものである。しかし、場合により、例えば、突然変異、調節領域、例えばプロモーター、もしくは調節因子のためのシス結合部位、の欠失を含む他の遺伝子異常によって、または多数の位置のいずれかでのコード配列のトランケーションによって、反応を破壊することが有益であることがある。遺伝子セットの完全に満たない欠失を生じさせるこれらの後者の異常は、例えば、産物の連動の迅速な評価が望まれるとき、または遺伝子復帰変異が発生する可能性が低いとき、有用であり得る。

所望の産物の増殖連動生合成をはじめとする生合成を結果として生じさせることができる、破壊すべき反応または代謝修飾のさらなるセットをもたらす、上で説明した二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する追加の生成解を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化方法を実行することができる。この方法は、整数カットと呼ばれる追加の制約をそれぞれの反復時に組み込みながら、上に例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復的に解くことによって行われる。整数カット制約は、産物の生合成を増殖に強制的に連動させる任意の前の反復において特定された反応のまさに同じセットをその解の手順が選択するのを有効に防止する。例えば、前に特定された増殖連動代謝修飾が、破壊に反応１、２および３を指定する場合には、次の制約が、同じ反応が後続の解において同時に考慮されることを防止する。この整数カット法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，１７：７９１−７９７（２００１）に記載されているのを見つけることができる。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークとそれらの併用に関して本明細書に記載するすべての方法と同様に、反復コンピュータ計算解析における重複を減少させる整数カット法も、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）をはじめとする当該技術分野において周知の他のコンピュータ計算フレームワークと共に利用することができる。

本明細書に例示する方法は、所望の産物を生合成生産する細胞および生物の構築を可能にするものであり、この方法は、特定された遺伝子改変を有するように遺伝子工学で作り変えられた細胞または生物の増殖にターゲット生化学物質の生産を連動させることを含む。従って、本明細書に記載するコンピュータ計算方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されたインシリコ法によって特定される代謝修飾の特定および実行を可能にする。前記代謝修飾のセットは、例えば、１つ以上の生合成経路酵素の付加、および／または例えば遺伝子欠失による破壊を含む、１つ以上の代謝反応の機能破壊を含むことができる。

上で論じたように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法論は、突然変異微生物ネットワークを、長い増殖選択期間に付したとき、それらのコンピュータ計算予測最大増殖表現型のほうに進化させることができることを前提として開発された。言い換えると、このアプローチは、選択圧のもとで自己最適化する生物の能力に影響を与える。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づく生化学的生産と細胞増殖とを強いて連動させる遺伝子破壊の組み合わせの網羅的列挙を可能にする。最適な遺伝子／反応破壊の特定は、結果として生ずるネットワークについての最適な増殖の解が対象となる生化学物質を過剰生産するように活性反応のセットを選択する二層最適化問題の解を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。

以前に例示されているおよび例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６に、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されているように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ代謝のインシリコ化学量論的モデルを利用して代謝経路に必須の遺伝子を特定することができる。本明細書に開示するように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的ネットワークは、所望の産物の増殖連動生産をもたらす遺伝子破壊の位置を正確に特定するために利用するこができる。さらに、二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解は、１セットの破壊しか与えない。すべての意味ある解、すなわち、増殖連動生産形成につながる破壊のすべてのセットを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実行することができる。これは、上で論じたように、整数カットと呼ばれる追加の制約をそれぞれの反復時に組み込みながらＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復的に解くことを必然的に伴う。

適応進化は、突然変異体もしくは遺伝子工学で作り変えられた微生物株の、または不自然環境条件下で増殖する野生型株の、増殖速度を増すために用いることができる強力な実験技術である。それは、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的形式によって設計された株に特に有用であり、結果として増殖に連動した産物形成をもたらす。従って、最適な増殖株への進化は、間接的に生産も最適化することとなる。Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６５５のユニークな株は、遺伝子ノックアウトおよび適応進化によって作られた（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４））。この研究では、すべての適応進化培養物を、定常期に達する前に新しい培地への回分培養物の連続継代によって長期指数増殖状態で維持し、従って増殖速度を主選択圧として与えた。このノックアウト研究のために選択された遺伝子は、ａｃｋＡ、ｆｒｄＡ、ｐｃｋＡ、ｐｐｃ、ｔｐｉＡ、およびｚｗｆであった。ノックアウト株を構築し、（それぞれのノックアウト株について４つの）異なる炭素基質を補足した最小培地で進化させた。進化培養を二重反復または三重反復で行って、合計５０の進化ノックアウト株を生じさせた。安定した増殖速度に達するまでそれらの進化培養物を指数増殖状態で維持した。コンピュータ計算予測は、ノックアウト株の進化後増殖速度の予測から、調査した５０ケースのうち３８ケースにおいて正確（すなわち１０％以内）であった。さらに、ＯｐｔＫｎｏｃｋ成形と適応進化の組み合わせは、改善された乳酸生産株をもたらした（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ａ．Ｐ．Ｂｕｒｇａｒｄ，Ｃ．Ｄ．Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｆ．Ｒ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．Ｍａｒａｎａｓ，およびＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ９１：６４３−６４８（２００５））。Ｅ．ｃｏｌｉに関連したこれらの教示のガイダンスを他の生物に適用することができる。

適応進化を行うために開発された技術は多数ある。例示的方法を本明細書において下で説明する。一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない生物の最適化は、これらの適応進化技術のいずれかの使用という主題を含む。

連続培養は、新しい増殖培地を収容するはるかに大きい容器に少量の増殖培養物を繰り返し移すことを含む。培養された生物がその新たな容器内で飽和まで増殖したら、前記プロセスを繰り返す。文献（Ｌｅｎｓｋｉ，Ｒ．Ｅ．およびＭ．Ｔｒａｖｉｓａｎｏ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳ．Ａ．９１：６８０８−６８１４（１９９４））では、この方法を用いて、何年もの期間にもわたって増殖速度の一貫した向上を明瞭に実証した実験で持続培養の最も長い実証が達成されている。上に記載したＰａｌｓｓｏｎｌａｂにおいて行われた実験では、移送は、通常、対数期の間に行われ、そのため各日、その移送容積が正確に計算されて、次の２４時間にわたって対数増殖が維持される。このプロセスは、通常、相当な労力を投資して手作業で行われ、および外部環境への暴露によって汚染される。さらに、そのような少量を各回移すので、進化は不十分であり、多くの有益な突然変異が失われる。プラス面としては、系列希釈は費用がかからず、並行処理が容易である。

連続培養の場合、ケモスタットでの細胞の増殖が、細胞集団に非常に高い割合が残存する極端な希釈例の代表である。培養物が増殖し、飽和状態になると、増殖した培養物の小率が新しい培地で置換され、それによってその最大集団サイズ近くで培養物を継続的に増殖させることができる。ケモスタットは、短期間の急速な増殖速度向上を実証するために使用されている。（Ｄｙｋｈｕｉｚｅｎ，Ｄ．Ｅ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６１３−６３１（１９９３））。これらの装置の潜在能力は認められているが、従来のケモスタットは、希釈耐性（静止）変異体の意図されたものでない選択のため、増加された増殖速度についての長い選択期間を維持することができなかった。これらの変異体は、ケモスタットの表面に付着することによって希釈に耐えることができ、およびそうすることによって、より高い増殖速度を有するものを含むあまり粘着性でない固体と競合してそれらに勝ることができ、従って、その装置の所期の目的を不要にする。（Ｃｈａｏ，Ｌ．およびＧ．ＲａｍｓｄｅｌｌＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ２０：１３２−１３８（１９８５））。この欠点を克服するための１つの可能な方法は、ＰａｓｔｅｕｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅによる特許（ＭａｒｌｉｅｒｅおよびＭｕｔｚｅｌ、１９９９年出願の米国特許第６，６８６，１９４号）に記載されているような、一時的な滅菌期間を定期的にこうむる、２つの増殖チャンバを有する装置の実行である。

Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）は、Ｅｖｏｌｕｇａｔｅ，ＬＬＣ（フロリダ州、ゲインズヴィル）によって開発された連続培養装置であり、従来の進化技術に勝る有意な時間および労作節約を示す。（ｄｅＣｒｅｃｙ，Ｅ．，Ｍｅｔｚｇａｒ，Ｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｃ，Ｐｅｎｉｃａｕｄ，Ｍ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｂ．，Ｈａｎｓｅｎ，ＣＪ．，ｄｅＣｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，Ｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：４８９−４９６（２００７））。定常期に達する前に新しい培地への回分培養の連続継代によって長期指数増殖状態で細胞を維持する。最適密度測定および液体処理を自動化することにより、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒは、大きな培養容積を用いて高速で連続移送を行うことができ、従って、細胞適応度の進化に関してはケモスタットの効率にほぼ等しい。例えば、翻訳機構の成分を欠失し、重度に増殖阻害されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰ１の突然変異体を２００世代で野生型増殖速度の８０％に進化させた。しかし、単一容器内に細胞を維持するケモスタットとは対照的に、この機械は、ひと巻の管の細分された領域内の１つの「リアクター」から次への移動によって動作し、このようにして壁での増殖の一切の選択を無くす。移送容積は調節可能であり、通常は約５０％に設定される。

本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供する本発明の定義の中に含まれることは理解されるであろう。従って、以下の実施例は、例証のためのものであり、本発明を限定するためのものではない。

実施例Ｉ
第一級アルコール生合成
この実施例は、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ代謝経路およびアシル還元代謝経路を使用して第一級アルコールを生産することができる微生物の産生を説明するものである。

図１に示すようなマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路を遺伝子工学で作るためにターゲット生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、オクタノールなどの第一級アルコールを生産することができる天然に存在しない微生物を産生のための良好な宿主となる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作に適し、および嫌気性条件下でエタノールなどの様々な産物を有効に生産できることが知られている。

第一級アルコールを生産するように遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株を産生するために、前に説明したようなマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路において利用される酵素をコードする核酸を、公知の分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記文献、１９９９；Ｒｏｂｅｒｔｓら、上記文献、１９８９を参照のこと）を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。詳細には、嫌気性条件下でケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する多酵素複合体をコードするｆａｄＩ／ｆａｄＪ遺伝子（ＮＰ＿４１６８４４．１およびＮＰ＿４１６８４３．１）、およびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードするＴＤＥ０５９７（ＮＰ＿９７１２１１．１）を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとでｐＺＥ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にクローニングする。アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードするａｃｒ１遺伝子（ＹＰ＿０４７８６９．１）およびアルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ遺伝子（ＢＡＢ１２２７３．１）を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとでｐＺＡ３３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にクローニングする。２セットのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換させて、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路に必要なタンパク質および酵素を発現させる。

結果として得られた遺伝子工学で作り変えられた生物を、当該技術分野において周知の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、２００１を参照のこと）に従ってグルコース含有培地で培養する。例えばノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、免疫ブロッティングをはじめとする、当該技術分野において周知のポリペプチド発現または酵素活性の決定方法を用いて、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路遺伝子の発現を裏付ける。発現された酵素の酵素活性は、個々の活性に特有のアッセイを用いて確認する（例えば、Ｔｕｃｃｉ、上記文献、２００７；Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、２００５；Ｉｎｕｉら、上記文献、１９８４；Ｗｉｎｋｌｅｒ、２００３；Ｔａｎｉ、２０００；Ｒｅｉｓｅｒ、１９９７；Ｉｓｈｉｇｅ、２０００を参照のこと）。ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて、遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株のオクタノールなどの第一級アルコールを生産する能力を確認する。

機能的マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳおよびアシル還元経路を有するように遺伝子工学で作り変えられた微生物株をその経路の効率的利用についての最適化によってさらに増加させる。簡単に言うと、その遺伝子工学で作り変えられた株を評価して、任意の外因性遺伝子が律速レベルで発現されるかどうかを判定する。例えば追加の遺伝子コピー数の導入によってその経路を通るフラックスを制限することができる、低いレベルで発現される任意の酵素について発現が増加する。

より良好な生産体を産生させるために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化する。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックダウンを設計するためにもモデリングを用いる（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照のこと）。モデリング分析は、第一級アルコールのより効率的な生産のほうに代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。１つのモデリング方法が二層最適化アプローチ、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４：６４７−６５７（２００３））であり、これは、第一級アルコールのより良好な生産を共同で生じさせる結果となる遺伝子ノックアウトを選択するために利用される。例えばアセチル−ＣｏＡ中間体または第一級アルコール産物のより良好な生産体を産生させるために、適応進化も用いることができる。適応進化を行って、増殖特性と生産特性の両方を向上させる（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４：１５６５−１５６８（２００６））。結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化の後続のラウンドをその第一級アルコール生産体に適用して、それらの生産をさらに増加させることができる。

第一級アルコールの大規模生産については、上記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路含有生物を、嫌気性条件下で、その生物の増殖を抑制することが当該技術分野において公知の培地を使用して、発酵槽で培養する。発酵は、回分、流加回分または連続様式のいずれかで行う。その培地に先ず窒素を散布し、その後、培養容器を密封することによって、嫌気性条件を維持する（例えば、フラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封することができる）。制限通気用の小さな穴を設けることによって、微嫌気性条件も用いることができる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸の添加によってｐＨ７で維持する。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を仮定することによって増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定する。望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースなどの副産物は、グルコースおよびアルコールについては屈折率検出器を使用して、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用して、ＨＰＸ−０８７カラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いるＨＰＬＣ（株式会社島津製作所（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））によって定量することができる、Ｌｉｎｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７５−７７９（２００５）。

産物第一級アルコールの単離は、それらの水への不溶性に基づいて行う。詳細には、二相発酵プロセスをこれらの産物アルコールの分離に用い、この場合、それらが別個の相を形成することができる、または発酵ブロスから有機相中にそれらを容易に抽出することができる。残留細胞および任意の他の不溶性不純物を濾過により除去し、それによって連続または半連続発酵プロセスが可能となる。

実施例ＩＩ
ＬＣＡの増殖連動生産を有する微生物
この実施例は、ＬＣＡの増殖連動生産のために設計した株のインシリコでの構築を説明するものである。

Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６５５は、破壊を導入する野生型株として役立つ。この破壊は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒのλ Ｒｅｄリコンビナーゼシステムによる相同組み換えを用いてインフレーム欠失を組み込むことにより構成する。（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄＢ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，９７（１２）：６６４０−５（２０００））。このアプローチは、染色体配列（すなわち、除去のターゲットにされた遺伝子）を選択可能な抗生物質耐性遺伝子（それ自体、後に除去される）で置換することを含む。ノックアウトを１つ１つ受容株に組み込む。それぞれの欠失後に抗生物質耐性遺伝子は残存せず、その結果、それぞれのターゲット株における多重突然変異の蓄積が可能となる。この欠失技術は、除去のターゲットにされた遺伝子を完全に除去して、構築された突然変異体が野生型に復帰変異する可能性を実質的に低下させる。

下でさらに説明するように、ＬＣＡの生合成を達成するための１つの例示的増殖条件は、嫌気性培養または発酵条件を含む。一定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物を嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で維持、培養または発酵させることができる。簡単に言うと、嫌気性条件は、酸素が全く無い環境を指す。実質的に嫌気性の条件は、例えば、培地中の溶解酸素濃度が飽和の０％と１０％の間であり続けるような培養、回分発酵または連続発酵を含む。実質的に嫌気性の条件は、酸素１％未満の雰囲気で維持される密封チャンバ内の液体培地中または寒天上での細胞の増殖または休止も含む。この酸素のパーセントは、例えば、Ｎ_２／ＣＯ_２混合物または他の適する非酸素ガス（単数もしくは複数）を培養物に散布することによって、維持することができる。

遺伝子工学で作り変えられた株を、その増殖速度、基質取り込み速度および産物／副産物分泌速度を測定することによって特性づけする。培養物を一晩増殖させ、新しい回分培養のための接種材料として使用し、指数増殖中にそれらについての測定を行う。増殖速度は、分光光度計（Ａ６００）を使用して光学密度を測定することによって決定する。培養上清中のグルコース、アルコールおよび他の有機酸副産物の濃度は、ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣよって決定し、それを用いて取り込みおよび分泌速度を計算する。すべての実験は、三重反復培養で行う。

組み換え株は、それらの代謝ネットワークがそれらの失われた機能に順応するまで最適化増殖速度を示し得る。この順応を可能にするために、それらの株を適応進化させる。それらの株を適応進化に付すことにより、細胞増殖速度が主選択圧となり、突然変異細胞は、それらの増殖速度を向上させるために、それらの代謝フラックスに再び割り当てられることを余儀なくされる。この代謝再プログラミングは、インシリコモデルによりアプリオリに予測された増殖速度に達することが、様々な基質で適応進化させた幾つかのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体について最近実証されている（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．ａｎｄＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＮａｔＧｅｎｅｔ，３６（１０）：１０５６−８（２００４））。これらの教示は、Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに適用することができる。

ＯｐｔＫｎｏｃｋ予測は、うまくいくと証明されており；適応進化によってもたらされる増殖増進を、増速されたＬＣＡ生産速度によって果たすこととなる。他のものより優れた生産品質を有する１つの株をともすれば生じさせる結果となり得るＥ．ｃｏｌｉにおいて以前に目撃された進化パターンの相違（Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．ａｎｄＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＮａｔＧｅｎｅｔ，３６（１０）：１０５６−８（２００４）；Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｊ．Ｙ．Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，ａｎｄＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１８５（２１）：６４００−８（２００３）；Ｉｂａｒｒａ，Ｒ．Ｕ．，Ｊ．Ｓ．Ｅｄｗａｒｄｓ，ａｎｄＢ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４２０（６９１２）：１８６−１８９（２００２））のため、ＯｐｔＫｎｏｃｋ生成株を（並行して実行する）三重反復で適応進化させる。達成される増殖速度向上に依存して、２〜６週間、進化を実行する。一般に、安定な表現型が得られたら進化を停止させる。

適応進化は、定常期に達する前に新しい培地への回分培養の連続継代によって細胞を長期指数増殖状態で維持することを含む。簡単に言うと、１つの手順は、希釈して新しい培地（すなわち、２ｇ／Ｌ炭素源を有するＭ９最小培地）に継代する前に細胞を中央指数増殖（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｇｒｏｗｔｈ）（Ａ_６００＝０．５）に到達させる。それぞれの培養について約５００世代を見込んでこのプロセスを繰り返す。進化の過程を通して毎日、培養サンプルを採取し、液体窒素で凍結させ、光学培養密度を記録する。他のものより優れた生産品質を有する１つの株をともすれば生じさせる結果となり得る以前に目撃された進化パターンの相違、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７０−７２：１８７−９８（１９９８）；Ｖｅｍｕｒｉら、ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６８：１７１５−２７（２００２）、のため、三重反復で進化を行う。適応進化段階は、約二か月以上まで要する場合がある。適応進化段階は、例えば、株設計に依存して二か月未満である場合もある。

もう１つのプロセスは、自動化技術を用いて細胞を進化させることができ、サービス契約のもとでＥｖｏｌｕｇａｔｅ，ＬＬＣ（フロリダ州、ゲインズヴィル）によって市販されている。この手順は、自動進化技術を用いて有意な時間および労作の節約を生じさせるＥｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）進化マシンを利用する。定常期に達する前に新しい培地への回分培養の連続継代によって長期指数増殖状態で細胞を維持する。光学密度測定および液体処理を自動化することにより、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）は、大きな培養容積を用いて高速で連続移送を行うことができ、従って、細胞適応度の進化についてはケモスタットの効率にほぼ等しい。例えば、翻訳機構の成分を欠失し、重度に増殖阻害されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰ１の突然変異体を２００世代で野生型増殖速度の８０％に進化させた。しかし、単一容器内に細胞を維持するケモスタットとは対照的に、この機械は、ひと巻の管の細分された領域内の１つの「リアクター」から次への移動によって動作し、このようにして壁での増殖の一切の選択を無くす。移送容積は調節可能であり、通常は約５０％に設定される。

単一容器内に細胞を維持するケモスタットとは対照的に、この機械は、ひと巻の管の細分された領域内の１つの「リアクター」から次への移動によって動作し、このようにして壁での増殖の一切の選択を無くす。進化の過程を通して毎日、培養サンプルを採取し、液体窒素で凍結させ、光学培養密度を記録する。安定な増殖速度が達成されるまでそれぞれの株にＥｖｏｌｕｇａｔｏｒを使用する。この装置を使用して、２週間でほぼ５０％の増殖速度向上が観察された。上で説明した株を（並行して実行する）三重反復で適応進化させる。１０日間隔で、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒから培養サンプルを取り、寒天プレートで精製し、上で論じたように三重反復で培養して株の生理機能を評価する。Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）は、従来の進化技術に勝る有意な時間および労作の節約を示す連続培養装置である。（ｄｅＣｒｅｃｙら、ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：４８９−４９６（２００７））。

適応進化プロセス後、それらの新たな株を、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を測定することによって再び特性づけする。これらの結果とＯｐｔＫｎｏｃｋ予測とを、生産エンベロープと共に実際の増殖および生産収量をプロットすることによって比較する。最も成功したＯｐｔＫｎｏｃｋ設計／進化の組み合わせをさらに追跡するために選択し、実験室規模の回分および連続発酵で特性づけする。このＯｐｔＫｎｏｃｋアプローチの背後の増殖連動生化学生産概念は、結果として、遺伝的に安定した過剰生産体も生じさせる。それ故、それらの培養物を一か月間連続モードで維持して、長期安定性を評価する。この実験を通して収量および生産性が維持されることを保証するために定期的サンプルを採取することとなる。

実施例ＩＩＩ
ＬＣＡの増殖連動生産を有する微生物
この実施例は、ＬＣＡの増殖連動生産のために設計した株のインシリコでの構築を説明するものである。

耐性マーカー（例えば、ＵＲＡ３）の除去および再循環を可能にするｌｏｘＰ部位が隣接するＫａｎＭＸカセットが割り込んでいる遺伝子の相同組み換えによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに遺伝子欠失を導入する（Ｗａｃｈ，Ａ．ら、ＰＣＲ−ｂａｓｅｄｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｍ．Ｆ．Ｔｕｉｔｅ，Ｅｄｉｔｏｒ．１９９８，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ：ＳａｎＤｉｅｇｏ）。プラスミド上のｌｏｘ−Ｐ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ配列で出発して、上記カセットに相同な領域が続く４５〜５０ｂｐターゲット配列を両方とも含有するプライマーを使用して、ＰＣＲにより、対象となる遺伝子のフラグメントが隣接するこの配列を有する人工構築物を作る。この線形ＤＮＡを野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換し、ゲネチシン耐性によって組み換え体を選択する（Ｗａｃｈ，Ａ．ら、上記文献］。コロニーを精製し、ＰＣＲによる正しい二重交差について検査する。ＫａｎＭＸマーカーを除去するために、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびブレオマイシン耐性を有するプラスミドを導入して、ｌｏｘＰ部位間の組み換えを促進する（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．ｅ２３（２００２））］。最後に、抗生物質が一切存在しない培地での逐次培養によって、結果として得られた株のＣｒｅプラスミドを回復する。最終株は、無マーカー遺伝子欠失を有し、従って、同じ方法を用いて同じ株に多数の欠失を導入することができる。

本明細書に開示する方法によって株を構築し、進化させ、試験する。例えば、幾つかの方法を用いて、遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入する。これらの方法は、プラスミドに基づくものであり得るが、他のものは、染色体における遺伝子の組み込みを可能にするものである。後者のアプローチは、組み込みプロモーターに基づく発現ベクター、例えば、ＧＡＰプロモーターに基づくｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαを利用する。前記発現ベクターは、耐性マーカーの除去および再循環を可能にするｌｏｘＰ部位が隣接するＫａｎＭＸカセットに加えて、ＧＡＰプロモーター、組み込みのためのＨＩＳ４野生型対立遺伝子およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの３’ＡＯＸ転写末端領域を構成する。これらのベクターは、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールズバッド）から市販されている。

前記方法は、適するプライマーでの対象となる遺伝子の合成および増幅、その後、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ酵素によって作られるもの（Ｖｅｌｌａｎｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：３１３−３１８（２００７））などの固有の制限部位でのその遺伝子の消化を必然的に伴う。その遺伝子を、ＧＡＰプロモーターの下流の発現ベクター内のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入する。この遺伝子挿入をＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列分析によって検証する。その後、その組み換えプラスミドをヒスチジン組み込みのためにＮａｒＩで線形化し、精製し、適切な形質転換方法を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体ＤＮＡに組み込む。それらの細胞を適切な選択マーカー（例えば、カナマイシン）と共にＹＰＤ培地にプレーティングし、２〜３日間インキュベートする。その後、それらの形質転換体をコロニーＰＣＹによる必要遺伝子挿入について分析することとなる。

その抗生物質マーカーを除去するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを含有するプラスミドを導入し、ｌｏｘＰ部位間での組み換えを促進する（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、上記文献）。最後に、抗生物質が一切存在しない培地での逐次培養によって、結果として得られた株のＣｒｅプラスミドを回復する。最終株は、無マーカー遺伝子欠失を有し、従って、同じ方法を用いて同じ株に多数の欠失を導入することができる。

遺伝子工学で作り変えた株を、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を測定することによって特性づけする。培養物を一晩増殖させ、新しい回分培養物のための接種材料として使用し、指数増殖期中にそれらについての測定を行う。増殖速度は、分光光度計（Ａ６００）を使用して光学密度を測定することによって決定する。ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳを含む分析法によって、培養上清中のグルコース、アルコールおよび他の有機酸副産物の濃度を決定し、それを用いて取り込みおよび分泌速度を計算する。すべての実験は、三重反復培養で行う。

ノックアウト株は、それらの代謝ネットワークがそれらの失われた機能に順応するまで、最初は最適下増殖速度を示すと予想される。この順応を可能にするために、それらの株を適応進化させることとなる。それらの株を適応進化に付すことにより、細胞増殖速度が主選択圧となり、突然変異細胞は、それらの増殖速度を向上させるために、それらの代謝フラックスに再び割り当てられることを余儀なくされる。この代謝再プログラミングは、インシリコモデルによりアプリオリに予測された増殖速度に達することが、様々な基質で適応進化させた幾つかのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体について最近実証されている。適応進化によってもたらされる前記増殖増進を、ＬＣＡ生産の増速によって果たすことができる。他のものより優れた生産品質を有する１つの株をともすれば生じさせる結果となり得るＥ．ｃｏｌｉにおいて以前に目撃された進化パターンの相違のため、ＯｐｔＫｎｏｃｋ生成株を（並行して実行する）三重反復で適応進化させる。達成される増殖速度向上に依存して、２〜６週間またはそれ以上の間、進化を実行することができる。一般に、安定な表現型が得られたら進化を停止させることができる。

適応進化手順は、定常期に達する前に新しい培地への回分培養の連続継代によって細胞を長期指数増殖状態で維持することを含む。簡単に言うと、１つの手順は、希釈して新しい培地（すなわち、２ｇ／Ｌ炭素源を有するＭ９最小培地）に継代する前に細胞を中央指数増殖（Ａ_６００＝０．５）に到達させる。それぞれの培養について約５００世代を見込んでこのプロセスを繰り返す。進化の過程を通して毎日、培養サンプルを採取し、液体窒素で凍結させ、光学培養密度を記録する。他のものより優れた生産品質を有する１つの株をともすれば生じさせる結果となり得る以前に目撃された進化パターンの相違、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７０−７２：１８７−９８（１９９８）；Ｖｅｍｕｒｉら、ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６８：１７１５−２７（２００２）のため、三重反復で進化を行う。適応進化段階は、約二か月以上まで要する場合がある。適応進化段階は、例えば、株設計に依存して二か月未満である場合もある。

もう１つのプロセスは、自動化技術を用いて細胞を進化させることができ、サービス契約のもとでＥｖｏｌｕｇａｔｅ，ＬＬＣ（フロリダ州、ゲインズヴィル）によって市販されている。この手順は、自動進化技術を用いて有意な時間および労作の節約を生じさせるＥｖｏｌｕｇａｔｏｒ（商標）進化マシンを利用する。定常期に達する前に新しい培地への回分培養の連続継代によって長期指数増殖状態で細胞を維持する。光学密度測定および液体処理を自動化することにより、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒは、大きな培養容積を用いて高速で連続移送を行うことができ、従って、細胞適応度^２５の進化についてはケモスタットの効率にほぼ等しい。単一容器内に細胞を維持するケモスタットとは対照的に、この機械は、ひと巻の管の細分された領域内の１つの「リアクター」から次への移動によって動作し、このようにして壁での増殖の一切の選択を無くす。進化の過程を通して毎日、培養サンプルを採取し、液体窒素で凍結させ、光学培養密度を記録する。安定な増殖速度が達成されるまでそれぞれの株にＥｖｏｌｕｇａｔｏｒを使用する。この装置を使用して、２週間でほぼ５０％の増殖速度向上が観察された。上で説明した株を（並行して実行する）三重反復で適応進化させる。１０日間隔で、Ｅｖｏｌｕｇａｔｏｒから培養サンプルを取り、寒天プレートで精製し、上で論じたように三重反復で培養して株の生理機能を評価する。

適応進化プロセス後、それらの新たな株を、増殖速度、基質取り込み速度、および産物／副産物分泌速度を測定することによって再び特性づけする。これらの結果とＯｐｔＫｎｏｃｋ予測とを、生産エンベロープと共に実際の増殖および生産収量をプロットすることによって比較する。最も成功したＯｐｔＫｎｏｃｋ設計／進化の組み合わせをさらに追跡するために選択し、実験室規模の回分および連続発酵で特性づけする。このＯｐｔＫｎｏｃｋアプローチの背後の増殖連動生化学生産概念は、結果として、遺伝的に安定した過剰生産体も生じさせるはずである。それ故、それらの培養物を一か月間連続モードで維持して、長期安定性を評価することができる。この実験を通して収量および生産性が維持されることを保証するために定期的サンプルを採取することとなる。

有用な遺伝子破壊ターゲットを生成するためのＯｐｔＫｎｏｃｋ方法論の応用を本明細書において上で説明した。ＬＣＡ生産とＥｓｃｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ増殖との連動を確立するための多数の破壊戦略を列挙した。この方法論は、多種さ様な細胞、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ以外の微生物に適用することができ、ならびにＯｐｔＫｎｏｃｋ以外の代謝モデリングおよびシミュレーションシステムにも利用することができる。

本明細書に記載するコンピュータ計算と工学を併用するプラットフォームは、任意の化学量論的モデル生物に一般に適用することができ、ならびに本明細書に提供する教示およびガイダンスによって、当業者は、任意の生化学物質の増殖連動生産をもたらす代謝改変のための遺伝子修飾のセットを設計および実行することができるであろう。

本出願を通して、様々な出版物を括弧内に参考文献として載せた。本発明が属する技術の状態をより十分に説明するために、これらの出版物の開示は、それら全体が、参照により本出願に援用されている。

本開示は、嫌気性条件下でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおけるＬＣＡの増殖連動生産のための遺伝子破壊戦略を提供する。提案する戦略は、これらの産物のそれぞれについて報告されている収量より産物収量を有意に増加させることができる。ＬＣＡ生産についての戦略の包括的リストを表１に列挙する。反応破壊のそれぞれについての関連遺伝子および化学量論を表２に載せる。表３は、代謝産物の略語およびそれらの対応する名称と共にそれらの一を列挙するものである。

開示した実施形態に関連して本発明を説明したが、上で詳述した特定の実施例および研究が本発明の例証となるものにすぎないことは当業者には容易に理解されるであろう。本発明の精神を逸脱することなく様々な変更を行うことができることは理解されるはずである。従って、本発明は、後続の特許請求の範囲によってしか限定されない。

Claims

第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする外因性核酸およびアシル還元経路酵素をコードする外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する、天然に存在しない微生物であって、前記第一級アルコールが、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールおよびヘキサデカノールからなる群より選択され、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物。
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つ、３つまたは４つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸は、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸は、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸は、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素は、脂肪酸形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）である、請求項５に記載の天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸の少なくとも１つはさらに、異種コード核酸を含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
嫌気性の培養基をさらに含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
第一級アルコールを生産するための方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を、嫌気性の条件下で、前記第一級アルコールを生産するために十分な期間にわたって培養することを含む、方法。
前記第一級アルコールを単離することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
脂肪アシル−ＣｏＡを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする外因性核酸を含むマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路を有する、天然に存在しない微生物であって、前記脂肪アシル−ＣｏＡの脂肪酸鎖が６−１０、１２、１４または１６炭素原子を有し、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸は、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１１に記載の天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸は、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１１に記載の天然に存在しない微生物。
前記外因性核酸の少なくとも１つはさらに、異種コード核酸を含む、請求項１１に記載の天然に存在しない微生物。
嫌気性の培養基をさらに含む、請求項１１に記載の天然に存在しない微生物。