JP2010528627A - 微生物による油の生産 - Google Patents
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Abstract
特に、本発明は、石油を含有している微生物およびこの種の微生物の低コスト培養の方法を提供する。
本発明も、例えばリパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、多糖分解酵素、脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA/アルデヒドレダクターゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒド・デカルボニラーゼおよび/またはACPのような酵素をコードする外来遺伝子を含んでいる微生物細胞を提供する。
本発明は、また、例えば再生できるディーゼル、バイオディーゼルおよび再生できるジェット燃料輸送燃料を製造する方法を含む。
Description
一つの方法では、本発明は、本発明を目的とする各種実施態様として、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、ポリサッカロイド分解酵素、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質(ACP)を備えるグループから選択されるタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでいる微細藻類細胞、油性酵母、または真菌類等の微生物を提供する。この微生物(例えば微細藻類細胞)は、例えば、表1から選ぶことができる。具体例として、この細胞はクロレラ属の種であり、例えばクロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)またはクロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)の種である。
他の実施態様において、この微生物は、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジダ属の種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グラシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択される油性の酵母である。
さらに他の実施態様において、この微生物は、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択される、真菌である。
他の実施態様において、本発明は、例えば大腸菌及びバチラ(Bacilla)のような細菌宿主で炭化水素修飾酵素を発現し、再生可能なディーゼルを生産する方法を含む。
実施態様の一つとして、(a)(i)微生物が、脂質として乾燥細胞重量の少なくとも10%を蓄積し (ii)固定炭素源が、グリセロール、分解されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組み合わせから選択される条件のもとで、固定化された炭素源の存在下で微生物群を培養する工程と、(b)培養した微生物から脂質成分を分離する工程と、(c)単離した脂質成分を一つ以上の化学反応に投入して直鎖アルカンを生成する工程と、を含む、再生可能なディーゼルを生産する方法がある。
他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている、微生物の他の種である。場合によっては、微生物は、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素またはショ糖資化性酵素の少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変される。
実施態様において、グリセロールは、エステル転移反応の工程の副産物である。実施態様において、グリセロールは酸化されている。他の実施態様では、前記グリセロールは酸化されていない。場合によっては、少なくとも一つの他の固定炭素源は、ブドウ糖である。場合によっては、少なくとも一つの他の固定炭素源は、脱重合されたセルロース材料である。実施態様において、少なくとも一つの他の固定炭素源は、ショ糖である。
場合によっては、外来遺伝子がショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素およびフルクトキナーゼを備える群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施態様では、タンパク質が、細胞外間隙に分泌されるショ糖インベルターゼである。いくつかの実施態様では、タンパク質が、細胞質を目標とされるショ糖インベルターゼである。
I.定義
特に定められない限り、本願明細書において用いられる全ての専門的で科学的な用語は本発明が属する当業者によって共通に理解される意味を有する。
以下の参照は、技術のうちの1つに本発明において使用する条件の多数の一般の定義を提供する。
Singleton et ai, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、及び、Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
ここで使用しているように、特に特定されない限り、次の用語は以下の意味を有する。
触媒は、生成物を形成するために他の反応体と作用したり、反応効率を増加したりする。
触媒は一般的に、それがより急速にまたは低い温度で反応するように、反応のために必要な全体の活性化エネルギーを下げる。このように、平衡反応は、より急速に到達されることが可能である。触媒の実施例には、生物的触媒である酵素、非生物学的触媒である熱、化石の石油精製プロセスで用いられる金属触媒を含む。
2種類以上の細胞が、両方とも微生物(例えば微細藻類細胞)であり、または微細藻類細胞と微細藻類細胞と異なる細胞とが培養される。培養条件は、2つ以上の細胞タイプの増殖および/または増殖を促進するものまたは継体のための細胞増殖を維持すると共に、2つ以上の細胞の一つ(またはサブセット)の増殖および/または激増を促進するものであってもよい。
後者の非限定的な実施例は、単一の酸素原子を含んでいるアルデヒドと同様に、アルコール分子を形成するために1つの炭素原子および1つの水素原子間の酸素原子を含んでいる炭化水素を含む。アルコール類を炭素原子および水素原子だけを含んでいる炭化水素に還元する方法は周知である。炭化水素の他の実施例は、エステルであって、酸素酸中で有機基が(1またはそれ以上の)水素原子に置換する。炭化水素化合物の分子構造は、天然ガスの成分であるメタン(CH4)のような最も単純なものから、原油、石油およびビチューメンで見つかるアスファルテンのようないくつかの分子のように非常に重い複合体に変化する。炭化水素は、ガスであるか、液状であるか、固形物またはこれらの形のいかなる組合せであってもよく、主鎖と隣接した炭素原子との間に一つ以上の二重または三重結合を有することができる。したがって、「炭化水素」という用語は、線形、分枝、環状または部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質およびパラフィンを含む。具体例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、トリオレイン、及びスクアレンを含む。
「栄養分の非制限的濃度」は、特定の培養期間の間に最大限の増殖を支える濃度である。
このように、特定の培養期間の間に生産される細胞の数は、栄養分の非制限的濃度の場合より栄養分の制限する濃度である場合の方がより低い。栄養分が培地中に「過度に」存在するとは、栄養分が最大限の増殖を支える濃度より濃い濃度存在する場合をいう。
アミノ酸配列の場合には、BLASTPプログラムがデフォルトとして文字列長さ(W)3、期待値(E)10およびBLOSUM62スコア算出行列を使用する。TBLATNプログラム(ヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列を使用する)は、デフォルトとして文字列長さ(W)3、期待値(E)10およびBLOSUM 62スコア算出行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10915 (1989) を参照)を使用する。
本発明は、輸送燃料、石油化学産業および/または食品および美容産業、さらにはほかの応用分野においても、特定の微生物が経済的に油、燃料および他の炭化水素または脂質組成物を生産するために用いることができるという洞察を前提の一部としている。適切な微生物は、微細藻類、油性酵母、真菌を含む。本発明に用いられる微細藻類の適している属は、脂質生産微細藻類のクロレラが好ましい。脂質のエステル転移反応は、バイオディーゼルとして有効な長鎖脂肪酸エステルを産生する。他の酵素及び化学的処理は、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類、アルカンおよびアルケンを生産するように改変することができる。本出願は、複数種の微生物の系統の遺伝子改変のため方法を記載し、油、燃料および油脂化学製品への転換に適している脂質の生産を容易にする特徴を有する微生物を提供するためにクロレラおよび類似した微生物を含む。ある用途では、再生できるディーゼル、ジェット燃料または他の炭化水素化合物が生産される。本出願も、生産性および脂質収量を増加するための、および/または上記の組成物をより費用対効果よく生産するのための微細藻類培養方法について説明する。
好適な脂質または炭化水素を生産するいかなる種類の微生物であっても使用することができ、自然に高水準の好適な脂質または炭化水素を生産する微生物が好ましい。微生物による炭化水素の生産は、Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66:486-496及びA Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998) によってまとめられている。
(1)細胞重量の割合として、高い脂質含有量。
(2)増殖の容易さ。
(3)遺伝的改変の容易さ。
及び、(4)バイオマス処理の容易さ。
具体的態様において、野生型または遺伝的に改変された微生物細胞は、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%または少なくとも70%以上の脂質を産生する。
微生物は、(光がない場合、糖に)従属栄養的であることが好ましく、または、例えば、本願明細書において説明される方法を使用してそのように改変されてもよい。選択可能なマーカーおよび微生物内で機能を有する(構造性のおよび/または誘導性の)プロモーターの形質転換の容易さおよび入手可能性が、遺伝的改変の容易さに影響を与える。作成工程を考慮する際には、例えば、細胞を溶解させるための有効な手段を入手することが可能
かどうかを含めて考慮される。
本発明の一実施形態では、微生物は、微細藻類である。本発明によれば、特に限定するものではないが、使用可能な微細藻類の実施形態は、表1で見つけることができる。
アクナンセス・オリエンタイルス(Achnanthes orientalis)、アグメヌルム(Agmenellum)、アンフィプロラ・ヒアリン(Amphiprora hyaline)、アンフォラ・コフェイフォルミス(Amphora coffeiformis)、アンフォラ・コフェイフォルミス・リネア(Amphora coffeiformis linea)、アンフォラ・コフェイフォルミス・プンクタタ(Amphora coffeiformis punctata)、アンフォラ・コフェイフォルミス・タヨロリ(Amphora coffeiformis taylori)、アンフォラ・コフェイフォルミス・テヌイス(Amphora coffeiformis tenuis)、アンフォラ・デリカティッシマ(Amphora delicatissima)、アンフォラ・デリカティッシマ・キャピタタ(Amphora delicatissima capitata)、アンフォラ属の種(Amphora sp.)、アナバエナ(Anabaena)、アンキストロデスムス(Ankistrodesmus)、アンキストロデスムス・ファルカタス(Ankistrodesmus falcatus)、ボエケロヴィア・ホオグランディ(Boekelovia hooglandii)、ボロディネラ属の種(Borodinella sp.)、ボツリョコッキス・ブラウニイ(Botryococciis braunii)、ボツリョコッカス・スデティクス(Botryococcus sudeticus)、バクテリオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、カルテリア(Carteria)、カエトセロス・グラシリス(Chaetoceros gracilis)、カエトセロス・ムエレリ(Chaetoceros muelleri)、カエトセロス・ムエレリ・スブサルスム(Chaetoceros muelleri subsalsum)、カエトセロス属の一種(Chaetoceros sp.)、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ(Chlorella Antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・カプスレイト(Chlorella capsulate)、クロレラ・デシカート(Chlorella desiccate)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata)、クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)バール。クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウゼノフィラ(Chlorella infusionum auxenophila)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ロボフォラ(Chlorella lobophora)(SAG 37.88株)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var. lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・オヴァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25のいずれかを含む)、クロレラ・プロトセコイデス・バー・アシジコラ(Chlorella protothecoides var.acidicola)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルティア(Chlorella vulgaris f tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アウトトロフィカ(Chlorella vulgaris var. autotrophica)、クロレラ・ブルガリス・バーヴィリディス(Chlorella vulgaris var.viridisu)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルティア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ヴィリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)、クロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)、クロレラ・ツレボウシオイデス(Chlorella trebouxioides)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロロコッカム・インフシオヌム(Chlorococcum infusionum)、クロロコッカム属の一種(Chlorococcum sp.)、クロゴニウム( Chlorogonium)、クロオモナス属の一種(Chroomonas sp.)、クリソスファエラ属の一種(Chrysosphaera sp.)、 クリコスファエラ属の一種(Cricosphaera sp.)、クリプテコディニウム・コーニィ( Crypthecodinium cohnii)、クリプトモナス属の一種( Cryptomonas sp.)、サイクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica),サイクロテラ・メネグヒニアナ(Cyclotella meneghiniana)、サイクロテラ属の一種(Cyclotella sp.)、ドナリエラ属の一種(Dunaliella sp.)、ドナリエラ・バルダウィル(Dunaliella bardawil)、ドナリエラ・バイオクラタ(Dunaliella bioculata)、ドナリエラ・グラヌラテ(Dunaliella granulate)、 ドナリエラ・マリタイム(Dunaliella maritime)、ドナリエラ・ミヌタ(Dunaliella minuta)、ドナリエラ・パルヴァ(Dunaliella parva)、ドナリエラ・ペイルセイ(Dunaliella peircei)、ドナリエラ・プリモレクタ(Dunaliella primolecta)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)、 ドナリエラ・テリコラ(Dunaliella terricola)、ドナリエラ・テルチオレクタ(Dunaliella tertiolecta)、ドナリエラ・ヴィリディス(Dunaliella viridis)、ドナリエラ・テルチオレクタ(Dunaliella tertiolecta)、エレモスファエラ・ヴィリディス(Eremosphaera viridis)、エレモスファエラ属の一種(Eremosphaera sp.)、エリプソイデン属の一種(Ellipsoidon sp.)、エウグレナ(Euglena)、フランセイア属の一種(Franceia sp.)、フラギラリア・クロトネンシス(Fragilaria crotonensis)、フラギラリア属の一種(Fragilaria sp.)、グレオカプサ属の一種(Gleocapsa sp.)、グロエオサムニオン属の一種(Gloeothamnion sp.)、ヒメノモナス属の一種(Hymenomonas sp.)、イソクリシス・エーエフエフ・ガルバナ(Isochrysis aff galbana)、イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)、レポシンクリス(Lepocinclis)、ミクル・アクチニウム(Micr actinium)、ミクル・アクチニウム(Micr actinium)(UTEXLB 2614), モノラフィディウム・ミヌツム(Monoraphidium minutum)、モノラフィディウム属の一種(Monoraphidium sp.)、ナンノクロリス属の一種(Nannochloris sp.)、ナンノクロロプシス・サリナ(Nannochloropsis salina)、ナンノクロロプシス属の一種(Nannochloropsis sp.)、ナビクラ・アクセプタタ(Navicula acceptata)、ナビクラ・ビスカンテラエ(Navicula biskanterae)、ナビクラ・シュードテネロイデス(Navicula pseudotenelloides)、 ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa), ナビクラ・サプロフィラ(Navicula saprophila)、ナビクラ属の一種(Navicula sp.)、ネフロクロリス属の一種(Nephrochloris sp.)、ネフロセルミス属の一種(Nephroselmis sp.)、ニツスチア・コムニス(Nitschia communis)、ニツスチア・アレカンヅフナ(Nitzschia alexandfna)、ニツスチア・コムニス(Nitzschia communis)、ニツスチア・デイシパタ(Nitzschia dissipata)、ニツスチア・フルスツルム(Nitzschia frustulum)、ニツスチア・ハンツスチアナ(Nitzschia hantzschiana)、ニツスチア・インコンスピクア(Nitzschia inconspicua)、ニツスチア・インテルメディア(Nitzschia intermedia)、ニツスチア・マイクロセファラ(Nitzschia microcephala)、ニツスチア・プシラ (Nitzschia pusilla)、ニツスチア・プシラ・エリプティカ(Nitzschia pusilla elliptica)、ニツスチア・プス・イリア・モノエンシス(Nitzschia pus ilia monoensis)、ニツスチア・クアヅラングラー(Nitzschia quadrangular)、ニツスチア属の一種(Nitzschia sp.)、オクロモナス属の一種(Ochromonas sp.)、オオサイスティス・パルバ(Oocystis parva)、オオサイスティス・プシラ(Oocystis pusilla)、オオサイスティス属の一種(Oocystis sp.)、オスシラトリア・リムネティカ(Oscillatoria limnetica)、オスシラトリア属の一種(Oscillatoria sp.)、オスシラトリア・スブレヴィス(Oscillatoria subbrevis)、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、パスケリア・アシドフィラ(Pascheria acidophila)、パブロバ属の一種(Pavlova sp.)、ファングス(Phagus)、フォルミディウム(Phormidium)、プラティモナス属の一種(Platymonas sp.)、プレウロクリシス・カーター・アエ(Pleurochrysis carter ae)、プレウロクリシス・デンタテ(Pleurochrysis dentate)、プレウロクリシス属の一種(Pleurochrysis sp.)、プロトテカ・ウィクケルハミイ(Prototheca wickerhamii)、プロトテカ・スタグノラ(Prototheca stagnora)、プロトテカ・ポルトリセンシス(Prototheca portoricensis)、 プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、プロトテカ・ゾフィ(Prototheca zopfii)、シュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)、ピラミモナス属の一種(Pyramimonas sp.)、ピロボツリス(Pyrobotrys)、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)、サルシノイド・クリソフィテ(Sarcinoid chrysophyte)、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)、シゾシツリウム(Schizochytrium)、スピロギラ(Spirogyra)、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)、スチココッカス属の一種(Stichococcus sp.)、シネココッカス属の一種(Synechococcus sp.)、テツラエヅロン(Tetraedron)、テツラセルミス属の一種(Tetraselmis sp.)、テツラセルミス・スエシカ(Tetraselmis suecica)、タラッシオシラ・ウェイッスフロギィ(Thalassiosira weissflogii)及びヴィリデイエラ・フリデリシアナ(Viridiella fridericiana)。
本発明の実施態様において、微生物は、クロレラ属であることが好ましく、クロレラ・プロトテコイデス(Chlorella protothecoides)クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)またはクロレラ・エメルソニィ(Chlorella emersonii)であることがより好ましい。
また、実施形態を本願明細書において参照する。他の脂質を生産する微細藻類は同様に改変されてもよく、原核生物の微細藻類(Kalscheuer st al., Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 52, Number 4 / October, 1999を参照)を含む。
本発明に用いられるクロレラの種は、ゲノムの特定の目標領域の増幅によって識別されてもよい。例えば、特定のクロレラの種または株の識別は、例えばWu et al, Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121に記載されるように、プライマーを使用し及びゲノムの任意の領域を使用して、核および/または葉緑体DNAの配列の増幅および配列決定を実行することができる。クロレラ属の種の識別は、リボソームDNA配列を単離し使用する。リボソームの内部転写されたスペーサ(ITSlおよびITS2 rDNA)、18SのrRNAおよび他の保存されたゲノム領域のように、系統学的な分析の方法は、これらの技術によって種の識別技術だけではなく、クロレラの種を識別することにより使用することができる。しかし、他の炭化水素及び脂質を生産する微生物に、本願明細書に説明される方法も使用することが可能である。藻類の識別及び分類の方法の実施形態のために、例えばGenetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 及び RNA, 2005 Apr;11(4): 361-4を参照する。
B.油性酵母
クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)
本発明の一実施形態では、微生物は、真菌である。本発明によれば、特に制限するものではないが、使うことができる菌類の実施形態は、表3で見つけることができる。
モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種
本発明の一実施形態では、微生物は、バクテリアである。
例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press)を参照する。
IV微生物を培養する方法
微細藻類は、光がある場合に、増殖することができる。例えば、波長スペクトルおよび一日毎の明暗時間の比率のような他のパラメーターと同様に、微細藻類細胞の培地を照射する光量は、コントロールすることができる。微細藻類は、また、自然光で培養されてもよく、同様に、自然光および人工光の組合せを同時または交互に照射してもよい。例えば、クロレラ属の微細藻類は、昼間の自然光の下で、または夜間の人工光の下で培養してもよい。
微生物の光合成による増殖に代わるものとして、上記の通りに、いくつかの微生物は、固定炭素源が増殖および脂質蓄積のためのエネルギーを提供する有機栄養増殖条件の下で培養されてもよい。
これらの原料は例えば以下の一つ以上を含む。ブドウ糖、穀物澱粉、脱重合したセルロース材料、ショ糖、サトウキビ、テンサイ、ラクトース、牛乳乳漿または糖蜜のような固定炭素源。例えば脂肪または植物油のような脂肪源。例えばタンパク質、大豆ミール、コーンスティープ液、アンモニア(純粋なまたは塩の形)、硝酸または硝酸塩または分子窒素のような窒素源。そして、リン酸塩類のようなリン源。加えて、発酵槽は、例えば温度、pH、酸素分圧および二酸化炭素濃度などの培養状況の制御を考慮に入れる。場合によっては、酸素または窒素のようなガス成分は、培地を泡立たせることができる。例えば、小麦、ジャガイモ、米およびトウモロコシのような他のデンプン(ブドウ糖)源。他の炭素源は、例えば工業水準グリセロール、黒液、例えば酢酸塩のような有機酸、糖蜜のようなプロセス・ストリームを含む。炭素源は、また、例えばショ糖および脱重合されたテンサイ・パルプの混成として混合物を形成してもよい。
図1は、細胞乾燥重量が純粋なグリセロールよりバイオディーゼルグリセロール副産物で高いことを証明し、この傾向は細胞がグリセロール単独およびグルコースとの組み合わせで増殖される場合にも有効だったと証明する。
図2は、クロレラの他の株で同様の傾向であることを示す。
図12(b)は、そのセネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)のリットル中の乾燥細胞重量は、純粋な試薬級グリセロールより、バイオディーゼル副産物の酸性及び非酸性グリセロールの中での方が高いことを証明する。
図13は、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)のリットル中の乾燥細胞重量が純粋な試薬グレード・グリセロールよりバイオディーゼルの副産物である非酸性のグリセロールの中で高いことを証明する。
図3および4が、多様なクロレラの種及び株で、リットル中の脂質量は、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が高いことを証明する。
図5および6は、多様なクロレラの種及び株は、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11は、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)とナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の双方が、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図12(a)は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)では細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積できることを証明する。
図7は、クロレラは、2%のブドウ糖がある場合よりも、1%のグリセロール/1%のブドウ糖がある場合の方が、培地のリットル中のより高い脂質量を蓄積することができる。
図12(b)は、そのセネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)のリットル中の乾燥細胞重量は、2%のブドウ糖がある場合よりも、1%のバイオディーゼル副産物グリセロール/1%のブドウ糖がある場合に存在するときに、より高いことを示す。
図13は、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)のリットル中の乾燥細胞重量が、2%のブドウ糖がある場合より1%のバイオディーゼルの副産物であるグリセロール/1%のブドウ糖がある場合に培養された方が、より高いことを証明する。
図8は、クロレラが、グルコース存在下で培養されるよりもグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11(a)は、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)が、グルコースだけの存在下で培養されるよりもバイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11(b)は、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)が、グルコースだけの存在下で培養されるよりも、試薬級のグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図12(b)は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)がグルコースだけの存在下で培養されるよりもバイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図8は、クロレラが、実験の当初にグリセロールとグルコースを同時に同量加えられた場合よりも、最初の期間グリセロールが加えて培養され、続いてグルコースが加えられて第2の期間培養され続けた方が、脂質の細胞重量に対する割合がより高いことを証明する。
図9は、クロレラが、グリセロールおよびブドウ糖を同時に開始期に加えられるよりもむしろ連続して加えるほうが、培地中のリットル中の脂質含有量はより高いことを示す。
この傾向は、酸性バイオディーゼル副産物のグリセロール、バイオディーゼル副産物の非酸性グリセロールまたは試薬級グリセロールが用いられるときに、観察された。
図10は、2つの異なる種のクロレラの4つの異なる株が、実験の開始時期にグリセロールとグルコースを同時に投与される場合より、グリセロールとグルコースが連続して投与された方が、培地のリットル中の乾燥細胞重量がより高いことを証明している。
この傾向は、酸性バイオディーゼル副産物のグリセロール、非酸性バイオディーゼル副産物のグリセロールまたは試薬級グリセロールが用いられるときに、観察された。
図14(a)及び(b)は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の両方が、発酵期の最初にグリセロールとグルコースの同一量を加えることに比較して、バイオディーゼル副産物のグリセロールが第1の期間に培地に加えられた方が、リットル中の細胞乾燥重量の増加を示すことができることを証明する。
セルロース材料は、一般に以下から成る。
40-60%の乾燥重量のセルロース、20-40%の乾燥重量のヘミセルロース、10-30%の乾燥重量のリグニン。
適切なショ糖輸送体の実施形態は、ジェンバンクの登録番号CAD91334、CAB92307およびCAA53390である。適切なショ糖インベルターゼの実施形態は、ジェンバンク登録番号CAB95010、NP 012104およびCAA06839である。適切なフルクトキナーゼの実施形態は、ジェンバンク登録番号P26984、P26420およびCAA43322である。クロレラを含む微細藻類の形質転換のためのベクターは、本願明細書で記載されるようにデザインされたような遺伝子を一つ以上コードする。
使用するショ糖インベルターゼ遺伝子は、この実施形態において、S・セレビシエ(S. cerevisiae)SUC2遺伝子をC・プロトテコイデス(C protothecoides)のコドン使用のために最適化された変更態様から成る。最適化された遺伝子のcDNAおよびアミノ酸配列は、配列番号:8および配列番号:19、にそれぞれ対応する。形質転換に使用するプラスミドの構成の実例は、図25に示される。例えば本願明細書において記載されるように、分泌可能なショ糖インベルターゼの発現は、細胞発酵のための栄養源を含んでいる糖蜜、サトウキビ液および他のショ糖含有原材料を使用できるようにする。
図23および24は、クロレラ細胞が、純粋な試薬級のブドウ糖と同様に、サトウキビを処理して得られた廃物の糖蜜で、増殖するという驚くべき結果を例示する。
サトウキビの処理工程で低価値廃棄物を使用することによって、炭化水素および他の油の生産に重要なコスト削減を実現することができる。リグニンおよび他のセルロース廃棄物を含む糖蜜は、多くの微生物に毒性を有し、それらの増殖を遅延させるが、クロレラ細胞がこの種の毒がある場合にも繁殖するということを見出した。
図23-24は、細胞外ショ糖インベルターゼの存在または不存在下のブドウ糖またはショ糖と比較して、3つのユニークな原料の糖蜜(指定されたBSl、BS2およびHTM)での細胞の増殖を示す。
混合栄養性の増殖は、細胞の増殖と炭化水素の生産のために、光と炭素源の双方をエネルギー源として使用する。混合栄養性の増殖は、フォトバイオリアクターにおいて実行されてもよい。微細藻類は、異なる種類の透明または半透明の材料でできている閉ざされたフォトバイオリアクターにおいて維持されることができ、増殖することができる。
この種の材料は、プレキシグラス(Plexiglas)(R)エンクロージャ、ガラスエンクロージャ、透明または半透明のパイプ例えばポリエチレンのような材料から作られるバックおよび他の材料を含むことができる。微細藻類は増殖することができて、水路池、池のような環境、他の閉ざされていない容器のような、開かれたフォトバイオリアクターにおいて維持および増殖することができる。
本発明の方法において役立つ微生物は、世界の全体にわたってさまざまな場所および環境で見つかる。他の種およびそれらの結果として生じる進化の相違からのそれらの隔離の結果として、最適な増殖および脂質および/または炭化水素成分の生成のための特定の増殖培地は、予測が困難である。場合によっては、微生物の特定の種は、ある抑制成分の存在または微生物の特定の種によって必要なある必須栄養的な必要条件の欠如を原因として、特定の増殖培地で増殖することができないかもしれない。
プロセス条件は、特定の用途に適している脂質の収率を増やし、および/または生産コストを減らすように調整されてもよい。例えば、特定の実施形態では、微生物(例えば微細藻類)は、例えば炭素および/または窒素、リンまたは硫黄等の一つ以上の栄養源の限界濃度があり、その一方で、例えばブドウ糖のような固定炭素エネルギーが過剰に提供された条件で培養される。窒素を制限することによって、窒素が過剰に提供されている培地の微生物の脂質収率以上に微生物脂質の収率が増加する傾向がある。具体例において、脂質収率の増加は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%または500%である。微生物は、一部の全体の培養期間の間のまたは全ての期間の間に、栄養分の極限量の存在下で、培養されてもよい。ある特定の実施形態では、栄養分の濃度は、培養期間全体の間に少なくとも二回限界濃度および非限界濃度の間で循環する。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の微生物は、生産する脂質の特性および/または比率を変え、および/または脂質への炭素フラックスを増やすために修飾される。さらに、あるいは代わりに、この経路は脂質の酵素の処理によって生産されるさまざまな炭化水素分子の特性および/または比率を変えるために修飾される。
微細藻類の場合、いくつかの野生型細胞は、すでに良好な増殖特性を有するが、所望の種類または量の脂質を生じない。具体例としては、ピロボツリス(Pyrobotrys)、フォルミディウム(Phormidium)、アグメネルム(Agmenellum)、カルテリア(Carteria)、レポシンシス(Lepocinclis)、ピロボツリス(Pyrobotrys)、ニッツチア(Nitzschia)、レポシンシス(Lepocinclis)、アナバエナ(Anabaena)、エウグレナ(Euglena)、スピロギラ(Spirogyra)、コロコッカム(Chlorococcum)、テトラエドロン(Tetraedron)、オスシラトリア(Oscillatoria)、ファンガス(Phagus)およびクロロゴニウム(Chlorogonium)を含み、それらは地方の汚水または廃水で増殖する上で望ましい増殖特性を有する。
この種の細胞は、クロレラおよび他の微生物の種と同様に、脂質生産特性を改善するために改変されてもよい。望まれる特性は、単位量および/または単位時間の脂質収量、炭素鎖長(例えば、バイオディーゼル生産のために、または炭化水素栄養源を必要としている工業的応用のために)、二重結合または三重結合を減少させ可能であればゼロに、リングおよび環状構造を取り除くかまたは除去して、異なった脂質群のうち特定の種の脂質の水素:炭素比率を増やすことである。加えて、適当な炭化水素を生じる微細藻類は、また、より望ましい炭化水素生成物を得るために改変されてもよい。この種の微細藻類の実施形態は、クロレラ属の種を含む。
特定の実施形態において、枝分かれを制御する一つ以上の鍵となる酵素が、脂質生産を改善するために正の制御または負の制御されてもよい。正の制御は、例えば、転写を増やす強いプロモーターおよび/またはエンハンサー要素を使用し、有益な酵素をコードしている遺伝子が発現される発現コンストラクトを有するように細胞を形質転換することによって実現されてもよい。このようなコンストラクトは、このような選択を目的とすることができるような選択マーカーを含むことができ、コンストラクトを増幅して、コードする酵素の発現量を増加させることができる。本発明の方法に従う正の制御に適している酵素の実施形態は、ピルビン酸をアセチルCoAに変換する役割を担うピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む(微細藻類のいくつかの具体例としては、ジェンバンク登録番号 NP_415392、AAA53047、QlXDMl及びCAF05587を含む)。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの正の制御は、アセチルCoAの生産を増やすことができて、このことにより脂肪酸合成を増やすことができる。アセチル−CoAカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の初期段階に触媒作用を及ぼす。したがって、この酵素は脂肪酸の製造を増やすために正の制御させることができる(微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号BAA94752、AAA75528、AAA81471、YP_537052、YP_536879、NP_045833、及びBAA57908)。脂肪酸産生はまた、脂肪酸合成の間伸長するアシル鎖を担持するアシル担体タンパク質(ACP)の正の制御によって増加させることができる(微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号A0T0F8、P51280、NP_849041、YP 874433を含む)。グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速段階に触媒作用を及ぼす。この酵素の正の制御は、脂肪酸産生を増やすことができる(微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号AAA74319、AAA33122、AAA37647、P44857、及びABO94442)。上述のタンパク質は、クロレラ属の種を含む微細藻類での発現の候補である。
包括的な制御因子は、脂肪酸生合成経路の遺伝子の発現度を調整する。したがって、一つ以上の脂肪酸合成の包括的な制御因子は、最終的には脂質の生産を増加するために、必要に応じて、脂肪酸合成遺伝子の複数の発現をそれぞれ抑制したり増幅したりすることが可能である。具体例としては、例えばSREBP-IaおよびSREBP-Ic(具体的には、ジェンバンク登録番号NP_035610およびQ9WTN3を参照)のようなステロール調節因子結合タンパク質(SREBPs)を含む。包括的な制御因子は、コントロールポイント酵素の調節に関して上述したように正または負の制御を受けることが可能である。
本発明の方法も、例えば脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク登録番号を有する表5の具体例を参照)、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素(ジェンバンク登録番号表6の具体例を参照)、脂肪酸アシルCoA還元酵素(ジェンバンク登録番号表7の具体例を参照)、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ(ジェンバンク登録番号を有する表8の具体例を参照)、脂肪酸アルデヒド還元酵素またはスクアレンシンターゼ遺伝子(ジェンバンク登録番号AF205791を参照)のような炭化水素修飾酵素をコードしている一つ以上の遺伝子を有する形質転換した細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよび自然に共同発現されたACPをコード化している遺伝子、場合によっては他の炭化水素修飾酵素をコードしている一つ以上の遺伝子は、細胞に形質転換することができる。他の実施形態において、ACP及び脂肪酸アシルACPチオエステラーゼが、それらが特定の組織か生物において自然に共同発現するかまたは発現しないかどうかにかかわりなく、2つが微生物および本発明の方法で一緒に使われるときに、他の一つに有利な効果をもたらす親和性を持つ。このように、本発明は、特定の長さの炭素鎖をACPから切断する反応を促進するために相互に親和性を共有する一組の酵素と同様に、自然に共同発現するこれらの一組の酵素を目的としている。
ウンベルラリア・カリフォルニカ(Umbellularia californica)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC49001)
キナモムム・キャンフォラ(Cinnamomum camphora)-ACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q39473)
ウンベルラリア・カリフォルニカ(Umbellularia californica)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q41635)
ミリスティカ・フラグランス(Myristica fragrans)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB71729)
ミリスティカ・フラグランス(Myristica fragrans)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB71730)
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABD83939)
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAD42220)
ポピュラス・トメントサ(Populus tomentosa)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABC47311)
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#NP_172327)
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA85387)
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA85388)
ゴッシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q9SQI3)
クフェア・ランセオラタ(Cuphea lanceolata)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA54060)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC72882)
クフェア・カロフィラ・サブSP・メソステモン(Cuphea calophylla subsp.mesostemon)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABB71581)
クフェア・ランセオレイト(Cuphea lanceolata)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAC19933)
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAL15645)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q39513)
ゴッシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAD01982)
ブドウ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAN81819)
マンゴスチン脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB51525)
カラシナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABI18986)
マドフカ・ロンギフォリア(Madhuca longifolia)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAX51637)
アブラナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABH11710)
イネ(インディカ栽培品種-グループ)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#EAY86877)
イネ(ツバキ栽培品種-グループ)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#NP_001068400)
イネ(インディカ栽培品種-グループ)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#EAY99617)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC49269)
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素。
AAC45217, YPJD47869, BAB85476, YP_001086217, YP 580344, YP 001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP 01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YPJ30411, ZP 01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688, YP_524762, YP_856798, ZP Ol 115500, YPJ)Ol 141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP 01221833, YP 130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634, CAD30694, NP_001063962, BAD46254, NP 001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019, 及び BAC84377
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アシルCoA還元酵素。
NP_187805, ABO14927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL_15288, 及び NP_190042
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ。
NP 850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319, NP 181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP_001420263, EAZ23849, NP_200588, NP 001063227, CAN83072, AAR90847, 及び AAR97643
例えば、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、12の炭素原子を有する脂肪酸をACPから切断するための特異性を有する場合がある。従って、各種実施形態で、微生物は、基質に含まれる炭素原子数に関して酵素活性(例えばACPからの脂肪酸の切断、アシルCoAのアルデヒドまたはアルコールへの還元またはアルデヒドのアルカンへの転換)に触媒作用を及ぼすための特異性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことが可能である。酵素の特異性は、各種実施形態において、8から34の炭素原子に、好ましくは8から18の炭素原子まで、そして、より好ましくは、10から14の炭素原子までを有する基質である可能性がある。最も好適な特異性は、12の炭素原子を有する基質である。他の実施形態において、特異性は、20〜30の炭素原子である可能性がある。
後述するように培養されるときに、微生物は、ACPに結合される脂肪酸を合成し、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼはACPから脂肪酸の切断をし、更なる酵素の処理で、脂肪酸アシルCoA分子を産生する。それが存在するときには、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、アシルCoAからアルコールへの還元を触媒する。同様に、あるときに、脂肪酸アシルCoA還元酵素はアシルCoAのアルデヒドへの還元を触媒する。それらの実施形態において、外来の遺伝子でコードされる脂肪酸アシルCoA還元酵素は、アルデヒド生成物を生産するために存在しまたは発現し、第3の外来遺伝子によってコードされる脂肪酸アルデヒド還元酵素は、アルデヒドからアルコールへの還元を触媒する。同様に、あるときに、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼは、アルデヒドのアルカンまたはアルケンへの転換反応に触媒作用を及ぼす。
いくつかの微細藻類は、大量の非脂質代謝物(例えば多糖)を生じる。多糖類合成は細胞が利用できる全代謝エネルギーの重要な一部を使用することができるので、スクリーニングによって、多糖類生産能を減少または除去され、脂質のより高い収率を生じることができる新しい株を用いる。
フェノール分析法は炭水化物を検出する(Hellebust, Handbook of Phycological Methods, Cambridge University Press, 1978。及び、Cuesta G., et al., J Microbiol Methods. 2003 Jan;52(l): 69-73を参照)。
1,6ジメチル・メチレンブルー分析は、アニオン性多糖を検出する(例えば、Braz J Med Biol Res. 1999 Mayや32(5): 545-50。Clin Chem. 1986 Nov; 32(11): 2073-6を参照) 。
多糖類は、また、ゲル電気泳動を使用して検出されてもよい(例えば、Anal Biochem. 2003 Oct 15; 321(2): 174-82; Anal Biochem. 2002 Jan l;300(l): 53-68を参照)。
VI脂質および炭化水素を回収する方法
プロテアーゼは、タンパク質を分解させるために、タンパク質を含んでいる炭化水素標品に加えられることができる(例えば、ストレプトマイセス・グリセウスからのプロテアーゼが、使われてもよい(SigmaAldrichのカタログ番号 P5147))。
分解後、炭化水素は、残余タンパク質、ペプチド断片およびアミノ酸から精製されることが好ましい。この精製は、例えば、上述するような遠心分および濾過のような方法によって達成されてもよい。
「細胞を溶解させる」という章の題名にて説明したように、細胞は最初に崩壊する、そうすると、細胞外の炭化水素と同様に細胞内及び細胞膜/細胞壁に結合される炭化水素は、上述したような遠心分離を用いて細胞量の全体から集めることができる。
炭化水素はまた、液化(Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4): 269-274を参照)、油化(例えば、Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738を参照)、及び、超臨界CO2抽出(例えば、Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334を参照)を使用して抽出されてもよい。
A.細胞を溶解される
一度抽出されると、脂質および/または炭化水素は油、燃料または油脂化学製品を生産するために精製される。
場合によっては、分離は、濃縮した沈殿を生成するために、遠心分離によって行われる。
遠心分離は、微生物から細胞内水の有意な量を取り除かなくて、乾燥工程ではない。バイオマスは、それから、培地および破片を取り除くために、洗浄水(例えば脱イオン水)によって洗われることができる。任意に、洗われた微生物菌は、また、細胞破壊の前に乾燥することができる(オーブンで乾燥され、凍結乾燥されて等)。あるいは、発酵が完全なときに、細胞は培地の一部または全てからの分離なしで溶解することができる。例えば、細胞が溶解するときに、細胞が細胞外の液体に1:1より少ないv:vの細胞の比率であることができない。
1. 熱によって誘発された細胞溶解
2. 塩基を使用している細胞溶解
3. 酸性の細胞溶解
4. 酵素を使用している細胞を溶解させること
a)セルラーゼ
b)プロテアーゼ
使われてもよい他のプロテアーゼは、アルカラーゼ2.4 FG(ノボザイム)及びフラボウルザイム 100L(ノボザイム)を含む。
c)組み合わせ
5. 超音波を使用している細胞を溶解工程
6. 機械細胞溶解
7. 浸透圧ショック(細胞崩壊)によって細胞を溶解させること
8. 溶菌ウイルスへの感染
したがって、感受性の微細藻類も、培地を適切なクロレラウイルスで感染することによって溶解することができる。クロレラの種をクロレラウイルスに感染させる方法は、公知である。例えば、Adv. Virus Res. 2006;66:293-336、 Virology, 1999 Apr 25;257(l): 15-23、Virology, 2004 Jan 5;318(l): 214-23、Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2、J Virol. 2006 Mar;80(5): 2437-44、及び Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447- 94 を参照。
9. 自己消化(溶解遺伝子の表現度)
本実施形態において、本発明による微生物は、微生物を溶解させる溶解タンパク質を生産するために遺伝子工学による。この溶解遺伝子は、細胞が発酵槽の望ましい密度に最初に増殖することができるために、誘導性プロモーターを使用して発現することができる。そして、細胞を溶解させるために溶解遺伝子を発現するためにプロモーターの誘導が続く。
実施形態において、溶解遺伝子は、多糖類分解酵素をコードする。
クロレラウイルスからの溶解遺伝子は、公知である。例えば、Virology 260, 308-315 (1999)、FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45- 53、Virology 263, 376-387 (1999)、及び Virology 230, 361-368 (1997)を参照。
B.脂質および炭化水素の抽出
VII 脂質および炭化水素処理の方法
A.酵素の変更態様
B.温熱性および他の触媒の変更態様
触媒は、違方性のまたは非対称の結果としてなるシリカアルミナまたはゼオライト、あるいは、カルボカチオンおよび水素化物アニオンに結果としてなる炭素-炭素結合の破損であることができる。これらの反応中間体は、他の炭化水素で、水素移転か転移を起こす。この反応は、このように、自殖性連鎖機構に結果としてなるために、中間体を再生させることができる。炭化水素は、また、任意にはゼロまで、その中の炭素間の二重結合または三重結合の数を減らすために処理されてもよい。炭化水素は、また、リングまたは環状構造をその中で取り除くかまたは除去するために処理されてもよい。炭化水素は、また、水素:炭素比率を増やすために処理されてもよい。これは、水素(「水素化」)の追加および/または炭化水素の「割れ」によるより小さい炭化水素すること、を含むことができる。
他の実施形態では、分画は、例えば有機化合物、熱および/または無機化合物のような他の触媒を有する無機化合物である。バイオディーゼルへの脂質の処理のために、エステル転移反応プロセスが、本願明細書において第IV節にて説明したように、用いられる。
VIII ディーゼル車およびジェットエンジンでの使用に適した燃料を生産する方法
A.バイオディーゼル
バイオディーゼルは、生物分解可能であり、毒性がない。従来のディーゼル燃料を超える、バイオディーゼルの付加的な利点は、低いエンジン摩耗性である。
1. バイオディーゼルの生産
a).一般的な化学プロセス
b)組換リパーゼの使用
エステル交換反応に適したリパーゼ。
黒色麹菌リパーゼABG73614、カンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼB(novozym-435)CAA83122、カンジダ・サイリンドゥラセア(Candida cylindracea)リパーゼAAR24090、カンジタ・リポリティカ(Candida lipolytica)リパーゼ(リパーゼL、天野製薬(株))、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ(例えば、リパーゼ-OF、名糖産業)、ムカー・ミエヘイ(Mucor miehei)リパーゼ(リポ酵母IM 20)、蛍光菌リパーゼAAA25882、A-IOFGリパーゼ(Lilipase A-IOFG)Q7M4U7_1、リゾムカー・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼB34959、リゾープス・オリザエ(Rhizopus oryzae)リパーゼ(リパーゼF)AAF32408、セラチア・マルセスセンス リパーゼ(SM Enzyme)ABI13521、テルモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼCAB58509、リパーゼ P(ナガセChemteX社)およびリパーゼ QLM(名糖産業(株)、名古屋、日本)
この問題は、固定化リパーゼを用いることによって解決された。固定化リパーゼが再利用可能であるからである。しかしながら、リパーゼベースのプロセスが生産コストに関して強塩基プロセスと競合するために、固定化リパーゼの活性は、最小限のサイクル数の間に再利用された後にまで維持されなければならない。
固定化リパーゼは、エステル交換反応において典型的に使用される低級アルコールによって被毒される。米国特許第6,398,707号(2002年6月4日発行、 Wu et al.)は、固定化リパーゼの活性を高めて、活性が低下した固定化リパーゼを再生させる方法について説明する。
付加的な実施形態において、酵素活性は、上記した配列のうちの1つと少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性を有する配列に存在する。そして、これらの全ては、ここで完全に記述したように、本願明細書に参照取り込みされる。
このリパーゼと選択可能なマーカーをコードするDNAは、好ましくは、コドンを最適化したcDNAである。微細藻類で発現のために遺伝子を再コードする方法は、米国特許7,135,290に説明されている。
2. 標準規格
B.再生可能なディーゼル
再生可能なディーゼルを製造するのに適した脂質は、有機溶媒(例えばヘキサン)を使用して微生物バイオマスから抽出するか、又は他の方法(例えば米国特許5,928,696に説明されているもの)によって入手可能である。
例えば、欧州特許出願EP1741768 (A1)、 EP1741767 (A1)、 EP1682466 (A1)、 EP1640437 (A1)、 EP1681337 (A1)、 EP1795576 (A1)、そして、アメリカ特許7,238,277、 6,630,066、 6,596,155、 6,977,322、 7,041,866、 6,217,746、 5,885,440;、6,881,873を参照する
1. 水素処理法
2. ハイドロ処理
いくつかの方法において、水素化および脱酸素は、同じ反応で起こる。他の方法において、脱酸素は、水素化の前に起こる。水素および触媒もある場合には、異性化は、それから任意に実行される。ナフサ成分は、蒸留によって好ましくは取り出される。
実施形態のために、アメリカ特許5,475,160(トリグリセライドの水素化)、5,091,116(脱酸素、水素化およびガス除去)、6,391,815(水素化)、そして、5,888,947(異性化)を参照する。
3. 間接的な融解
C.ジェット燃料
役立つ添加物は、抗酸化剤、静電防止剤、腐食抑制剤および燃料系統糖衣インヒビター(FSII)剤を含むが、これに限定されるものではない。抗酸化剤は、ゴム状になるのを妨げて、通常、例えばAO30、AO31またはAO37のようなアルキル化フェノールに基づく。
静電防止剤は、静電気を消して、スパークするのを妨げる。活性成分としてのジノニルナフタレンスルホン酸(DINNSA)を有するStadis 450が例として挙げられる。例えば、腐食抑制剤、DCI-4Aが一般人で軍の燃料のために使われる、そして、DCI-6Aが軍の燃料のために使われる。FSII剤は、例えば、Di-EGMEを含む。
1. 流動接触分解
他の前処理は、例えば硫黄であるか、酢であるか、窒素であるか、塩化水素酸のような酸を有する脂質組成を接触させることによって、軽度の酸洗浄剤を含むことができる。
接触させることは、外界温度および大気圧で通常希釈した酸性溶液によってなされる。
サイクロンによって分離される触媒は、分離容器に戻され、それからストリッピング・ゾーンに戻される。ストリッピング・ゾーンは、蒸気との逆電流接触によって、触媒の表面から、吸着炭化水素を取り除く。
2. ハイドロ脱酸素
C2-C5オレフィンを生じるために脂質組成を分解することに役立つ典型的なHDOアプリケーションおよび触媒は、米国特許第7,232,935号に記載され、本参照によって完全に組み込まれる。
方法の第二段階、すなわちいわゆる異性化工程においては、異性化は、炭化水素鎖の枝分れのために実行され、低温でのパラフィンのパフォーマンスを高める。
好ましくは、水素化触媒はPd、Pt、Ni、NiMoまたはCoMo触媒に支持され、支持はアルミナおよび/または二酸化ケイ素である。
代表例として、NiMo/Al2O3およびCoMo/Al2O3触媒が用いられる。
異性化工程の触媒層は、並流か逆流方法で作動することができる。
IX. 微生物工学
クロレラ、特にクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)は、本願明細書において説明されている遺伝子工学方法に用いられる好適な微生物である。但し、他のクロレラ種が微生物の他の種類と同様に使われてもよい。
A.発現のためのコドン最適化
B.プロモーター
他の実施形態では、配列番号:3またはクラミドモナス・レインハルヅティ(Chlamydomonas reinhardtii)RBCS2プロモーター(配列番号:4)のいくつかの一部を含む核酸のような、ボツリオコッカス(Botryococcus malate)リンゴ酸酵素のプロモーターである。場合によっては、プロモーターを含んでいる少なくとも10か、20か、30か、40か、50か、60のヌクレオチドまたはより多くのプロモーターを含むの配列が、使われる。クロレラ属の種に内因性の好適なプロモーターは、配列番号:1および配列番号:2である。
クロレラにおいて活性添加されたプロモーターは、例えば、in Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l): 187-94; Plant MoI Biol. 1994 Oct;26(l): 85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(l): 150-9; and Virology. 2004 Jan 5;318(l): 214-23 で参照することができる。
C.選択マーカー
例えば、MoI Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5): 572-9 である。
Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73 (本願明細書において完全に引用したものとする)には、クロレラ・エリプソイデア(Chorella ellipsoidea)形質転換体のための選択マーカーとして、HPT遺伝子の使用が記載される。
Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205 (本願明細書において完全に引用したものとする)には、クロレラ属の種のDTのための選択マーカーとして、Sh bleの使用が報告される。
D.誘導性の発現
E.2つ以上の外来遺伝子の発現
変更は、生産される炭化水素、他の炭化水素と関連して生産される一つ以上の炭化水素種の量および/または微生物において生産される炭化水素種のタイプの量の変化がありえる。
例えば、微細藻類は、TAGsのより高い量および/または割合を生じるために改変されてもよい。
F.区分化された発現
1. 葉緑体での発現
外来DNAでおおわれている高速度タングステン・マイクロ発射体を有する受容細胞の衝撃を使用しているクラミドマナス・レインハルドティ(Chlamydomonas reinhardtii)(緑藻)の葉緑体の安定した形質転換は、記載されていた。
例えば、Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538、Blowers et al. Plant Cell (1989) 1 : 123 132 and Debuchy et al., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809を参照する。
形質転換の技術は、タングステン・マイクロ発射体を使用し、それはKlein et al., Nature (London) (1987) 7:70 73を参照する。
植物および微細藻類のための葉緑体の形質転換の他の方法は、公知である。
例えばアメリカ特許5,693,507、6,680,426並びにPlant Physiol. 2002 May;129(l): 7-12及びPlant Biotechnol J. 2007 May;5(3): 402-12を参照する。
2. ミトコンドリアの発現
3. 小胞体での発現
G.形質転換
簡潔には、0.4ミクロン・タングステン・ビードは、プラスミドでおおわれていた。 3X 107クロレラ・ソロキニアナ(C. sorokiniana)細胞は、選択的でない寒天培地の3枚の中心で広げて、PDS-1000/He バイオリスティック・バーティカル・デリバリー(Biolistic Particle Delivery)(R)システム(バイオラド)で照射される。
室温で15分後に、200μLのPNC(40%のポリエチレングリコール4000、0.8MのNaCl、50Mm CaCl2)が加えられて、室温で30分間穏やかに混合された。この後に、0.6Mのソルビトール/マンニトール溶液、1%のイースト抽出物および1%のブドウ糖で補充される0.6のMlのf/2培地は加えられた、そして、形質転換された細胞は細胞壁再生のために、暗所で12時間25°Cでインキュベートされた。類似した方法は、Huang et al. (2007)(上記) によってクロレラ属の種(Chlorella sp.)DTに第二水銀還元酵素をコードしているトランス遺伝子を導入するために用いた。
丸山その他(2004)によって報告された、Biotechnology Techniques 8:821-826(本願明細書において完全に引用したものとする)、この技術は、安定期の細胞からトランス遺伝子をクロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)c-211-1のプロトプラストにもたらすために用いた準備をする。導かれたプラスミドの一時的発現は、600および900V/cmおよび約400ms間のパルス持続時間で観察され、ここで70-kDaのFITC-デキストランの高い膜透過性で観察された。
また、実施形態を本願明細書において参照。
菌類(例えば、モルチエレラ・アルパイン(Mortierella alpine)、ムカー・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)およびアスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus))のトランス遺伝子の発現の実施形態はまた、文献で見つけることができる(例えば、Microbiology, Jul; 153(Pt. 7): 2013-25 (2007)、Mol Genet Genomics, Jun; 271(5): 595-602 (2004)、Curr Genet, Mar;21(3): 215-23 (1992)、Current Microbiology, 30(2): 83-86 (1995)、Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004)、及び国際特許出願 PCT/JP2004/012021 を参照する。)
大腸菌のようなバクテリアの外来遺伝子の発現の実施形態は、周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press を参照する。
X.実施例
以下のクロレラ種および株は、培養された。
クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)(263、397、398、2228株)。クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana(1663、1665、1669、1671、1810株)。クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)(2911、2469株)。クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(31、249、250、264株)。
各々の株は、固体培地から液体培地(2g/Lイースト抽出物、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl2'2H2O、0.3mMのMgSO4"7H2O、0.4mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.43mMのNaCl)に植菌され、75μEm-2s-1の光強度の下で、72時間27℃で、25mlで振盪培養される。これらの培養方法は、2mlの以下のメディアを含む24穴プレートに、mlあたり1x105の細胞の最終的な密度に各々の株に植菌をするために用いた。
(a)基礎培地のみ。(b)基礎培地にさらに0.1%のブドウ糖を加えた。(c)基礎培地に0.5%の試薬級のグリセリン(EM Scienceのカタログ#GX0185-6)。
プレートは、暗所に置かれ、27℃、74時間で振盪培養された。3通りの条件で成育されたそれぞれの株のサンプルは、蒸留水で1.9:1に希釈され、吸光度がMolecular Devices SpectraMax 340PCの600nmで計測された。全ての株は、基礎培地のみと比較してブドウ糖およびグリセリンがある場合に、増殖を示した。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(250株)、#2(264株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(398株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質したプロテオース培地で維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.025g 0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび1リットルにつき2gイースト抽出物から成った(g/L)。バイオディーゼル生産(酸性グリセリン(AG)及び非酸性グリセリン(NAG))からのグリセリン廃棄物は、Imperial Western Products (セルマ、CA、米国)から得られた。「純粋な」または「試薬用」グリセリンは、EM Science(メルクKGAの部門)カタログ#GX0185-6から得られた。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%の純粋なグリセリン
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン
4. プロテオース+1%の純粋なグリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後に加えられた)
5. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
6. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
上澄みを取り除いた後に、細胞沈殿物は、-80℃で、研究室スケール凍結乾燥器(Labconco、MO、米国)において凍結乾燥された。結果は、図1に示される。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(250株)、#3(249株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(397株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地で(実施例2を参照する)に維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なるメディアは、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1 %ブドウ糖
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1 %ブドウ糖に酸味を加えた
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1 %ブドウ糖
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(249株)、#4(31株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(397株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)で維持される。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#2(264株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(398株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)に維持された。
各々の株のために、以下の異なる培地の1mlは、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+1%の純粋なグリセリン
2. プロテオース+1%の非酸性グリセリン
3. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
4. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(249株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(397株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)で維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
脂質%は、乾燥菌体重量によって分離される総脂質量から算出された。結果は、図5に示される。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#2(264株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(398株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2参照)で維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
2. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(250株)、#4(31株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(397株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照する)に維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+2%ブドウ糖
2. プロテオース+1%グリセリン+1%ブドウ糖
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(249株)、#4(31株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(398株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)に維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+2%ブドウ糖
2. プロテオース+ 1%グリセリン+1%ブドウ糖
3. プロテオース+ 1%グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(250株)、#3(249株)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(397株)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)に維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
3. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
4. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
5. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
72時間の最初の増殖の後、1%の(w/v)ブドウ糖は、#2、#4および#6培地に加えられて、さらに24時間培養した。脂質含有量は、全てのサンプル(実施例4を参照)において計量された。結果は、図9に示される。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(STRAIN 250)、#3(STRAIN 249)、#4(STRAIN 31)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(STRAIN 397)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例2を参照)に維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+ 1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+ 1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
3. プロテオース+1%酸性グリセリン+1%ブドウ糖
4. プロテオース+1%酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
5. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
CMVプロモーター、ハイグロマイシン抵抗cDNAおよびCMV 3'UTR(配列番号:5、pCAMBIA138Oベクターの結果、Cambia、キャンベラ、オーストラリア)を含んでいる A BamHI-SacII断片は、pBluescriptのBamHIおよびSacIIサイトにクローンをつくられて、本明細書において、pHygと称される。
クロレラの遺伝子銃による形質転換。
短時間(1-2秒)音波処理の後、DNAコートの分子の10のμlは、キャリア膜に直ちに伝達された。
エレクトロポレーションによるクロレラの形質転換。
ジェノタイピング
PCR状況は、以下の通りだった。
95℃ 5分のx 1サイクル、
95℃ 30秒の−58℃30秒の−72℃ 1分30秒のx 35サイクル、
72℃ 10分のx 1サイクル。
予想される992bp断片は、遺伝子銃の方法で及び単一のエレクトロポレーションのコロニーから、10のコロニーのうちの6つで見つかった。より低いサイズの非特異性のバンドは、全てのレーンに存在した。結果は、図16に示される。
増幅された992bp断片、2つの遺伝子銃のバンドおよびエレクトロポレーションバンドの同一性の確認は、ゲルから切除されて、個々に配列決定された。全3つのバンドの配列は、予想される992bp断片に対応した。(DNA ladder: Bionexus(R)、All Purpose Hi-Lo(R)DNA ladder catalog # BN2050)。
(a)スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)(UTEX 2340)および(b)ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。スピルリナ(Spirulina)の保存種は、スピルリナ(Spirulina)培地で維持された、そして、ナビクラ(Navicula)は土壌抽出物培地(SEM)で維持された。スピルリナ(Spirulina)培地は、162mMのNaHCO3、38mMのNa2CO3、1.9mMのK2HPO4、29mMのNaNO3、5.75mMのK2SO4、17.1mMのNaCl、0.8mMのMgSO47H2O、0.25mMのCaCl22H2O、2mMのNa2EDTA、0.36mMのFeCl3-OH2O、0.21mMのMnCl2-4H2O、0.037mMのZnCl2、0.0085mMのCoCl2-OH2O、0.017mMのNaMoO4-2H2O、0.78のμM CuSO4-5H2O、0.15のμM ZnSO4-7H2O、10のμM H3BO3および0.001mMのビタミンB12から成った。土壌抽出物培地は、2.94mMのNaNO3、0.17のmMCaCl2-2H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mMのK2HPO4、1.29mMのKH2PO4、0.43mMのNaClおよび土壌抽出物から成った。バイオディーゼル生産(酸性グリセリン(AG)及び非酸性グリセリン(NAG))からのグリセリン廃棄物は、Imperial Western Products(セルマ、CA、米国)から得られた。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
(a)
7.スピルリナ(Spirulina)培地+2%ブドウ糖
8.スピルリナ(Spirulina)培地+2%試薬用グリセリン
9.スピルリナ(Spirulina)培地+2%の非酸性グリセリン
10.スピルリナ(Spirulina)培地+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
(b)
1. SEM+2%ブドウ糖
2. SEM+2%試薬用グリセリン
3. SEM+1%試薬用グリセリン+ 1 %ブドウ糖
4. SEM+2%の酸性グリセリン
5. SEM+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. SEM+2%の非酸性グリセリン
7. SEM+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)(UTEX 2552)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地に維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.025g 0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H20および1リットルにつき2gイースト抽出物から成った(g/L)。
各々の増殖条件のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
(a)(b)
1. Proteose +2%ブドウ糖
2. Proteose +2%グリセリン
3. Proteose +2%の酸性グリセリン
4. Proteose +2%の非酸性グリセリン
5. Proteose +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、土壌抽出物培地(実施例13を参照)
各々の増殖条件のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. SEM +2%ブドウ糖
2. SEM +2%グリセリン
3. SEM +2%の酸性グリセリン
4. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
5. SEM +2%の非酸性グリセリン
6. SEM +1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)は、5×105セル/mlの濃度で、ブドウ糖または異なるグリセリン(純粋であるか、酸性か、非酸性)を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet(バークシア、英国)の軌道振盪機によって撹拌された。96時間の後、細胞発育は、乾燥細胞重量(実施例13を参照)で測定された。結果は、図13に示される。
セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)(UTEX 2552)およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の改質プロテオース培地およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(実施例1を参照)の土壌抽出物培地で維持された。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)
5. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
6. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)
1. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
2. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖(72時間の後で加えられた)
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、AlgaeのCulture Collectionから得られた。保存種は、改質プロテオース培地(実施例1を参照)で維持された。
各々の状態のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
4. プロテオース
5. プロテオース+0.5%ブドウ糖
6. プロテオース+0.5%キシロース
7. プロテオース+0.25%ブドウ糖+0.25 %キシロース
結果は、図15に示される。
各々の状態のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース
2. プロテオース+1%ブドウ糖
3. プロテオース+1%フラクトース
材料および方法。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 249)は、3つの50mlのフラスコ中の1%のショ糖を有するプロテオース培地(2.94mMのNaNO3、0.428mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.427mMのNaCl、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、プロテオーゼペプトンlg/L)に、4x105細胞/mlの最終的な菌体密度になるように、摂取された。インベルターゼ(シグマ#14504)は、0.01のU/mlおよび0.05U/mlで培地2つに加えられた。全3つ培地は、暗所で150回転数/分60時間振盪のために大きくなった。
最終的な体細胞数は、暗所で60hrsの振盪後で、全3つの培地で実行された。0.01U/mlおよび0.05U/mlフラスコがそれぞれ1x108および3x108の菌体密度に至るともにに、コントロールフラスコは4.4x105細胞/mlに到達した。各々のフラスコは顕微鏡分析によって実験終了後コンタミネーションを検査されたが、全てがきれいだった。
クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)((a) UTEX 397および(b)UTEX 398)およびクロレラ・フスカ(Chlorella fusca)((a) UTEX 251および(b)UTEX 1801)の培地は、自動栄養の液体培地から50mlのフラスコの10mlのプロテオース+1%のショ糖培地に1×106細胞/mlで植菌された。コントロール培地は、また、プロテオース培地だけを有する同じ密度で植菌された。培地は、暗所で7日間、28℃、250回転数/分で振盪培養され大きくなった。その位置では、菌体密度は血球計数器で測定された。図21-22に示すように、全4つの株は、最初の菌体密度およびプロテオースのみのコントロールと比較してショ糖で増殖した。
植菌のためのクロレラ細胞の準備
クロレラの10mlの液体培地での培養は、固体プロテオースプレートから植菌物を取り出し始められた。培地は、26℃でほぼ2日の間の光において大きくなった。増殖は、750nmの光学濃度計(OD)を使用して細胞乾燥重量を決定することによって測定された。
以下の表13に示すように、5%の原液は、糖に砂糖きびの商業処理から得られるブドウ糖、ショ糖および3つの異なる糖蜜サンプル(BSl、BS2およびHTMにラベルをつけた)によって準備された。全ての株のpHは6-6.6の範囲であることを確かめられた、そして、株はそれからオートクレーブで処理された。
インベルターゼの40単位/mlの原液は、10ミリリットルの蒸留水の400単位/mgのインベルターゼ(シグマ)の1mgを再構成することによって準備された。
10mlの培地は、プロテオースを基礎とする培地で、それぞれが1%の最終的な糖蜜/糖の濃度、0.05単位/mlのインベルターゼ、及びクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の1.0×106細胞/mlで、準備された。
培地は、以下の通りに番号をつけられた。
(1)培地のみのコントロール、
(2)1%のHTM、
(3)1%のBSl、
(4)1%のBS2、
(5)1%のブドウ糖、
(6)1%の蔗糖。
類似したコントロールセットは、また、インベルターゼの追加なしで準備された。培地は、暗所で28℃、250回転数/分、5日間の振盪で大きくなった。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)細胞の増殖は、暗所でそれぞれの栄養源上の5日間の培養に続いて評価された。図23-24に示すように、細胞は、純粋な試薬用ブドウ糖上の増殖のそれと同等の収率を有するショ糖インベルターゼがある場合には、糖蜜に増殖することができる。外来ショ糖インベルターゼを発現するために、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の22の遺伝子工学を例示する
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 250)は、テキサス大学(オースティン、TX、米国)で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地で維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび1リットルにつき2つのgイースト抽出物(g/L)から成る。
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)のインベルターゼの分泌を発現するために、サッカロマイセス・セルビジア(Saccharomyces cerevisiae)SUC2遺伝子は、3つの異なるプロモーターの制御の下に配置された。
35Sカリフラワーモザイクウイルス・プロモーター(CMV)、クロレラウイルス・プロモーター(NC-IA)及びクロレラHUPlプロモーター。
酵母SUC2遺伝子は、クロレラ・プロトセコイデス(C. protothecoides)のために最適化されるコドンの選択性を適応させるために合成されて、インベルターゼの細胞外の分泌を導くために必要なシグナル配列を含む。
各々の構造物は、pBluescript KS+、EcoRI/AscI、Ascl/XholおよびXhoI/BamHIサイトを組み込まれ、特定のプライマーを使用しているPCR ampilicationによって、各々のプロモーター、インベルターゼ遺伝子およびCMV 3'UTRを導入された。
精製されたPCR製品は、順次クローンをつくられた。最終的な構成概念の実例は、図25に示される。
それが6xl06細胞/mlの菌体密度に到達するまで、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)培養は、75μmol光子m-2sec-1の連続照明下で旋回振盪機上の改質プロテオース培地で大きくなった。
短い(1-2秒)音波処理の後、10μlのDNAコートの分子は、キャリア膜に直ちに移転された。
細胞は、滅菌蒸留水で一度洗浄されて、50のμlの培地(1×107セル)で再懸濁されて収集されて、選択的でないプロテオースプレートの3番目の中心に広げられた。細胞は、PDS-1000/He Biolistic Particle Deliveryシステム(バイオラド)で衝突された。破裂板(1100および1350psi)が使われた、そして、プレートはスクリーン/マクロ・キャリヤ組立体の下に9-12cm配置された。細胞は、12-24時間の25℃にリカバーすることができた。
リカバーに応じて、細胞は、ゴムベラでプレートからこすり落されて、培地の100μlを混ぜ合わせられて、1%のショ糖を有する改質プロテオースプレートに広げられた。暗所で25℃7-10日間のインキュベートの後に、形質転換された細胞を発現しているコロニーは、プレートに現れた。
コロニーは、暗所で培養した1%ショ糖を有する改質プロテオースプレートから拾い上げられ、細胞の同一量は1%のショ糖を有する1mlの改質プロテオース液体培地を含んでいる24枚のウェルプレートに移転された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で5日間、Labnet(バークシア、英国)の軌道振盪機によって撹拌された。
速いDNA隔離のために、細胞(サイズのほぼ5-10uL)の量は、50uLの10mMのNa-EDTAにおいて再懸濁された。細胞懸濁液は、10分の間の100℃でインキュベートされて、10秒超音波で破壊された。1分の間の12000gの遠心の後、3uLの上澄が、PCR反応のために使われた。PCR増幅は、DNAサーマルサイクラー(パーキン-エルマーGeneAmp 9600)において実行された。反応混合物(50uL)は、製造業者の指示に従って3uL抽出されたDNA、上述されているそれぞれのプライマー100pmol、200uM dNTP、Taq DNAポリメラーゼ(NEB)の0.5ユニットおよびTaqDNAポリメラーゼ・バッファを含んだ。DNAの変性は、第1のサイクルの間の5分の間の95℃で実行され、それから30秒間実行された。プライマー・アニーリングおよび伸張反応は、それぞれ58℃30秒間、72℃位分間で実行された。PCR製品は、それから、1%のアガロースゲル上でエチジウムブロマイドを用いて着色され視覚化された。図26は、上で識別される遺伝子に特有のプライマーを使用しているクロレラ・プロテコイデス(C. protothecoides)形質転換体のPCR遺伝子型の結果を示す。矢印はPCR製品の予想される寸法を示す、そして、星印は各々のトランスフォーマントからDNAサンプルが予想されるサイズと合うPCR生産物を示していることを表す(V:ベクターのみ、WT:野生型)。
暗所で5日培養の後、遺伝子型が陽性の形質転換体は、暗所で最小の液体プロテオース培地+1%のショ糖上で増殖を示した。その一方で、野生型細胞は暗所の同じ培地でも増殖を示さなかった。
分泌されたインベルダーゼ。
分泌されたショ糖インベルターゼ(サッカロマイセス・セルビジア(Saccharomyces cerevisiae)由来でジェンバンク登録番号 NP_012104)をコードしている遺伝子は、Cauliflower Mosaic Virus 35sプロモーターを所有しているpUC19誘導体と、EcoR I/Asc I及びXho/Sac Iカセットとしての3'UTRからサブクローニングされたpUC191599bp Asc I-Xho断片として新たに合成された。
これらの実験において使用する培地は、液体培地(実施例1を参照)及び最終的な濃度が1%となるショ糖またはブドウ糖で形成する固定炭素源を含む固体培地(+1.5%寒天)であった。この実験において使用する株は、付加的な固定炭素源の非存在下の暗所で基本培地上では増殖しなかった。種は、プレートに打ち出されて、28℃の暗所で増殖される。
一つのコロニーは選ばれて、1%のブドウ糖を含んでいる500mLの液体ベース培地に植菌するために用いて、対数期の半ばまで暗所で培養され、毎日、細胞数を測定した。各々の以下の株は、以前暗所唯一の炭素源としてショ糖上の増殖を見つけるため検査され、増殖を示さなくて、このように分泌されたインベルターゼを有する形質転換体を選択された。
(1)クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)
(2)クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(UTEX 2341)
及び(3)クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)(CCAP 211/15)。
充分な培地は、ほぼ1-5x108の全細胞を与えるために遠心分離された。結果として生じる沈殿物は、加算固定炭素源なし基本培地で洗浄された。細胞は再び遠心分離され、沈殿物は5x107から2×108細胞/mlを与えるのに十分な基本培地の量において再懸濁された。250-1000μlの細胞は、それから、1%のショ糖で補充された固体基本培地に植菌され、無菌のフードのプレート上へ乾燥することができた。プラスミドDNAは、メーカーの推奨(Seashell Technology、ラ・ホーヤ、CA)に従って、金の分子上へ誘発された。形質転換体は、破裂板ホルダから9cmでセットされるマクロ・キャリヤ組立体を有する1350psi破裂板を使用しているバイオラドPDS He-1000の分子デリバリー系を使用して行われた。
形質転換後の、プレートは、28℃暗所でインキュベートされた。全ての株は、多数の形質転換体のコロニーを生成した。コントロールプレートは、インベルターゼを挿入せずに形質転換されるが、同一方法で準備されてもコロニーを含まなかった。
ゲノムDNAは、以下の通りにクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)野生型細胞および形質転換体のコロニーから引き出された。細胞は、100ul抽出緩衝液(87.5mMのトリスCl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS)の中に再懸濁し、逆位を経た混合物と60℃30分間でインキュベートされた。PCRのために、サンプルは、20mMのトリスCl(pH 8.0)で1:100に希釈された。
サンプルは、マーカー遺伝子のためにジェノタイプされた。
プライマー2383(5'CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3')(配列番号:20)及び2279(5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(配列番号:21)は、このジェノタイピングで使用する。
使用するPCRプロフィールは、以下の通りだった。5分間94℃の変性。94℃-30秒、60℃−30秒、72℃−3分、72℃−5分の35サイクル。
図27に示すように、同一のサイズのA帯は、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)のポジティブコントロール(プラスミド)および2つの形質転換体から増幅された。
ゲノムDNAは、以下の通りにクロレラ野生株および形質転換体から抽出された。
細胞は、100ul抽出緩衝液(87.5mMのトリスCl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS)の中に再懸濁されて、逆位を経た混合物と60℃30分間でインキュベートされた。PCRのために、サンプルは、20mMのトリスCl(pH 8.0)で1:100に希釈された。ジェノタイプは、野生株からのゲノムDNA、形質転換体及びプラスミドにされた。サンプルは、マーカー遺伝子のためにジェノタイプにされた。
プライマー2336(5'GTGGCCATATGGACTTACAA 3')(配列番号:22)及び2279(5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(配列番号:21)は、指定されたプライマセット2(1215bpと予想される産物)であった、一方でプライマ2465(5'CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3')(配列番号:23)及び2470(5'CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3')(配列番号:24)は、指定されたプライマセット4(1442bpである予想される産物)であった。
使用するPCRプロフィールは、以下の通りだった。2分の間の94℃の変性。94℃-30秒、60℃-30秒、72℃−1分、30秒、72℃-5分の29サイクル。
分泌されたインベルターゼを含んでいるコントロールプラスミドが、PCRのコントロールとして使われた。図28は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(UTEX 2341)の形質転換体および分泌されたインベルターゼをコードしている遺伝子を有する微細藻類のクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)(CCAP 21 1/15)種を示す。
株及び培養条件
この研究において使用する藻類の種は、下記の表14にリストされて、ブドウ糖の形で外因的に提供されたセルロース系材料および場合によっては付加的な固定炭素を有するProteoseメディアで大きくなった。24の藻類の株がこの研究において使われ、そして、クロレラ、2つのパラクロレラ(Parachlorella)および2つのプロトテカ(Prototheca)および各々の一つのバクテオコッカス(Bracteococcus)及びシュードクロレラ(Pseudochlorella)を含んでいる。酵母(Saccharomyces cerevisiae)(PJ-69-4A株)は、YPD培地(リットルあたり、10g バクトイースト抽出物、20gバクトペプトンおよび20gブドウ糖)で大きくなった。藻類および酵母は、暗所28℃で大きくなった。暗所のセルロース系材料または他の付加的な固定炭素の非存在下でプロテオース培地に対するこれらの株の増殖は、発生しなかったか、極めて最小限であった。
湿式の、爆発されたトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫黄の酸性溶液のトウモロコシ茎葉を料理して、National Renewable Energy Laboratory(Golden, CO)によって準備され、結果として生じる懸濁液を脱水する。メットレール・トレド・モイスチュアー・アナライザを使用して、湿式のトウモロコシ茎葉の乾燥した固体は、24%であると同定された。
100gの湿式のサンプルは最終的な420ml量に脱イオン水の中に再懸濁し、pHは、10N NaOHを使用して4.8に調整した。セルクラスト(R)(ノボザイム)(セルラーゼ)は、 4%の最終濃度になるように加えられ、結果として生じる懸濁液は、50℃72時間で振盪でインキュベートされた。この材料のpHは、それからNaOH(ごくわずかなボリューム変化)で7.5に調整し、0.22umフィルタで殺菌されて濾過されて、-20°Cで保存した。サンプルは、後述するように、Sigmaからヘキソキナーゼ・ベースのキットを使用しているグルコース濃度の決定のために用意されていた。
グルコース濃度は、Sigma Glucose Assay Reagent #G3293を使用して決定された。サンプルは、上述されるように処置され、400倍に希釈された、そして、40μlは反応に加えられた。トウモロコシ茎葉・セルロース化合物準備は、ほぼ23gの/Lのブドウ糖を含むために同定された。
ブドウ糖、キシロースおよび他の単糖糖に対するセルロースの酵素処理および糖化の後、上で準備される材料は、それぞれ24の藻類の株の増殖またはプロテオース培地またはYPD培地の酵母(S. cerevisiae)のための栄養源として評価された。プロテオース培地は、23g/Lの最終的なグルコース濃度(トウモロコシ茎葉のセルロース分解性処置を経て発生するブドウ糖の終濃度)にされ、そして、純粋なブドウ糖および/または脱重合されたセルロース系材料の様々な量を加えることによって、酵母(S. cerevisiae)の培養のためのYPDとした。セルロース系材料の様々な濃度が含まれた。そして、各々の培地で23g/Lのブドウ糖の0、12.5、25、50および100%を提供した。これらの構成要素は下記の表15に示される。適切な培地の1mlは、24穴プレートのウェルに加えられた。YPDの28℃で従属栄養的に増殖する酵母(S. cerevisiae)は、酵母ウェルのための植菌材料(20ul)として用いられた。24の藻類の株のための20マイクロリットルの植菌材料は、20gの/Lのブドウ糖を含んでいるプロテオース培地で混合栄養的に増殖する藻類細胞によって供給された。
株および培養条件
この実施例において使用する藻類の株は、表14(上記)にリストされて、脱重合されたセルロース系材料を備える固定炭素および/または純粋なブドウ糖を加えたプロテオース培地で増殖された。酵母(Saccharomyces cerevisiae)(pJ69-4a株)は、脱重合されたセルロース系材料を備える固定炭素および/または純粋なブドウ糖を加えたYPD培地で増殖した。藻および酵母は、暗所28℃で増殖した。
湿式の、爆発されたトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫黄の酸性溶液のトウモロコシ茎葉を料理して、結果として生じる泥漿を脱水することによって、国立Renewable Energy Laboratory(Golden、CO)によって準備された。スイッチグラスは、また、トウモロコシ茎葉のために同じ方法を利用している国立Renewable Energy Laboratory(Golden、CO)によって準備された。テンサイ・パルプ(ペクチナーゼ処理を経て発生する)は、フレデリック博士のAtlantic Biomass社によって供給された。Mettler Toledo Moisture analyzerを使用して、乾燥した固体は、湿式のトウモロコシ茎葉の24%、スイッチ草の26%およびテンサイ・パルプの3.5%であった。トウモロコシ茎葉またはスイッチグラスの100gの湿式のサンプルは最終的な420ml量に脱イオン水の中に再懸濁された、そして、pHはNaOHイオンを使用して4.8に調整した。ビート・パルプのために、8.8グラムの乾燥した固体は、脱イオン水で350mlに調整した、そして、pHはNaOHイオンで4.8に調整した。全ての栄養源のために、アセレラーゼ1000(R)(Genencor)(セルラーゼ酵素複合体)は、グラム乾燥したバイオマスにつき0.25mlの酵素の比率で使用した。サンプルは、72時間の50℃で振動(110回転数/分)によってインキュベートされた。この材料のpHはそれからNaOH(ごくわずかなボリューム変化を伴う)で7.5に調整された。そして、フィルタが0.22umフィルタによって殺菌されて、下で概説される増殖実験で用いられた。サンプルは、後述するように、Sigmaからヘキソキナーゼ・ベースのキットを使用しているグルコース濃度の決定のために用意された。セルロースの栄養源の同一セットは、また、前記の実施例で上述したセルクラスト(R)(ノボエンザイム)(セルラーゼ)を使用して用意された。
グルコース濃度は、Sigma Glucose Assay Reagent #G3293を使用して決定された。サンプルは、上述する処理をされ、400倍に希釈し40ulは反応に加えられた。トウモロコシ茎葉、スイッチ草およびビート・パルプからのセルロースの準備は、それぞれ、ほぼ23.6、17.1および13.7gの/Lのブドウ糖を含むと同定された。
セルロース源の酵素の脱重合後のブドウ糖、キシロースおよび他の単糖、上で準備される材料は、プロテオースまたはYBD培地で酵母(S. cerevisiae)及び表14にリストされる24の藻類の株の増殖のための栄養源として、評価される。トウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたはビート・パルプ由来のセルロース材料の量を変化させた間、培地は、ブドウ糖を一定濃度含むように改変されていた。プロテオースおよびYPD培地の第1セットは、23.6g/Lの純粋なブドウ糖を含み、一方、培地の第2セットは、トウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびビート・パルプを脱重合した。そして、それぞれは23.6gの/Lのブドウ糖を含んだ。スイッチグラスおよびビート・パルプ培地は、全てのセルロース培地中のブドウ糖を23.6g/Lに維持するために、6.5および9.9gの/Lの純粋なブドウ糖を補充された。適切な培地の1mlは、24穴プレートのウェルに加えられた。28℃のYPDで従属栄養的に増殖する酵母(S. cerevisiae)は、酵母ウェルのための植菌物(20ul)として役立った。
20μlの24藻類の株の植菌物は、20g/lのグルコースを含むプロテオース培地で混合栄養的に増殖される藻類の細胞によって備え、全ての細胞は、二日間暗所でセルロース栄養源の様々な濃度で振盪(300回転数/分)によりインキュベートされた。増殖は、UV分光光度計の750nmで、吸光度の測定によって評価された。驚くべきことに、全ての藻類の株は、アセレラーゼ1000(R)またはセルクラスト(R)によって準備されるトウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびビート・パルプ材に増殖した。そして、100%の発酵性糖がセルロース由来だった培地条件を含んだ。セルロース栄養源および脱重合酵素の組み合わせのない下で、酵母(S. cerevisiae)は、同量の純粋なブドウ糖上での増殖より効率が良く、セルロース系材料の酵母の増殖に対する阻害剤が発酵の生産性に大きな影響を与えることを示す。
藻類の株、脱重合酵素及び100%セルロースから派生した単糖の栄養源の組み合わせは、表16で示すように100%純粋なブドウ糖より効率が良い。
株及び培養条件
下で特定される微細藻類のさまざまな株の種培養は、24穴プレートの1mlの液体培養で始まり、光源下で48時間350回転数/分で撹拌し自動栄養的に増殖した。プレートは、唯一の固定炭素源として1%のブドウ糖、グリセリン、キシロース、蔗糖、フラクトース、アラビノース、マンノース、ガラクトースまたは酢酸塩を含んでいる1.5%のアガロース・ベースの中実のプロテオース培地を有する準備であった。各々の株のために、自動栄養性の24穴プレートからの5μlの培地は、固定培地に植菌された。プレートは、28℃の暗所で7日間インキュベートされ、付加的な固定炭素を含んでいないコントロールプレートと比較しての増殖を調べた。下記の表17に示すように、増殖は、各々のそれぞれの栄養源でテストされる各々の種のために観察された。暗所で付加的な固定炭素の非存在下でプロテオース培地に対するこれらの株の増殖は、発生しなかったか、極めて最小限しかなかった。
細胞製造
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 250)のF-Tankバッチ(約1,200ガロン)は、抽出過程の間のバイオマスを生成するために用いた。バッチ(#ZA07126)は、100時間動作することができた、その間コーンシロップが終了した後に16g/Lでブドウ糖レベルを制御した。残余のブドウ糖レベルは、 2時間後、<0g/Lに落ちた。
これは、最後には102時間齢の結果になった。最終的なブロス容量は、1,120ガロンであった。製造過程の汚染検査および最終的なブロスサンプルの徹底的な分析は、汚染の徴候を示すことに失敗した。培地は、遠心分離され、ドラムは乾燥した。ドラム乾燥細胞は、ヘキサンの中に再懸濁されて、ほぼ1000本バーで均質にされた。ヘキサン抽出は、それから、標準分析法を使用して実行された、そして、結果として生じる藻類のトリグリセリド油は残余のヘキサンで自由であると決定された。
藻類のトリグリセリド油は、ほぼ3%のC18:0、71%のC18:1、15%のC18:2、1%のC18:3、8%のC16:0および2%のその他であった。油は、最初に加水分解を受け、水およびガスに近似の20%の収率損失に結果としてなった。水素異性化は、ガスに対する収率の近似の10%の損失としてそれから実行された。第1の蒸留はそれから、ナフタ分画を取り除くために実行し、目的とする産物を残した。材料のほぼ20%は、この第1の蒸留のナフタを失った。第2の蒸留は、それから、ASTM D975仕様を満たすのに必要な分画を取り除くが、D975蒸留のための90%の位置を満たさなかった底の分画を残すのに十分な温度で実行された。材料のほぼ30%は、第2の蒸留の底の断片に残された。結果として生じる材料は、それから全てのASTM D975仕様を見つけるため検査された。
表18は結果として生じる再生産できるディーゼル製品の沸点配布を示す、そして、表19はASTM D975仕様の遵守のための最終産物の分析の結果を示す。
Claims (402)
- 再生可能なディーゼルを生産する方法であって、
(a)固定炭素源の存在下における微生物群の培養工程と、
(b)培養された微生物から脂質成分から単離する工程と、
及び(c)一つ以上の化学反応によって、単離された脂質成分から直鎖アルカンを生成する工程と、
を含み、
前記(a)の培養工程において、
(i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し、
及び(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、脱重合されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩および前述の任意の組合せを備える群から選択される、
生産方法。 - 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項3に記載の方法
- 前記微生物がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項4に記載の方法
- 前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項6記載の方法
- 前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項8記載の方法
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすること特徴とする、請求項10記載の方法。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項12記載の方法。
- ジェット燃料を生産する方法であって、
(a)固定炭素源の存在下で、微生物群を培養する工程と、
(b)培養した微生物からの脂質を単離する工程と、
及び、(c)一つ以上の化学反応によって、単離された脂質成分から直鎖アルカンを生成する工程と、
を含み、
前記(a)工程において、
(i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し
及び(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、脱重合されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩および前述の任意の組合せを備える群から選択される、
生産方法。 - 前記微生物が微細藻類であるであることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項15記載の方法。
- 前記微生物が、クロレラ属の一種であることを特徴とする、請求項16記載の方法
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ(Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項19記載の方法
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項21記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項21記載の方法
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項23記載の方法。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 前記脂肪経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項25記載の方法。
- 請求項1の方法によって製造される液体炭化水素の組成であって、前記組成がASTM D975の仕様に合致する組成物。
- 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項28記載の組成物。
- 前記微生物が。クロレラ(Chlorella)属の一種であることを特徴とする、請求項29記載の組成物。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項30記載の組成物。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項32記載の組成物。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項34記載の組成物。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項36記載の組成物。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 前記脂肪経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項38記載の組成物。
- 請求項14の方法によって製造される液体炭化水素の組成であって、前記組成がASTM D1655の仕様に合致する組成物。
- 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類であることを特徴とする、請求項41の組成物。
- 前記微生物が、クロレラ(Chlorella)属の一種であることを特徴とする、請求項42記載の組成物。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項43記載の組成物。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項45記載の組成物。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項47記載の組成物。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項40記載の組成物。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすること特徴とする、請求項49記載の組成物。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項40記載の組成物。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項51記載の組成物。
- 同じ種の野生株細胞に比べて異なるレベルで、脂質経路酵素の発現するように、遺伝的に改変および/または選択された、微細藻類細胞または酵母細胞。
- 前記細胞が、前記細胞と野生株の細胞とを同一条件下で生育させた場合に、野生株の細胞と比べて多くの脂質を生産することを特徴とする、請求項53記載の細胞
- 前記細胞が、野生種の株より高いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選択されたことを特徴とする、請求項53の細胞。
- 前記脂質経路酵素が、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項55記載の細胞。
- 前記細胞が、野生種の株より低いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選択されたことを特徴とする、請求項53記載の細胞。
- 前記脂質経路酵素が、クエン酸塩シンターゼを備えることを特徴とする、請求項57記載の細胞。
- 前記細胞が、野生種の細胞と比べて複数の脂肪酸合成遺伝子の発現量が異なる細胞であって、遺伝的に改変および/または遺伝的に選択されることによって野生種の細胞と比べて脂肪酸合成系の調節因子の発現量が異なることを特徴とする、請求項53記載の細胞
- 前記脂質経路酵素が、脂肪酸を修飾する?酵素から成ることを特徴とする、請求項53記載の細胞。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素およびグリセロ脂質不飽和酵素から選ばれることを特徴とする、請求項60に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項53に記載の細胞。
- 前記微細藻類がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項62記載の微細藻類細胞。
- 前記微細藻類細胞が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項63に記載の微細藻類細胞。
- 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボキシラーゼおよびアシル担体タンパク質を備える群から選択される一つまたは複数のタンパク質をコードする外来遺伝子を、一以上含む石油生産微生物。
- 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項65記載の微生物
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項67記載の微生物。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項69記載の微生物。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項71記載の微生物。
- 前記微生物がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項72に記載の微生物。
- 前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)であることを特徴とする、請求項73記載の微生物
- 前記外来性遺伝子が、プロモーターと作動可能に結合する遺伝子であって、前記プロモーターが刺激への応答によって誘導又は抑制されることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 前記刺激が、外部から投入された小さい分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択されることを特徴とする、請求項75に記載の微生物。
- 前記外来遺伝子が、細胞区画で発現することを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 前記細胞区画が、葉緑体およびミトコンドリアを備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項77に記載の微生物。
- 前記外来の遺伝子が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
- 外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが、アシル担体タンパク質(ACP)より8からの18の炭素数の脂肪酸への切断を触媒することを特徴とする、請求項79に記載の微生物。
- 外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼは、ACPを10から14の炭素数の脂肪酸への切断を触媒することを特徴とする、請求項80に記載の微生物。
- 外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼは、12の炭素数の脂肪酸への切断を触媒すること特徴とする、請求項82に記載の微生物。
- 前記外来の遺伝子が、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、20から30の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項83記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項83記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項85記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項86に記載の微生物。
- 前記外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルデヒドへの還元を触媒することを特徴とする、請求項88記載の微生物。
- 前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項86に記載の微生物。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項65記載の微生物。
- 2つの外来遺伝子を含む微生物であって、前記外来遺伝子の第1遺伝子が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードし、前記外来遺伝子の第2の遺伝子が脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素およびアシル担体タンパク質を備える群から選択されるタンパク質をコードする微生物。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項94に記載の微生物
- 前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項96に記載の微生物
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項92に記載の方法。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項98に記載の方法。
- 前記の種が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項99に記載の微生物。
- 前記の種が、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)であることを特徴とする、請求項100に記載の微生物。
- 前記2つの外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結する遺伝子であって、前記プロモーターが刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記各々のプロモーターが同一の刺激に応答して誘導されうることを特徴とする、請求項102に記載の微生物。
- 前記チオエステラーゼが、第1の外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒することを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする遺伝子であって、前記還元酵素が8から18炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元することを特徴とする、請求項104に記載の微生物。
- 前記チオエステラーゼと前記還元酵素とが同一炭素鎖に作用する微生物であって、前記チオエステラーゼが、第1の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記還元酵素が第2の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項105に記載の微生物。
- 前記チオエステラーゼが、第1外来遺伝子にコードされ、12炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、前記還元酵素が、第2の外生の遺伝子にコードされ、12-カーボン脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項106に記載の微生物。
- 前記第2の外来遺伝子が、脂肪アセチルCoA還元酵素をコードし、前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応するアルデヒドへの還元を触媒する、請求項104に記載の微生物。
- 前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードする請求項92記載の微生物であって、さらに脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第3の外来遺伝子を含む微生物。
- 前記チオエステラーゼと前記還元酵素と前記デカボニラーゼとが同一炭素鎖長に作用する微生物であって、第1外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒する前記チオエステラーゼと、第二外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応する脂肪酸アルデヒドへの還元を触媒する前記還元酵素と、第3外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アルデヒドから対応するアルカンに転換する前記デカルボニラーゼを含む、請求項109に記載する微生物。
- 前記微生物が、さらに一つ以上の外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
- 前記第2の外来遺伝子が、アシル担体タンパク質をコードし、前記アシル担体タンパク質が自然に同時発現する、請求項92に記載の微生物。
- 前記第2の外来遺伝子がアシル担体タンパク質をコードし、脂肪酸アシルCoA還元酵素および脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を備える群から選択した酵素をコードする第3の外来遺伝子をさらに含む、請求項92に記載の微生物。
- 前記第3の遺伝子が脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードし、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の外来遺伝子をさらに含む、請求項113に記載の微生物。
- 微生物群で分子を生産する方法であって、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程からなり、前記微生物は、
(i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および(ii)脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、
ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質(ACP)、ACPから脂肪酸を切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法。 - 前記微生物が、微細藻類である、請求項115に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母である、請求項115に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項117記載の方法。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴そる、請求項115に記載のほう方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項119に記載の方法。
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項115に記載の方法。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項121記載の方法。
- 前記の種が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項122に記載の方法
- 前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)であることを特徴とする、請求項123記載の微生物。
- 前記培地が、グリセロールを含むことを特徴とする、請求項115に記載の方法。
- 前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項125記載の方法。
- 前記培地が、グリセロール及び一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項125記載の方法。
- 少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項127記載の方法。
- 前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項127に記載の方法。
- 前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、発酵期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項127に記載の方法。
- (a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合、微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源は、第1の期間の終わりに形成される工程と、
及び(c)微生物が、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合には、第2の期間中培養される工程と、を含むことを特徴とする、請求項127記載の方法。 - 前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される、方法であって、
第1の刺激を提供する工程と、
及び、アルコールを生産するために、第1の刺激存在下で、第1の期間中の微生物群を培養する工程と、をさらに含む請求項115に記載の方法。 - 水性バイオマスからアルコールを抽出する工程をさらに含む、請求項132に記載の方法。
- 第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項115に記載の方法。
- 第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼがACPより10から14の炭素数の脂肪酸を切断することを触媒し、及び第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項134に記載の方法。
- 第1の外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼがACPより12炭素数の脂肪酸を切断することを触媒し、第2の外来遺伝子にコードされる前記還元酵素が12炭素数の脂肪酸アシルCoAよりドデカノールに還元することを触媒することを特徴とする、請求項135に記載の方法。
- 前記微生物がアシル担体タンパク質をコードする第3の外来遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項115記載の方法。
- 前記第3の外来遺伝子がアシル担体タンパク質をコードし、前記アシル担体タンパク質が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現することを特徴とする、請求項137記載の方法。
- 微生物群で脂肪分子を生産する方法であって、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程を含み、前記微生物は、
(i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および(ii)脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、
ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質(ACP)、ACPから脂肪酸を切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法。 - 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項139に記載の方法
- 前記真菌が、真菌であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項143に記載の方法
- 前記微生物が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項145記載の方法。
- 前記種が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項146に記載の方法。
- 前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)であることを特徴とする、請求項147に記載の微生物。
- 前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される、方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及び、アルデヒドを生産するために第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項115に記載の方法。 - 水性バイオマスからアルデヒドを抽出する工程をさらに含む、請求項149に記載の方法。
- 第1の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルデヒドに還元し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖上に作用することを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記微生物が、アルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカボニラーゼをコードする第3の遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項139に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及びアルカンを生産するために第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項152に記載の方法。 - 水性バイオマスからアルカンを抽出する工程をさらに含む、請求項153に記載の方法。
- 第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応を触媒し、第3の外来遺伝子によってコードされるデカルボニラーゼが8から18の炭素数のアルデヒドを対応するアルカンへ転換する反応を触媒し、前記チオエステラーゼ、前記還元酵素及び前記デカルボニラーゼが同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項152に記載の方法。
- 前記微生物が、アシル担体タンパク質をコードする第3の外来遺伝子をさらに含む、請求項139に記載の方法。
- 第3の外来遺伝子にコードされる前記アシル担体タンパク質が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現する、請求項156に記載の方法。
- 前記微生物が、アルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項156に記載の方法。
- 前記培地がグリセロールを含む、請求項139に記載の方法。
- 前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項159記載の方法。
- 前記培地が、グリセロール及び一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項159に記載の方法。
- 一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項127記載の方法。
- 前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項161に記載の方法。
- 前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、発酵時期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項161に記載の方法。
- (a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に、微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び(c)微生物が一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に、第2の期間中培養される工程と、を含むことを特徴とする、請求項161に記載の方法。 - 培地中で脂肪を生産する微生物の群を培養する工程を含む、微生物群中の特定の炭素鎖を有する脂肪酸分子を生産する方法であって、
前記微生物が特定の炭素鎖への活性を有する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードする外来の遺伝子を含み、
並びに前記微生物がアシル担体タンパク質と及びチオエステラーゼを合成し、
前記アシル担体タンパク質は脂肪酸と結合し、
前記チオエステラーゼは脂肪酸を特定の炭素鎖へ合成するときにACPより脂肪酸を切断する反応を触媒する、生産方法。 - 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項168に記載の方法。
- 前記真菌が、真菌であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項170に記載の方法。
- 前記微生物が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項166に記載の方法。。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項172に記載の方法。
- 前記種が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項173に記載の方法。
- 前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)であることを特徴とする、請求項174に記載の微生物。
- 前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及び、第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項152に記載の方法。 - 水性バイオマスから脂肪酸を抽出することをさらに含む、請求項176に記載の方法。
- 前記微生物が、アシル担体タンパク質をコードする第2の外来遺伝子をさらに含む、請求項166に記載の方法。
- 脂肪酸アシル担体タンパク質をコードする前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現することを特徴とする、請求項178に記載の方法。
- 前記アシルACPチオエステラーゼが、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒することを特徴とする、請求項166記載の方法。
- 前記培地が、グリセロールを含むことを特徴とする、請求項166に記載の方法。
- 前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項181記載の方法。
- 前記培地が、グリセロール及び少なくとも一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項181記載の方法。
- 一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項183記載の方法。
- 前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項183に記載の方法。
- 前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源が、発酵時期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項183に記載の方法。
- (a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び(c)微生物が、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に第2の期間中培養される、ことを特徴とする、請求項183に記載の方法。 - 外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記外来遺伝子がコードするタンパク質が、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼまたは多糖類分解酵素を備える群から選択される、微細藻類細胞。
- 前記微細藻類が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
- 前記微細藻類が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項189に記載の微細藻類細胞。
- 前記種が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項173に記載の方法。
- 前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)であることを特徴とする、請求項191に記載の微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結することを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
- 前記プロモーターが刺激に応答して誘導か抑制できることを特徴とする、請求項193に記載の微細藻類細胞。
- 前記刺激が外部から投入された小さい分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択されることを特徴とする、請求項194に記載された微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が、細胞区画において発現されることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
- 前記細胞区画が、葉緑体およびミトコンドリアを備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項196に記載のの微細藻類細胞。
- 前記遺伝子がリパーゼをコードし、前記リパーゼが表9から選択されるリパーゼと少なくとも70%以上のアミノ酸相同性を有する、請求項188記載の微細藻類細胞。
- 前記リパーゼが、ノボザイム435(novozym-435)であることを特徴とする、請求項198に記載の微細藻類細胞。
- 前記遺伝子が、多糖類分解酵素をコードすることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
- 前記多糖類分解酵素が、クロレラウイルスに内在していることを特徴とする、請求項200に記載の微細藻類細胞。
- 2つの外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記第一外来遺伝子がリパーゼをコードし、前記第1の遺伝子が多糖類分解酵素をコードする、微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結することを特徴とする、請求項202に記載の微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターは刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項203に記載の微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記結合は同一の刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項204に記載の微細藻類細胞。
- 前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記結合は一つ以上の刺激に応答して誘導され、前記刺激はほかのプロモーターを誘導しないことを特徴とする、請求項204に記載の微細藻類細胞。
- 脂質分子を微生物内で製造する方法であって、
(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間の間の微生物を培養する工程と、
(b) 刺激を加える工程と、
及び、(c)刺激が存在する第2の期間の間の微生物を培養する工程と、
を含む方法であって、
前記(a)の培養工程は、
(i) 外来遺伝子がリパーゼをコードし、
および/または(ii)外来遺伝子が多糖類分解酵素をコードし、
前記外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターは刺激に応答し誘導されることを含む、製造方法。 - 微生物内で脂質分子を製造する方法であって、
(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間中に脂質を製造する微生物を培養する工程と、
(b) 微生物と直接接触したときに、微生物に感染し溶解させることができるウイルスを提供する工程と、
及び、(c)第2の期間中、水性バイオマスの溶解を生成するために微生物を培養する工程、を含む製造方法。 - 溶解した水性バイオマスから脂質分子を抽出する工程を、さらに含んでいる請求項208に記載の方法。
- 外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記外来遺伝子が脂質経路酵素のための補因子をコードする、または前記外来遺伝子が補因子の合成に関与するタンパク質をコードする、微細藻類細胞。
- 脂質を生産する微生物を培養する方法であって、脂質経路酵素のための補因子の非存在下よりも微生物由来脂質を増やすために、前記補因子が十分な量があるときに微生物を培養する工程を含む方法。
- 前記補因子が、一つ以上の脂質経路酵素に必要とされるビタミンであることを特徴とする、請求項211に記載の方法。
- 前記補因子が、ビオチンであることを特徴とする、請求項211に記載の方法。
- 前記補因子が培地中に含まれる微生物によって提供される工程を含み、前記微生物が補因子を製造するように遺伝的に改変されたことを特徴とする、請求項211に記載の方法。
- 微生物にエネルギー源としてブドウ糖およびキシロースの混合物を提供する工程を含む、微生物での発酵方法。
- 前記混合物がリグニンをさらに含む、請求項215に記載の方法。
- 前記混合物がフルフラールの一種をさらに含む、請求項215に記載の方法。
- 前記混合物が脱重合されたセルロース材料であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
- 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
- 前記微細藻類が表1から選択される、請求項219に記載の方法
。 - 前記微細藻類がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項220に記載の方法。
- 前記微細藻類がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項221に記載の方法
- 前記の微細藻類が、バクテリオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトテコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、pロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項220に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項224に記載の方法。
- 前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項226に記載の方法。
- 前記混合物がショ糖資化性酵素をさらに含む、請求項215に記載の方法。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項228に記載の方法。
- 前記微生物が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素またはショ糖資化性酵素の少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変される、請求項215に記載の方法。
- 前記混合物がショ糖インベルターゼを含む、請求項228に記載の方法。
- 微細藻類を培養する方法であって、セルロース材料、五糖類、六糖類および酢酸塩を備えるグループから選択される少なくとも一つの炭素基質を含む培地で培養する工程を含む、培養方法。
- 前記炭素基質はブドウ糖であり、前記微細藻類はクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)を備える群から選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質はキシロースであり、前記微細藻類はクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、プロトテカ(Prototheca)を備える群から選択される属である、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質がショ糖であり、前記微細藻類は、クロレラおよびブラクテオコッカス(Bracteococcus)を備えるグループから選択される属である、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質がフルクトースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)を備えるグループから選択される属である前記請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質がアラビノースであり、前記微細藻類はクロレラ属の種である、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質がマンノースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)を備える群から選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質がガラクトースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)を備える群から選択される属の中であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
- 前記炭素基質が酢酸塩であり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)およびプロトテカ(Prototheca)を備えるグループから選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
- 前記培地が、ショ糖資化性酵素をさらに含む、請求項232に記載の方法。
- 前記微細藻類は、クロレラ属である、請求項241に記載の方法。
- 前記微細藻類が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、ショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする、請求項242に記載の方法。
- 前記培地が、ショ糖インベルターゼを含む、請求項241に記載の方法。
- 前記微細藻類を表1から選ぶ、請求項232に記載の方法。
- 微細藻類を培養する方法であって、脱重合されたセルロース材料存在下において、複数の微細藻類細胞を播種することを含む、培養方法。
- 前記微細藻類が、グリセロール、ショ糖、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組合せを備える群から選択される添加された固定炭素源存在下で、培養される、請求項246に記載の方法。
- 前記微細藻類が、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)属の種、クロレラ属の種、パラクロレラ(Parachlorella)属の種、シュードクロレラ(Pseudochlorella)属の種、プロトテカ(Prototheca)属の種、またはセネデスムス(Scenedesmus)属の種を備える群から選択される、請求項246に記載の方法。
- 前記微細藻類は、バクテリオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトテコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項248に記載の方法。
- 前記微細藻類が、ショ糖資化性酵素の存在下で培養される、請求項246に記載の方法。
- 前記微細藻類が、クロレラ属である、請求項250に記載の方法。
- 前記微細藻類が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、またはショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されている、請求項246に記載の方法。
- 少なくとも一つの前記ショ糖資化性酵素がショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項250に記載の方法。
- 少なくとも一つの前記脂質修飾酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼから選択されることを特徴とする、請求項252に記載の方法。
- 少なくとも一つの前記炭化水素修飾酵素が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質から選択される、請求項252に記載の方法。
- 脂質を製造する微生物を培養する方法であって、酢酸存在下で且つ固定された窒素源の不存在下において、微生物を培養する工程を含む方法。
- 前記微生物が、酢酸不存在下よりも微生物由来脂質量を増やすために酢酸存在下で培養され、前記培養条件以外は二つの培地間で同一である、請求項256に記載の方法。
- (a) 微生物の群、
及び、(b)ブドウ糖、キシロースおよびリグニンを備える群から選択される分子、並びにフルフラールの種を備える培地、を含む微生物培養物。 - 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項259に記載の微生物培養物。
- 前記微生物が、クロレラ属の種である、請求項260に記載の微生物培養物。
- 前記微生物がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項262に記載の微生物培養物。
- 前記微生物は、バクテリオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトテコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項248に記載の方法。
- 前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項264に記載の微生物培養物。
- 前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項266記載の微生物培養物。
- 前記微生物が少なくともいつ以上の外来ショ糖資化性遺伝子を含む、請求項258に記載の微生物培養物。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
- 前記微生物が脂質経路酵素をコードする少なくとも一つ以上の外来遺伝子を含むことを特徴とする、微生物培養物。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項270に記載の微生物培養物。
- バイオディーゼルを製造する方法であって、
(a) 脂質を生産する微生物を第1の微生物培養で培養する工程と、
(b) 第1の微生物培養によってできるバイオマスから脂質を回収する工程と、
(c)脂質をエステル転移し、脂肪酸エステルおよびグリセロールを生産する工程と、
並びに(d)グリセロールを第2の微生物培養に加える工程、を備える製造方法。 - 前記第1微生物培養方法および前記第2微生物培養方法が、同一種の微生物を培養することを特徴とする、請求項272に記載の方法。
- 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項274に記載の方法。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項275に記載の方法。
- 前記微生物がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項276に記載の方法
- 第2の微生物培養方法が、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)を備えるグループから選択される微生物を含む、請求項272に記載の方法。
- 微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項279に記載の方法
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項281に記載の方法
- 前記微生物が少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項272に記載の方法。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項283に記載の方法。
- 微生物が脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含む、請求項272に記載の方法。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項285に記載の方法。
- グリセロールおよびグリセロール以外の固定炭素源存在下で微生物を培養することを含む、発酵方法。
- 前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源が、予め定められた比率で同時に微生物に提供される、請求項287に記載の方法。
- 前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源の全部が、発酵の開始期に微生物に提供される、請求項288に記載の方法。
- 前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源の全部が発酵期を経過して、あらかじめ定められた率で微生物に与えられる、請求項288に記載の方法。
- (a) グリセロールが、第1の期間中、グリセロール以外の固定炭素源がない場合、微生物に提供する工程と、
(b) グリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び、(c)微生物が、グリセロール以外の固定炭素源存在下において、第2の期間中、培養される工程を含む、請求項287に記載の方法。 - グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第2の期間中、予め定められた率で微生物に供給される、請求項291に記載の方法。
- グリセロール以外の固定された前記炭素源の全てが、第1の期間の終わりに微生物に提供される、請求項291に記載の方法。
- (a) グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第1の期間中、グリセロール不存在下、微生物に提供される工程と、
(b) グリセロールが、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び(c)微生物が、グリセロール存在下、第2の期間の間培養される工程を含む、請求項287に記載の方法。 - 前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
- 前記微細藻類が、表1から選ばれることを特徴とする、請求項295に記載の方法。
- 前記微細藻類が、クロレラ属であることを特徴とする、請求項295に記載の方法。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項297に記載の方法。
- 前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項299に記載の方法
- 前記微生物が真菌である、請求項287に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項301に記載の方法
- 前記微生物が少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項287に記載の方法。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項303の方法。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含む、請求項287に記載の方法。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項305に記載の方法。
- 前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項287に記載の方法。
- 前記グリセロールが酸性であることを特徴とする、請求項307に記載の方法。
- 前記グリセロールが非酸性であることを特徴とする、請求項307に記載の方法。
- 他の固定炭素源が、ブドウ糖であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
- 他の固定炭素源が、脱重合されたセルロース材料であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
- 他の固定炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
- (a) 微生物の群、
(b) グリセロール、
及び、(c)少なくとも一つの糖がキシロース、ブドウ糖およびショ糖を備える群から選択された、から成る発酵槽。 - 前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物であることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
- 前記微生物が微細藻類である、請求項の中で発酵槽。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項315に記載の発酵槽。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項316に記載の発酵槽。
- 前記微生物がクロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項317に記載の方法。
- 前記微生物が、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
- 前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項313記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項320に記載の方法
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項322記載の発酵槽。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項324に記載の発酵槽。
- 前記微生物が、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項326の中で発酵槽。
- 固定炭素源を唯一の原料として、エステル転移反応の工程の副産物であるグリセロールを提供する工程、を含む微生物での発酵方法。
- 光のエネルギーが微生物に提供されないことを特徴とする、請求項328に記載の方法。
- 光のエネルギーが微生物に提供されることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
- 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項331に記載の方法。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項332に記載の方法
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項333に記載の方法。
- 前記微生物がパラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)から選ばれることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
- 前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項336に記載の方法。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項336に記載の方法
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項338に記載の方法
- 前記微生物が少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含む、請求項328に記載の方法。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項340に記載の方法。
- 前記微生物が脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含む、請求項328に記載の方法。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項342に記載の方法。
- 外来のショ糖資化性遺伝子を含む微生物。
- 前記遺伝子がショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
- 前記遺伝子が、ショ糖インベルターゼをコードすることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
- 前記遺伝子がフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項347に記載の微生物。
- 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項348に記載の微生物。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項349に記載の微生物
- 前記微生物がクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)を備えるグループから選択される種であることを特徴とする、請求項350に記載の微生物。
- クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)またはクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)の種の細胞であって、前記細胞が外来の遺伝子を含む細胞。
- 前記外来遺伝子がショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素およびフルクトキナーゼを備える群から選択されるタンパク質をコードする、請求項352に記載の細胞
- 前記タンパク質が、細胞外間隙に分泌されるショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項353に記載の細胞。
- 前記タンパク質が、細胞質を目標とされるショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項353に記載の細胞。
- (a) 微生物の群
並びに(b)(i)ショ糖および(ii)ショ糖インベルターゼ酵素から成る培地
を含む、微生物培地。 - 前記微生物が微細藻類である、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項357に記載の微生物培地。
- 前記微生物はクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項358に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項359に記載の微生物培地。
- 前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項361記載の微生物培地。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種を備える群から選択されることを特徴とする、請求項363に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項365に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項366に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖インベルターゼが、外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌型のショ糖インベルターゼであり、微生物群によって発現されることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記微生物は、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項369に記載の微生物培地。
- (a)微生物の群と、
並びに(b)(i)糖蜜および(ii)ショ糖インベルターゼ酵素、
を備える微生物培地。 - 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
- 前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項372に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項373に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項374に記載の微生物培地。
- 前記微生物は油性酵母である、請求項371記載の微生物培地。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項376に記載の微生物培地。
- 前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項378に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項371に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項380に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードする、請求項381に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖インベルターゼが、微生物群によって発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされ、分泌型の酵素であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
- 前記微生物が少なくとも一つの脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項384に記載の微生物培地。
- (a) 微生物の群
及び(b)培地を備える微生物培地であって、
前記培地が
(i)ショ糖を備える培地と、
(ii)リグニンと、
及び(iii)ショ糖インベルターゼ酵素と、を備える微生物培地。 - 前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項387に記載の微生物培地。
- 前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項388に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項389に記載の微生物培地。
- 前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)を備える群から選択されることを特徴とする、請求項391に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記真菌が、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種を備える群から選択されることを特徴とする、請求項393に記載の微生物培地。
- 前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項395に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項396に記載の微生物培地。
- 前記ショ糖インベルターゼが、微生物群によって発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされ、分泌型の酵素であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記微生物が少なくとも一つの脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
- 前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項399に記載の微生物培地。
- (a) ショ糖資化性遺伝子をコードしているcDNA、
及び(b)ハイグロマイシン抗生物質またはG418抗生物質に対する耐性タンパク質をコードしているcDNA、を備える核酸。 - 微細藻類を播種する方法であって、
(a)従属栄養性の増殖を実行することができる微細藻類細胞を提供する工程と、
(b)セルロース材料を含む増殖培地に微細藻類を播種する工程と、
及び(c)細胞が増殖すること可能な十分な期間、微細藻類を培養する工程を含む、培養方法。
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