BRPI0811967A2 - produção de óleo nos micro-organismos - Google Patents

Abstract

produção de óleo em microorganismos a invenção fornece método e composição útil para a produção de óleo, combustíveis, óleos químicos e outros compostos em microorganismos. em particular, a invenção fornece microorganismos oleaginosos e método de cultivo de baixo custo destes microorganismos. a invenção também fornece células microbianas contendo genes exógenos de codificação, por exemplo, uma lipase, transportador de sacarose, invertase sacarose, frutoquinase, um polissacarídeoenzima degradante, acil-graxo tioesterase acp redutase acii-coa/aldeído graxo, acii-coa graxo redutase, aldeído redutase graxo, decarbonilase aldeído graxo e/ou uma proteína transportadora de acil. a invenção também inclui o método de fabricação de combustíveis de transporte, tais como diesel renovável, biodiesel e combustível de aviação renováveis.

Description

PRODUÇÃO DE ÓLEO EM MICROORGANISMOS

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta divulgação diz. respeito à produção de óleos, combustíveis e óleos qmhmcos fabricados a partir de microorganismos. Em particular, a divulgação se relaciona com 5 microorganismos oleaginosos, incluindo microalgas, leveduras e fungos, e cora os métodos de cultivo de tais mi&romgsmssmos pura a produção de compostos úteis, incluindo os iipídeos, éateres de ácidos graxas, ácidos graxos, aldeidos, áleoois e aleanos, para utilização na indústria ou como urna fonte de energia ou dc alimentos. Os microorganismos ds invenção podem ser selecionados ou geneticamente modificados para uso nos métodos nu 1Q outros aspectos da invenção aqui descrita,

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Combnstivs· tóssd è um termo genérico para depósuos geológicos de combustíveis enterrados da materiais orgânicos, formados a parisr de plantas e animais decompostos que foram convertidos era óleo era, carvão , gás natural ou óleos pesados por exposição ao calor 15 e à pressão na crosta terrestre ao longo dc centccas de milhões de anos,

No diálogo comum, o combustível fóssil, também conhecido como combustível mineral, é ullhzado como sinônimo de outros recursos naturais contendo hsdrucarbonems. como carvão, petróleo e gãs natural. A utihzaçào de combustíveis fósseis tem permitido o desenvolvimento industrial em grande escala e em grande parte suplantado os moinhos de 20 água, bens como a combustão de made-ra ou de turfa para, aquecimento. Os combustíveis fosseis são recursos nâo-renovâveis fímtos.

Ns geração de electricidade, a energia da combustão de combustíveis fósseis è muitas vezes usada para alimentar uma turbina. As gerações mais antigas muitas vezes usavam vapor gerado pela quemta do combustível para, girar a turbina mas, em novas plantas 25 de energia, os gases produzidos pela queima do combustível gira uma turbina a gás diretamente. Com a modernização global nos séculos 20 e 21, a sede, de energia proveniente de combustíveis fósseis, especiaímente a. gasolina derivada do petróleo, é uma das causas dos grandes conflitos regionais e globais.

A queima de combustíveis fósseis por seres humanos é a maior fonte dc emissões 30 de dióxido de carbono, um dos gases geradores do eleito estufa, permitindo o fbrçnmento radiativo e contribuindo para o aquecimento global. Nos Estados tinidos, mms de 9f<% das emissões de gases dc efeito estufa são psx-vemeutes da queima de combustíveis fosseis. Além disso, outras poluentes atmosféricos, como oxides de nitrogênio, dióxido dc enxofre, compostos orgânicos voláteis (CGV) s metais pesadas são produzidos.

A atividade humana. aumenta os níveis de gases de efeito estufa, prinuipalniunte pela liberação de dióxido de carbono proveniente da queima de combustíveis fósseis, rnas ouiro.s gases, eotno o metano, ntlo sim negltgenclávcís. As concentrações de muitos dos gases de efeito estufa t&m aumentado so longo du tempo devido às atividades homanas, cotno 9 queiraa de combustíveis fósseis e o desmatameato. levando & alias concentrações de diúxjdo de ca.rbo.au. Segundo a hipótese do ttquecimenio global, gases de efeno estufa 5 proveaieute* da industria e da agricultura têm desctnpeahítdo am papel importante no aquecimento global observado recententente.

A demanda por energia aumentada pela economia global também tem colorado u.ma pressão crescente sobre o.s custos do.s hidrmuu'bunetos. Além de energia, muitas indústrias, indo;ado os fabricantes de plástico e de produtos químicos, dependent· muito de lí; disponibilidade dos hldroc«rbouetos ctmto matéria-prima paru seu» processos de fabricação, Alternativas economicamente viáveis para as atuais fontes de abastecimento poderão ajudar a reduzir a pressão ascendente sobes a energia e os custos das matériasprimas.

RESUMO ΟΛ INVENÇÃO

Em um aspecto, a pmsente invenção é direcionada para a invenção que fornece um micróbio que, em várias modalidades, podo iitcltur uma célula de roicroalgns, uma levedura oleaginosa, ou um fungo que contém um gene que sxógetm que codifica uma ptWma seicemtrada do grupe constituído por eras lipase, urn transportador de sacarosc, sacarose invertase, fmtoqumasn. enzima degradante de poiissacarídcos, urna tioesterasc dc aeil -ACP gmxo. um acyí-CoA grstxo/aideído redutase, uma redutase de acd-CoA graxo, um aldeído íedutase graxo, um aidcído deearhouilase graxo, e urna ptoteína transportadora de acila (ACP). O micróbio (por exemplo, células de microalgas) pede, por exemplo, ser selecionado de Tabela 1. fim modalidades especfbcas, a céluht é uma espécie do gênero OZmr/fn, come, por exemplo. CWore/fo /«eco. OWuofós promtfcecmdes.

poívuoídoro, CÀWdõí Áwderi. CWo-.do vK^«írM-,C&fore<7d ,vra;oWr.ç:.à>A<'. CMmWõ? .rorolAda/m ou Odore&i cfóp.midno. Em outras modalidades, o micróbio é ttma levedura oleaginosa selecionada do grupo consistindo de Cryptoeoceus eurvatus, Cryptococeus terrieoltts, Candida sp., Lipomyces starkeyi, Ltporayees lipofer, findomycupsra vemalis, Rhmknomfa slutiiús. Rhodotorula gracilis, e Yarrowia lipolítica. .Aluda em outras modalidades, o micróbio é um fungo selecionado do grupo que •.rrasAte em uma espécie des gênero AfóAíerrí/ra ÃforderrM vmmm#, Afór.rarrróu u/píne, <fót\:rn'oa.<m;., Afueor cfóí mef/oideí. dsYifrgí/fus· ra-áraeí-a.r, As^ergú7u.$· mmuM. Peanrc E./m'n eVra-inum . uma espécie do gênero Hení<?nu/o. uma espécie do gênero C/wtomum, uma espécie do gênero CWmpfWíurw, uma espécie do gênero Muíõrmm/tea. uma espécie do gênero A’hiy.op'n.v, e uma espécie do gêuem Λ^:ím«m. Em outras otodttltdadss. a invenção inclui a expressão de enzimas de modificação de hidromtrbrmetos em hospedeiros bueterianos. cmo<> <.«Ε e

Soof/t, um método de produção de diesel renovável. Em uma modalidade. o método compreende (a) cultivar uma população de microorganismos na presença de bit» fonte de carbono fixo, no qual (ri os microorganismos acumulam pelo menos 10% do seu peso celular seco como iipídios, e tu) a fonte de carbono lixo é selecionada do grupo que 5 consiste de glkeroL material ccíulósico despolhnerizado, sacarose, melaço. glicose» arabinose, galactose, xilose, frntose, ttrabinose, manose, aeelatn, e qualquer combinação dos anteríotes, íb) isolar componentes lipklieos da cultura de mictoorgarnsmos. e (c) submeter os componentes llpídicos isolados a uma ou mais reações químicas para gerar alcunos de cadeia linear pelos quais o diesel renovável é produzido.

Em outro aspecto, a presente invenção é dtngida a uma composição de hidrocartmnetos liquides feitos de acordo com o método descrito acima, onde a composição esta de acordo com as especificações da norma ASTM Dõ?$,

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produzir combustível de jatos. Em uma modalidade, o método compreende {a} cultivar uma 15 população de microorganismos na presença de uma fonte de carbono fixo, no qual (ij os microorganismos acumulam pelo menos 10% do sen peso celular seco como itpidms, e tis > a fonte de carbono fixo é selecionada do grupo que consiste de glíoerol, material celulósico despolimeriz&do, sacare.se» glico.se, arabinose, galactose, xílose, frutose, arabinose, manose, acetato, e qualquer combinação dos anteriores, (b) isolar componentes Iipiduos da 20 cultura de miciorganismos. ic) submeter os componentes lipfdicos isolados a uma ou mais reações químicas para gerar alcanos de cadeia linear» (d) quebrar- os aícanos de cadeia linear pelos quais o combustível de jato έ produzido.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição de hidrocarbtmetos líquidos produzidos de acordo com o méte-d» descrito acima, onde a 25 composição está de acordo cent as especificações da norma .ASTM D155S.

Em outro aspecto. a presente invenção é dirigida a uma célula de levedura ou de tnicroalga que tenha sido geneticamente modi ficada e/ou selecionada para expressar ama enzima de caminha hpídíoo em um nível alterada em relação a uma célula de tipo selvagem da mesma espécie. Em alguns casos, a céluls produz mais liptdeos em 30 comparação corn a célula de tipo selvagem quando ambas as células süo cultivadas nas mesmas condições. Em alguns casos, a célula toi geneticamente modificada e/ou selecionada para expressar uma enzima de via hpídica em utn nível mais elevado do que as células de tipo selvagem. Em alguns casos, a enzima de via lipídica e selecionada do grupo íotKixttntío de ptruvsto dcsídrogcnsxe, aeetil CoA catboxíl&se, protema tmnsportadcm de 25 acila, e glicerol-3 losfato anil transferase, Em alguns casos, a célula foi geneticamente modificada e/ou selecionada para expressar uma enzima dc via llpídlea em um nível inferior ao da célula de noo selvagem. Era pule menos ymg modalidade na qual a eelala expressa a enzima de via Hpidka em ara nível iisferitsr, a enzima de via íiptdica compreende citrato sisPase.

Em aigumna .modalidades, as mtcroalgas oa células de le-vedunt acima descritas foríaa genericamente modificadas e/ou selecionadas para expressar ara regulador global da síntese de ácidos graxos, em um ravel alterado «m ralação ã ceküa de tipo selvagem, pelo qual os níveis de expressão de ama pluralidade de genes siméricov de ácidos graxos são alterados em relação à célula de üpo selvagem. Ear alguns casos, & enzima de via lipídicsi compreende uma enzima que modifica um ácido graxo. Em alguns casos, a enzima de via 10 lipídica é selecionada de- um extearoil-ACP desaturase e de um ghceroàpídeo desaturase.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a «m micróbio produtor de óleo comendo um c-u mais genes exógenos. onde os genes exógenos codificam proteínafsi selecioíiudafs} do grupo constituído por uma tioesterase de acil-ACP graxo, uma redmase de aciK'oA gravo, um aldeído redutase g.raxo, um acyECoA graxo/aldeido redutase, um 15 aldeído decarimnilase graxo, e uma proteína transportadora de aciia, Em alguns casos, o micróbio ê Cú/ore/Za promrirecmdes. Cíwrôi fmámrérerénp <7nVireZ/ít ewrsomí, Cátore/Zu >w<àmmrm. CúZoreZZu eZZípsrddea ou <?.è/orví7a .rp, Em outros casos, o micróbio é outra espécie, como aqui descrito. Em uma modalidade, o gene exógexio csUi em ligação operáveí com um promotor, que é iuduzíve) ou repressive) em resposta & um estímulo. Em 20 alguns casos, o estímulo é selecionado do grupo constituído por uma pequena molécula produzida exogenameme. calor, frio e luz. E.m alguns casos, o gene exógeno é expressado em vim compartimento celular. Em algumas modalidades, o compartimento celular é selecionado do grupo consistindo de um vkiroplasio e de uma mitocórtdria.

Em uma modalidade, o gene exógeno codifica uma tioesterase cie aeíl-ACP de 25 ácidos graxos. Em alguns casos, a tioesterese codificada pelo gene exógeno catalisa a cllvagem de um ácido graxo de 8 a 18 cwrbonos a partir de ema proteína transportadora de ucila lACP), Em alguns casos, a tioesíerase codificada pelo gene exógeno catalisa a divagem de um ácido gravo de lü a 14 carbonos de. uma ACP, Em uma modalidade, o tioesterasc eodificada pelo gene exigents catalisa a divagem de um ácido graxn de 12 3Q earbonos de uma ACP,

Em uma modalidade, o gene exógeno codifica um acil-CoA gmsk'nldeidcs redutn.se. Em alguns casos, a redutase codificada pelo gene exógeno catalisa a redução de um acíl CuA gmxo de 20 a 30 earbemos em um álcool primário correspondente. Em alguns casos, a re.dmnsr codificada pelo gene exógmm catalisa a reduçáo de um adl-CoA graxo de 8 a 18 o5 carboric em um álcool primário correspondente. Em alguns casos, a redutase codificada pdo gene exógeno catalisa a redução de um acil-CoA graxo de 10 a 14 carbono cm um

5/127 álcool primário correspondente, Em uma modalidade. a redutase codiirc&da pelo gene exógeno catalisa a redução de um acil-CoA gmxo de 12 curbonos em dodecunol

Em uma modalidade, o gene exógeno codifica um acil-CoA redutase graxa. Em alguns c.&so.s, a redutase codificada pelo gene exógeno catalisa a tedvçào de um acil-CoA graxo de 8 a 18 carbonos em um aldeído corespondents. Em uma modalidade, s todutase codificada pelo gene exógeno catalisa a redução de um acil-CoA graxo <le 12 carbotrós em dodecanal

Em pelo menos uma modalidade, o micróbio da invenção contém atmia um ou mais genes de utiiízaçáa de waruse exógenos.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um micróbio contendo dois genes exógenos, onde o pr-melro gen exógeno codifica tioesterass de aeilACP graxa e o segundo gen exógeno codifica uma proteína selecionada de um gnrpo consistindo de uma tedutase de acil-CoA graxo, um acyl-CoA graxo/aldcído redutase, e uma proteína transportadora de asila. Em alguns casos, α micróbio 2 CZdond'a .s,si??<o. C7tiorri/<i emerswjú, Odore/fo .w<?h'?tí®íít, Oróre/ía rAòpaafdeí?, Ckí.ore//« .spou G7iore<f<i pramotor, ç.ee á w&xfi-rí em resposta u a/n estfmrdo. £m alguns caw, cado prwuorór

Ent uma modalidade, a fioesierase codificada pelo primeira gene exógeuo catalise a clivagem de um ácido graxode 8 a 18 carbonos de uma ACP.

Eni algumas modalidades, o segundo gene exógeno codifica om acil-CoA graxo/aldddo mdutase, que cataiiza a redução de um acíl-CoA graxa de 8 » 18 carbonos em urn álcool primário correspondente. Em alguns casos, a t.ioesterasc codificada pelo priinei.ro gene exógeno cataiisa a clivagsm de um ácido graxo de 10 a 14 carbonos de um ACP, e a mdutii.se codificada peto segando gene exógeno catalisa a redução de um aeiiCoA graxo de 10 a 14 carbonos no álcool primário cormspondente, onde a tioexterase e a redutu.se atuam no mesmo comprimento de cadeia de carbono. Em uma modalidade, a ioesterase codificada pelo primeiro gene exógeno ctttahsa a eíiv&gem de «m ácido graxo de 12 carixmos de um ACF, e a redutase cot»ficada pelo segando gene exdgeno catalisa a redução de nm acíl-CoA graxo de 12 carbonos em dodecauol. Em alguns casos, a reduíase codificada pelo gene exógen» catalisa a teduçâo de um acil-CoA graxo de 8 a 18 carbonos em um aldefdo correspondente.

Em algumas modalidades, o segando gene- exógeno codifica um uctl-CaA redmase graze, e o micróbio ainda contém «ru terceiro gene exógeno que codifica um aldefdo <kreartmnila.se gtxxo. Em alguns casos, o tioesierase codificada pelo primeiro gene exógftno catalisa a divagem de um ácido graxo de - * )8 carbenes ere urna ACK a tedutasu codificada pelo segundo gene exágeno catalisa a redução de urn acil-CoA graxo de S a 18 carfsonos em nm aldeído graxo correspondente, e a deearbomlsse codificada pelo terceiro gene exágeno catalisa a conversão de um aldeído graxo de 8 a 18 carbonos eni sm alcano 5 correspondente, ottde s doesterase, a reduta.se e a deembonikísc atuam no mesmo comprimento de cadeia de carbono.

Em algumas modalidades, o segtmdo gene exógeno codifica ume proteína transportadora de acilâ que é naturalmcnte co-expressada oom a òoesterasc de acíl-ACP graxo.

Etn algumas modalidades, o segundo gene exógeno codifica uma proteína tnmsportsdora de aeila. e o micróbio contém ainda um tercem* gene exógetw que. codifica uma proteína selecionada do grupo constituído por uma mduutse de acii-CoA. graxo e uru acil-CoA gmxo/aldeído redutasc. Em alguns casos, o terce ire gene exógeno codifica uma redmase de aciuCoA graxo. e o micróbio ainda contém um quarto gene exógeno que 15 codifica ama decartxmilase de aldeído graxo.

Em outro aspecto, a presente utvenção é dirigida a. um método de produção de uma írír.déctria em ema população de micróbios. Etn utrta modalidade, o método compreende o cultivo de uma população de micróbios em um meio de cultura, onde os micróbios contém (h um primeiro gene exógeno que codifica uma tioe.stera.se de acil* ACP graxo, e (ri? um 20 segundo gene exógeno que codifica um aeil*CoA graxo/aidetdo redutase, e os micróbios sintetizam um ácido graxo ligado a uma proteína transportadora de acüa (ACP). a tioesterase de acil-ACP graxo catalisa a divagem do ácido graxo da ACP para, produzir, por meto de traits formação, um acil-CoA graxo, e o acil-CoA graxo/aldefdo redutase catalisa, a. redução do acil CoA. em um álcool,

Em uma modalidade de método de produção de uma molécula em ama população do micróbio, o micróbio é Cío.neín Jtnmmsoma, Odureífo Céú?.o?iáe soro&Trâmrt, CVorWa e/Epsródím. Cdiorej/c rp. ou CiVore/ín Em outros casos, o micróbio é outra espécie de microorganismo, como aqui descrito. Em alguns casos, o meio de coitnra contém gliceml. Em uma modalidade, o gltcerol e um subproduto 30 de um processo de transestetificaçao. Eut alguns casos, o meio de ouifttra contém glicerol e peto menos uma outra fonte de carbono fixo. Em uma modalidade, a pelo menos uma outra fonte de carbono fixa é sacaro.se. Em alguns casos, todo o gbcerol e pelo menos uma outra fonte de carbono fixa são fornecidos para os micróbios rto tuício da fernteniação. Em alguns casos, o gllcerol c polo menos tuna outra fcrde de carbono fix* são alimemudos aos 35 micróbios em uma taxa predeterminada ao longo do curso da fermentação. Em alguns métodos de cultura da invenção, o glicercd c fornecido tms micróbios na ausência de pela menos titna outra fonte de catbono fka am pritneiro periodo de tempo, pelo iuenos uma outra fonte de uatbono fixa í iorneeida so final do primeiro periodo de tempo, e os micróbios sâo cultjv&dos por um segundo periodo de tempo na presença de pelo <meno\ um outra fonte de carbono ftxa.

Hot algumas modalidades, os gases exógenos csW> cm ligação operacional corn ero promotor que é mdwdvel etn resposta a out esfímtd». Em alguns e«sos, o método inclui ainda fornecer o primeiro estímulo c incubar a população de micróbios por um prímetto periodo de tempo na presença do primeiro estímulo pura produzir um ákottl. Em alguns casos, o método compreende amda a extração de álcool s partir da biomassa aquosa 10 compreendendo o meto de cultura e os micróbios.

Em algumas modalidades, a tloexietíise codificada pelo primeiro gene exógeno catalisa a divagem de um ácido graxo de S a 18 carbonos do ACP, e a icdutase codificada pelo segundo gene exóguno catalisa a redução de um acll-CoA graxo de 8 a 18 carbouos em om álcool pnmário correspondente, onde a uoe.sterase e a redutase atuam no mesmo :5 comprimento de cadets de carbono. Em alguns casos, a tioesterase cod?ficada pelo primeiro gene exógeno catalisa a divagem de am ácido graxo de 10 a 14 cttrbonos do ACP. e a redutasc codificada pele segando gene exógeno catalisa a redução de um acilCo A graxo de 10 a 14 carbonos em um álcool primário cmrespondeatc, onde a tioesmtttsc e a redutase atuam no mesmo comprimem» de cadeia de carbono. Em urna modalidade, a 2G üoesterase codificada pela primeiro gene exógeno catalisa a divagem de um ttckk; graxtt de 12 carbonos do ACP, e a redutase codificada pelo segundo gene exógeno catalisa a redução de um actl-CoA graxo de 12 carbonos em dodeeanoi. Em alguns casos, os micróbios ainda contém um mtedro gene exógeno codificíusdo uma proteína transportadora de aella. Em algumas modalidades. o terceiro germ exógeno codifica umti 25 proteína transportadora de acikt que é natura.lmunte co-expressada com a tíocsteímm de scil-ACP graxo.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de uma molécula de lipídio em uma população de micróbios. Etn atua modalidade, o método compreende o cultivo de uma população de micróbios em um meio de cultura, onde os 30 micróbios contém (it em primeiro gene exógeno que ctxiifiea uma tioestmse de acil» ACP graxth e fiii um segundo gene esógeno qtm codifica reèetase de acil-CoA graxo, e onde r>s micróbios sintetizam em ácido grttxo ligado a uma proteína transportadora de seda (ACP), a tioesterase de acil*ACP graxo cataliso a ciivagem do ácido graxo dst ACP para pnxíusir. por meio de iransformaçâv. um scil-CoA graxo, e a reduuse de scilOoÀ graxo 35 catalisa a tcduçâo do adfCoA cru um aldeldo. Etn alguns casos, o micróbio é Chlotclla miíiutíssuna, Chloreíla emersomi, Chlorella sorokintana. Chlomlla ellipsoidea, Chlomlla sp. ou Cblorella prmoihecoides. Em outros casos, o micróbio é outra espécie de micruorganisnto. como aqui descrito.

Em algumas modalidades. os genes exdgenos estão em ligação opemcional com ura promotor que é iadtufvd em resposta a em primeiro estímulo, e o método ainda com preemie fornecer o primetro estimulo e incubar a população de micróbios por um primem) periodo de tempo na presença do primeiro estímulo para produzi;· um aldeído. Em uma modalidade, o método compreende ainda a extração de aideidos a paror da biomasss aquosa compreendendo o meio de cultura e a população de micróbios.

Em algumas mmialídtídes, a tioesterase codificada pelo prirueíre gene exógeno catalisa a divagem de um ácido graxo de 3 a 18 earbonos da ÁCP, e a redutase codificada 'pelo segundo gene exógeno catalisa a redução de um acil-CoA graxo de 8 s i8 carborms em um aidmdo correspondente, onde a tioestemse e a redutase atuam no mesnx) comprimento de cadeia de emborto. Em alguns casos, os micróbios ainda contêm unt terceiro gene exógeno que cochfictt um aídeido detarbontlnse graxo que catalisa a conversão do aídeído em um aleano.

Em alguns casos, os genes exógenos estão em ligação operacional com um promotor que έ induziveí em resposta a um primeiro estímulo, s o método compreende ainda fornecer o primeiro estímulo, e incubar a população de micróbios por um primeiro período de. tempo no presença do primeiro estímulo pata produzir um aicano. Em alguns casos. o método compreende, ainda » extração de alcanos a partir da biomassa aquosa compreendendo a meio <lc cultura c a população <ln micróbios.

Em alguns casos, o tioesterase codificada pelo primeiro gene exógeno catalisa a divagem de um ácido graxa de 8« 18 carbonos da A CP, a redutase codificada pelo segundo gene exógeno catalisa a redução de um acibCoA graxo de 8 a 18 carbonos em um aldeado graxo correspondente·. e a decarboailtise codifícada pelo terceiro gene exógeno catalisa a conversão de um akleído graxo de 8 a 18 carbonos em ura aicano correspondente, onde tt tioesteruse. a redmase e a dccarhmálase atuam no racsnro comprimento de cadeia de carbono.

Bm algumas modalidades, os micróbios ainda contém tstn terceiro gene exôgeno codificando uma proteína transportadora de aetla. Em alguns eases, o terceiro gene exógeno codifica uraa proteína transportadora de aeila que é nataralmetite co-expressada com & tioesterase de aeib ACP graxo. Em alguns casos, os micróbios ainda ctmtêtn um quarto gene exógeno que codifica um aldeído decarbomlaxe graxa que catalisa a conversão do aldeído em um akano.

Em alguns métodos, o meio de cultura ctmtcrn gliecrol. Em trota modalidade, o gliceroi c um subproduto de um processo de transesteriftcaçâo. Era algtms casos, o meio d»

9/127 cultura contém gitcetol e ptdo menos uma outra fome de carbono fixe. Em urna modalidade. pelo menos uma ouin fome de carbono fixa é «acarose. Em alguns casos, todo o gíieeml e pelo trsenos uma outra fonte de carbono fixa sâo fornecidos para os micróbios no tateio da fermentação. Em alguns casos, o glicerol e pelo menos una outra 5 foste de carbono fíxa sào alimentados aos micróbios em uma taxa predeterminada ao longo do curso da fermentação. Em uma modalidade, o glicerol é fornecido aos micróbios na ausência de pelo menos uma outra fonte de carbono fixa por um primeiro período de tempo, pelo menos uma outra fonte de carbono fixa e fornecida no final do primeiro período de tempo, e os miefobios sào cultivados por um segundo período de tampo na W presença de pelo menos um outra fonte de carbono fixa.

Em outro aspecto. a pteseme invenção é dirigida a um método de produção de uma molécula de ácido graxo com um compnmemo de cadeia de carbono específico em uma população de rmmóbios. Em uma modalidade, o método compreende o culftw de uma poptílação de micróbios produtores de Hpfdios em meio de cultura em que as micróbios 15 contém um gene exógeno que codifica ama tiuestera.se de adí-ACE graxo cem uma atividade específica para um comprimento de cadeia de carbono, e em que os micróbios sintetizam um ácido graxo ligado a uma proteína transportadora de «cila t'ACPg e a tioesterasc catalisa a ciivagem do ácido graxo da ACP quando o ácido graxo foi sintetizado para o comprimento da cadeia de carbono específico. Em alguns easos. u mãnóbío é. 20 €5 tomba mmuossima, Chíoreíla emersonti. Chlotella sorokmiana, Chloreila eílipsosdea,

Chloreila sp. trn Cblorelía protothetoides. Em outros casos, o micróbio ó outra espécie de microorganismo. como aqui descrito.

Em algumas modalidades, o gene exógeno está em ligação operacional com um promotor que d laduzível em resposta a um primeiro estimulo, e o método ainda 25 compreende fornecer o primeiro estímido e incubar a população de micróbios por tmt período de tempo tia presença do primeiro estímulo. Em alguns casos, o método compreende ainda a extração do ácido graxo a purtir da biomassa nquosa compreendendo o meio de enlture e u população de micróbios.

Em alguns casos, os micróbios ainda contém um setundo gene exógeno codificando 3Ü uma proteína transportadora de acila. Em algumas modalidades, o segundo gene exógeno codtfks tuna proteína usasportsdora de acila que é nautralmcnte co exptessada com a {ioesterase de acil-ACP sraxo. Em uma modalidade, a tmesterase de acil-ACE catalisa a clívagem de um ácido graxo de 8 a 18 carbotms de uma ACP.

Em alguns casos, o meio de cultura contém gíicerol. Em uma modalidade, o 35 gltceroi é um subproduto de uns prócassu de tornscsterificação. Em algumas modalidades, o meio de cultura contém glicerol e pelo menos uma outra fome de carbono fixa. Em uma modalidade, pelo merms uma outra fome de carbono é saearosn. Em alguns casos, lodo ο gltceto; c pelo menos uma outra Fonte de carbono fixa são fornecidos para os micróbios no início da fermentação. Em alguns casos, o giieerol e pelo menos uma otilra fonte de carbono fixa são alimentados aos microhms em uma taxa predeterminada. ao longo do 5 curso da íetmamaçfo. Em uma modalidade, o glicerol d fornecido aos micróbios «a ausência de pelo menos uma outra fonte de carbono fixa por um primeiro período de tempo, pelo mtmos uma outra fonte de carbono lixa é fornecida no final do primeiro período de tempo, e os micróbios são enfocados por um segundo perfodo de tempo ns presença de pelo menos tint outra fonte de carbono fixa.

Em nutro aspecto, a presente invenção è direcionada a uma célula de microalgas contendo um gene exógeno, em que t> gene exogeno codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste de uma lipase, aro transportador de «acarose, uma sacarose invertase, uma íwtuqmnase, ou ema enzima degradame de pctfissacatideox. Fm alguns casos, a célula é Cblorellu mmutissima. Chlorelía emersonti. Chlorella aorokiniana, Chlorella ellipsoideít,

Chlorella sp. ou Chlorella protothecoide.s, Em outros casos, a célula ê outra espécie de microalga, como aqui descrito.

Em alguns casos, o gene exógeno está em hgação operacional cem um promotor. Em alguns casos, o promofot é induzísel ou repreensível em resposta a um estimulo. Em várias modalidades, o estímulo é selecionado do grupo constituído por mmt pequem» 20 molécula produzida exogenamente, calor, (tio e luz. Em alguns casos, o gene exógeno é expressado em um cumpanimemo celular. Em algumas modalidades, o compartimento celular é selecionado do grupo consistindo de «m cloroplasto e de uma mitocbndrta.

Em alguns casos, o gene codifica uma lipase que tenha pelo menos 70% de identidade de aminoâctdos com «ma lipase selcckmada da Tabela 9. Em ama modalidade. 25 a ltpa.se é Novozym-435. Em uma modalidade, a enzima degradante de pohssaeartduos é endógena a um C&forcífo vfoíx.

Em outro aspecto, a presente invenção ê díTreeionada a uma célula de microalga com dois genes exógenos, em que um primeiro gene exógeno codifica uma lipase e um segundo gene exógeno codifica uma enzima que degrada poltssacstídeos. Em alguns casos, 30 cada um dos genes exógenos esta cm ligação operacional com ttm prssmottm Em alguns casos, cada um dos dois genes exógenos está em ligação operacional com promotores que gâo mdtiidveís em resposta a mst estimulo. Em alguns oasc-s. coda um dos dois genes exôgcftos está' em ligação operacional coas promotores que stfo índuzísels em resposta ao mesmo estímulo. Em alguns casos, cuda um dos genes exógenos esta em ligação 35 operacional com um promotor qtte 5 iasfozfsol cm resposta a pelo menos unt estímulo que nào mdmí o outro promotor.

íiZ127

Em outra aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de uma molécula de iipídio em ι-m micróbio. Em uma modalidade, o método compteeade ú) cultivar o micróbio por um primeiro período de tempo, suficiente para aumentar a densidade celular, mide u micróbio contém (i) um gene cxágcno que codifica uma lipase e/tm (ill um gene exógeno que codifica uma enzima que degrada polissacatídeos, em que o(s) gencfsz ezrógenrXsi estão em ligação operacional com tmi promotor que é indiizível em resposta a um estímulo, (b) fornecer o estimulo, e tc) iacttbar o micróbio por um segundo período de tempo na presença do estímulo.

Em outro aspecto. a presente Invenção é dirigida a em método de produção de ema molécula de iipídio em em micróbio. Em uma modalidade, o método compreende (a) cultivas^- um micróbio produtor de fipidkis por tim primeiro período de tempo, suficiente para aumentar a densidade celular, tb) fornecer em vírus capaz de mfectar e Hs&r o micróbio, quando em contato direto com ele, e ic)< incubar o micróbio por um segundo período de tempo para produzir biomassa aquosa Usada. Em urna modalidade, o método compreende ainda extrair moléculas de lipfdios da biomassa aquosa lisatía.

Em outro aspecto, a pmsente mvençào é direcionada a tsma célula de mleroulga contendo um gene exôgeno, em que esse gene codifica um colator para ama enzima de via lipídica ou codifica uma proteína que participa da síntese do cofator.

Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de cultura de um micróbio produtor de llpfdios. Em tona modalidade. o método compreende cttifivar o micróbio na presença de uma quantidade suficiente de urn ou mais codator(es) para uma enzima de via lipfdita pnra amneutar n produção de ispíciros mienobitmos sobre a a pfodnçãu de íipidios microbiarms na ausência de um ou mais dos referidos cofactores. Em alguns casos, um ou mais co-fatores è uma vitamina exigida por tima <iu mais enzimas de via iipídica. Em uma modalidade, um oti mala co-fatores é bioltmt. Em alguns casos, um ou rtrakt co-fat»res é/são fornecidos pela inclusão tia cultura de tsm micróbio geneticamente modificado para produzir tim ou mats eo-fatures.

Em outro Mpeetti, u presente invenção é direcionada 3 um método de fermentação de um microorgitnism© qae compreende fornecer uma mistura de glicose e xilose como femíe de energia pars o micrurganismo. Em ama modalidade, a mistura compreende amdtt lignins. Em uma modalidade, a mistura ainda compreende, pelo menos urna espécie de ftafural Em aigtms casos, a .mistura é raitteritil celulóske despoil matizado. Em ídgmts casos, a mistura ttitida compreende, pelo menos uma enzima de utilização de sacarose, Ent uma modalidade, a misttna sompreetróe uma sacaiose invertase.

Em alguns casos, o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de Zírí.^fc?'rtv:o.<í?s,'.s· minor, Cáíore/άϊ m/ípsíwdim, OtíoreGn .It-.as/.<·?/, Cã/nre/m iateovindàr.

llllllllllllllllllllllllllllllf

Odoreí/a raômEs.uvai. Cmmr/ki crao'rs. Ch&rrífa tWgom, /Vraira&kWiif tos/en. FrotutÃrea m«r(/òn»ü, e Pse«&W^<wl/<? n^nutòa. Em wuixo.S Cíiíws, o microorganismo é outm estxícic de tnícroorganístrio, cornu aqui descrito. Em alguns casos, o mictorganismo fbi geneticamente modificado para expressar um gene exôgeno que codifica pelo menos uras? enzima de modificação lipídicn, uma enzima de ímxiiHcsção de hsdrocarbonetos, ou ums enzima de utilização de sacarose.

Em outro aapecto, a presente invenção è direcionada a um método de cultivar uma mícroalga, que compreende o cultivar a roicroalga em meio de cultura incluindo uma matéria-prima compreendendo pelo menos um substrato de carbono selecionado do grupe etmsbnmdo de um material eehilôsico, mn açúcar de 5 carbonos, um açúcar de 6 carbonos c acetato. Em alguns casos, r> substrato de carbono è a glicose s a mlctoalga e de ura gênero selecionado do grupo consistindo de Oj/oreí/o, FormVi/wref/íi, Ps^míu<.A/«r<edfe. Bmwe?x’oecus·. f«?foí«rw e ScenedeAmur. Em alguns casos, o substrato de carbono é a xilosc e a microalga é de um gênero selecionado do grupo consistindo de Cb/mvíkt. Fvem/or&fnnr&c u /Vmvvbco··? Em alguns casos, o substrato de carbono ê a sacarose c a microalga <i de um gênese· selecionado do gropo consistindo de CVore/kt. e Smcteocoecíu. Em alguns casos, o substrato de carbono é a frutose e & microalga é de um gènerts selecsonado do grupo consistindo de CVí&reZkt, EsratclíZorefá-í, /’rotorAecm e S7.vnedesmu'>. Em alguns eases, o substrato dc carbrmo é arabinose e a microalgas é CTdore/fa >sp. Em alguns casos, o substrato de carbono é manose e a microalga è de um gênero selecionado do grupo consistindo de C^w/fn, Fmoebáirehh, Z?r{xc<wwemt, ZVoíotWco, e Em alguns casos, o stibstmfo de carbono é a galactose e a nõeroalga έ <ic uni gênero selecionado du grape consistindo de 8rnrfe<mmreHs, Earn·'•Atmr/fcr. Chlmella, Pseudochlorelia, Bmcteococcus, e ãbznvvàccn. Em alguns casos, u substrato de carbouo ê o acetato u a microalga é de urn gênero selecionado do grupo consistindo de Chktrella, ParttehiOrella e Prototheca,

Em uma modal idade, o rncie de cultura ainda inchsi pelo menos mmt enzima de utilização de sacarose. Era alguns easos, a microalga foi geneticamente modificada para expressar um gene exóge&o que r odifraa pelo menos uma enzima de mtxfíftcação liptdieii. uma enzima de modificação de hidrocarbcmetos, ou ama enzima de utlbzaçâo de sacarose. Em alguns casos, o meto de cultura melei, ama sacaruse invertase.

Em outro aspecto, a prsseme invenção é direcionada a um método de cultivo de microalgas que compreende a tmloeação de urna plmalidade. de cêiules de microalgas na presença de material eeluíósico despolimerizado. Em algmts casos, as mictoalgas sào cultivadas na presença de ura» fonte, dc carbono fixa adicionai selecionada do grape que couxiste de glicerol, .«arose, glicose, arabinose, galactose. xtlose. frutose. arabmose, manose. acetato, e quakjucr combinação destes materiais. Em uma mudalidads. as tnicroalgas são cultivadas n» presença de pelo menos urna cnziniti de utilização de |||||j|®^||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Em alguns casos, as microalgas são selecionadas a partir de uma espécie do gênero

Br&oteococcns, uma espécie do gênero Chlorella, uma espéeic do gênero ParachloreHa, uma espécie do gênero Puxolheca, ou uma espécie do gênero Pseadochlorella. Em alguns casos, as nticroalgas são selecionadas dentre Bracteococcns minor. Chlordls elltpsoidea, ChlmelU kesslerl Chlorella luttmvíridis, Bracteococcas medionueleatus, 1Q Cblorelia minutissima. Chlorella ovalis, Chlorella protothecoides. Chlorella saccharophíla, Cblorelia sorokiniana, Chlorella sp.. Cblorelia vulgaris, Parachlorella kessleri. Prmotbeea moriformis. s Pseudochlorelia aquatics. Em outros casos, as microalgas suo outra espécie de rnicroslgas. como aqui descrito.

Em algumas modalidades, as microalgas foram geneticamente modificadas para expressar um gene exógeno que codifica pek> menos uma enztmtt de modificação liptdica. uma enzima de modificação de hidroc&rtxinetos, ou uma enzima de utilização tie saeatose. Em uma modalidade, pelo menus ema enzima de utilização de s&c&rose ê ama saearotse invertase, Em alguns casos, pelo menos uma enzima modificação lipidica é selecionada a parth de um esreareil-ACP desaturase. de um giiceroliptdeo desaturase, tie um pimvsto 20 desidrogenase, de uma acctH-CoA caámxilase. e de um gllcerol- 3 fosfato aciluansferase.

Em alguns casos, pelo menos uma enzima de modificação de hidiocarbonetos é selecionada a partir de uma tioestexasede aetl-ACP graze, uras redutase da acil-CoA graxo, um aldefdo redutaxe graxo. um acyl-CoA graxo/aldeído redtnase. um akieído dcearbmiilase graxo, e uma proteína transportadora de adia.

Em ouiro aspecto, a presente invenção ê direcionada a um método de cultivar um micróbio produtor de lípídíos contpreendendo o tnéiodo eultivar o micróbio na presença de ácido acétíco e na ausência de uma fonte de nitrogênio fixa. Fim alguns casos, o mtcróbto é etiltivado na presença de uma quantidade rio doido acêtícn suficiente para aumentar a produção lipídica microbi&na sobre a produção lipídlea miorobiana na ausência 30 de ácido acético. onde as condições de cultura são de outra maneira a mesma entre as duas culturas.

Em outro aspecto, a presente invenção ê direcionada a uma cultura microbiatta contendo tuna população de microorganismos e melo de cultura composto de glicose., sãlose e de uma molécula xeleuíonada do gtupo composto do ílgnina e urna espécie de 35 furfural. Em alguns casox. os microorganismos são selecionados dentre Bracleocttccus minor. Cõlorella eUipsmdea. Chlorella kessleri. Chlorelía lateoviridís, Braemocoecus ntedmnucleatus, Cblorelía mlnuussuna, Qdorella ovalís, Chíorcíla protothecoides, Chksrella aaccbaropbim, Chlorella smokimana, Cblorefm sp., Chlorella vulgaris, Parachloreíla kessleri. Protmheca munfonms, e Pseudochloreíla uquauca. Em outros casos, os mtcmmgauismos são outra espécie de microorganismo, como aqui descrito.

Em OUtrO asíKiCíO. 4 presente invenção é direcionada a «ira método de cultura dc microalgas. Eni uma modalidítdc, o método compreende (aa fornecer uma célula dc microalgas capaz de realizar o crescimento de heterotróftcos, (b) colocar a célula dc tnicuoalg&s em meios de crescimento, onde tal meto compreende matenal cclulóstcu despobmerizado. e (c) tncubar as oticro&lgs» por um período de tempo suEdenís para 10 permitir que a célula cresça.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de biodiesel Em urna uiodalidade, o metodo compreende (a) cultivar um microorganismo produtor de lipfdios em uma primeira cultura microbiana, (h) recuperar ílpídlos da hiomassu produzida pela primeira cultura mscrobi&tia, tet submeter os lipídios á 15 transestedt-cação para produzir ésteres de ácidos graxo» e glicerol, e (d> ad-cionnr o glicerol à segunda cultura mierubiana. Em alguns casos, a primeira e a segunda culturas mierobianas são culturas da mesma espécie do micromgamsm». Em alguns casos» a segsmda cultura miorobiana compmcnde mlcrorgamsmos .selecionados do grupo consistmdu de Z^rne/í/ors-Ea sess/eri. CéforeEa prmorimeomes, Bracieoeweews 20 me<ft>w?m.7í?«ms, ProAnfteco amri/orrm's, Ch/ore/fu mòmársirsa, C/tZom’Z» sp„ e CÃ ZonrZZrt roroÀYrtiuun. Em outros casos. & segunda cultura miembiana compreende outra espécie de miuroorganisam, corno aqui dese-rito.

Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de fermentação que compreende cultivar mu microorganismo, na ptesença de glioerol e de pelo menos uma 25 outra tome d<- carbono fíaa. Em alguns casos, o gliccrcd e pelo menos mna outra fonte de carbono fixa sü$.í íomeeidos aos microurgaxüamos simultaneamente cm tuna proporção predeterminada. Em alguns casos, todo o gliecml e pelo menos ama outra fonte de carbono lixa sâe- fornecidos paru os microorganismos no início da fermentação. Em alguns casos, todo o gliuerol e pdo rnerms uma outra fonte de carbono fixa são alimentado» aos 30 microorganismos em urna proporção predeterminada ao longo do curso da fermentação. Em mna mtxíalldade dro método, o glícarol é fornecido aos mkmxu'gsmsmms na ausência de pelo menos ama outra fonte de carbono fisa por um primeiro período de tempo, pelo menos uma outra fonte de carbono fixa e fornecida no final do primeiro permdo de tempo, e o microorganismo é cultivado por um segundo período de tempo na presença de pelo 35 menos urna outra fonte de carbono fixa. Em. urnu modalidade, pelo menus uma outra fonte de carbono fixa é alimentada ao mterorgímismo em uma proporção predeterminada durante

Í5/127 o segundo período de tempo. Em algmiv casos. toda s outra fonte de carbono fixa ê fornecida ao microorganismo ao final do prnneir» período de tempo. Em uma modalidade do método, a mitra fonte de carbono fixa é fornecida at» microorganismo na ausência de gíicerol por um primeiro período de tempo, o glicerol é fornecido ao finai do primeiro 5 período de tempo, e o rnií-roorganismo c cultivado por um segando periodo de tempo na presença de glicerol. Em uma modalidade, o glicernl é um subproduto de um processo de tmnsesicrificaçac. Em uma modalidade, o glicerol e aeidulado. Em entra modalidade, o glicerol nao é acidulado. Em alguns casos, pelo menos uma outra fonte de carbono fixa é a glicose.. Em alguns casos, pelo menos uma outra fonte de carbono fixa e material 0 ceíulósico despoHmerizado. Em uma modalidade, a pelo menos uma outra fonte de carbono fixa é sacaroxe.

Em outro aspecto. « presente invenção s dirigida a um fermentado? compreendendo unw população de mietoorgtmismos. glicem.1 e pelo menos um açúcar, selecionado do grupo cifnsjsdndo de xilose, glicose e sacarose. Em uma modal idade, o glicerol é um IS subproduto de um processo de t.ran.sesteríficaçao de hpídeos. Em alguns casos, os mierorganismos são selecionados do grupo consistindo de Paraehlonella kessleri, Chloralla prototheeoides, Bracteoeoceus medionueleatus, Frototheea moriformis, Chlomlla míautissima, Chlorella sp., e Chlomlla sorokmiana. Em outros casos, os microorganismos sao omxa espécie, como aqui descrito.

Em ot-tro aspecto, a presente invenção é dneeiomida a um método <le íermcmação de microorganismos. Em urna modalidade, o método compreeade fornecer subptodum de glicerol de um processo de Irunsesierificaçâo como única fonte de energia de carbono fixa. Em uma modalidade, a energia da luz não é fornecida ao microrganismo. Em outra modalidade, a energia da luz é fornecida para o microrganismo. Em alguns casos, o 25 mlerorganismo é ,selecionado dentre Parachlorclla kessleri, ChloreUa protothecoides, Bracteococcux medionucleatus, Protmheca moriformis, Chlmella mimmsiUma. Chlmclla sp.. e disorellú sort-kmlans. Em omros casos, o microorganismo é otnra espécie, como aqui descrito.

Em outro aspecto, a presente mvençâo é direcionada a um miermtrganismo que 30 contenha um gene de miíizaçllo de sacarose exfigeno. Em ums modalidade, o gene codifica um triiuspmsador de sa.ca.rose. Em uma modalidade, o germ codifica uma saccrose. invertase. Era mna modalidade, o gene codifica uma fimvquíaasc. Em alguns casos, o ímerorganismo f^: unia espécie selecionada do grupr; consistindo de (.VporesiU witfiww, Gmoreàm emer.wm, fTdoreí/o somA.?e{7íím. CÃfore/a ei/ip.snEicu, Cú/orefM sp, <m 35 CmovWm . Em outros casos, o microorganismo é outra espécie, como aqui descrito.

Em outro aspecto, a preseme invenção é dirigida a uma célula das espécies CWre/ú? prom-rimruíró?,y. CA&w/fe emerscui?. <><a Cfíforetta zm/mtosunu cm que a célula contém um gene exógeno Em alguns cases, o gene exdgeno codiRca ura» proteína selecionada do grupo que consiste de um transportador de aaearose, uma xaçaruse 5 invunasu. urna ettzima de modificação lipidica. uma enzima de modificação de hidrocarbonetos e uma fmtoqumase. Em algumas modalidades, a proteína e uma saearose invertase seeretada no espaço ewaeehdan Em algumas modalidades, a proteína é uma sacarose invertase dücciunada ao eitoplasma.

Em nutio aspecto, a presente invenção é dulgída a turn) cultom micmbtana U, contendo uma população de microorganismos, e um meio de cultura que com.preende t.i) a sacarose e (ii) uma enzima sacarose invertase.

Em outro aspecto, a presente invenção e dirigida para uma cultura microbiarta contendo uma população de mierourgímismos. e um meio de. cultura que compreende {il melaço e (il) umx enzima sacarose invenasc.

Em ostro aspecto, a presente invenção é dirigida x uma cultura mlerobiana contendo uma população de microorganismos, e um. meio de cultura que compreende (11 a sacarose. (ill a lignina.e (iii.) urna enzima sacarose invertase.

Em várias culturas raicrobiartas descritas acima, os microorganismos contêm pelo menos um gene de utilização de saca rose e!tóge.no. Em algumas modalidades, o gene de 20 utilização de saearo.se codifica mn transportador de sacarose. orna sacarose invertase, urna bexnqmn&se, uma gineoquinsiss, ou ema frmoqmuase. Em uma modalidade, a enzima sacarose snvertaae é uma enzima sacarose invertase secrelâvel codificada por um gene de sacarose mvertase exògerm expressado peia população de microorganismos. Em alguns casos, os microorganismos contêm pelo menos um gene exôgeno que codifica uma enaima 25 de via lipídica ou uma enzima de modificação de hídrocarbonetos.

Em outro aspecto, a presente invenção é dirisciouada a um ácido rtucléico que compreende stn cDNA que codifica tmt gene de miíização de. sacarose. c um uDNA que. codifica rmut proteína que confere resistência ao antihióúco bigromicina ou o antibiótico ||||||·||||||||||||||||||||||||||^

Em modalidades des vários métodos, composições, células, mmroorpmsmos, mtetdblos. culturas mícrobianas, fermemadoms e similares descritos acima, o microorganismo ou mlcrôbio pude ser mierualgas, uma levedura oleaginosa, ura fungo ou uma bactéria, a menos que seja especificado em eomránq. Em alguns casos, o microorganismo é selecionado do gropu conxlstiudo de mirroalgax listados na Tabela l.

Em alguns casos, o microtgamsmo é uma espécie do gênero Cóforefíu. Etn alguns casus, o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de Cáfcw/írt zmàrnm, Cfc/ore/fu

Gèfoi χ· /< <:< sáíVóVjriVjk Odor-:ί m xmPd&fc ·, £ otor«d&í cápsAíáM: C2òvíSA Ates, tefÃta^M. C4<Wí:;;íí /;:<%·<?,: C£umv7ré _: í® víxewnltim, Cb&w/lü: gt«<<>íCÃioreEo iWmKMtíim, fTímre·//.-:; m/ásíoinfm ure. .4 eroph íúst, Oiróreífo frtfy.!tm«mn Mr. Au-renopáda, £'.7<ό>ο?.ΙΛ·ι êe.e.de rí, C?áÍíW .%í /«teouiridi.?, Cáfo.refôt &/e<m>ídw y«r, oureovtndiz, ChíoreÍk; Zureov/ridÀt w. /.urnsccfis', C/taSa leíftfííío., Ojfereifo miimrfwiníí, OtftwZta íwtó^& Cklm^fi mrcmran, i;ií|iílBlOÒÍ040fOAOOOBiO/ÉOittÈIO/lBO|É?ÍOÍfOB®ífl)oiOí?i:^!B(Bii íOfoSAf B® jOfpíWAfc

C&i&)i’/i& rir&irn, Í.AímAfo rímp/ei:. Orómsrm .sOtwKmimtít. O?/íwe?ãf ψ., OforerZí?

5$θΗ<: S.AÓòsVÓí _: qígíbkfAWí WfêÒí ÍGÓf Óró&· Wí^íiiO< ό'.άά<<-?;^:'k>

ílílíl;íl;OsO®lí®/M4B?OÈVWíl®lílf4^ víridfs. Oí/tmeZ/ri XíinráeZ/me Chloreila zofmgiensis. Em alguns casos, o microorganismo é uma levedura oleaginosa selecionada do grupo consisti ndo de Cryptococcus curvatus, Cryptncoeeus eoicohss, Candida sp_. Lipomyees starkcyl, lápomyees lipofer, Endomycopsis vemaiis, Rhodotoruls glurinis, Rhodotortila gracilis, e Yarrowia Upolíticm Em alguns casos, o microorganismo é um fungo selecionado do grupo que consiste em mna espCrèk. do gênero Morõereila. Mortierrla vinacea, Mortiereila alpine, Pythium deharyanum. Mucor clreinelksides, Aspetgillus ochraceox, Aspergillus terreus. Pemiíeíllúin· iílaeinnm , uma espécie do gênero Hensenulo, uma espèeie do gênero Chaeíomium. uma espécie do gênero Cladosporium. uma espécie do géneto Malhranchea, uma espécie do gênero Rbizopus, e uma espécie do gênero Pythium.

Nas v&w modalidades descritas acima, o microorganismo contém pelo menos um gene de uulização de sacarose exógeno. Em alguns eases, o gene tie utilização de saesrose codifica um transportador de sacanoxe, uma sacarose utveaase. uma hexoquiuase, uma glucoquime. ou uma truioquimc

Em várias modalidades acima desc ritas, o microrganismo pode conter pelo menos um gene exógeno que codifica uma enzima de via lipi'dica.. Em alguns casos, a enzima de via liptdica è selecionada do grupo consistindo de um estearoil ACP desaturase, mn gliccrolipfsfeo desaturase, um piruvato desidmgeuase., um acetil-CoA carboxilase, uma proteína transportadora de asila, e um glicerobÔ fosfato aeiltransferase,

Nas várias modalidades descritas acima, o mietoorgamsmo pode conter pelo menos um gene exógeno para codifrèm· tuna enAma de niodifieaçáo de hidrmtatbonetos. Em alguns casos, a enzima de modificação de hidrocíubonetsis é selecionada de um grupo que consiste em uma tioestemse de aciEACP graxo, um aciECoA graxo/aldeído redmase, uma

18/127 redutase ds acil-CoA graxo, am aldeido mdutase graxo. am aldeido decarbonila.se graxo. e/ov uma proteína transportadora de acila.

Quaisquer duas ou mais das várias modalidades deserdas acima podem ser combinadas para produzir modalidades adicionais inseridas no âmbito da presente 5 invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura l mostra o peso seco de célukts por litro de múltiplas espécies e subespécies de C/aCoáC quando cultivadas na presença de vários tipos de glicerol cotn c sem glieo.se adicional.

A figura 2 mostra o peso seco de cent las por litro de múltiplas espécies e sahespédes de C/i/orv/úi quando cultivadas na presença de vários tipos de glicsrol com glicose adicional.

Λ figura 3 mostra a concentração relativa de lipkhos de culturas de múltiplas espécies e snbespécies de Cú/oraíiu quando cultivadas na presença de vários tipos de »5 glicerol com glicose adicional.

A figura 4 mostra a concentração lipídica de culturas de várias espécies e subespécles de CbZrwlZít quando cultivadas na presença de vários tipos de glicerol com e sem glicose adicional

A figura 5 mostra os lipldios como uma porcentagem do pese celular seco d« duas espécies e subespêetes de Cfe/orei/a quando c-ulhvadas na presença de vários tipos de gliuerul com glicose adicional, onde o glicerci & adicionado seqtienciaimenlc após a glicose.

Λ figura 6 mostra os lipídíos como uma porcentagem do peso celular seco de duas espécies c subespécies de Cn/o.mda quando cultivadas na presença de vários tipos de 25 glicerol com glicose adicional

A figura 7 mostra & concentração relativa de lipídios de culturas de múltiplas espécies e subespécies de CÀdoraEa quando cultivadas nu presença de 3% de glicose e DA de glicose f 1% de glicerol de grau reagents.

A hgura R mostra os lipídios eomo uma porcentagem do peso celular seco de 30 múltiplas espécies e subespécies de (.3í/<>,m/ú.> quando cultivadas na presença de glicose, coa> e sem glicerol de grau reugemk. rm que o glicero! é adicionado sequencialmeate ou combinado com a glicose.

A figura 9 mostra a concentração relativa de lípídios de culturas de múltiplas espécies e subespéeiev de quando cultivadas mi presença de vários tipos de glicerol com glicose adicional. onde o gliceroí é adicionado ssqttencialmente ou combinado com glicose.

is/n?

A figura 10 raosu-a. u pese eclulat seco put litro de raiiUiplas espécies e subespdtiea de OtZore/Zn quando cultivadas na presença de vários tipos de glicerol com glicose adicionai, onde o glicerol ê adicionado saquencialmente ou combinado com glicose.

Figura 11 ía) utosira es lipídios como uma porcentagem do peso celular seco de

Spinibaa plmeuslx quando cultivadas na presença de. glicose. glicerol de grau reagcnre, g·icerol subproduto de biodiesel nãoraciduladu. e tuna combinação de glicerol e glicose.

Λ bgura 11(b) ntosna os lipídlos como tuna porcentagem do peso celular seco de .Vuwr.uút pef/íru/o.m quando cuitivadas na presença de vários tipos da glicerol e na presença de combinações de glicerol e glicose.

A figura 12(a) mostra os lipídios como uma porcentagem d» peso celular seco de wcdeswfv nrmotns quando cultivadas na presença de vários tipos de gheerol e na presença de u.ma corabiuaçãu de glicerol e glicose.

A figura 12(b) mmttra o peso celular seco por Ut.ro de Ñreuív/cK?r<uji mmm'/is qua ado cultivadas na presença de vários tipos de glicerol e na presença de mna combinação de 15 glicerol subproduto de biodiesel e glicose.

A figura 13 mostra <· peso selular sect? por litro de iVmwa&r pe/iran/om guando cultivadas na presença de vários tipos de gbcerol e na presença de uma combinação de glicerol subproduto de biodiesel náo-acidulado e glicose.

A ftgura 14 mostra o peso celular seco por litro de &vv?<?de.wra.í snwttf e 20 AVo-tctda /ndfemWs quando cultivadas na presença de glicerol subproduto de biodiesel acidulado e nâo-acidulado com a glicose adicional, onde o glicerol ê adicionado sequenciaimente ou cm combinação com a glicose .

A figura 15 mostra um efeito smergkm de unsa combinação de xilose e glicose sobre o crescimento de Còúuc/áv era comparação com xilose ou sememe glicose.

A figura 16 mostra genoupagem de transformantes de Cfe/í?/e/lu mrauonWxudes contendo um gene exógeno.

A figura 17 mostra o uso de codâo de Cfcfore&t prnmriwoúfex.

A figura 18 mostra o uso do eodâode D. Sn/dut e de O&m’Zo pyrem.?«fe.m.

A Figura 19 mostra (a,i glk-etoí de grau reagents, íb.) glicerol subproduto de 30 biodiesel não-acídulado, e (cj glicerol subprtfdmo de biodksel acídulado, todos utillzadus em experiências descritos nos exemplos.

A figura 20 mostra o crescimento de CTriorel/a poútorneí';?ráí^;.r em glicose e 1'rutose.

A figura 21 mostra o crescimento de Chlorelkt/uem om 1 % de sacarose.

A figura 22 mostra o crescimento de Cbkuolla éevrieri era i ra sae_ftjosc

A figura 23 mostra o peso celular seco por litto de Ot/rn e/iâ pm/tfr/reeofdes quando cultivadas na presença de glicose, sacarose, ou uma <las várias amostras de melaço ídesiguttdas BS I 852 e HTM). na presença ou na ausência de uma sacarose invertase.

A figura 24 mostra o crescí memo de Chforeífo pwmri?ert?tu'r> quoeífo rufov«da.> ,<;<< pr*.?<?uçu ffo «íréi.oí. ,saíw«, ou n-mu das vdrio.s «wos/rns de ?η<·ύ<ρο {.desígnufoss £?.$.< 852 e //?&(), «« prese«ç<t ,u« n« umêwcm «e m?m x«rorose òtueernse, rortm medido peta 5 dertsifhüe ee/n&xr re&mw.

A figura 25 mostra tuna ilustração de vários constractos de plasmídeos de invertase de levedura (SUC2). cotn ttès diferentes pro«x>tore$ (designados CMV, CV e HUP I '). bem como áreas de restrição úteis para subelunagem.

A figura 26 mostra s genotípagetn de transformantes de CA/osrs/rr prrín.si.tfecrwAst 10 selecionados em sacarose no escuro contendo um gene de s&carose invertuse exógeno.

A figura 27 mostra a gertotipagem de células de Cúfo?-s?da /zr£>&>r&^<?m<&>.s transformadas com am gene que codifica uma raeamse invertase secretads de 5.

I|||||í00®iilllllllllllllllllllllllllllllllllllllill||lilllli^

A figura 26 mostra genotipagem de células de Cmoce/m nu.eufouw;<> e Odoref/u 15 ««oi» transformadas com utn gene que codifica uma sacarose invenase seeretada da 5.

lllllilteBOOiillllllllllllllllllllllllllli

A figura 29 ilustra um eromalografia a gás gerada pels unãfise de um produto diesel renovável produzido de acordo com os métodos da presente Invenção, e descrito no Exemplo 37.

A figura 30 ilustre um gráfico de dixtribmçâo de pontos de ebulição de um produto diesel renovável produzido de acordo corn os métodos da presente invenção, e descrito ík« Exemplo 27.

DESCRIÇÃO DETALHADA .DA INVENÇÃO

l. DEFINIÇÕES

A menos que definido de outra forma, to-dm os termos técnicos e científicos utilizados aqui tém o scttlido rsormaímeme entendido por um perito ao -assunto ao qurd pertence esta invenção. As relerèacias a seguir iomecem um perito uma definição geral de muitos dos termos utilizados no presente invento: Smgieton et ai. _x Dtctionary of Microbiology and Molecular Biology 12 edJ994.b Cambridge Dictionary of Science and

Tcchuoiog y (Walker, cd., Í98ÍÇ; O Glossário de Genética <£ TB ;. Ed 5. A’iCger ef nA teds.), Springer Verl&g 11991) e Hide .¾ Marhare, The Tferper Qd/ms Dàrionory -·;/ /ííedogy {1991;, Como usados aqu·. os seguintes termos têm os significados a eles atribuídos, salso especificação em contrário.

Como asado com refetêncía a um ácido naclêieo. ativo em microaigtts refereAe a orn ácido naclelco que é funcional em microaigas. For exemplo, um promotor que tem sido utilizado para conduzir um gene de resistência a antibióticos para conferir resísténda a

............. .....177 antibióticos para uma microslga transgénica é ativo em microalgas. Exemplos de promotores ativos em raie-roalgas silo os promotores eudógeaos para certa espécie de algas e promotores encontrados nos vírus de plantas,

Uma proteína transportadora de aejía ou .ACP é uma proteína que se .liga um» cadeia acila crescente dimttite a síntese de ácidos graxos como um éster tiol no tiol distai da metade 4-fosfopanfôtefna e compreende ums componente do eomplexo ácido graxo síntase, A frase, aamralmente co-ex pressa, com rcrèrência a uma proteína iranspmtüdom de acila em conjunção com uma tioesterase de aeil-ACP graxo, significa que a ACE e a tioesterase são co-expressas natural mente em um tecido ou organismo do qual são 10 derivadas, por exemplo, porque os genes que codificam as duas enzimas estilo sob o controle de uma sequência regulatórin comum ou porque sào expressas em resposta ao mesmo estímulo.

Uma molécula aed-CoÁ ou adfiCoA ê uma molécula que compreende uma metade de acila covalentemente ligada à coenzima .A através de anta ligação ésic;· tioi nu 15 dol distai da metade d'-fosfopsnteteinu da eoenzima A.

''Axêmca, significa ama cultura de am organismo que ê livre de contaminação por outros organismos vivos.

Biodiesel e um éster de aíquila de ácido graxo produzido biologicamente, adequado par» uso como combustível etn tim motor a diescí.

O termo biomassa refere-se ao material produzido pelo crescimento e/ou propagação das células. A biomassa pode conter células e/ou cometido intracelular, bem como material extracelular. O material extracelulsir incluí, entre outros, os compostos secrniados por uma célula.

“Bkireator significa é um cercado ou cercado parcial no qual as células são 25 cultivadas, opcíonalmente, em suspensão.

Conforme utilizado aqui, tmt ’'catalisador refere-se a um agente, tal como urna molécula ou complexo macromolecular, capaz de facilitar ou promover uma reação química de em reagenle em um produto sem se tornar uma paste do produto. Assim, um catalisador aumenta a taxa de uma reação, após a qual o catalisador pode atuar em outro 30 rangente para formar o produto. Um catalisador normalmente diminui u energia de ativação totíd necessária para η seaçâo, de modo que cia proceda -mais rapidamente ou cotn ama temperatura mais baixa. Asvim, um equilíbrio de reação pode ser smtis rapidamente alcançado. Exemplos de catalisadores incluem sss enzimas, que são catalisadores bkdógkms, o calor, que é em catalisador nâo-brológicsx e os catalisadores de metais 35 utilizados nos processos de refino de petróleo fóssil.

Mataria; eelulosico'* significa es produtos da digestão de celulose, incluindo glicose e si lose ¢, opcmnalnKmtc. os compostos adicionais como dissavartdeos, oligossacarídeos. lignina, furfurtus e outros compostos, Exemplos mio íimitsmes de fontes de material celuldsico incluiem bagaços de cana-de-açúcar, polpa de açúcar de beterraba, resíduos de milho, lascas de madeira, serragem e grama,

O termo eocultyra e suas variantes, como “co-cultivo*', referem-se ã presença de dois ou mais tipos da células no mesmo bíonaator. Os dois ou mais tipos de células podem ser tanto mktrorgímisrnos. como miexoalgas, quanto uma célula de microaigas cultivadas com um tipo de célula diferente. .As condiçóes de cultura podem ser aquelas que promovem crescimento e/ou a propagação das dois oti mais tipos celulares, ou aquelas que facsUtam o crescimento e/ou a proliferação de uma das duas ou mais células, ou um subconjunto delas, enquanto rmmfern o crescimento celular para o restante,

O termo ‘cc-fator c aqui vtilizado para se referir a qualquer molécula, além do substrato, que ç necessária para uma enzima exercer sua atividade, mtzímáiiea.

Como asado aqui, ONA complementar ( cDNÀ} é uma representação do DNA do mRNA, geraimente obtido por transcrição reversa do RNa mensageiro fmRNA) ou amplificação (por exemplo. através de reação em cadeia da polimcrase f‘PCR**)}.

O termo cultura e suas variames, referem-se s promoção mtemciomd de crescimento (aumento de tamanho celular, do conteúdo celular e/ou da atividade celular) e/ou propagação (aumento do número celular por mitose) de uma ou mais células através da utilização das condições de cultura pretendidas. A combinação dc crescimento e propagação pode ser chamada de proliferação. Uma eu mais células podem ser aquelas de uru microorganismo, como as mkroalgas. Exemplo» de condições previstas incluem a miíiznçâo dc um meio defímsfo (com características conhecidas, tais come pit força iôuica.. e fome de carbono), temperatura especificada, tensão de oxigênio, níveis de dióxido de carbono, e crescimento eus um biorreator. O termo não se refere ao crescimento eere a propagação de microrganismos nu natureza ou sem intervenção humana direta, eomo o crescimento natural de ura orgarasmo que, em última análise, se torna fossüizado para produzir óleo cro geológico.

Conforme utilizada aqui, o termo “citõHse refere-se a Use das células em um ambiente b.ipot'oaieo. Λ uitúdisc é causado por osmose excessiva, ou o movimento de água para o interior de uma célula (hiper-hidraiaçâu). A célula não pode suportar a pressão osmóticada água no interior, e assim explode.

Como usado aqui, os tennos vetor de expressão ou v'onsirttto de expressão se miem a um cunstrtno de ácido nuc’eico. gerado rceombinante ou síutetiearaente. com uma série úe. elenumtos de ácido nucléko determinados que permitem s transcrição de um determinado âckkt nucléiooem uma célula hospedeira O vetor de expressão pode ser parte

23/127 de um píasmídeo, de um virus, ou de um fragmento de ácido mtcléieo. Normalmente. o vetor de expressão inclui um ácido nucléico para ser transcrito ligado opemvelmente a um promotor.

“Gene exógeno se refere a um ácido nucktcn tiansformado «m ama célula. Uma célula transformada pode ser refenda como uma cêluht rec-ombmante, em que gcne(s) exógenofst adicionalíts) podefm) ser míroduzidofs). O gene exógeno pode ser de ama espécie diferente íe assim heterólnga). ou da mesma espécie (e assim homóloga) em relação à célula que está sendo transformada. No caso de um gene homólogo, ele ocupa uma posição diferente no gettoma da célula em mlaçào à cópia entiógena do gene, O gene 10 exógeno pode estar presente em mais de uma cópia da célula. G gene exógeno pode ser mantido em uma cela como uma inserção tio genoma, ou como uma molécula episomal, ’’Fornecido exogenamente descreve uma molécula fornecida para o melo de cultura de ama euhura de células.

Conforme utilizado aqui, uma tioesterase de adl-ACP grnxo é ama enzima que 15 catalisai a divagem de um ácido graxo de uma proteína transportadora de acihi (ACP), durante, a síntese de lipídtos.

Conforme utihzado aqui, um acil-CoA graxo/aideído reductase” é uma enzima que catalisa a tcduçào de uma molécula de actl-CoA em um álcool primário.

Conforme utilizado aqui, uma redutase. de acil-CoA graxo” é uma enzima que 20 catalisa a reduçSo de uma molécula de aeil-CoA em um aldeído.

Conforme utilizado aqui, um aldeído decarbonilase graxa é tuna enzima que catalisa a conversão de um aldeído graze em <mi aíoano.

Conforme utilizado aqui, um aldeído redutase graxo é uma enzima que catalisa a redução de um aldeído em um álcool primário,

Fonte dá carbono fixa'' significa molécula(s) contendo carbono, de preferência orgânico, que estilo presentes à temperatura e pressão ambiente no estado sólido ou líquido.

Fungo, como utilizado aqui, significa organismos heterotróficos earaMcrlzado» por uma parede celular qtiitinosa do reino dos fungos.

l iomogetieizado significa biomassa que foi fisicamente rompida.

Como Usado aqui, bidrocarboneto'· refere-se a: (as uma molécula contendo apenas âiomos de hidrogênio c carbono em que os átomos de carbono xtm cnvalentemente ligados para formar uma estreiam linear, ramificada, eúritea ou parcishnente cíclica a qual os átomos de hidrogênio estão ligados, ou (b) tmta moiémda que. apenas primarinmcme 35 contém átomos de hidrogênio e de carbono e que pode ser convertida para conter somente átomos de hidrogênio e carbono por uma a quatro reações químicas. Exemplos náo limilantes desse ultimo incluem hidracarbonetos contendo um átomo de oxigênio entre um átomo carbono e um de hidrogênio para fonnar mea molécula de álcool, bem como aideídns comendo «m átomo de um oxigênio. Métodos para a redução dos áíeoois um hldrocarhonctos contundo apenas átomos de carbono e hidrogênio são bem conhecidos.

Gutro exemplo de um hidracarboneto é um éster, em que um grupo orgânico substitui um átomo de hidrogênio (ou mais de um). em um ácido de oxigênio. A estmíura molecular de compostos <le hntocarbonetos vam desde as mais simples, na forma de metano (CH.Ò, que e um componente do gás natural, até as muito pesadas e muito complexas, como algumas moléculas tais conto asfahenos, cnecnuadas no óleo cru, no petróleo, e em betumes.

Hidrocanx>ítet.os ptxkm- estar ms fortes gasosa. liquida ou sólida, ou qualquet eoothmaçã» destas formas, e podem ter uma ou mais ligações duplas ou tnplas entra átomos de carbono adjacentes n;t estrutura, Assim, o termo mclut al canos lineares, ramificados, cíclicos ou parcialmejtte· cíclicos. alquenus, lipsdios e parafina. Exemplos mcluem o propane, bulano, penta.no, hexuno. octano, trioleína, e esqualeno.

Enzima de modificação de hidrocarbonetos se refera a uma enzima que modifica a estrmura covaíente de um hidtocatbcneto. Exemplos de enzimas de modificação de hidrocarbonetos incluem lipase, tioesterase.de acib/kCE graxo, um acybCoA graxo/aldeldo radttta«e. uma radutase de acil-CoA graxo. um aldeído teduuse graxo, u um aldeído decarbonise graxo. Compostos produzidos pela atividade enztmática das enzimas <k modificação de hidrocarbonetos, incluindo os ácidos graxos, álcoois, aldetdos, alcanos, ou outros compostos derivados, são chamadas arpei indistmumranle <k hidrocarbonciox ou liptdios.

O termo hidrogênio: proporção de carbono se refere â proporção de átomos de hidrogênio para átomos de carbono em uma molécula ent tuna base de átonto-átomo, A 25 proporção pode ser usada para se referir ac numero de átomos de carbono e de hidrogênio smt uma molécula de hidrocarboneto. Por exemplo, o hidrocarboneto com a proporção mms elevada é tt .mma.no CH$ (4:1.}.

Fração Hidrofóbiea” referc-se ã parte, ou fração, de ura material que é mais soldvel em uma fase hldrofóbtea em comparação com uma fase aquosa. Utna fração 30 hidrofóhiea é subsuneialmeníe insokivel em ágtttt e geralmente não-polar.

Como usado neste documento, a expressão aumento da produção de lipídios refere-se a um aumento da produtividade de uma cultura mícrubiana, por exemplo pelo aumento de peso seco de células pr.tr litro de cultura, atmtetnando a porcentagem de rómlmt que constituem hpidio, ou ao aumento da quaubdade tr.mil de llpklms por litro de volume 35 de cultura por unidade de tcrnpo,

Cm promotor induzfvel e aquele que medeia a transcrição de um gene ligado operaelonaimcnte em resposta a urn estímulo particular.

Conforme utilizada aqui, a expressão “em Hgaçào operacional'' se. refera a uma hgação funcional entre duas sequências, como uma sequèreda de controle ítípieamente um promotor) e na sequência de. ligação. O promotor esià em ligação operacional com um gene 5 exógeno se pode mediar a transcrição do gene,

O termo “in sito significa no lugar ou na soa posição original. Por exemplo, uma culture pode conter urea primeira microalga sectelaudo um catalisador e um segundo snicroorgaaiamo seeretando um substrato, onde o primeiro e o segundo tipos de- célula produzem os componentes necessários para uma reação química em pariioular ocorrer in 10 si tu da eoOuitmn sen· a necessidade de mais separação ou precessamento dos materiais.

Uma “concentração limitante de um nutnente é uma concentração em uma cultura que limita a propagação de um organismo cm cultura. Uma concentração nào-iimiíaníe de um nutriente ê uma concentração que suporta a propagação máxima durante um determinado período de cultura. Assmi. o número de céiulas produzidas durante um 15 determinado período da cultura é menor na presença de ama concentração liroitante de uni nutriente do que· quando o nulrienre nau é liraltaríte·. lim nutriente é considerado em excesso em uma cultura quando o iminente está presente em uma concentração maior do que aquela que suporta a propagação máxima.

Conforme utilizado aqui, uma bpase é uma enzima solúvel em égua que catalisa a 20 hidrólise de ligações éster em substratos iipídicos insolúveis em água, Lipases catalisam a hidrdii.se de lipidios em gliceróis e ácidos graxos.

Conforme utilizado aqui, ama enzima de via iipídica é ema enzima que desempenha um papel no metabolismo Hpídico. ou seja, tanto a síntese llpídrea, quanio a modificação u-u a degradação. Este icr-no engloba as proteínas que modificam 25 qmmícameme os lipídios. bem como as proteínas transportadoras.

Lipídeos sãs uma ciasse de hidrocarbonetos que são solúveis em solventes apoiares (como éter e clorofórmio) e sào relativamentc ou lotalmente insolúveis em água. Moléculas lipídicas têm essas propriedades porque consistem em grande parte de longas caudas de hldrucarbosietos que são hidtofóbicas na natureza. Exemplos de lipídios incluem 30 ácidos graxos (saturados c. insaturados): glicerideos t>ti glicarelipídeos rtals como niouoglicerídeos, digllceridecs, triglicerídeos ou gorduras .neutras, e fosfoglicerídeus ou glicerofosfolípideos); não-gbcerideos (esfingolipídeos, lipídios esterés*. incluindo o coleslerol e os hormônios esterôides, lipídios prenots incluindo terpeaóidex, álcoois graxws, eeras u poticetídeos) e lipídios complexos derivados (lipídloa de açúcar ligado, ou 35 gíicolipídeos, e lipídios de proteína ligada). Gorduras” são um subgrupo de lipídios chamado “triacílglieerídeos,”

Conforme utilizado aqui, o termu lísado refere-se a ums solução contendo o coraeúdo das cébikís lisadas.

Conforme utilizado aqui, o termo 'íi$e“ refere-se à raptara da membrana plaranática e, opeiomümeme, da parede celular de »m organismo biológico o stjfreieme. para liberar pelo menos parle do ctmteôdo intracslular, geralmenté através de mecanismos mecânicos, virais ou osm.4dc.os que comprometem sua integridade.

Conforme utilizado aqui, o «ermo “lisar^d tefere-se a romper a membrana celular e, opcionalmeníe. a parede celular de uma célula ou organismo biológico o suficiente para liberar pelo menos parte do conteúdo intracelular.

Microalgs” significa um organismo microbi&no eucariota que contém um cloroplasto. e, opcionalmente. que é capaz de realizar a fotossmtese, ou um organismo miurobiano procariota capaz de realizar a fotossíntcse. Microalgas incluem fotoautótrofos obrigados, que nâo podem, metabolizur uma fonte de carbono ftxa como energia, bem como neterótrofos, que podem viver exclusivamente fora de uma fonte de carbono fixa. Mtcroalgas podem referir-se a organismos aniceluiares que se separam a partir de células Irmas logo após a divisão celular, como Gtlomjdoutonns, e também podem se referir aos micróbios, como, por exemplo, VWvor, que é um micróbio fotossintético multicelular simples de dois tipos de células distintos. Mkrroalga também pode se referir a células como C/díw//n e .Oímnfíel/c, “Mlcroaigas” também inclui outro» organismos fotussintéticos mterobianos que exibem adesão célula-célala. como A^ntertef/uw:, Arm&renoe lW«m. Microalgas inclui também microrganismos heterotráfkos obrigados que perderam a capacidade de realizar íotossíntese. como certas espécies de algas d.inoflsígeludas,

Qs termos microorganismo e ’’micróbio silo utilizados alternadamente aqui para referir-se a organismos unicelulares microscópicos.

Levedura oleaginosa, como attlizado aqui, sigmfica que a levedura pode naturalmente acamular mais de 10% do seu peso celular seco como lipídlos ou pude fazê» lo como resultado da engenharia genética. As leveduras oleaginosas incluem organismos corno Karrtnwt iqro/yriea, bem como cepas modificadas de levedura, tais como &Kzóuroav’ce5· cerevísme que foram modificada» para acumular mais de UM dt> seu peso celular saco como lipídins.

Conforme utilizado aqui, e- termo choque ysmóticu refere-se h ruptura das células em uma solução na sequência de uma redação súbita ds pressão osmôtica. O choque osmótico é as vezes induzido para liberar componentes celulares dessas células em uma solução.

“Fotobiísreaicr se. refere a ura recipiente, em que. pelo arenes pane dele é pmcítdmeme transparente ou parcialmente aberta, pemtitirtdo a passagem de luz.. no qual urna on msU células de microalgas sdo cultivadas, Fotrsbloreatores podem ser fechados, como «o caso de um saco de polietUeno ou um Erlenmcyer, ou podem ser abertos para o ambiente, como no coso de uma lagoa so ar livre.

Conforme utilizado aqui, ama enzima degradante de polissacarideos se relére a qualquer enzima capaz de catalisar a hidrólixe, ou despolimeáraçâo. de qualquer polissacarídeo. Per exemplo, cciulases catalisam a hidrólisc da celulose.

’'Poltssacarfdcos’^! twnbéin chamados dc glycans”} sito carbuídraios compostos de motxossaearídcos unidos pot ligações glícosídicas. A celulose é um exemplo de um polixsaearídeo que compõe certas paredes celulares de plantas, A celulose pode ser despxdimerizstda por enzimas para produzir raonoss&csrídeos come xitase e glicose, bem coroo díssaearídeos e oltgossacsn'deos maiores.

Abertura, no contexto de um btoneatur, refere-se a ema abertura no biorreator que portnire influxo ou efltotu de materiais como gases, líquidos e células As portas sào normalmeme conectadas à Uthuhtçita que vem do fotobimeator.

Um promotor ê definido como um conjunto de sequências de controle de ácidos nucletcos que direcionam a transcrição de um ilcislo nucleíco. Conforme utilizado aqui, um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias perto do local de início da transcrição, tais conto, ao caso de utxta polimerase tipo H promotora, aro elemento ΤΛΪΑ. Lhn promotor também Intltd opcional mente um õnensífteador distai ou elementos repressures, que podem ser localizados tautu quanto alguns nttlbares de pares de bases do local de início da transcrição.

Conforme utilizado aqui, o termo recombinante'q quando usado coro referência, por exemplo. a uma célula, ou ácido nucléico. ou proteína, ou vetor, indica que a célula, o ácido nudéteo, a proteína ou o vetor, foi modificado pela introdução de um íiddu nueléico exôgeno ou de o ma proteína, ou pela alteração de um ácido aucléleo nativo ou proteína, oa que a eéltda ê derivada de uma célula que foi modificada. .Assim, por exemplo, células recombinantes expressam os genes que mio sita encontrados dentro da forma nativa da uélultt fnào recombinante) eu expressam genes naovos que sita anormalmente expressos em contrário. nos tennos expressos oa não expressos em tudo, Ü termo ácido nucleico reconibinsíníc ftquí é signífleado dc ácido aaclêtCo, orightalmcnte formado ist yjtro. ero geral pela manípttlaçao de ácido nuetéloo, por exemplo, usuraio poíimemses c endonucleases, de tuna forma tmrmalraenle aào encontrada na natureza. Desta forma, a ligação opnrsciomil de diferentes sequências é alcançada. Assim, um ácido umkncs isolado em fonna linear ou um vetor de expressão forrtrado in vttro pela bgaçáo de moléculas de DNA, que normalmeme não são unidos, são ambos considerados recumblnaates para os fins da presente invenção, Entende-se que urna ve? um ácido nuciekm recombinante é leim e reimrodtrzido em uma célula ot, organismo hospedeiro. ele irâ replicar de forma não recombmante, ou seja, usando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira, em vez de manipulações in vitro; no entanto, tais ácidos nucleicos, uma vez produzidos de forma recombmanie, embora postedormcme replicados de forma não recombíaante, ainda são considerados recomhinantss para efeitos da invenção, Da mesma forma, ama '‘proteína rccombinaate” é uma proteína produzida através de técnicas de ícromhinaçacs, isto é, utravés da expressão de um ácido mscieico rccombinante como descrito acima.

Conforme utilizado aqui, o termo d-esel renovável refere-se aos alcanos (como CiiOdl Cl2;0, C:14;Ü, C16;0 e C1E:O) produzidos através de hidrogenação e desoxigenação de fipfdios.

Conforme utilizado aqui, o termo sonicação se refere a um processo de interrupção de materiais biológicos, tais como uma célula, através da milixação da energia das ondas de som, ‘'Espécie de furfural refere-se a z-Furancarboxaldeído ou um derivado que mantém as mesmas características estruturais básicas,

Como usado aqui, silagem refere -se aos caules c folhas secos remanescerdes de uma colheita após o grile ser colhido.

O ‘‘gene de utilização de sacarose” ê um gene que, quando expresso, ajuda na capacidade de uma célula para utilizar xacaro.se como fome de energia Proteínas codificadas por um gene de utilização de sacarose são aqui referida» como enzimas de uso de sacarose e Incluem os transportadores de sacarose, a sacarose invertase e hexoquinasea como giueoqtfmases e frutequúmes, “Agua residual é um resíduo aqttoso que tipicamente cmarêm agua de lavagem, resíduos de lavanderia, fezes, urina e outros resíduos líquidos ou xemi-líquidos. Ele incha algumas formas de resíduo.» urbanos, burn como esgoto sexundariamente tratado.

Para fins de comparação para determinar a porcentagem de identidade de ttecleolídeos ou aminoâeidos, geralmente uma seqüência ttiutt como uma seqdéncia de referencia, cunt a qual seqliéneitis de teste sâo comparadas. Ao trêlizzr um algoritmo de comparação de sequência. »s sequências de teste e de referência são colocadas cart um computador, subsequenti&.« coordenadas são designadas, se necessário, e os parâmetros de seqtiéncia de programa de algoritmo são designadas. O algoritmo de comparação de ssqtiês.ciw. então, calcula a identidade dc sequência por cetito para a sequénctaís) do ensaio íiíU tetação à sequência de referência, com base nos parâmetro» do programa designado,

O alinhamento ótimo ds sequências para comparação pode ser realizado, por

29/127 iov.'paio, pelo algutittno de homologia local de Smith & Waterman, Arfv. Αρρλ Λ&ηΆ 7.:482 Π 981). pelo algoritmo tie nlinhítrncnio de homok-gía de Necdlemait & Wtmsch, J. M&L Bif>L 48:443 (197()), pela método tie busca de similaridade de Pearson & Lipman,

AÍHííwtfri. Acmf. Xcí. L^?ã'A &L2444 (.(95(0, por írf?/?/ezm?n?íq.vh? ? eompmríZari&n&i dewes «ígorrimos (GAP. ΒΕΤΤΙΊΤ. FASTA e ?7>UZA em Wcrnwm Generrór 5'q/twre Package. Generic.! Ctmputer Crrwp, 575 «Science Z2r., AWíron, W.O. r.m por ímrpeçdo l|l|||®id|/)/Í|i|MÍiiiO)É^M®ÍOIOMÈÍÍIIIIIIIÍIÍÍÍÍIÍÍÍÍ^

Ontio algoritmo de exemplo que é adequado para determina!· a identidade de seqiiéncta por cento e a similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em 10 Ateidhd e/ mí Z A/rri. 8í#L 2l5:403-4IO <1990), O software para a realização de análises BLAST está publicamente disponível através do Nacional Center for Biotechnology Information fat the web ttddrass ww.ttcbt.nlm.uih.gov i. Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pates de sequência de resultado alto (HSPsj. atwês da identificação de palavras curtax de compnmemn W na sequência de consulta. que cooespomíam ou 15 .satisfaçam algum resultado Ί no limite do valor positivo, quando alinhado com uma palavra de mesmo comprimento de um banco de dados. T é referido como o limite de pontuação da palavra próxima ( A/wc/ud e/ «’.(.< .Supro.}, Estes acertos das palavras próximas iniciais agem esmo sementes para o mfcio de pesquisas para encontrar HSPs mais longas que &x contenham. Os acertos de palavras são depois exiendídos em ambas as 20 direções ao longo de eadst sequência para tão longe quanto apontuação do aiinhamema cumulativo posas ser aumentada. Pontuações eutnulativas são calculadas asando, por seqüências de nucieotídeos, os parâmetros M /resultado de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (resultado de pena para resíduos mm correspondentes; sempre <0). Para as sequências de amtnoácidos. uma matrix de pontuação 25 é usada para calcular a pontuação ctimuladva. A. extensão dos acertos dc palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo atingido; st pontuação curtmlativst vai a zero ou. abaixo devido á ít<'.umaíitção de um ou mats alinhamearós de resíduos tie resultado negativo; ou u fim de uma seqüêacta é alcançado. Para identifica.? se um tkklo nucléiee ou pohpeptídeo está 30 dentro do escopo da invenção, os parâmetros padrão dos programas BLAST são adequados O programa BLASTN (para seqütmcias de nudeofídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W.· de 11. uma expectativa (El de lit. M ~ 5, N 4, e uma comparação de ambas os filamentos. Para as sequências de aminoácldos, o programa Bl.ASTF usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3. uma expectativa (E) tie 35 l/?. e a an-trlz. de pontuação BLOSUM62. O programa TBLATN (utilizando seqtiència da proteína paria seqüência de nucieotróeos) usa come padrão um comprimento de palavra (s¥,i de 3. urna expectativa (Et de 10, e uma matrix tic pontuação BLOSUM 62. (ver l-knikofF& HeniktdT. Arms Mid. ArW Srv, f/5A 89:I0915 {1989)).

Além de calcular identidade de seqtièncía por cento, o algoritmo BLAST lambent realiza ama análise estatística <la semelhança entre dims sequências (ver. /.w exe/npfo, .Karlin & Aitschul. Prtx;. Adi'/, .deed, 5d, (/5/1 90:5873-578? (1993)). Uma methda de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST è a menor probabilidade de soma (P(N)k que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre dois nudeotidos ou sequências de amítmâcidos ocorrería put aca.se, Pm exemplo, um ácido msclêíco ê considerado semelhama a urna sequência dc teferlncia se a menor proòabilidada de '.ema cm uma eompamçuo da ácido nacleitm de teste eom o ácido nucléieo de referência á inferior a cerca de 0,1. mais preferivelmente names de cerca de 0a.ll e mais preferivelmente menos que cerca de 0.00 L

Π. GERAL

A invenção está baseada, em parte, na percepção dc que certos míeromgamsmos podem ser usados para produzir óleos, combustíveis e outras ctsmposições dc hidrocarbonetos ou Upídieas de modo econômico e em grandes quantidades, para uso no transporte de combustível, na industrie petroquímica, e/ou na indústna de alimentos e cosméticos, entre outras aplicações. Os microorganismos adequados incluem micrualgas. leveduras oleaginosas e fungos. Um gênero preferido de microalgas para uso na invenção ê a mictosdga produtora de Lipídios tMfore/G. A transesteriflcação dos lípídíos longa produz êstetes dc ácidos graxos de cadeia longa úteis como biodiesel. Outros premesses emrlmâticos e químicos podam ser adaptados para produzir ácidos graxos, aldcídos. álcoots, aicanos e aksnos. O presente pedido descreve métodos para a modificação genética de múltiplas espécies e cepas de mivrorgsmsmos, incluindo Ch/mv/Ài e micróbios semelhantes, pata fornecer organismos com características que facilitam a produção de lipídios adequados para a conversão em óleos, combustíveis e dkms químicos. Em algumas aplicações, o diesel renovável, o combaMh-eí de jato, tm outros compostos de hidrocarbonatos sâu produzidos. G presente pedido também descreve métodos de cultivo de mieroulgas para aumentar a produtivsdude e produção de bpídeos melhorada, e/uu para uma produção de custos mais eficazes dos composições aqui descritas.

Em modalidades particulares, « presente pedido descreve, cepas geneticamente modificadas de mícrnalgas som um ou mais genes exôgenos Por exemplo, mimoalgas que produzem altos -níveis de triacilgllcerídeos (TAG? adeqtmdo para o biodiesel podem ser projetadas para expressar uma lipase, que pode facilitar a transesíerificsçüo de mictoalgas TAG. A lipase opciunalmente pode ser expressa através de um promotor mduzível. de modo que as células podem ser cultivadas primeiro em nma densidade desejável em um fermeutador c depois colhidas, seguidas de indução d» promotor para expressar a lipaxe, «pcionalniente na presença de álcool suficiente para conduzir a conversão de TAGs em ésteres de ácidos graxos.

Alguns lipidios das microalgas são sequestrados nas membranas celulares e em 5 outras partes não aqvosas da célula. Ponanto, para aumerttar o rendimemo da reação de transesterifícaçã», pode· ser benéfico Iisa.r as células para aumentar a acessibilidade da lipase ao lipídio. O rompimenw celular prxlo ser eailxado, por exemplo. nieeanícameme. através da adição de vapor sob pressão, ou através do emprego de um vírus que lisa as células de mleroalgas, expressando um gene para produzir uma proteína htica na célula, ou 10 ír&íur a cullura com um agente que lisa aa células de microalgsa. O tratamento coro vapor dc microalgas para rompimento celular é descrito, por exemplo, na Patente U.S. 6.750.048.

Também aqui divulgada é a engenharia genética de reicroulgas que produzem tiltos níveis de TAG puro expressar um gene que Usa as células de nikroalgas. como por exemplo, um gene de um vírus lítreo. .liste gene pode ser expressado através de um 15 promotor induzfwl. de modo que as células podem ser cultivadas primeiro a uma densidade desejável em um fermentador e depots colhidas, sogurda de indução do promotor para, expressar o gene para iisar tts células, Um gene que codifica uma enzima que degrada polissaeari'dens, por exemplo. pode ser expresso para lísar as células.

Opcionalmenre, a llpase pode ser expressa em um compartimento intracelular, onde 20 permanece separada da maioria dos lipídios de mteroaigas até a irunsexterificaçãs.

Geralmente, ê preferível realizar a iransesterificaçâo após a água ler sido substancialmente removida da preparação e/ou um excesso de álcool ter sido adicionado. As lipases podem usar a água., assim couto o álcool, como substrato na trartsestexificação. Corn a água, os lipídlos sán conjugados a unia fração de hídroxila paro produzir um ácido graxo polar, ao 25 revés de um ester. Coot um álcool, como o metanol, <.< hpídio c conjugado a um grupo media. prodazrado um êster de ácido graxo apoiar que normalmente é preferível como um combustível de transporte. Para limitar a exposição da hpase aos liptdios das microalgas até que as condições estejam adequadas para transerteriflcação para st produção de ésteres de ácidos graxos, s lipase pude ser expressa, por exemplo, uo clomplasto, n« mitocôndria, 30 ou outra organela celular. Esta expressão eompartirnerttalizada resulta no seqüestro da lipase da maioria dos llpídcre» celulares até depois dc as células tecem sido rompidas.

Etn oníra modalidade partícula!', o presente pedido descreve eepus geneticamente modifleadüt; de míeroaigas, de leveduras oleaginosas, de bactérias ou de longos com uni ou mais genes exógenos para produzir vários compostos de hidroemboneios. Por exemplo, as 35 microalgtis que naturalmentc, ots através da modificação genética, produzem altos níveis de lipídíos, ptxiem ser modificadas *ou reais modificadas) para expressm urea lioesterase de acil-ACP graxo exágena, o que pode íacilirar a divagem de ácidas graxos da proteína transportadora de adia (ACP.r durante a siutcse de lipi'dios. Esses áaldes graxos podem ser recuperados on, através de otnrr.i processa mento ensãmãtíeo demro da célula, produzir outros compostos de hidrocarbonetos. Opcionalmente. a tloesterasc de acil-ACP graxo 5 pode ser expressa a parür de um gene ligado operacionalmente a um promotor indurdvet. e/ou pode ser expressa em um compartimento intracelular.

A tioesterase de acil-ACP graxo pode ser escolhida com base na sua especificidade para am eresctraenío (durante a símese de. ácidos grazes; de ácidos grazes crars um conrpnnrenio de cadeia de carbono espccitrco. Por exemplo, tt rioesierase de acil-ACP 10 graxo peda ler uma especificidade para um comprimento de cadeia de carbono variando de S a 34 átomos de carbono. de preferência de 8 a 18 átomos de carbono, e mais preferem ixlmeate de lü a 14 átomos de carbono. A especificidade de um ácido graxo cotn l2. átomos de carbono é & mais preferível.

Além disso, a invenção fornece cepas geneticamente modiücadas de microalgas 15 para expressar dois ou mais genes exógeaos, como, por exemplo, um gene de lipase e um lítiec, por exemplo, um que codifica uma enzima degradante de polissacarideos. Um ou ambos os genes podem ser expressos usando um promotor mduzívei, que permitem que o sracromsmo relativo de expressão desses genes deve ser t-ouirdad» para aumentar a produção de lipídius e a conversão em ésteres de ácidos graxos. A invenção também 20 fornece vetores e métodos para micróbios produtores de lipidios modificados mesabolizarem a sacarose, que ê uma característica vantajosa, pois permite às células modificadas converterem açúcar de cana ou outras matérias-primas em lipídíos adequados para produção dc óleos, combustíveis, óleos químicos e similares.

Em outras modalidades, a invenção fornece cepas modificadas de micróbios (por 25 exemplo. raicroalgas. levedura oleaginosa, bactérias ou fungosp que expressam dots ou mais genes exógenos. como, por exemplo, uma tiuestera.se de acil-ACP graze e tint adiCoA graxo/aldeído redutase, cuja ação combinada produz um álcool. A invenção prevê ititidtt outra» combinações de genes exógenos, incluindo, entre outras, uma lifxtsierase de tteii-ACP graxo c uma proteína transportadora de sells co-expressa namralmenle para 30 gerar ácidos grazes de comprimento especifico, ou tuna tioesterase de aeti-ACP graxo e uma redatase de aoil-CoÀ graxo para gerar aldeídcs. A invenção também prevê, a combinação dc uma tioestera.se de aeíl-ACP graxo, uma redutase de acil-CoA graxo. e um aldeído deearbonilase graxo para gerar aleanos ou aicenos. Um ou mais òos genes exógenos pode ser expressos através de um promotor mduzível.

A inve-rçào fornece outras modificações de miuroaígas, por exemplo, para fornecer microaigas com caractctteílcas dc crescimento desejadas e/uu paia aumentar α quantidade e/ou a qualidade dm lipfdtos produzidos. Por exemplo, as microalgas podem ser raodificsdas para aumentar o fluxo de carbono na via Itpfdtca c/ou modifier· o oamiaho fipídico para, alterar beneficamente as proporções ou propriedades dos lipldios produzidos pelas eeluias,

Este pedido reveltt cepas geneticamente modificadas de rnicroalgas para expressar dots ou mais genes exógeuos, um codificando um transportador de uma fonte de carbono fixa (como a sacarose), e ura segued codificando uma enzima xacarosc mvenase. Os organismos fermentáveís resultantes produzem htdroeatbouctos cm menor custo dc produção do que o que foi obtido por métodos previamenre conhecidos de produção 10 biológica de hidrocarbonetos. A inserção dos dois genes exógenos descritos acima pode ser combinada com a interrupção da biossintsse de polissacarideos através de mutagénese direta e/ou aleatória, que dirige fluxo de carbono ainda maior nu produção de hidrocttrboneios. Individualmente e em combinação, a conversão trafica. a engenharia para alterar a produção de hidroesirbotretos e o tratamento com enzimas exógertas alteram o 15 composição de hidrocarbonetos produzidos por um microorganismo, A alteração pode ser uma mudança na quantidade de hidrocarbonetos produzidos. an quantidade de uma ou mais espécies de hidrocarbonetos produzida em relação a outros hidrocarbonetos, e/ou nos tipos de espécies de htdrocarbonetos produzidos no microorganismo. Por exemplo, as micraalgas podem set projetadas para produzí·· uma maior quantidade e/ou percentagem de 20 TAGs.

III. MICROORGANISMOS PRODUTORES DE ÓLEO OU UPÓHOS

Qualquer espécie de organismo que produz üptdios ou hidrocarhonetos adequados pode ser utilizada, embora os microorganismos que produzem naturalmente altos níveis de lipídios ou hidrnearbonelos adequado* sejam preferido*. A produção de hidrocarbonetvs 25 por microorganismos é revisada por Metzger et al. Appi Microbiol Biotechnol (2005 ) 66: 4SÓ-496 and A Look Back at the US. De.part.msnt of Energy’s Aquatic Species Program: .Biodiesel from Algae. NREI/rP-580-24190, John Sheehan. Tetri Dttnahay, John Benemann and Paul Roessler (1998-,

Considerações sobre a seleção de microorganismos para uso na invenção backrest, SO além da produção de lipi'dios ou hidrocarbonetos adequados pars a produção tie óleos, combustíveis e óleos químicos: 11 elevado teor tic Kpidos em percentagem de peso celular; t2) facilidade de crescimento, (3) facilidade de engenhada genética, c (4) fact lidado de processamento de biornassa. Em modalidades particulares, o tipo selvagem ou geneticamente modificado de microorganismos produzem eélukts que são pelo menos 35 41'Fõ, pelts menos 4561, pelo menos 5fí%, pelo menos 55%. pelo menos 60%, ao mlrauaj.

õã%, »u. pelo meno;>70% o» mui* sipidkas. Organismos preferidos crescer heterotroftee |||||||||||||||||||||||||||||||||||||^||l:|2il (em açúcares na ausência de luz) ou podem ser projetados para fazê-lo usando, por exemplo. os métodos aqui divulgados. A facihdade de transformação e a disponibilidade de marcadores e promotores selecionáveis, constitutivos e/ou induzíveis, que são funcionais no ramroorganistno, afetam a facilidade de engenharia genética. O 5 processamento de considerações de pode incluir, por exemplo, a disponibilidade de meios eficazes para lisar as células.

A» Aim

Em uma modalidade da presente invenção, o microtganismo é uma microalga.

Exemplos não limitímtes de micmalgas que podem ser usados em conformidade com a 1Q presente invenção podem ser encontrados na Tabela l.

Tabela l. Exemplos de micrmlgas.

Achnzíwdres orierUrt/è?. Á,çwi»«€í/«m. Arupftíprwr» />yul;Âwíp?u>r<7 eqf/H/ontót.

AmpAoru cq^ifortm s tów. Arep/iuru íZe?i«m w«w. .dutpúoru ík/ituíímw <'<íx’í'íííP<,

Antp/mríí sp., /tnoboerep 4nto<4ww. AnáwweVsnwjittour, Eocfohn-iu hivigioruhi.

ZfríFfvAne/fo λ·»?., ^yrryocwcns õrwaatí, 8^?ry<,v.oeít/t sac/Oflí «s> Bs-uc.u-oer.íf.eíí.s taín-vr. Zimcre.OKKru.s’ merfíortnrdtfymtó. Curtertn. ChueíUíer<?x p/ueZAT, Cftuertwr<>.y «uje/for?, CAue.Uít r rz·.? ume/foC .whsairutn, Oíoctoceíos ,sp„ Cúíurv/ré ôtòreta. CÂ/ore/í'» An&trcrira. Cêíereí/n «wreowm&s. CfuTí-eZ/u c««d«fe. C/t/ore/fc» «qxvdme, OuTre/fo cA-uü-íop?'.. Cft/ítrebu cí/tp.$pidea. CMore/fc emerso««; CMwdfe /u.»e«, CWtw/la fiereu w. t-utuoíotíí. ΐ{ίϊί)ί{ί)ίίΒ0ί|Ο|ί)|βΙβΛ

C/tfore/ta íA/uwurem >u>'· ítutrettophtim Ch/ore&t fou,sré?è Chforeh’u (obophoro forrurâ SAG ST.Sá·/. GMurvfú:» fítrcm úàZA'. OtioreíZa /«/«.»»0-58.-.- <.-s?-. íuueuvrèrèüT CA/wc/fe ótfcm réídts vor. /uteszenx. CA/oreEtt Ou'_;-a>?:^:8u múums.rímn. Chforerio mumbítE. CÃloref/íj noítfHrma, C/uoreZ/o ovce/w, Ch/<?re.Ziu ptuvu. CTt/nreífo píuífíípíttfo. ChforaEn prmg,ráíUtrm. f7pfc't'í47<-í /..v-í?míhet?uí<rè.t fwfofotfe quo/çur r cepo u'e l/T£X /896. 294. 25ó. 255, 250.

249. 5/. 29. 25,1 GWrcsiU prototAecoídes cor. «t-w/rêofc?. Ckfore/Aí rag«/aw, CAforatVu tegufoí ii- vw. .wumo, Chforeku regafow v«r. «mèricato, O&wOe rcmglti. C/uLucíTu írtccArt ropAt ía'. C/Worc h'u .<u rchrt r opAt íu t ^:o r. e ? Apsoit&?«. Cú ú>r í-fot &yfiazx_t C.hZí.>,<·.« ? fu .ttuípter. CA/w<u7íí mroámrénA CêZrfíc/Zít ,tp.. t’VtZore.;Z« .tpòí-rerieu, CZsZo/eZ/p Í)Í)Í)Í)Í)Í5ÍpOfoO®ÍíiB®5i®

CAforororí-mn úplt.vííxnum. CAh/rocoecmu rp., Cítíttr^wnwru. CÃroo/aíUtíts ?/?..

CZuysí>\$/.>?í<-:/e m sp.,. Críí o.vpéu<?m ,çp.. CnprZscrtxZí?t >'twa.-: oúr. ú>. Crypr<ws<»/<·ue .yp.. C) cZou? ÍZe |||||||i|||||||||||||il||||||||||||||||3oi7li|lillliil onpfrca, Cfecrórc/fe tncnegAmtòau. C'yetia sp.. Dunnhe&i sp._: i'.fea7:drèf<íí baróasvtZ, Zfenafedfe feocafem, ZWtfSa graWure, ZWróre&t wtów, wm .Ommjfeòo purw, ZMmo’irtfe petren. feoWfeife prmmfe' m, DmmAeZ&í /.Jíotoífe/fe' {??«. Z>umi&lAí tmipfectn, Dumu/feífe ν<'ί·ή:ό'.ϊ, £p<nm'felfe rormifecm, &çwtpfeisííi vrèfefe Eremosp/usera ,ψ.< EV/ípszudon sp., Eugfena, Zovtficefe sp._: Z>«gi?«mãt croícnefrtfe to'cirjiferfe ;sp\. Gfeoropsví sp„ €íf<^«zZ3ârf?íríte>ri sp.. ff¥,»»ení?ínorms sp„ /.w/imis n/í gfefeum, £rocAr>w gróàtum, Lepoefedfe Àfrêracrimum. Aftcrsrefbnam fò7EX Lê :Won<>rqpAídfem mtmtf «ei, AfonumpAn/wm sp,. LUvmwAfens ep., .%wtót«çw sr4úw, pstvfefíiíncl/oòfes. A?avicm'a pe/feafe ja, .V,7wca1,7 .< <rp ropPiPi, ffeufc «1,7 sp.. AfepólOfeilons •VíO„$«/.·,';.< posíl/o íhoí;wré. .Víi;'..s<'?írò Virtwãín vp„ Gfhnwt»»nv .tp., f7fx?y.íí?s' ρ«Γ’Λϊ, <.}f>ey>íò' ρκάί&ϊ, é)<M ysr/r sp„ fÀ>'£íl/í<;í:í?rò /òm&uròsz ókel/íkí-ork; <p._;

A'hia/.'?! <>!'?£,'£!; op«eas< 5<7?\< kroV e/iryvppAi’/e. Secmu/esamA' «r/aíiUtó. 5eAí;'.Of?«vínu?«.

7Wί·β.ΐί·<ί»ό ?p.< ?'t’?ra.s<?,'??s? s .$«£*£: íí íi, rAolímlfíivro and VVmAW/o /rúLrkkvi.íi

1,. CA/oreffe

Em sã» modahdüde preferida da presente invenção, v microorgaaisnto ê do gênero Chhreiln, de preferência , Chioreila prorethecoides , ChlwelU ellipsoid»», Chlorella minuítssirna, ou Chlorelía ememníi.

OiforeiÈ? ê «tn gênero de algas verdes nnicelulares, pertencentes ao filo

Chíorophyia. È de forma esférica, de 2 a K) pm de diâmetro, e ê sem Hagslos. Algumas espécies de Cêfore/âa são saltmilmeate liaieroiròfieas.

Odorc/lo. particularmente a C/nMre&í pr<Por/ti?< ofdcs\ é um microorganismo preferido para u uso na invenção, devido à sua elevada composição de lípidios, W prinsipalmente lípidios de cadeia longa adequados para o biodiesel Além disso, esta microaíga cresce hetcrotroliearacnte c pode ser geneticamente modificada como demonstrado ra:ss exemplos ruencianados.

Em uma modabdsde preterida da presente invenção, o microorganismo usado para a expressão de um tratisgene é do gênero Ofem/o. de preferência, f'A/are/ia pwrofAeccmfer, C&lore&i wtóáw, ou CTdorelfe emersonò’. Exemplos de expressão de transgenes, por exemplo, ms Gtkvelm, podem set encontrados na literatura (ver, por exemplo Grere/a McreiZwifogy vol. 35 (I997.r pp. 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2QÍX.I Jul; 16 (4) :445-6: Cioresr Afá: o/bíoràgy vol, 38 (1999), pp, 335-341; Appf

AEcrobfot BfotecbuoZ (2(.816} 72: )97-295: Msrtmr Bmtec&wlogy 4, 63-73, 2002; Can?» Cremrrrès 39:5, 365-370 (200.1); Flnm Cell Ttepom 18:9, 778-780, (1999) ; Bmfogfo PiimfiiriH-m 42 (2): 209-216, (1999); PÀi.m /Vdaefogy.. J 2.1 (1 i: 13-20, (2(.815)), Veja também exemplos aqui. Outras mictoalgas produtoras de Upídlos podem set também mndjfkíidas. incluindo as microalgas ptoearíotns (ver Kalscncuer al ST. Applied

Microbiology and Biotechnology, Volume 52, Number 4 / October, 1999}.

2, Identóficnção ds jf&pme CldorelU

Espécies de 67dt?rell« para uso na invenção podem ser identificadas pels amplificação de certas regiães-elvo do geimma. Per exemplo, a identificação dc un-s espécie ου cepa específica de (.Vdere/fo· pode set alcançada através de amplificação e 15 seqüesíiam&mo de materiais nucleares e/ou DMA do eloroplasto, usando primers e metodologia de utilização dc qualquer região do genoma, por exemplo, utilizando cs métodos descritos no Wu et at, Bot. Bull. zlcnaf, 57«. (2(811) 42:115-121 Identification of Olorella rpp. isolates usrâg ribosomal DNA sequences. Métodos bem estabelecidos de análise filtígetiériea, como a smiplifieação e seqilenclaurenio do espaçador .huertio transcrito 20 ribossomal (ΓΓ81 e ÍTS2 rDNA), 188 rRNA, e outras regiões gcnômícas conservadas podem ser usados pelos perilos cm idcntificat espécies, não ao Chlornlla, mas outros organismos produtores de hidrouarbtmeítss e lipfdius capazes de tisar os métodos aqui divulgados, Para exemplos de métodos de identificação e classificação de algas veja também, por exemplo, (.remdrés, 20(15 Aug;l70(4); 160.1 -10 and foV4, 2005 Apr;) I(4):361 ^lllllllllllllllll^il^lll^l

Em uma modalidade da presente invenção, o míctorganismo é uma levedura oleaginosa. Exemplos não limitantes de leveduras oleaginosas que podem ser usados em conformidade com apresente invenção podem ser encontrados na Tabela 2.

Tabela 2. Exemplos de le vedmns oleaginosas.

CmmAeoccío.· enreums. CrypAifoecws· remocmíiíx, C'h.mfrac rp„ f.fpu.myres smrèeyi, £ipom>res· l/pq/er. EmÀ.>mye<?piò' verrm/ó?, glntràix B/mdofmWa and ((((((((^(Οβί®θΕθΟίΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙίΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

C, Outras Fumtos

Em uma modalidade da presente invenção, o mierorgsmisnio è imi fungo. Exemplos uâo limitastes de fungos que podem ser usados em conformidade com a presente invenção podem ser encontrados na Tabela 3.

Tabela 3, Exemplos de funges,

Mordcrelúc A/prtrèrrio véim-eo. .4fur^re?/$t uipw, PyrAmm dvíWri.mum. A/mor i.ítrme/úddes. Arpergt7k« ocAmrenx Aspergito réo-eur, Femrè E/râza ntaerâweí, Me«.s<?AUiio_; Qmetotarâtn. CtótpímM Afe7£ran<?Ae<í. Aúò',ppus, and Fv.fmmn

D> Ihctéms

Em uma modalidade da presente invenção, o mletorganismo é uma bseténa.

Exemplos de expressão de genes exõgenos em bactérias, como a E co/á são hem conhecidos; ser. por exemplo AfoGotdm· CGmrtg.’ A Zzíbwratfory Afanaaí, &ηί/λ»ζν?έ eí íif. (3d edition, 3001, Cold Spring Harbor Press?,

IV MÉTODOS DE CULTIVO DE MICROO&G ANISMOS

Ox mierorganisms são cultivados tamo para fins de realização de manipulações genéticas quanto para a subsequente, produção de hidrocaxbonetos (por exemplo, lipídios, ácidos graxos, aldeídos, álcoois e alcanos). O primeira tipo de. cultura é resdlzado cm pequena escala e, inictalmente, pelo menos, nas condições em que o micrerganismo pode 15 começar a crescer. Por exemplo, se o micmrganismo de partida é um fmomstóirofo, a cultura inicia; ê (etia aa presença de luz. As condições de cultura podem ser alteradas se o míctorgamsmo á desenvolvido ou projetado para crescer indepundeulemeníe da luz. A cuhma para fias de ptodução de hidrocarbonetus é geralmente conduzida em larga escala. De preferência, ama fonte de carbono fixa está presente. A cultura também pode ser 20 exposta à luz por algum ou todo o tempo.

As mkroalgas podem ser cultivadas em meios líquidos, Λ cultura pode ser contida dentro de um blorreator. Opciunalmente, o biorreator nào permite a entrada de luz. .Akermuivamcnte.. as mícroalgas também podam ser cultivadas em fraobiexreatores que contém uma fonte de earbono üxa c permitem que a luz ataque as células. A exposição de 25 células de mictoalgas à luz, mesmo na presença de urna fonte· de carbono fixa que as células transportam e utilizam {isto é, crescimento mixotrúfko), oonfudo, acelera o crescimento em relação ao cultivo de células no escuro. Os parâmetros de condição de cultura podem ser mampuladox pxra otimizar a produção total de hidrocarbunetos. a combinação de espécies de hidrocarbonetos produzidos, e/ou a produção de uma espécie de 3G hldro-rarbcmeto. Em alguns casos é prferi'vei cultivar as células «a escuto como, por exemplo, quando fermenladores exttemnraenk grandes {Ap.OtX; litros e malotes) são usados, não permitindo que a luz atinja a cultura.

Os meios de cultura de microalgas normalmente contêm componentes como uma fonte de. mtrogênio fixas, elementos traços. opcionaimenle um tampão para a manuiençào do pH, ε fosfato. Qutros componentes podem incluir uma fonte de. caibono fixa. tais como acetato ou glicose c sais, corno cloreto dc sódio, principalmciuc para microalgas marinhas. Exemplos de Gememos traços incluem zinco, boto, cobalto, cobre., manganês e 5 molibdênio. por exemplo, nas respectivas fórmulas de ZnCl?, .H5.BO5, CoCbõHjO <

Cuí'b»2H^O, MnC'b» 4H;>U e (NH^l^Mo^/O^wdH^O,

Para organismos capazes de crescer em uma fonle de carbono fixa. a fonts de carbono fixa podem ser. por exemplo, glicose, frutose. sacaro&e. galactose, xilo.se. mannse, mmnosc. N aectílglicosamlns. gliceroL floridosfdeo, e/ou ácido glucutênico . Uma ou mms W fontea de carbono podem ser fornecidas em uma concentração de pelo menos cerca de 50 ’M. pelo menos cerca de 1U0 : ’M. pelo menos cerca de SIX) : -M. pelo menos cerca 5 mM. pelo menos cerca de 30 mM, e pelo menos cerca de 500 mM, de tmta ou tnals fonte de carbono ftxa exogemmtenle fornecida. Algumas espécies de microalgas podem crescer utilizando uma fonte de carbono fixa, como a glicose ou o acetato, na ausência de luz. Tal 15 crescimento 0 conhecido como crescimento hcterotrófico Para a UWcnWtti prcíoíbeconíVr, por exemplo, crescimento heterotrófico resulta em alia produção de biomasas e acúmulo de elevado teor de Hpidos nas células.

Alguns microrgamsmos crescem naturalmente ou podem ser modificados para crescer ern ama fonte de carbono foa que é uma fonte heterogênea de compostos como os 20 resíduos urbanas, esgoto secundariamente tratado, águas rest duals e outras fontes de carbono fixa e outros nutrientes, como sulfates. fosfates e nitratos. O componente de esgoto serve como fonte de nutrientes na produção dc btdrocarbotiei.es. c a cultura fenie.ee uma fonte barata de hidrocarbonetos.

Outros parâmetros de cultura também podem ser manipulados, como 0 pH do meio 25 de cultura, a identidade e a concentração de elementos traços e outros constituintes da |||||íi||t|||||||g|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||j^

As mícroalgas podem ser cultivadas na presença de luz. Q número de fátons marcantes de uma cultura de cêluhia de micrualgas pude ser manipulado, ixmi como msttos 30 parâmetros, eomo o es'pectro de comprimento de onda e o proporção horas no escuro por dia. As micmàlgax podem ser cultivadas na luz natural, bem como em combinações simultâneas orna alternadas de luz tistutal e luz atúficiíd. Por exemplo, as mkruídgas do gênero ímmre&y podem ser cultivadas sob luz «aturai durante o dia e sob luz arüfkúd durante a noite.

O teor de gás de um futobiotrealor para o crescimento de mlcrorganismos como microulgaa pode ser manipulado. Farte do volume de um íotoblorrealor pode emster gás,

39/127 em vez. de líquido. As entradas de. gás podem ser usadas para bombear gases no fuiobifsrreattir. Qualquer gás pode «ser bombeado para um ietobiorreatnr, incluindo ar, misturas de ur/CQ?. gases nobres como argônio e outras. A taxa de entrada de gás em um futohiorreator também pode ser manipulada. O aumento do fluxo de gás em um S fotobiormâtor aumenta a turbídez de a má t-tiltuta de mieroalgas, A colocaçao de aberturas de transporte, de gases «m um fotobíonuator também pode afetar a turbidez de uma cultura em uma determinada taxa de fluxo de gás. As mismots de sr/COz podem ser moduladas para gerar quantidades ideais de CO2 para 0 crescimento máximo de um organismo espectricu. As mkroulg&s crescem signifjcaíivameate mms rápido tut luz sob, por exemplo.

3% de CQ;</97% de ar do que. em 100% de ar. 3% CO?/ 97% de ar tem aproximadamente

100 vezes mats CO 2-.^ o encontrado rm ar. Por exemplo, ar: misturas de CO? de cerca de 99.75% ar: 0,25% de CO?. cerca de 99,5% ar: 0,5% de CQ?.< cerca de 99,0% art 1.00% de CO?. cerna de 98.0% ar: 2,0% de Cf)?, cerca de 97,0% ar: 3,0% de CO₂, cerna de 96,0% nr: 4,0%. de CO?, e cerca de 95.00% ar: 5,0% de CO> podem ser infundidos em um : 5 biorreaíur ou fotobiorreator.

As culturas tie microalgas também podem ser submetidas a mirturaçâo usando aparelhos comes lâminas e impulsares giratório, balanço de tnrsa cultura, barras de agitação, infusão de gás pressurizado, e outros instrumentos.

Os fowbiorreatores podem ter aberturas permitindo a entrada de gases, sólidos, 20 semi-sólidos e líquidos para dentro da câmara que contém as mícroalgas. As aberturas estão geralmente ligadas á tubulação ou outros meios de transportar substâncias. As aberturas de gás transportam, por exemplo, gases para dentro da cultura. O bembeamento de gases em um fotobiorreator pode servir tamo para alimentar células com co 2 <^? com ou{tx>s gases quanto pata arejar a cultura e. poítaam, gerer turbídez. A quantidade de 25 turbldez de uma cultura 'vttriit conforme o numero e tt posição das aberturas de gá.-> são alteradas, Por exemplo, as aberturas tie gás podem ser colocadas ao longo do fundo de um saeo de polietiletio cilíndrico. As microalgas crescem mais rapidamente quando ?. é adicionado ao ar c borbalhad» em um fotoblorreator. Por exemplo. 5% de CO:·.: 95% de mistum de ar e injetado eni um folobkareator contendo células de ôofryococeuí (ver. por 30 exemplo 1 Agrlc Potxi Chem. 2906 Jtrn 28:54( 13):4593-9: J Biosci Biotmg. 1999: 8? ib) :8l 1-5, e J Nat Pfõd. 2.ÍXJ3 .lan;66(6}:772%).

Os fotobioneatores podem ser expostos a uma ou mais fotitsx de luz para fornecer microalgas com a luz como fonte de energia através de luz direcionada para uma superfície do fotobiorreator. De preferência, a fonte de luz fornece uma intensidade que é suncieate 35 para as célula® crescerem, ma® não tão intensa para causar dat>o oxtdativo ou provocar uma icsposra fotomihidoía. Etn alguns casos, uma fome de lax taut um alcance de comprimento •40/127 de onda que imita ou aproximadamente imita o aleanee do sol. Em outros casos, um alcance de comprimento de ondtt diferextfe -á utilizado. Os fotohíowa tores podem ser colocados ao ar livre ou em estufo ou outra instalação que permita que a luz solar atinja a superfície. As intensidade', de loteo preferidos paru as espécies do gênero S.-urweoceas lêm entre 25 e 5QQ m pE ~ s^: í ver. por exemplo Photosynth Re», 2003 Jun;84( 1-3/:21-7/,

Os fotobioereatores têm, preferencialmente, uma ou mais aberturas que permttem a entrada de meio. Mão é necessário que apenas uma subatàncte entre ou saia de uma abertura. Pot exemplo, uma abettnta pode ser utilizada pata escoar meios de cultura para o fombionrator e depois pode ser utilizada paru amostragem, entrada do gás, saída de gâs, 10 ou para outros fios. Em alguns casos um fotobiorreator está cheio de metus de cultura no tutelo de uma cultura, e não é administrado mais meto de crescimento apõs a cultura ser imaculada. Em outras palavras, a biomassa de mieroalgas é cultivada em um meio aquoso por um período de tempo durante o quai as microalgas reproduzem e aumentam em número; contudo, ag quantidades dc meio da cultura aquoso não são escoadas através do 15 fotoblorrcator durante todo o período de tempo. Assim, em alguma» modalidades, o meio de cultura aquoso não é escoado através do fotoblorreator após a inoeulaçào.

Ent outras situações, o meto de cultura pode ser escoado pelo fotobiorreator durante todo o período de tempo no qual as mtcroalgas reproduzem e aumentam em número. Em algumas modahdttdes, o meio ê infortdido nu fotobiorreator após a iruxutiação, mas antes 20 de as células chegarem a uma densidade desejada, Em outras palavras, um regime de fluxo turbulento de entrada de gás e entrada de meio não é mantido para α reprodução de tníoroalgas, até um aumento desejado no número das referidas mivroalgas ser atmgido.

Os íotobiorreatores têm, prelerencialmente, uma <..>u mais aberturas que permitem a entrada de gás. O gás pode servtr tanto pura fornecer nutrientes tais como o CQ?, quanto 25 para fornecer turbulência aos meios de cultura. A lurbulência pode ser alcançada rada colocação de tuna nbcrtuxã de entrada do gás abaixo <k< nível de.s meios de cultura aquosos, de modo que a entrada de gás na fotobrorreator borbulha ate superfície da ctthtma. tuna ou mais aberturas de saída de gás permitem que o gás escape, evitando o acúmulo de pressão nu fotobioereaicr. De prelerêneta, uma abertura de salda de gás leva a uma válvula dü unidtracionaí que impede a contaminação por mxcrorganixmos de entrar no fotobiorreatur.

Em alguns casos, as células sáo cultivadas ern cm fotobimreator por um período de tempt) durante o qual as mierrsalgas reproduzem e aumentam em numero; no entanto, utn regime de fluxo inrbulento, com redemoinhos turbulentos predotnínaniemente cm todo o meio de eultnra causados pela entrads de gás. não é msn-ido durante todo o período de tempo. Em 35 outros cusos, um regime de fluxo turbulento, corn redemoinhos turbulentos ptsidomtnantememe em todo o meto de cultura o&usades pela entrada de gás. pode ser mantido durante todo o período de tempo no qaal as microalga» reproduzem e aumerttam era nútneto Em alguns casos, ura intervalo prédetermlnado de proporções entre 3 dimensão do fotobiorreator e a escala dos redemoinhos não 0 mantido pelo período de tempo no qual as microulgas reproduzem e aumentam em número. Em outros eases, taí 5 intervalo pode ser mantido.

Os fotobiorreatores de preferência tem pelo menos uma abertura que pode ser utilizada. para a amostragem da ctdttira. De preferência, uma abertura de amostragem pode ser usada repetidamente sem alterar o comprometimento da natureza axêrúca da cultura. Uma abertura de amostragem pode set eonügyrada com uma válvula ou outro dispositivo 10 que permite que o Huso de amostra seja interrompido e iniciado. Aítemativamente. urna abertura de amostragem pode permitir a amostragem contínua. Os fotobiorreamres de preferência têm pelo menos ama abertura que penrate a inoculação de ama cultura. Essa abortara pode também ser utilizada para outros fms, como meios ou a entrada de gás.

Como uma aíternatlva para o crestimento fotoxsintético de mictourgamsmos, como descrito acima, alguns nucrorgamsmos podem ser cultivados em condições beterotróficas de cmseimento em que uma fonte de carbono fixa fornece energia para o crescimento e o acúmulo de li.pídios.

Em um método de cuhivo heterotrófieo, de acordo cure a invenção, o custo de 20 produção de biodiesel. glicerol bruto, parcíalmente purificado cm purificado produzido como ara subproduto da tranvesterifícação lipídlua pode ser empregado com» matériaprima para a fermentação de. por exempio. culturas microbianas de produção de llpídlos. Assim, a invenção compreende cultivar um micróbio ípor exemplo, uma miewalgaj, em uma primeira cultura trocrobiana; recuperar os llpídios mierobranos da cultura; submeter os 25 íipíd.ios mieroblanos a transestcrilkação para pnxluzir éstete« de ácidos graxos e glicerou como descrito acima; e acrescentar o gliccroi a uma segunda cultura mlcrobiana como matêria-pnma. A primeira e a segunda culturas micrebrertas podem, tires não precisara, ser culturas do mesmo micróbio. Se desejar, um sistema contínuo pode ser concebido. no qual o glicerol produzido a partir da irpídio recuperado de uma cultura pode ser alimentado de 30 volta para a mesma cultura,

A Invenção fornece parâmetros da cultura slgirificativamente melhorados incorporando & utilização de glicerol para a fermentação de vários gêneros tanto de micróbios eucariot&s quanto procaritrtas, raeluindo micróbios dos gêneros ChloreUa , AzofíuZo. S'lrenK’de.miu.v, e S/nrnhnu. Como os exemplos demonstram, micróbios de. 35 linhagens evolucionárias extremamente divergentes, iaclairido Chréredííj, Mn-áaàí.

ScenerZermuz, e Ópiraámn , bem como culturas de várias espécies e cepas distintas de

Ctowíto crescem mu1·ο bem não só em glicerul de grau reageme purificado, nuts unnbé.ra em glireroí arndmado e n«o acidfoado subpreiílmo do tranaesterífteação do biodiesel. Era alguns casos, microalgas como as cepas de Cúforaiio submetem-se mais rapidamente à divisão celular na presença de gUcerei do que nu presença de glicose. Nesses casos, processos de crescimento de dois estágios, no qual a« células silo alimentadas primeiro cora glicarol para aumentar rapidamente a densidade cdmar c, em seguida, coot glicose para acumular lipídeos. podem melhorar a eficiência oura que os lipídios .são produzidos. O too do glicerol subproduto do processo de transesterifleaçâo oferece vantagens econômicas significativas quando colocado ds volta no processo de produção. Outros métodos de alimentação também são oferecidos, como misturas de gbcerol e glicose. A alimentação com tais mistura também tem os mesnms benefícios econômicos, Além disso, a invenção fornece métodos de alimentação ulíerrniiíva pam microalgas com açúcares como s sacaxo.se em várias combinações com gliccrol Estes benefícios proporcionados pola invenção foram demonstrados aqui em micróbios <le linhagens evolncionárias extremamente divergentes, mcluindo tanto procariotas quanto eus axioms, demonstrando a utilidade da invenção para a fermentação microbiana.

As métodos padrão para o crescimento e propagação de Olom’&t profot/tecrudetr são conhecidos (ver, por exemplo, Miao and WyJ. Bmrecénn/ogj. 2004. 11:85-93 and Mino and Wu.Sfo.Sínor.e Tee/irtoingy 1200ό) 97 841-846). A invenção também fornece novas condtçóes de crescimento para CãZ<w/&. Por exemplo, várias espécies de Cntóre/fu e múltiplas cepas dentro de uma espécie podem ser cultivadas na presença de glieerol, incluindo glicerol subproduto da transesíenficaçáo do biodiesel.

Para a produção de hidrccarbonetos, células, incluindo células rectmtbíri antes da invenção arpei descrita, são preferem-iaímente cultivadas o« fermentados cm grandes quantidades, O cultivo pode serem grandes volumes de líquidos, tais como ca items cm suspensão, por exemplo. Outros exemplos incluem começar com uma pequena cultura de células que se expande em uma grande biotrtassa, eombmada com r.> crescimento e propagação de células, bem como a produção de htdrucarfeonetos. Os biorreatures ou fermentadotes de aço pode ser usados para acomodar grandes volumes de cultura. Um fermentado*· semelhante aos utilizados na produção de cerveja e/ou vinho é adequado, assim como os feymeutarkacs axtremamenm grandes utilizados na produção de etanol.

Αχ fontes de nutrientes adequarias para a cultura num fertnemador sào fornecidas. Elas incluem matérias-primas corno ume ou mais das seguintes: uma fome de carbono fixa como glicose, amido slc milho, material celulóstco despobmenzado. sacaroxe, xana-deaçúcar, açúcar de beteaaba, lactose, soro -de ieile, ou melaço; uma fonte de gordura, corno gorduras ou óleos vegetais; urna fonte de nitrogênio como proteína, fareln de soja, macerado de milho, amhuia (puxo ou «η forma de sab, nitrato ou sal de nitrate, ou mtrcfgêsio molecular; e uma fomc de fósforo como os sais de fosfato. Além disso, um fermentado? permite o controle das condições de cultive, como temperatura. pH< traisiio de oxigênio e m'veis de dióxido de carbono. Qpciomrimeute, componentes gasosos, como 5 óxígênio ou nitrogênio, podem ser borbuihados na cultura líquida, Outras fontes de amido {glicose} nicluem o trigo, batata. arroz e sorgo. Outras fontes de carbono incluem correntes de processo, como o glicerol de grau técnico, licor negro, ácidos orgânicos, tais como acetato, e melaço. Ifontes dc carbono também podem ser fornecidas come misturas, tal como tuna mistura dc saearose e pclptt de açtkar de beterraba dcspolimcrizado.

W Utrt fermentado? pode ser usado para permitir que as células se submetam às várias fases do seu ciclo de creseunento. Como exemplo, um inóculo de células produtoras de hidrraraxhoaetos pode ser imrodurido em um meio seguido por um período de latêncto (fase de latènctaj, antes de as células começarem o crescimento. Após o período de hitêticiu, a taxa de crescimento aumenta consiantememe e entra na íase log ou exponenciai.

A fase exponential por sua vez é seguida por uma desaceleração do crescimento devido á diminuição de nutrientes e/ou aurnemo de substâncias tóxicas. Após esta desaceleração, o crescimento pára, e as células entram em uma fase estacionária ou estado estacionário, dependendo do ambiente específico fornecido para as células.

A produção de hidrocarbímeuis por células aqui divulgada pode ocorrer durante a 20 fase log ou posteriormeníe, incluindo « fase estacionária, onde os nutrientes ano fornecidos, ou ainda disponíveis, para permitir a continuação da produção de bidrocafoonetos na ausência de divisão celular,

Preferenclalmente, os microrgaaismos crescidos tuts condições aqui descritas e conhecidas compreendem pelo menos cerca de 20% em peso de lipulíos, de preferência 26 peto menos cerca de 40% em peso, mais preícrenchmiente pelo rtrextos cerca de 50% em peso, e mais preferivelmente pelo menos cerca de tK) % em peso.

Unut descoberta surpreendente é que várias espécies, e as múltiplas cepas dentro de unia espécie de Ch/ore//« têm melhor desempenho nu presença de glicerol subproduto da transesterifkíição <k< que em uma quantidade equivalente de glicerol de grau reagents. O 30 glicerol subproduto da trarisesterifíéação geralmeote cvmtém metanol residual e outros conraminaates, além de glicerol. Por exemplo, as figuras la 6 mostram que capas de Chforrífo prruo/becmdes e de Cíaforetot ke-refou apresentam melhor produtividade cm glicerol acidulado e aãtwctdulado subproduto de reações de transesteriíicaçtki lipimeit do que quando cultivadas era glicerol de grau reugetite puro. Outros tnicróbtos, wmo m 35 ratcroalgaa .sromOromro· e A\r,í'ettfo também pretera ter um raclbot desurapenlio tia presença de glicerol subproduto da transesíerlflcaçao do que ran urua quantidade equivalente de glicerol de grau reugente.

Peso Celulat Seen pot litro: A figura 1 demonsua que o peso cchdar seco fol maior no biudiesel subproduto de glieerol do que em glieerol puro, e esta tendência ere verdade quaado as células foram cultivadas em gliceroí por si só ou em combinação com a glicose.

A figura 2 mostra as mesmas tendências com tensões adicionais de OtArac/ró. A figura 12(61 demotisua que- o peso celular seco por litro de óraurerfesem ííwmras é maior em biodieáct subproduto de glfecrol acldulado e não aciduhtdo do que cm glicctol de grau reagcmc puro. Figura 13 demonstra que o peso celular seco por litro de Nuvréuiu i.u'.i'feup>ru ê maior «obre biodiesel subproduto de glleeroía nào ncidulad» subproduto do 10 biodiesel que em glieerol de grau reagents paro.

Conteúdo Lipídieo por litro: .As figuras 3 e 4 demonstram que. com várias espécies de C&róralró e málüplss cepas dentro de uma espécie de Cáróro/ré, os níveis de lipídeus por litro silo mais elevados quando as células. são cultivadas na prasettça de giíeetol subproduto do bitxíiesel do que quando cultivadas na presença das concentrações 15 equivalemos de glbcroí de grau reageníe puro.

Ltpídios como uma Porcentagem de Fuso Celular; Figuras 5 e 6 demonstram que várias espécies de Cúróra&n e múltiplas cepas dentro de uma espécie de CMw&n acumulam uma maior percentagem de peso celular seco de lipidios. quando cultivadas na presença de glleerol subproduto do biodiesel do que quando cultivadas na presença de 20 concentrações equivalentes de gílceroí de grau reagente puro. A figura 11 demonstra que tanto .Sgóufrèrt p/ure.vo.s· quanto .Vnrrèzdo peif/ett/om podem .acurnular urr.a maior percentagem de peso celular seco de bpídios. quando cultivadas na presença de glieerol subproduto do biodiesel do que quando cultivadas na presença de concentrações equivalentes de glicerol de grau raagcnte puro. A figuro 12(a) demonstra que 5cmeí/e.»x«x 25 <íwíí« pode acumular uma maior percentagem de peso celular seco de liptdíos. quando cultivada na presença dc glicerol subproduto do biodiesel do que quando cultivada na presença de concentrações equivalentes de glicerol de grau re&gente puro.

Onto) resultado surpreendente è que várias espécies de micróbios, incluindo as mieroalgas <romu Gdora&t u múltiplas cepas dentro de uma espécie, de GWoro/ώ, e outras 30 mteroalgas, tais como écenedé.onuy. Mn-fcuíce Spmdmn apresentam melhores característica» como produtores de biodiesel na presença de misturas de glicerol s glieuat. do que na presença apenas de glicose.

Conteúdo Lípidíco por litro: A figura ? demonstra que GVorsr/ía pode acumular alios níveis de lipídios por litro de cultura na presença de 1 de g1is'.eroi/l% de glicose <lu 35 que na presença de 2% de glicose.

Peso Celular Seco por litro; A figura 12fb.) demonstro que o peso seco de células por litro de «rwtorw é maior quando cultivado n& presença de IG· de biodiesel subproduto do glieetolZ 1% de glicose do que na presença de 2% de glicose. A figura 13 demonstra que o peso seco de células por litro de Auvà.mG pe;7&sdrsm è maior qtraudo cultivado na presença de 1% de biodiesel subproduto do gliuerol/l% de glicose do 5 que na presença de 2% de glicose.

Lipídios como uma Porcentagem de Peso Celular: Λ figura 8 demonstra que 0?fc'íí'/éu pode acumular uma maior percentagem de peso seco de lipídios quando cultivada ua presença de uma mistura de concentração igual {por cento em peso) de glicerol e glicose, dc que quando cultivada na presença apenas de glicose, A figura 11(a) 10 demonstra que .Spirulitra platensis pode acumular urna maior percentagem de peso celular seco de lipídios, quando cultivada na presença dc uma mistura de concentração igual (per cento em peso) de biodiesel subproduto do glicerol e glicose do que quando cultivada na presença &pcw dc glicose- A figura 11(b) demonstra que Navietila pellictdosa pode acumular uma maior percentagem de peso celular seco de llpídios, quando cultivada na 15 presença de uma mistura de concentração igual ípor cento em peso) de glicerol de grau reagertte e glicose, assim como biodiesel subproduto do glicerol. do que quando cultivadas tia presença apenas de glicose. A figura 12(b) demonstra que Scertedesmus armatus pode acumular uma maior percentagem de peso celular seco de Γ-pídras, quando cultivada tia presença de uma mistura tie eoneentruçao igual ípor cento etn peso} de biodiesel 20 subproduto do ghcerot e ghcoxe do que quando cultivada na presença apenas de glicose.

Unia descoberta adicional e inesperada é que a adição de glicerol e glicose para os nitcróblns. incluindo as mlcroalgas como CArâodfe, Srenedesnmue MtvfruZn scqüencialmente ao invés de em um único lote de mistura de glicerol e glicose pode gerar ganhos de rendimento adicionais. Este atributo de tnühíplm: espécies de CMmv/ra e 25 múltiplas cepas dentro de uma espécie de émfe.raúU foi testada na presença do biodiesel subproduto do glicerol e glicerol de grau reagents.

Ltpidios como uma Porcentagem de Peso Celular: A figura 8 demonstra que GWte pode- acumular uma maior percentagem de peso seco de lipldiris. quando glicerol é adicionado a uma cultura por ura primebo período de (empo, seguido dn adiçào de 30 glicose e a cultura ctmtíuua pot ura sugando período de tempo, do que quando as mesmas quantidades tie glicerol e glicose sliti adicionadas no início do experimento.

Conteúdo Idpídico por litro: .A figura 9 mostra Cbá-vre/út apresentando níveis mais elevados de lipídios por litro de cultura quando glicerol e glicose são adicionadas seqúencialmenie do que quando aa mesmas quantidades de glicerol e glicose são 35 adiciotiàdíts no itdeio do experimento. Esta tendência foi observada quando o biodiesel subproduto do gbcerol sciduladr», o biodiesel subproduto do glicertd não acidulado, rra o

4Ρ/Γ27 glicerol de grau reagents foi usado.

Pcos Celular Seco por litro: A figura 19 demonstra quatro diferentes linhagens de Cã/ore/fíí de duas espécies diferentes acumulando maior peso seco de células por litro de cultura quando glicerol e glicose sãs adicionadas seqüenuialmente do que quando as meso;as quantidades de glioerol e glicose são adicionadas ao início do experimento. Esta tendência foi observada quando biodiesel subproduto do glicerol ac-idulado, biodiesel subproduto do glicetol não ao id alado, ou glioerol de grais reagerau foi usado. As figuras 14(a) e (b) demonstram que ramo .Sr.enzdesmro' nrmzaa.v quanto AteUca/o pc/írèzdoro podem apresentar aumento de peso seca de células por litro, quando apenas biodiesel subproduto do griserol é adicionado a uma cultura por um pnmeiro período de tempo, seguido ciais tarde pela adição de glicose, em comparação ctrm adição de idênticaa quantidades de ghccrol e glicose no início da fermentação.

Três diferentes marcadores de produtividade (peso scco dc células por litro, gramas por litro de· lipídios e porcentagem de peso seco de íipídios) na produção de hpídios microblanos sim melhorados através da atihraçâir de biodiesel subproduto e da separação temporal dc fontes de carbono. A invenção, poosn’o, fornece novos métodos de produção de maior quantidade de lipídios por unidade dc tempo em várias espécies de micróbios em áreas altamente divergentes da árvore evolutiva, incluindo procariotas e eucariotas. Os métodos de fabricação de lipfdios e hidrocarbonetos aqui divulgados usando glicerol nSo estão limitados a tnicroalgas, mas podem ser usados com qualquer micróbio capaz de utilizar o giicurul como fonte de energia.

Em ura método alteraarivo de crescimento hcierotrófico era conformidade com a presente invenção, os mierorganismos podem ser cultivados usando biomassa celulósica despolím&rizada como matéria-prima.. A biomassa eeluldsica (por exemplo, silagens como residiras de milho) ê barata e facilmente disponível, no entanto, as tentativas de usar este material como matéria-prima para a levedura falharam. Em especial, tal matéria-prima foi encontrada para ser inibidom para o crescimento de levedura, e levedura n£o pode usar o catbono de 5 açúcares produzido a partir de materiais celulósicos (por exemplo, xilose de hemi cduluse). Em contrapartida. as microalgas podem erescer em material odulóskm processado. Assim, a mvençào fornece um método de cultivo dc microalgas na presença de turn material celulósico e/ou de carbono de 5 açúcares. Materiais celuiósicos em geral, incluem:

Componente Porcentagem em Peso seco

Celulose 40-60%

Hemicel u lose «20-40%

Idgnína 10-30%

Materiais celulósicos adequados incluem resíduos de culturas energéticas anuais e perenes, bem como as culturas agrícolas, ou seja, as partes das plantas, principalmente raízes e folhas, não retiradas dos tempos como alimento primário OU produto dc fibra.

Exemplos incluem os resíduos agrícolas, como bagaço de cana, casca de sroz, fibra de milho (incluindo caules, folhas, cascas. e espigas), palha de trigo, palha de arroz, polpa de açúcar de beterraba, polpa cítrica, casca de citrinos: resíduos fiotestais, como desbastes de madeim dura o macia <fe opemçto de madeira; resíduos de madeira. corno resíduos de serralherla (cavacos de madeira, serragem} e resíduos de fábrica de celulose, resíduos ttrbanox. tais como papel de frações de resíduos .sólidos urbanas, resíduas de madeira urbanos e resíduos verdes urbanos, tais como a grama municipal e resíduos de construção em mademt. Celulõsscos adicionais incluem culturas celulósieas dedicadas, mis como swítdigrass, madeira de choupo híbrida, e miscantos. fibra de. cana, e fibra de sorgo. Carbonos de 5 açucares que são produzidos a partir dc uns materiais incluem xilose.

.Surpteetidenicmemc, algumas espécies de CAZorerio foram mostradas aqui para apresentar os núw mais elevados de produtividade quando cultivadas em uma combmaçãtj de glicove. e xilose do que quando cultivadas apenas em glicose ou xilose. Esre efeito sinérgico oferece ama vantagem significativa na medida em que permite o cultivo de CWortrifa cm combinações de xilose e. glicose, tais como materiais ceiulósicos, e é mostrado na figura. 15.

Ainda em outro método dc crescimento heterotrófico alternativo, em confonnidade com a presente mvenção. que em si pode, opcionalnxente, ser utilizado em combinação com os métodos descritos acima, sacarose produzida por exemplo a partir de cana«deaçúcar ou beterraba, é utilizada como matéria-prima. Conforme descrito em maior detalhe 25 na seção intitulada Engenharia de Micróbio” abaixo, a produção de bpfdios pode ser facilitada ou tomar-se mais; eficiente a-savés da engenharia de micróbios como Gtróre/fu, para uolíz&r sae«m.«e como fonte de carbono. Por exemplo expressão, dc um transportador de sacarose e s&c&rose invertase permite a CMw&i transportar saearosc para a célula do meto de cubam e hidmlisar sacarose para produzir glicose e frmose. Opcionalmetite, mn 3Q fmtoqwnase pode ser expressa., bem como nos casos em que s atividade da hsxoqcinase endágena é .msttfieieafe para a iosíoriktçãa máxima de frutose. Exemplos de transportadores de .wttrnse adequados são GcnSank mbneroa de adesão CAD91334, CAB92307 a CAA53390, Exemplos de invertase adequados são Genbaak numeres de adesão CAB95010. NP„í)l3í()4 e CÀA06839. Exemplos de ímetchinases 35 adequadas são GenBank números de adesão P26984, B2Õ420 e CAA43322, Vetores de transformação de microalgas, incluindo Chlorellu. que codificam um ou mais desses genes

Λ® podem ser concebidos como aqui descrito.

A secreção de uma sacarose- invertase pode eliminar a necessidade da expressão de um transportador que pode transportar a sacarose dentro da célula. Isso ocorre porque uma invertase secretada catalisa a conversão de uma molécula de sacarose em uma molécula de glicose e ama molécula de frmosc. ambas as quais postem ser transportadas c utilizadas pelos micróbios aqui descritos. For exemplo, a expressão de uma sacarose invertase «como SEQ ÍD NO: 14) com um sinal de secreção (como o da SEQ lf.í NO: 15 ía partir dc leveduras), SEQ ID NO: 16 (a partir de plantas superiores λ SEQ ID NO : 17 (sinal de secreção do consenso eucarióüco), e SEQ ID NO: 18 (combinação de seqüência de sinais 10 de plantas superiores e de consenso eucanático) gera atividade- da invertase fera da célula.

Veja Havíkins et ab Current Microbiology vol. 38 (.1999,6 PP- 335-341 para exemplos de sinais de secreção ativos em O/ore&r. A expressão dessa proteína, como possibilitada pela metodologia de engenharia genérica descrita aqui, permite que as células jâ capazes de utilizar ít glicose extraceluíat como uma fonte <ic energia para utilizm a sacarose como uma 15 fonte de energia extracelular. Era células como ('.7c<nvú'>:< proíraáeíoíUes . Cú/orel/o ««MW e Cd/nreúãí erarar.v.vdí que, como demonstrado aqui podem usar tanto a frutose extraceíular e glicose, extracelular como uma fonte de energia, a secreção de uma invertase pode fornecer u única atividade c&iaiítica necessária para o uso da sacarose como Ionte de energia eficiente, barata.

Por exemplo, como mostrado a& Figura 26, a Odortd/a prvtotÃecoide.s pode ser projetada com um gene da sacarose invertase sob o coiilrole regulator»’.} de um dos três promotores (promotor 355 do virus do mosaico couve-flor fCMVp promotor do virus Chloreila (CV), ou promotor HUFl do Chiorelltt (HUP1 ?.!. Q gene da sacatose in vertase utilizado neste, esempto inclui unia alteração no gerre SUC2 do S. crrevirirar para otimizar o uso do oddon de C. prororferewdes. As seqüéneias tie eDNA c de amiuoácidos do gene otimizado correspondem a SEQ ID NO 8 e SEQ .113 NQ: 19, respeetivamente, Lima ilustração dos constractos da plasmídeo usados na transformação é mostrada na Figura 25. A expressão de uma sacarose invertase secretável, como a aqui desenta, permite a utilização de melaços. caldo de cana, e outras matérias-primas contendo sacarose para a 30 ferment sçílo das células.

Da mesma forma, as Figuras 27 e 28 mostram o* resultados da transformação de C7i/on?&u prutíuòs-cobfer, U/?forei7<? mrânrô.yim<? e C'.'hío?v/À< «e/ww, respectiva are ate, com o gene da sacarose invertase do 3. wewwe sob o controle do promotor CMV.

O potencial de crescimento dos microorganismos expressando uma saemose 35 invertase exógerté scctctével é Ilustrado pela adição de trata itivratase ao meio de etilrura da Otoxrodíi p.om.mWradm\ conforme descrito em detalhes nos Exemplos. As Figuras 23 e 24 ilustram o resultado surpreendente que as células de Oifrtre/iit crescem tão bem em melaço de resíduos do processamento da caaa-de-açúcar corno na glicose de grau reagente

49/127 ptust: o uso deste produto de batxo valor de resíduoa do processamento da cana-de-açúcar pode fornecer importantes reduções de castos na produção de hidrocarbonetos e de outros olees. O melaço contém ligniua c outros produtos de resíduos eelulósicos que envenenara muitos mkroreanfetrtos e. retardara seu crescí ntetuo. e-o entanto, foi descoberto que as 5 células Otore/la prosperam na presença de tais venenos. As Figuras 23-24 mostram o crescimento das células em três únicas fontes de melaço (designadas BSl. BS2 c HTM}_: quando comparado ao crescimento da glicose ou sacarose, na presença ou ausência da sacarose invertase extraceluíar.

Àltemativamente, uma invertase sacarose também pode ser expressa mwacelularmente- em células que expressam ura transportador de sacarose, bem como em células que expressam qualquer transportador de earbtridraro que permite que a sacarose entre na célula.

Um gene e.vtrange?ro foi transformado e expresso tra C7?<wrò'ct preíszfecron/e,. conforme descrito no Exemplo 12. A expressão de genes de utilização de sacarose pode ser 15 realizada utilizando a mesma metodologia ou similar e. desenho vetonaL

Biorreatcres podem ser empregados para o uso em métodos de crescimento heterotráfien. Como será apreciado, as provisées feitas partí tornar a luz disponível para as células cm métodos tie crescimento fotassmte-kos são desnecessárias quando se utiliza «roa fonte de carbono fixa nos métodos de crescimento heterotrôfiors aqui descritos

2C Os exemplos específicos das condições de processo e métodos dc crescimento helerotfofico aqui descritos podem ser combinados em qualquer forma adequada para melhorar a eficiência de crescimento mferobiano e produção de llpídios. Além disso, a invenção incluí a seleção e/ou engenharia genética de micróbios. íms como mit.ro.dgas, para produzi·' mscróbios que sào mais apropriados para o uso nos métodos acima descritos.

Por exemplo, os micróbios tendo uma maior capacidade de utilizar qualquer uma das matérias-primas acima descritas para a proliferação aumentada e/ou produção de hpidios /por exemplo, ácidos graxosl estão dentro do escopo da invenção.

C·

O crescimento mixomófico é o uso tanto da fome de luz. e de carbono fixa como fontes de energia pata que as células cresçam e produzatrt hidrocarbonetos. O crescimento núxourôflots pode ser realizado cm um fotobioreator. .As mtcroalgas podem ser cultivadas o mastida.s em fotobioreatorcs fechados feitos de diferentes tipos de material transparente <m semitransparenre. Tal material pode incluir cercamentos Plexiglass , cercamentos de vidro, sacos feitos de substâncias tais como poiietileno. tubos transparente ou seraitramsparente e outros materiais. As microaigas podem set cultivadas c mantidas em fotobioreactores abertos, tais como tanques raceway”. tanque de colonização. e outros recipientes não fechadas.

U. Meio de Qwim.enfe

Os microorganismos tikis. de acordo ecu? m> métodos da presente invenção são eneotttrados era vários loeats e «ramentes de lodo o utuado. Como tuna c’tmsequimcra de 8M isulamento de outras espécies e as suns divergências evuhsciouarias rests Harttes, o raeio de crescimento particular para o crescimento 6’imo e geração de lipideos e/ou componentes de h;drocarbonett> pode ser difscsl de prever, Em asguns cams. certas cepas de microorganismos podem ser incapazes de crescer em um meio de crescimento particular devido á presença de algum componente in-bitóritj. ou ausência de alguns requisites autriciomus essenciais exigidos pela cepa de microorganismos particular.

Os meios de crescimento sólido u líquido estão geralmeute disponíveis em srrs ampla variedade de fontes, e as instruções pura a preparação dos meios particulares que é adequada para uma grande variedade de cepa.* de microrganismos podem set encontradas, por exemplo online, em http:ZAvsvw.utex.org/, em site -mmlido pela Universidade do Texas em .Austin para sua coleção de cultura de algas Í.1.1TEX}. Por exemplo, vários meios de água doce e água salgada incluem aqueles apresentado* na Tabela 4, aba-xo.

Tabela 4. Meio de Algas Exemplar.

_____......____ ililMiieii.......................................

MfiGLMgkB^ _______________

..àláuxÀlkd...........................

Mrio..B.Qí..l.-..l iimiiiiiiiiiiiiiii ííl.......&k.té......ds.......Àgeit......Elartiifo

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ÊSZIÔ.....Msk'.....ik.....Agas.....Msaàthit „ÍiÕrt™___________.................

fc.&2......Mete......ik......ÀBá.......MiU.tltha

....................................................

	sibMÈfc
ΜίΐΟ,ΜΚ	lOllllil^^
àí§tâJx^JN..ModlficMn	F?2*NH-i
	Sto>WM
_	..AaK»....blat®k...AddiriA
	................................... Mrivde IMfri&S
	gdk±Ms;usE.Agia
	SSMgwDAusu .....
..... ABs.tfc.ss’k.'Afe-s&AS.
Ãsúâ.4.e..Sj>feLMsk.Ql<..tdlll4
........................... Arva.èe.S?:’lís..S&ri.A.I.u?Í?
........................ hkiu.Tra
M&d.yjdYí.x;acsaav.íN
...MãisAMxSá...................................................
>k.adeHw.nuA^pía

Em um exemplo específico, um meio adequado para, o £.ultlv$> da Ouore/m prí.koí/tmnWrr {GTEX 31) compreende o Meio de Proteose. Este meio e adequado pura culturas axênkas, e ura volume de IL do meio (pH -6.8/ pode ser preparado pela adição 5 de ig de pcptona proteose para i litro do Meio Bristol O meio Bristol compreende 2,94 mM de NaNO.u 0,17 mM de Ca.C.b%H_;:Q, 0,3 mM de MgSÜ^?H-Q, 0,43 mM, 1,29 mM de K.HX-Oo- 1.43 mM NuCl em uma solução aquosa. Para 1,3% do meio de ágar, IS g de «gar pode ser adicionada a l t da solução. A solução é coberta e autoclavada e então armazenada a uma temperatura refrigerada ardes <lo aso.

Outros meios adequados para uso com os métodos da invenção podem «er facilmente identifícndos através da consulta da UPL acima identificada, ou através da consulta a outras orgamzaçòes que manténs culturas de microorganismos, couto o SAG. CCAP, nu CCAlA. SAG refere-se à Culture Collection of Algae na Universidade de Gotürtgen tGõumgcn, Alemanha}, CCA.P refere-se a coleção de cultura de algas e pintozoários gerida pela Scottish Association for Marine Science lEscócia, Reino Unido.}, e CCALA refere-se à coleção de cultura do laboratório de algas no la.stituie of Botany ('frebml. República Teiteca).

E< Produção Crescente de Ltpfdem

As condições do processo podem ser «justadas para aumentar & produção de íipidius adequados pars um determinado aso e/ou para reduzir o custo de produção. Por exemplo, em cedas modalidades. um micróbio (por exemplo, cuia tmcroalga} é. cultivado π» presença de uma concentração limitante de um ou mais nutrientes. tais como, por 5 exemplo, carbono e/ou nitrogênio, fósforo ou enxofre, enquanto fornece um. excesso da energia de carbono fixo, cerno a glicose. A limitação por nitrogênio tende a aumentar a produção liptdíes. microbtana em relação ao rendimento lipídíco mterobiano ura uma cultura em que o nitrogênio e fornecido em excesso. Em modalidades particulares. o aumento na produção de lipídios é de pelo menos cerca de: H)%, 20%, 30%. 40%, 30%, 10 75%·, 100%, 200%, 300%, 400%, ou 3(8)3¾. Os micróbios podem ser cultivados ns.

presença de uma quantidade de um nutriente limitam» para uma porção do período de cultura total ou por todo <? perfodo. Em modalidades particulars, a utmesntmção de nutriente® é cicladtt entre uma concentração limitam», e. unia concentração nlio-íimitamc dc pelo menos duas vezes durante o período de cultura total.

Para aumentar a produção de lipídios, o ácido acêtico pode ser empregado «a matéria -prima para um micróbio produtor de llpidio® (per exemplo, uma mieroalga.i. G ácido acético alimenta diret&mente o ponto de metabolismo que imuia a síntese de ácidos graxos (ou seja, acetil-CoA). fornecendo assim o ácido acético na cuitura que pode aumentara produção de ácidos graxos. Geralmeme, o micróbio è cultivado na presença de 20 ama quantidade suficiente de ácido acético pára aumentar a produção lipídica nltcrobiana e/ou produção de ácidos grasos mictobíana, especificameníe, em relação a produção lipídica microbiatta tpor exemplo, ácida graxo) na ausência de ácido acático.

Em outra, modalidade, a produção de lipídios é aumentada pela cultura de mn micróbio produtor de lipídios tpor exemplo, microalgasi, na presença de um ou nmi's co25 tatísr(s) de urna enzima de oansinho lipídko (por exemplo, uma enzima simêtleo de ácido graxol. Geralmente, a concentração do coiatorí.S} ê suficienre pars aumentar a produção lipídica míerobiana (por exemplo, ácidos grasos) em relação a produção bpídlca microbiana na ausência de codslor(s). Em uma modalidade particular, os co-foíores são fornecidos para a cultura, incluindo na cultura um micróbio (por exemplo, mtcroalgas) 30 contendo uns gene exógetio que codifica os co-fatorcs. Altenmüvamente, os co-fotores poderão ser fornecido® a uma cultura, incluindo em micróbio (por exemplo, mlcmalgast, contendo um gene exógeno que codifica uma proteína que participa na síntese do eofator. Em certas modalidades, cofatorcs adequados Incluem qualquer vitamina exigida por uma ctuima de uanánhu- lipídieo. soai», por exemplo, bmtma. puntotenato. Os coletores de 35 codificação de genes adequados para aso na Invenção ou os que participam na síntese de tais eofatores como bem conhecidos e podem ser introduzidtis em micróbios (por exemplo, raicroalgask usando construct»® t técnicas tais como as descritas acima,

V. ENGENHA RIA IX) CAMINHO LIPÍDICO

Em algumas modalidades da presente invenção, os microorganismos da presente wvenção são modificados para alterar as propriedades c/ou proporções de lipídios produzidos e/ou para aumentar <3 fluxo dc carbono em lipfdius. O caminho fxide ainda, ou, altenwtivameme. ser modificado para alterar as propriedades e/ou proporções de várias molécirlas dc hidrocarbocetos produzidas através do processamento enzimátien de lípídios.

IHdrocarbonetos Produzidos

No caso das microalg&s, algumas células do όρο selvagem, já tem boas características de crescimento, mas não produzem os tipos ou quantidades de lípídios desejadas. Os exemplos meluem fyroòotm, Phomúhum, Agnremrífuos. Carferrô.

Gpo<. nx ro Ρν*·ι/>;ίΓο, .VíOehíH, f.epm rn< /,'?<. AauNe rm F'qt’éMo. Spüoavro, OdrwxwY w, rororar/ro. GsciBuíwwr, /’drrgwse Odroogrmráw. que léra a característica de crescimento desejável do crescimento em esgotos mtramlpais ou água?) residual?:. Essas células, assim coroo espécies de Enfere&z e outros micróbios,, podem ser projetadas para 15 ter melhores características dc produção de íipídlus. Às características desejadas incluem a otimização da produção lipídica por unidade de volume e/ou por unidade de tempo, comprimento da cadeia de carbono (por exemplo, para a produção de biodiesel ou p;ua aplicações industriais que requerem matéria-prima dc tòdrocarbouctos). redução do número de ligações duplas ou triplas, opetonálmenle, a zero, remoção ou eliminação dos 20 anéis e estruturas cíclicas. e aumento do hidrogênio: razão dc carbono dc uma determinada espécie dc iipídio ou de urna populaçã» de hpídeos distíntr.ss Além disso, as mie melgas que produzem hidrocarboneto.s adequados também podem ?ax' projetadas para ter saídas de hídrocarbonetos ainda mais desejáveis. Exemplos de tais tnicroalgas incluem espécies do gén oro Dí /ora íin.

1» Regulação de enzimas que Controlam Ponlus de Ramificações na

Síntese de Ácidos Graxas

Em modalidades particulares, urna ou mais enzinuts-chave que controlam os es pontos de ramificação nu metabolismo para a síntese de ácido» graxos podes» ser super· reguladas ou sub-reguhtdas para melhorar a produção de lípídios. A super-regulação pode 30 ser alcançada, pw exemplo, pela transformação das células corn constwctos de expressão nos quais ura gene que codifica a enzima de interesse é espresso, por exemplo, usando um promotor forte sAra elementos intensificadotcs que aumentam a transcrição, Esses cemstruetos poderá hrelrer um raarcador selecronável de modo que tx; tramúbrnrantsa possam ser submetidos á seleção, o que pode resultar na ampliação do constructs e urn 35 aumento no nível de expressão da emuma codificada. Exemplos de. enzimas adequadas para a super-regnlaçâo de acordo com os métodos da invenção incluem desidrag.exase, que. desempenha um papel na cotuersào do piruvato ent ncetii-CoA (exemplos, algumas das microaigas. incluem números de ticew.» ;i<> GenBatik NP..4l5?-ri2; A.-\.-\53t.?4‘^?; QIXDMí c

CAF055S7) . A «sobre-regutaçáo do piruvato desidrogenase pode aumentar a produção de acedl-Go.A. e assim aumentar a slute-re de ácidos graxas. A AeeübüoA carboxtlase catalisa a etapa imta;.d na síntese de ácidos grazes. Assim, esta enzima pude ser super regulada para aumentar a produção de ácidos graxos (exemplos, algumas das microalgas, incluem números de acesso ao GeoBanà BAA94752; AAA73528: AAA81471; YP„537052; ¥P„,536879; NPJM5833 e BA.A57908), A produção de ácidos graxas também pode, ser aumentada peht super-reguíaçâo da proteína transportadora de adie, ÍACP), que carrega as cadeias de acua crescentes durante a síntese de ácidos graxos (exemplos, algumas das microalgas. incluem números de acesso ao GertBarÀ A0T0F8; P3l2ã0; NP...849041;

W YP.,,874433). G glicetol-3-fosfato actltransferase catalisa a etapa htmtaute da taxa da síntese de ácidos graxox. A super-regulação desta enzima pode aumentas a produção de áridos gra.xos (excntplos, algumas -das uncroalgas. incluem í-úmero» dc acesso ao GrnBartk AAÀ74319; AAA33122; AAA37647; P44857; e A.BO94442). As proteínas anteriores são candidatas para a expressão em microalga. incluindo as espécies do gênero Io Ortoreílc.

A sub-regulação de uma enzima de interesse pode alcançar usando, por exemplo, anít-senso, RNáZDNA catalítica. ínterterêneia de RN.A ÍRNAJ, knods-oat'^-, knock·· down' ., ou outras técnicas de mutagênese. A expressão/função da enzima também pode ser Irtíbida com intraeorpos. Exemplos de enzimas adequadas para a sub-regulaçào dc acordo 20 com os métodos da invenção incluem a citrato sintaxe. que consome acetil-CoÀ como pane do ciclo do ácido tricarboxíiico (TCA). A sub-regulaçào da citrato siatase pode forçar mais acetlECoA para o caminho sintético de ácidos graxos.

2. Modulação dos Reguladores Globuts de Genes Sintéticos de Ácidos Graxas

Os reguladores globais modulam a expressão dos genes dos caminhos biossiutèticos de ácidos graxos. Assim. um ou mais reguladores globais da síntese de ácidos graxos podem ser para super ou sub-regulados, conforms o raso, para inibir ou aumentar, respectivameníc. a expressão de uma pluralidade de genes sintéticos de ácidos graxos e. fiualmunte, para aumentar a produção de Itpídir.ss. Exemplos incluem proteínas de ligação a elemento regulador de estcrol (SREBPs}, tais como SREBP-la e SREBP-IC (para exemplos, ver números de acesso ao Genbank NP.„0356W u Q9WTN3). í.)s reguladores globais podem ser para super ou sub-regaiados, por exemplo, como descrito acima no -que diz respeito ã regulação das enzimas do ponto de controle.

3. Regulação das Enzimas de Modificação de Hidrocarbonetos

O» métodos da invenção também mrhtern a transformação de células com um o« mais genes que codificam enzimas de modificação de hsdrmtarhonetos, utis como, por exemplo, uma tionsterase neil-ACP graxa (ver exemplos na Tabela 5 com os números de avessos, um acil-CoA írraxa/aldeído rndutase (ver exemolos na Tabela 6 com os números de acesso), um» redutasé stclfiCoA graxa (ver exemplos rat Tabela 7 com os números de acesso). «n aldeído decarhtmíl&sc graxo (ver exemplos na Tabela K coo? os ntítnero^. de acesso), um aldeído redutase graxo, ou um gene de esquaíeno simase (ver número de acesso ao GenBank AF205791). Em algumas modalidades, os genes; que codificara uma 5 tioesterase acn-ACP graxa e uma proteína transportadora de adkt co-expressa naturalmente pode ser transformada em uma célula, opcioíudmente coot um ou mass genes que codificam as outras enzimas de modificação de hidrocarbonetos, Em outras modalidades, o ACP e a tíoesterase acil-ACP graxa podem ter uma afinidade para utna outra que dá uma vantagem quando as duas são «>adax em conjunto com os micróbios e us 10 métodos da presents invenção, independentemente de «e s»o ou não, naturalmente, co expressas esr< ura tecido específico ou organismo. Assim, a presente mvençâo contempla tanto os gates naturalrnefilc co«cxptessos destas enzimas, bem como aqueles que compartilham uma afinidade pata interagir um com o outro para facilitar a cbv&gem de uma cadeia de carbono de comprimento específico do ACP.

IS Ainda em outras modalidades, uma gene esdgano codificando uma desaturase pode, ser transformado era célula cm conjunto com um ou reais genes que codificam outras enzimas de modificação de hidrocarbonetos, a fím de proporcionar modificações no que dia respeito à saturação de hidrocarbonetos. A estearoií-ACP desaturase (ver, por exemplo, números de acesso ao GenBank AAFlãsüH; A.B.M43911 e AAY860H6), por exemplo, 20 catalisa a conversão do estearoibACP em oleoil-ACP. A super-ragulação desse gene pode aumentar a proporção de ácidas graxos monoinsaturados produzidos por ama célula, enquanto a sab-regaíaçâo pode reduzir a proporção de tnonosaiurados. Do mesmo modo, a expressão de ama ou mats desaturases gliuerolipídicax podem ser cxmuoladus pura alterar a razão de ácidos graxos inaakrrados para saturados, como tt>-6 desaturase de ácido graxo, e>25 3 desaturase de ácido graxa, ou ra-b-olcatu desaturase. Em algumas modalidades» a desaturase pode «er selecionada de acordo com um comprimento da cadela de carbono desejado, de tal forma que a desaturase sqia capaz de fazer modificações específicas no local dentro de um determinado substrato de comprimento de carbono, ou substratos tendo um comprimento de carbono dentro de uma faixa especificada.

Em modalidades particulares, os micróbios da presente invenção silo geneticamente modificados para expressar um ttu mais gensa exõgenos selecionados tie uma tiuester&se acibAC? graxa, uma actl-CoA graxa/aldeído mdutase, uma redutase aciKoÀ graxa, um aldeído reduta.se graxo, um aldeído decafbomlase graxo, ou, uma proteína transportadora de aciia co-expressa trasuralmeale. Qs métodos de expressão adequados são descritos 35 acima com relação à expressão de um gene da Hpase, inmuindo. entre ornro». métodos, a expressão induzívcl c s expressão compaitimentada.

Sem ter s. intenção de ser ligado por qualquer teoria particular ou mecanismo cehiisr, ama tioester&se acil-ACP graxa diva um ácido graxo a partir de uma proteína transportadora de acda (ACP). durante a síntese de lipídios. Através: da transformação enzimática adicional. o ácido graxo clivado ¢: então combitiadrí com unia íoenztma para produzir uma tnoiéctila de acibCoA. Este acil-CoA é o substrato para a atividade enzimática de uma redumse acií-CoA graxa para produzir um aideido, bem como para uma 5 aeií-CoA graxa/aldeído redutase para produzir um álcool. O aideido produzàdo pela ação da redutase acil-CoA graxa acima identificado. é o substrato para a atividade enziraática adicional tanto por qualquer um aideido redutase graxo para produzir um úlctiol quanto por ara nldeido decarboailass graxa pura produzir um aluuno ou alqueno.

As enzimas descritas direiaiueiite acima lém tuna especificidade para amar sobre um substrato que inclui ran determinado náracro de átomos de carbono. Por exemplo, uma tioesterase acibACP graxa pode ter uma especificidade para a divagem um ácido graxo com 12 átomos de -carbono <io ACP Em algumas modalidades, o ACP e a tioesterase de cumprimento especifico podem ter uma afinidade para uma outra que as torne paniwlarmeme útil como uma combinação (por exemplo. ACP exógeno e os genes de tioesterase podem ser nuturaimente tu-expresses em um tecido tspedfieo ou organismo em que eles são derivados). Por isso, em várias modalidades, o micróbio pode conter um gene que coditka a proteína exógena com uma especificidade para catalisar uma atividade enzintàtica (por exemplo, a clivagem de um ácido graxa de ure ACP. a redução de uma acilOoA pura ran aideido ou uni álcool, ou conversão de um aideido para um alcano) no 20 que diz. respeito ao núnicro de átomos dc carbono comido no substrato. A especificidade enzimática pede, em várias modalidades, ser para um substrato rendo de 8 a 34 átomos de carbono, preferivelmente de 8 a lb átomos de carbono, e man; preferivelmente tie IO a 14 átomos <A carbono. A especificidade mais preferida é pura ran substrato tendo 12 átomos de carbo»». Ero outras modalidades a especificidade pode ser de 20 a 30 átomos de ES carbono.

Tmesterases de acil-ACP graxas adequadas para uso com es micróbios e c>s métodos da invenção incluem, sem liínitaçâo. aqueles listados rts Tabela 5, ______Tabela 5. Tioesterase aeil-ACF graxas and GctiBaak ümóGm/raCu rau'iA/rnrra:, tioesterase acií - ACP graxa {GenBank ^ÃAC4<KXi l) toswew camp/mro tioesterase anil -ACP graxa. (GenBank £Q39473) lÁmra/üdteon tioesterase acii-ACP graxa (GenBank -8Q41Ó35)

Mvwrieít /'rwgríras rloesrera.se aell-ACP graxa (GenBank #AAB71?29) Λ/jrlrtàra·/re^ass tioesterase arai -ACP graxa (GettBank 4.A.AB71730) EiWtT gtdneenm tioesterase aed-ACP graxz (GenBank #ABD83939} Efeera g.raaei'aiis' tioesterase aeil-ACP graxa (GenHank #AAD4232l» ZGpnms'JowrentíAtn tioesterase acii-ACP graxa (GenB&tik #ABC47311 j Amludopsís ivWrèura tioesterase acil-ACP graxa (GenBxnk 4,NP...172327) Ar«bn/oy.tÀt rWtram tioesterase aed-ACF graxa iGenBank #CAA&5387.1 ArtíÀ>íd<s</.ot.$ r/kitàura- iioestera.se ãcil-ACP graxa (GenBaak *‘CAA85388) Go.ssypòim õirsníutn tioesterase acil-ACF graxa (GenBaux dQFSQlá) ΓίψΑτζί /unceufatu tioesterase acil-ACP graxa (GenBank &CAA54060;

C'up&m tiue»tcrase acii-ACP graxa (GenBank í?AAC?2882} íbp/reu em’uphv/io «ίΖ>ψ. me«x?remon tioeslerase acibACP graxa (GenBauk #ABB7158U

Cupêca àrmxrekíto tksesrerase «cil-ACPgraxa (GertBank «CACO 9933) £<'>reò' paiuí ew.Si.s 1 loss-crase acil-ACP graxa (GcnBank PAA1.15645) Capãwí Azragradcaa titsesrerase aci ; ACF graxa (GenBank #Q39513) Gí?5p,7'?s«m frèváírarzi tíoesterase acil-AGP graxa (<3enBaiik #AAD()1982) V'ó'<\y vim/erc tkicsterase acil-ACP graxa (Genfíank #CAN8'1819)

Grirem?# *?m\g<»írara tioesterase acil-ACP graxa (GenBank #AAB5l5251 íDarxrèíí/uuceíí tioesterase. acil-ACP graxa(GenBank #ABÍ 18986) Áf.re4ferei_f· fongifu/ía tioesterase acil-ACP graxa (GenBunk 4AA.X.5163?) Brm-srèa aqpns tioesterase acil-ACP graxa (GenBank #ABHI 1? 10)

Dryre surívo (indka euítivar-group) tioesterase acil-ACP graxa (GenBank #EAY86877) í)r>7.« wmt (japonica culuvar-group) tioesterase acil-ACP graxa (GenBank ||||i í|l||É||||ÍÍ||^|||^|^||||j||||^^||||^|

Orvza tofò*· (indica cultmr-group) tioexterase acil-ACP graxa (GenBank PEAY996Í7) f íiralíto totrófia tiise^erase aeil-ACP graxa t.GenBank 5.AAC49269)

A acil-CoA graxívíddefdo redutases adequada» para o uso com os micróbios s ntétodos da it-vençâo incluem, sem 11t-utaçao, açudes listados na Tabela 6.

Table 6. acikCoA graxs/nldeido redufcasas listadas pelos números de acesso no ' ΑΑ€452Ϊ7Ϊ‘γΟ^ό^ΓBABBóTó, ¥PJX)1086217. YP...580344. YP...001280274.™ YP...26458X YP. 436109, YP..959769, 215.61736962. ZP..61960335. ZP .61892096. ZÍ\.01K.K)974. 215.01915077, YP..924166. YPJ30411. ZP...01222731, Y15..5608Í5, YP...983312, Yí5.001019688. YF...524762, ¥P..836798, ZP...QI 115506, ¥.15.601141848. ΝΪ5.336Ο4?, NP..216059, YP...882409, YP...706156, ΥΡ...ΟΟ1136Ι5Ο_: YP...952365, ZFJH221833. ΥΡ,.13Ο()76. NP 567936. AAR88762, ABK.28586. NP... 197634. CAD30694, NP...001063962, BAD46254. NP...001630809, EAZ10132. EAZ43639, EAZ07989, NP..061062488. CAB88537, NT..001032541, CAPI66597. CAEO2214,

Redutases adl-CnA graxas adequadas para o uso com os micróbio* e métodos da invenção incluem, sem iúmiaç&x aqueles listados na Tabela 7.

Tabela 7. Redtnases acd-CoA graxas listadas pelos números de acesso ao

GenBank. ,

.....NFõinÕ4968Y......CAN83375’......NPJ912K......ΕΑΖ42Μ2Π

EAZfiM5.3. CAD30696. BAD31814, NP.J91X146. AAD38039. CAD30692. OAN8I286. NP 197642, NP 190641, AAL1.3288. e<NP 190042

--------------------„_wwwwww:;:...._ww.....„.........................................................................................>

Aldeído dec&rboniíases graxos adequados para o uso com os micróbios e métodos da invenção incluem, asm limitação, aqueles liatsdra; n& Tabela 8.

'Tabela 8, Aldeado decafbomlases graxos listados peles números de acesso ao GenBank,

58/12?

NF ..850932, ABN07985, CAN60676, AÀC23640. CAA65I99, AÀC24373, CAEO3399. ABD28319. NP... 181306. EAZ3I322, CAN6349E EAV94825, EAY8673I, CAL.55686.

XP„00 142026.3, EAZ23849, NP„ 218)588, NP„OO 106.3227, CAN83072, ÁAR9D847. e liilllliliiililliffM

As combinações de tioesterases acibACP graxas cmexpresss naturalmente e proteínas transportadoras de aetía são adequadas par» uso coro os micróbios e os métodos da invenção,

Outros ewnpfes de enzimas de modificação de hidrtxwbonetos incluem sequências de aminoãcidos contidas em, referenciadas em, ou codificada» por sequências de ácidos fiudétcos contida» eu referenciadas em qualquer utna das seguinte» patentes US,: 6.610.527, 6.451.576, 6.429.014. 6.342.380, 6.265.639, 6.194.185, 6.114.160, 6.083.731. 6043.072, 5.994.114, 5.891.697, 5.871.988, 6.265.639, e descrito em detalhes nos 10 núíPeros de acesáõ ao GenBsnk: AA018435; ZP„005l389i; Q.387IO; AAK6061.3;

AAK60610; A.AK.606N; NPJB747; CAB75874; AAK66612: AAF20201; BAAH024: AF205791 e CAA03710.

Outras enzimas adequadas para o uso com os micróbios e os métodos da invenção incluem aqueics que. tem pelo menos: ?0^f5 <je identidade de aminoãeido com uma «ias 15 protefnas listadas nas Tabelas 5··8. e que exibem a atividade etizimática desejada corrcstxttKlentc (píx exemplo, divagem de um ácido graxo a partir de uma proteína transportadora de ítciia, redução de um acil-CoA para um aideítio ou un< álcool, ou n conversão de um aídeído em tim alcaao). Em modalidades adicionais, » atividade cnzõnática esiá presente em uma sequência que tem. pelo menos, cerca de 75%, pelo 20 menos cerca de 80%. pelo menos cerca de 85%. pelo menos, cerca de 96%. pelo menos, cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99'% de identidade com uma das sequências acima descritas, todas as quais são incorporadas por referencia como se fossem pienamente estabelecidas.

As emmnas de. modificação de hidrucarbónetóx descritas acima são úteis na 25 ptoduçüo de vários hidrocarbonetos de uro micróbio (por exemplo, tuns rnlcroslgss, uma levedura oleaginosa, ou em fengoi ou população de micróbios, através da qual arou tioestertue acil -ACP graxa diva um adds graxo a partir de uma proteína transportadora de seda (ACT), durame a síntese de lipídiot;. Através da transformação enzimãoea adicionai, o ácido graxo clivado é então combinado com uma coenzima para produzir uma molécula 30 de acil-CoA. Este acibCuA ê o substrato para a atividade etuimática de uma redntase acil* CoA graxa para produzir um aldeído. hem como para uma aeil-Uo.A gntxa/aldeído redutase para produzir um álcool. Q aldeído produzido pela ação da redutase adl-CoA graxa acima identificado, é o substrato para a atividade emotmuleii adieiomt! tanto por qualquer tsm

59/127 aldeído redutase graxo para, produzír ura álcool quanto por um aldeído dccarbomlase graxo para produzir nus akano ou alqueno,

As enzimas <k modificação de hidrocarboneto têm uma especificidade para atuar sobre um substrato que inclui um determinado número de átomos de carbono. For exemplo, uma tioestranse acil-ACP graxa pode ter tuna especificidade para a divagem ura ácido graxo cora 12 átomos de carbono do ACP. Por isso, em várias modalidades, o micróbio pode conter um gene que codifica a proteína exógena com uma especificidade para catalisar atrai atividade en&imátlea (pot exemplo, a divagem de um ácido graxo de um ACP> a redução de uma aeibQ.-A para um aldeído ou ura álcool, ou conversão de ura aldeído para um alcuno) tio que diz respeito ao número de átomos de carbono comido no substrato. A expedite Idade emtirnútiua pode, em várias modalidades, ser para um substrato tendo de 8 a 34 átomos de carbono, preferivelmente de 3 a 18 átomos de carbono, e mais preferivelmente de 10 a 14 átomos: de carbono. A especificidade mais preferida é pare um substrates tendo 12 átomos da carbono, Em oraras modalidades a especificidade prale ser ds? 20 a 30 átomos de carbono.

Em algemas modalidades, os ácidos graxo* oti os álcool» primárioc correspondentes, aldeídos, alcanos ou alquenos, gerados pelos métodos descritos aqui, contém, pelo menos, cerca de 8, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 14, pelo menos cerca de 16, pelo menos cerca de 13, pelo menus cerca dc 20, pelo menos cerca de 22, pelo menos cerca de 24, pelo menos cerca de 26, peto menos, cerca de 26, pelo menos cerca de 30, pelo menos ecrca de 32, ou pelo menos cerca de 34 átomos de carbono ou ciais. Os ácidos graxos preferidos para a produção de biodiesel, dtesei renovável, ou combustível jato, ou os álcoois prítnários correspondente», aldeído». alcsnos c alquenos. para aplicações industriais cotuáin, pelo menos, cerca de 8 átomos de carbono ou trtais, Em certas modalidades, cs ácidos graxos acima, bran cotrto outras moléculas de hidrocarbotiraos correspondentes, rattàti saturados (sem ligações duplas carôouo-carbotio ou triplas), monoAnsaturados (única ligação duplapoli rasaturados (duas ou mais ligações duplas): são lineares (nào cícbcos), e/ou têm pouca ou nenhuma ramificação em suas estruturas.

Pela seleção da combinação desejada dos genes extSgenos a serem expressos, podese adequas^- o produto gerado pelo micróbio. que pode então ser extraído a partir da biomassa aquosa. Por exemplo, o micróbio pode cooler: ti) utn gene exôgeno codificando uma tioesterase acil-ACF graxa; e< opcioualmctne, (il) max proteína transportadora de asila natural traia to co-cxpressa or; uma proteína, transportadora de neda dc outra forma tendo afinidade para a tme.stera.se acil-ACF graxa (ou vice-versa) e , opcionalmente, (ili) um gene exógeno codificando uma acibCoA graxu/aldeídu redutase nu umtt redutase acibCoA graxa, e, opcionaimertíe, (jv) um gene exôgeno codificando um aldeído redutase graxo ou um aldeído deeurbomlase graxo, O micróbio, quando cultivada conto descrito abaixo.

sintetiza am ácido graxo bgado a anw ACP e a uoesterase adi-ACP graxa catalisa a divagem do ácido graxo da ACT pata produzir, através do pro<re»suuremo onzimáticu adicional, unia molécula de aeil-CaÁ graxa. Quando presente, a acil-CoA graxa/aIdeldo reducaiasc catalisa a redução da aeti-Co para tttn álcool. Da mesma forma. a redutase 5 aell-CoA graxa, quando presente, catalisa & redução da acil-CoA para um aldeído, Nestas modalidades em que um gene exógeno que codifica uma redutase acil-CoA graxa está presente e expressa para produzir um produto de aldeído, um aldeído redutase graxo, codificada pelo terceiro gene exógeno. catalisa a redução do aldeído para turn álcool. Da mesma forma, um aldeído decarhanilase graxo catalisa a conversão do aldeído para um 10 alcano ou um alqueno, quando presente.

Os genes codificando tais enzimas que podem ser obtidos a partir das células já conhecidas para apresentar ptoduçào de lipídios significante tais como Ot.forrihj /mottuáeío,iíréx. Os genes já conhecidos por terem um papel .mi produção de iipldtos, por exemplo, tint gene que codifica uma enzima que satura ligações duplas, podem ser 15 transformados ind i v hi tra Intente em células reeebedoras. Entretanto. para a prática da invenção, não é necessário fazer suposições u priori a respeito de que genes são necessários. Uma biblioteca de DNA contendo genes diferentes, tais como cDNAs de um organismo de boa produção de íipidie. podem ser transformados cm células reeebedoras, O cDNA está preferivelmente em ligação operável com um promotor ativo mts microalgas. 20 Diferentes células de microalgas reeebedoras transformadas por uma btblsoteca recebem genes diferentes dtt bibhoteca. O transfonnantes tendo produção de lipídius melhorada são identificados através de métodos de triagem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo. HPLC, cromatografia gasosa e métodos de espeetrotnetria de massa de análise tie hidrocarbonetos (paraexemplos de tais análises, ver Biomass and Binenergy Vol. 6, No. 4.

pp.· 269-274 (1994); Experience 38: 47-49 (I98.'2s; e f’bytochernislry 63 (20G4.I 31593165). Estes trtmsformam.es são então sujeitos a transformação adicional, com a biblioteca tirigtmtl e/t>u, opclonaknente, cruzados para gerar um novo ciclo de organismos com produção lipldictt melhorada. Os procedimentos gerais para a evolução de organismos inteiros para adquirir tuna propriedade desejada são descritos em, por exemplo. IJS.

6,716.631. Tais métodos envolvem, por exemplo, a introdução de uma biblioteca de fragmentos de DMA em ttma pluralidade de células, segunda a qtrai pelo menos um dos fragmentos sofre recombinaçào com ttm segmento no genomtt ou um episome dtts células pat's produzir célula» modificadas. .As cêitthts modificadas são então tríadas para células modific-adas que evoluíram para a aquisição da função pretendida. Os vetores e métodos 35 para a transformação são análogos àqueles discutidos em conexão com a expressão des genes de lipa.se.

Além disso, its bibliotecas snbtratjvss podem ser usadas paru identificar genes cuja transcrição é induzida em condições diferentes, especiuímente as condições empregadas no cultho de microorgantstrzcs para a produção de biodiesel. ou para a produção de hídtxxtatironeros tllels como matéria-prima para aplicações industrials. As bibliotecas subtrativas contém sequências de nudeolideos rel'lelindo as diferenças entre duas amostras diferentes. Essas bibliotecas são preparadas através de procedimentos que incluem as etapas de desnaturação e hibridização das populações de poíinucleutídeos (por exemplo. rrtRNA. cDNA, seqilências amplificadas} de cada amostra, As sequências comuns a ambas as amostras hibridizam e silo removidas, deixando as sequências «ve diferem entre as amostras Desta forma, as sequências que mdturidas sob condições especiais podem ser identificadas. Esta técnica pode \er empregada, por exemplo, para identificar os genes üreis para aumentar a produção Hpfdica ípor exemplo, ácidos graxos) e, em particular, a produção de ílpldios sob quaisquer condições de cultura desejadas. A técnica de hibridizaçâo subtrativa também pode ser empregada para identificar os promotores, por exemplo, os promotores úiduzívejs. ritei» nos consln-ítos tie expressão de acordo corn a invenção.

Assim, por exemplo, as bibliotecas suhtrativas podem ser preparadas a partir de culturas de microrganismvs crescidas autotrcficamente (á luz, sem uma fonte de carbuno fixa) ou heterotruilcamente (no escuro, na presença de uma fonte de carbono fixa). Em particular, os genes heterotrôficos podem ser induzidos durante o crescimento escuro na presença de uma fonte de c&rbotio fixa e podem, portanto, estar presentes em uma 20 biblioteca geradas subtraindo as sequências a partir de célula» autotróficas ít partir de seqüências de células hetcrotrófícax escuras. As bibliotecas subtrativas também podem ser preparadas a partir de culturas em que um substrato de carbono particular. tal como a glicose, foi acrescemado para identificar os genes que desempenham um papel no r;iclítbulismo do substrato. As bibliotecas subtrativas preparadas a part.tr de culturas 5 cultivadas na presença de excesso versus nitrogênio limitado podem ser usadas para identificar os genes que controlam a divisão celular, em oposição ã produção de acumulação de hidrocarbonetos. A preparação de turra biblioteca subtratmt de uma cultura em que liptdíox (por exemplo, ácidos graxos) foram adicionados pode amd&r a identificar os genes cuja super-expressüo aumenta a produção de ácidos graxtss. Mais 30 especificamente, a adição de ácidos graxos a uma cultura ds células que pode mílirar os ácidos graxos adicionados levará ã sub-regulaçáo dos genes sntiéticos de ácidos graxos para sub-regular a produção de ácidos graxos. A super-expressão de um ou mais genes, terá efeito oposto.

Algumas micrualgas produzem quantidades sigmfkutt-ras de metabélitos não lipídicos. corna, por exemplo, pollssaearideos. Porque a hiossíutese de polissitcazldeus gude utilizar trota proporção significativa da energia metabõlica total disponível pars as células, a mutagênese das células produtoras de lipídúra seguida pela triagem para prttduçâo de poliasacarideos reduzida ou ebrmnada gera novas cepas que são capazes de produzir maiores rendimentos de lipfdios.

G feuok o ensaio de ácido sulfãtrèo detecta a earboidratos {ver Hellebust. Handbook of Phycologrèal Methods, Cambridge University Press. 197$; e Cuesta G., et al.

J Microbiol Methods. 2003 Jan;52( I ):69-73). O ensaio do aaul de 1.6 dimerllmetileno detecta OS pel issacarf decs aniônicos. (ver, por exemplo. Braz J Med Biel Res 1999 M&y;32(5):545-50; Clin Orem. 1986 Nov;32(11):2973-6)Ox polissacarfdeos t&mbém podem ser analisados através de métodos como a HFI..C, eromatografia por exclusão de tamanho, e cromatogralia de troca aniõnica (ver, por 1Q exemplo Frosky 1,, Asp N. Schweizer TF, DeVnes JW & Farda .1 (.1988) Determination of insoluble, soluble and lotai dietary fiber in food and food products: Inlerlahnratory study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 71. 1017*1023, Im J Biol Macmntol. 2003 Nov'.33(1-'3HM8). Os poliwK'arideos tatnbém podem ser detectados usando a elerroforese em gel (ver, por exemplo, Anal Oioehem. 2003 Get 15:321(2):17415 82; Anal Biochem. 2002 Jan 1:300( I ):53-58),

VL MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE LIPÍDEOS E H1DROCÀRBONETOS

Os hidrocarbouetos (per exempio. lipfdios. ácidos graxos, aldefdos. dlcoois e alcanas) pruduzidos pelas células da invenção podem ser colhidos, ou de outra forma 20 coletados, por qualquer meio convenient^. Por exemplo, cs hidrocaxhonetos seuretadus pedas células podem ser centrifugados para separar os hidrocarbonetos em uma camada hidrofóhica de contaratnames em uma camada aquosn e, opcionalmente, a partir de qualquer material sólido conto um precipitado, após centrifugação, 0 material comendo a célula oa frações da. célnla pode ser tratado com proteases para degradar proteínas 25 eontaminantes antes ou após a cenirifngação. Fm alguns casos, as proteínas contamin&ntes estão associadas, possivelmente covaíentemente, sos hidrocarbonetos ou precursores de hidnscafbonetos que formam os hidrocarbunetox após a remoção da proteína. Em outros casos, as moléculas de hidrocarboaetos esfeo era uma preparação, que também contém proteínas. As proteases podem ser adicionadas às preparações de hidrocaxbonetos contendo 3Ü proteínas para degradar protulrsas (por exemplo, a protease de 5?repn?rayí es gró'r«.« pode ser usada Inúmero de catálogo SígmaAldrích P5I47), Após ;> digestão, os hidroearbonetos são, preferivelmente purificados a partir das proteínas residuais, fragmentos de popddeos e aniinnãcidos, Esta purificação pode ser realizada, por exemplo, pelos métodos listados aeima. como a eentriftigação e filtração.

t)s hidroetubonetos exuaceluíares também podent ser extraídos fn vivo de células vivas de. microalgsa, que são, então, retornadas para um biooeator pcE exposição das eékdas, em u.m ambieme de outra forme estéril, a um solvente de extração nào-tóxico. seguido pela separação das células vivas c a fração hsdmfóblaa do solvente de extração e hldrocarboiietos. no qual as células vivas separadas \ão em seguida, rcionmdas para cm recipiente de cultura, tal como um fermentadur de açu inoxidável ou fotobiotcaior {ver Biotechunl Bíoeug. 2004 Dec 5:88(5):593-600 e Biotcchnol Bioeng. 20Í.M Mar 5-,85/5 ):475-81).

Os iòdrocarboncfos também podem ser isolados pela extração da célula inteira. As células sã» primeiró divididas, como descrím na seção intitulada Células LisadasC e então hidrocatfionetos intracelulares e associados a membrana ccltilar/p&rede celular assim como os hídrm:arlxmc{os extracsluíares podem ser coletados a partir da massa de células inteiras, com» pela utilização da centriftigaçâo. tal como descrita acima.

Vários métodos estão disponíveis para a separação de hidtxxtsrbonetos e lipídios dos lisados celulares produzidos pelos métodos acima. Por exemplo, os liidrocarbeaetos podem ser extraídos com um solvente hidrofóbico, tais como hexano {ver Erenz ei ai. 1989. Enzyme Microb. Techaot. 11:717), Os hldrecarbonctos também podem ser extraídos csiuido líqaefaçáo {ver. por exemplo Sawayanta ei sl. 1999, Biomass and 15 Bioenergy 17.33-39 e incite ei al. 1993. Biomass Bioenergy 6(4) :269-774/: liqnefãçâo do petróleo (ver. por exemplo Minowa ei ah 1995. Fuel 74 112}. 17'35-1738) c extração de CG? supeterítie» (ver. por exemplo, Mendes et al. 2003. Inorganics Cbimica Acta hh)s)sss|||g||||||||||||||||||||||||||||||||||^

Miao e Wu deacrevenmi um protocolo de recuperação de hpidios das mieroalgas, 20 de uma cultura de Cã/onriás prom/Ae«ícm<fo? tio qual as células foram colhidas por cemrífugaçãu, lavadas com água destilada c seca* por l.ltifilízação,. O pó de célula, resultante íoi pulverizado em um mortor e. em seguida, extraído com n-hexano. Míae and Wu, Biosource Technology (2(855) 97:841-846.

A. Ligt.de€éhúg§

Lipídíos intracelulares c hidrtscarlxjnetos produzidos no microorganismos são. em algumas mraíalid&dcs, extraídos após a íise das células do microorganismo. Uma vez extraído, os V-pídlos eZcm hídtOCiuboneios podem ainda ser refinados para produzâr óleos, combustíveis ou óleos químicos.

.Após a conclusão do cultivo, os microorganismos podem ser separados do caldo de 30 fermentação. Opctonalraente. a separação é efetuada pela centrifugação paru germ uma pasta concentrada. A centrifugado não remove quantidades stgrtiftoativas de ágna

i.mracelulnr dos microorganismos e não é uma ebipa de secagem. A biomassa pode ser lavada com uma solução de lavagem (por exemplo, água Dl) para se livrar do caldo dc fermentação e detritos. Opcionalmente. a biornassa trácrobiana lavado também pode ser 35 seca (seca em forno, líofdlzada, etc> antes do rompimento celular. Alternativsxmente. as células podem ser lixadas sem separação de alguns ou iodos os caldo de fermentação, quando a fem-em&çá» estiver completa. Por exemplo, as células podem estar em tmra

64/127 ptOpocçâo de menos de I: l ν;ν células para ο líquido extracelufer quando as células são iisadas.

Microorganismos contendo um lipídeo e/ou hidrocarboneto podem ser bsados para produzir um Usado. Como detalhada aqui. a etapa de Use de um microorganismo (também referida por use celular; pode ser alcançstda por qualquer maio ctmveraente, btcltürtdo a Use induzida peto calor, adição de uma base, adição de um ácido, aso de enzimas como proteases e enzimas de degradação de poiíssacarídeos, tais como amilases, uso de ultrasom, Use mecânica, uso do choque osmótic», mfecçâo por um vírus lítieo, e/ou expressão de um ou mais genes liticoa. A Use é realizada para liberar mofeenlsit; folraeehdares que foram produzidas peto microorganismo. Cada um desses métodos pata lise de um microrgawsmo pode ser usado como ntn método ünico ou em combinação simultânea ou seqüencíalmeníe.

A extensão da divisão celular pude ser observada pela análise microscópica. Usando um ou mais dos métodos desentos aqui, normal mente reais de 7971.- da quebra dc. células é observado Preferivelmente, « ruptura celular é mais dc 89%. mais preferivelmente maior que 90% e mais preferido cerca de 109%·.

Era modalidades particulares, o microorganismo é lisado após o crescimento, por exemplo. para aumentar a exposição dos lipídeos celulares e/ou bldrocarbtmetos pn.ru a extração ou processamento atficitmal. O momento da expressão da lipase (por exemplo, através dc ura promotor induzívei} ou lise celular pode ser ajustado para otimizar a produção de lipídios e/ou htdrncarbonetos. Abaixo são descritas várias técnicas tie lise. Estas técnicas podem ser asadas individualmente ou em combinação.

1. Lise induzida pelo «ator

Em uma modalidade preferida da presente invenção. s etapa de ll.se dc sim microrganismo compreende o aquecimento de anta suspensão celular contende o microorganismo. Nesta modalidade, o caldo de fermentação comendo os microorganismos <ou uma suspensão dc microrganismos isolados do caldo de fermentação} é aquecido até que os microorganismos. ou seja, u.s paredes celulares e membranas de microrganismos degradem ou quebrem. Normalmente, as temperaturas aplicadas são pelo menus 50%?. As temperaturas mais elevadas, como, pelo menos. 31FC, pelo menus, 66%'.’, pelo menos. 70%?, pelo menos, Sfe’C, pelo meses, 90%?, peto menos, 190%2, pelo menos 119®C, pelo menos, l 2ÍEC, pelo menos 131.EC ou mass sãss usadas para a lise- celtdur mais eficiente.,

A lise das células pelo tratamento térnüco pode ser realizada através da fervura do microorganismo. Alteraativameute, o tratamento térmico (sem ferver) pode ser realizado em um autoclave. O Hsado tratado por calor pode ser resfriado paru tratamento adicional.

A divisão enlulur tambéra pode ser realizada por um tratamento coat vapor, ou seja, através da adição de vapor pressurizado. G tratamento cons vapor dc- mlnroítlgíts para a divisão celular é descrito, por exemplo, na Patente US. No. 6.750.948,

65/127 ^:

2, Lixe Usando txma Base

Ent oatra nxaialidade preterida da presente invenção, a etapa tie stse de ttm mktorgatdsnns compreende a adição de uma base a uma suspensão cetular contendo o tmcrrjurganismo

A base deve see forte o suficiente para hidrolisar. pete menos, uma porção dos compostos protéteos das mictorgantemo* ut-hzxdos. As bases qae sac úteis para solubilizar as proteínas sat; conhecidas na técnica da -química. Basea exemplar que são úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, hidróxidos, carbonato» e bicarbonatos de liíte, sódio, potássio, cálcio e misturas dos mesmos. A base preferida é KOH. O tratamento da base de microalgas paxa a divisão celular é descrito. pox exemplo, na Patente US, No. 6.750.04B.

3, Lixe Ácida

Em outxa modalidade preferida da presente invenção, a etapa de lixe de um mtcrorgttmsmu compreende a adição de um ácido a uma suspensão celular contendo o microorganismo. A li.se ácida pode ser feira utilizando um ácsdo era mua concentração de. I0-5ÍX) mN ou, pxeíem-elmeme 40-160 nM, A Use ácida 6 realizada, prcfereacíalmeatc., acima da temperatura ambiente (por exemplo, exn 40-1605 e pteFcrivehnsmc, uma temperatura de 50· 1305 Paru temperaturas moderadas tpor exemplo, temperatura ambiente a I00X e particularmeme temperatura ambiente a 055 o tratamento ácido estar de mudo útil combinado com xoatcsção ou com outros métodos de divisão celular,

4.. Líse de Células Usando Enzimas

Em ou-ra modalidade preterida da ptvstmic invenção, a eistpa de líse de um trhcrcirgattismo compreende a Use do microorganismo pelo uso de uma enzima. As enzimas preferidas para ti líse de um microorgamsmo são proteases c enzimas de degradação de pobssacarideos. como hemicelulase ípor exemplo, hemicelulase de Ax/jíUgt/N.r niger; Sigma Aldrich. St. Louis, MO; 4112125), pectinase (por exemplo, pectinase de Abicupu'.-: sp.; Sigma Aldrich. St. Louis, MO; 4P24l.il). Manuawy 4.0 1, (Novitzymes). celulase (pot exexnpte, celulose de Trichoderma vivida; Sigma Aldricb, St. Loura. MO; 4C9422), u driselase Ipor exemplo, drlselase de. Se odioínvoCiCA $p.·. Sigma Aldrich, St. Louis, MO; 4D95I5.

a) Cehdases

Em «ma mtsdalidade preferida da presente invenção, ama celulase para a liste de um microrganismo é ama enzima de. degradação de polissucarideo, upcxonalmente de COífresíít ou um vírus Odorallo

b) Proteases

As proteases coma a protease de Stieptorayees gxitetra, químotripslaa, prraemuse K.. proteases listadrra era Degradation of Polylaettde by Commercial Proteases. Oda Yet tth, Jeamal of l-Mlymers and the Envixonmem, Volume S. Number I. January 2ÍKX) . pp. 29

66H37 .32.(4). e outras proteases podem ser usadas para a Use de microorganismos. Ouiras proteases que podem ser usados tnclacm Alcalasc '2.4 FG (Novozyme*) s Flavouraima 100 L fNovozyracsx

e) Combioações

Qualquer combinação de ums protease e uma enzima de degradação de polhsacartdeo mmhêm podem ser usada, incluindo qualquer combinação das proteases anteriores s enzimas de degradação de polissacarídeo.

5. Lise de Céhdas Usando Ultra-som

Em outra modalidade preferida da presente mv&nçào, a etapa de lise de um W microrganismo ê realizada por meio de ultra-som. ou seja, sonicação. Assim, as células também podem ser lisadas com som de alta frequência. O ®om pode ser produzido eletronicamente c transportado através de uma ponta metálica para urna suspensão celular devidamente concentrada. Esta scmícação (ou ustra-sonicaçâo) divide a integridade celular baseado na criação de cavidades ns suspensão celular.

6, Live Mecânica

Em outra modalidade preferida da presente Invenção, a etapa de lise de tstn microorganismo é realizada através da lise mecânica. As células podem ser 'dsadas mecanicamente e» opcíonahneme. homogeneizadas para facibtar a coleta dst hídrouftrbonero (por exemplo, lipísleo) Por exemplo, um disruptor de pressão pode ser usado para bombear 20 uma célula csmiendo * mistura fraca através de ama válvula <k orifício restiira. A alta pressão tató 1500 bar; é aplicada, seguido de uma expansão iostuntônea «través de um bico de saída. G rompimento celular é realizado por tres diferentes mectnilsmos: o choque na. válvula, alto cisalhantento líqmdo no onffeio. e queda de pressão repemins mediante, descarga, causando uma explosão da célula. O método libera moléculas intracelulares.

Alteraativamente, um moinho de esferas pode ser usado. Eni um moinho de esferas, us células sâo agitadas em suspensão com pequenas partículas abrasivas, rare como contas. As células quebram por causa de forças de cisalhamemo, tnoagem entre as contas, e colisões com as contas. As contas dividem as célula® para liberar os conteúdos celulares. A.s células também podem ser divididas por forças de cisalhamento, corno com o uso da 30 mistura (cor exemplo, com uma alta velocidade ou misturador Waring, como exemplo.%1. prensa francesa. »u mesmo eentrifugaçâo no caso de paredes celulares fracas, para dividir as células.

7, Lise da® Células por Choque Oxmâíieo tCitólíse)

Em outra, modalidade preferida da presente invenção, a etapa de lise de um 35 raicroorgamstno é reahzada através da apliínqàk;· de um choque usmbl ico.

8. Infecção com tmt Virus Idtko

Em uma modalidade preferida da presente mvenção, a etapa de tise de um. microorganismo compreende a infecção do microorganismo cura tira virus litres:·, tlma

67/127 grande variedade de virus é conhecida por Itsar os microrganismos adequados para o uso na presente invenção, e a seleção e utilização de urn determinado virus lítieo para uro micrcmrgamsmo particular estã dentro do nível de uma pessoa versada na técnica.

Por exemplo, o vhus paramecrâzn bursorrô eüíoreiú? lP3CV-b é o protótipo de um grupo ífamília Phycodnavmdae, gênero Chloroviras) de grandes vírus de DNA de eadoia dupla, grandes, icosaédricos, fotmadorro de placas que replicam dentro, e Usara, certas algas verdes coroo a chlorella eticariótica, unicelular. Assim, qmdquer mkroalga sensíveis, pode »er lisada pela infecção da cultura com um vírus ehlorella adequado Métodos de infectar espécies de CAirtre/f» com um virus chlorella são conhecidos, Ver, por exemplo Adv. Vim» 218)6:66:293-336: V/rofogy. 1999 Apr 25;25?(l): 15-23; Víroíogy, 2004 Jan 5;31âfl};214-23; AWeíe zlcids .Sy.mq, 20í)0;(44):161-2: /. Viro/. 2006 Mar;SOÍ5 í:243?-44; andÂmsu. Rev. MerohãR. 1999;53:447 -94.

9, Aniôiíse (Expressão de um Gene Lítieo)

Em outra modalidade preferida da present's invenção, a etapa de lise de um microrganismo compreende a atttdiise. Nesta modalidade, um microorganismo dc acordo com a invenção é geneticamente modificado pura produzir uma proteína lítlca que lisa o microorganismo, Este gene lítieo pode ser expresso através de um promotor mduxível de modo que as células possam ser cultivadas primeiro a uma densidade desejável era um fermentador, seguido pula indução do promotor para expressar o gene lítieo para lisar as 20 células. Em uma modalidade, o gene lítieo codifica uma enzima de degradação de políssacartdeo.

Em algumas outras modalidades, o gene lítieo é um gene de ura vírus lítseo. .Assim, por exemplo, um gene lítieo de um vírus Chlorella pude ser expresso eni uma célula de algas do gênero Chfore/ás, como C. prrtíof/teíroüfes.

Os métodos de expressão adequados são descritos aqui com relação à expressão de um gene da lipase, .A expressão de genes lítieus é preferivd mente feita usando um promotor mduxívsl, tal couro um protrrotot ativo era micrualgas que é Induzida por um estímulo, como a presença de utrta pequena molécula, íuk. calor e outros estímulos. Gs genes liticos do vírus chlorclhí são conhecidos. Por exemplo, ver V/roíogy 2.60, 398.-3 í 5 ((999?: Afíivxíò/oAu.çy 5e,’?er.$ ISO (5999) 45-53; Vúro/og.y 26.3, .376-.387 (1999). e

WroMgy 230,361-368 (1997).

Os lipfdeos c hidrocarbuneies produzidos pelos microorganismos da presente invenção podem ser recuperados por extração cons um solvente orgânico, Em alguns caso».

o solvente orgânico preferencial é hexano. Normslmente, o solvente orgãnteo é adicionado diretamente ao Usado sem a prévia separação dos compcsnentes do lis«d<:>. Em uma modalidade, o lisadcs gerado por um ou mais rios métodos descritos acima é contatando core, um solvente orgânico por um período de tempo sufsctente para permitir que os hpiíhos

68/127 e/ou componentes de hidrocarbcneto formem uma solução com o solvente orgânico. Em alguns casos, a solução pode ser ainda refinada para tceuperat os componentes lipídico desejados específicos e de hidroearbonclos. Métodos de extração de hexano são bem conhecidas na técnica.

VIL MÉTOIWS DE PROCESSAMENTO 1>E LJPÍDEOS E

HIOROCARBONETOS

A · MpdífieaeãjaEagUpáU^

Hídroeartxsnetos (por exemplo, iipidios, ácidos graxos, aldeídos. áicoois e aícanos) produzidos petas células, como descnto aqui podem ser modificados pelo uso de ama ou 10 várias enzimas, incluindo uma lipase, como descrito acima. Quando os bidrocarboneros estão no ambiente extracekdar das células, uma ou mais enzimas podem ser adicionadas a esse ambiente. sob condições cm que a enzima modifier os hídrecarbortetus nu completa sua síntese a partir de um precursor de hidrocarboneto. Altemativameníe, os Itidrocarboacios podem ser paxclnlmente ou completamente isolados do mafenal genético 15 antes da adição de um ou atais catalisadores, tais como enzimas. Tais catalisadores são adicionados exogenam&me. e sua atrvidade acorre fora da célula ou is Ciro.

B, Modijfkuçã» Térmicas e Outras Çatalítíeas

Ridrocarbonetos produzidos por células m vivo. ou enzimaticamente modificados òí

Ntro. como descritos aqui, podem ser opcíonalmente tratados pnstenormente por meios 20 convencionais. O tratamento pode incluir eraqueamento para reduzir o tamanho, e assim aumentar o hidrogênio: a razão de carbono, de moléculas de hidrucarbonetos. Os método·» dc. crsíqueamuuto térmico e catalítico são usados rotmeirametrte em bidrocarbonetos e ao proeessun-entts de óleo de trtgheèrtdeos. Métodos catalíticos envolvem o uso de um catalisador, tal como um catalisador de ácido sólido. O catalisador pode ser de silica25 alumina ou um zedíito. que resultam na quebra de ama ligaçáo earbono-cariiono beieroíítica ou assimétrica pare resultar em um earboeáõon e um ânion de hidreto, Esses intermediários read vos. em seguida, submetidos nu ao rearranjo ou a transferência de bidrefo cotn outro bidroearboaeto. As reacçôes podem, assim, regenerar os imermediános para resultar cm um mecanismo em cadeia de auto-propagação. Os Itidrocarbottetos 30 também podam ser processados para reduzir, opcionalmente a zero, o número de ligações carboao-carbtmo duplas ou triplas, neste. Ds bidrocarbrmetos também podem ser processados para remover ou eliminar uma estrutura em anel ou cíehca do mesmo. Os hidrocarboítetos também podem ser processados para aumentar o hidrogênio: razão ds cadjono. .Isso pode incluir ü adição ds hidrogênio ( hidrogcttaçüo? e/ou o '‘craqueantento 35 de hidruearbonetos em hidrocarbonelos menores.

Os métodos térmicos envolvera o «so de temperaturas elevadas e pressão para reduzir o tamaxsho do hidrocarbonetu, (Jma temperatura elevada de cerca de bí.KPC e pressão de cerca dc 700kPa podem ser usados. Estas condições geram “luz”, am terms que às veires é usado paru se. referir a rat-ltotlas de hidrocarbotrelos ricas em hidrogênio (comrs distinguído de fluxo de fótons}, enquanto também gera, por condensação. moléculas de htdrocarbonews raaís pesadas que são relativamente. empobrecidas de hidrogênio. A metodologia fornece quebra homolrticà ou simétrica e produz alqueuos, que podem ser opcionabneate enzimmicaraente saturados, corno descrito acima

0s métodos térmicos e catalíticos sito padrão «sn instalações para o processamento de hidrocarbonefos e de refino de petróleo. Assim os hidroearboaeíos produzidos por células, como descrito aqui podem ser coletados e processados ou refinados através de meios convencionais. Vejtt Hillen et al, (Biotechnology and Bioengineering. vol, 10 XXIV:}93-205 (1982)} de urn relatório sobre hidrocraqueumentc de hidrocarixmetos produzidos por microalgas. Em modalidades alternativas, a fração 6 tratada eom outro catalisador, como um composto orgânico, calor e/ou um compost» inorgânico. Para o processamento de Upídios em biodiesel, um processo de transestmifioaçao é usado como descrito na Seção IV.

Qs. hlrlrocarbonetox produzidos através de métodos da presente invenção são úteis em uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, a produção de sulfonuto de alquitbenzcno linear tl-AM. ura surfactants aniônico usado em quase todos os tipos de detergentes e preparações para limpeza, utiliza hidrocarbonetos geralmentc composto por uma, cadeia de KM4 átomos de carbono. Veja, por exemplo. as Patentes US. Nos

6,946,43(8 5.3(16.201; 6,692,730; 6.268.517; 6,020,509; 6,140,.302: 5,0,30,848: e

5,567.359. Suriaetanfâs. tais corno l.A$. podem ser usados na fabricação de composições de cuidados pessoais e detergentes, tais corno as descritas nas Patentes US. números: 5,942.479; 6,036,903; 5,833,999: 6,468,955: e 6,407,044.

VHL MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE COMBUSTÍVEIS ADEQUADOS

PARA O USO EM TRANSPORTÁiXIRS A DIESEL E MOTORES A JATO

Imeres.se crescente ê direcionada para o uso de componentes de hidroearbortelos de origem biológica em combustíveis, como o biodiesel. diesel renovável e combustível de aviação, já que os materiais de inicio biológtcos renováveis, que podem substituir materiais derivados de combustíveis fósseis estão disponíveis, e sua utilização ê desejável. Há uma 3Q neeessufcide urgente por métodos para produzir componentes de hidrocarixmeto a partir de materisos biológicos. A presente invenção atende a essa necessidade, fornecendo métodos para a produção de biodiesel, diesel renovável c combustível de aviação usando os lipídeos gerados pelos métodos aqui descritos tomo um material biológico para produzir bíodtssel, diesel renovável e combustível de aviação.

O combustíveis diesel tradicionais são destilados d» petróleo ricos cm hidrocarbouelos paraffnieov Eles têm de faixas de ebulição tão amplas eumo 37Í.C a 78(f 'F, que sào adequadas para s. combustão em motores de ignição por compressam tais como um transportador com naotora diesel, A Sociedade Ameneana de Testes e Materiais t ASTM .·,

70,'Ί 27 estabelece ο gray de diesel de acordo coni a faixa de ebulição, juntamente corn escalas pennmiveis das propriedades de outros combustíveis como o adtncro de cetano. ponto de névoa, poai-o <ie fulgor, viscosidade, pr.mio de atui ias, teor de enxofre, teor de âgua, teor de cinzas, corrosão da tira de cobre. c resíduo de carbono. Tecnicamente, qualquer material 5 destilado de hidrocarboneto derivados da bitmrassa ou de outra forma que ateada a especificação ASTM adequada pode ser definido como combustível para motores a diesel (ASTM 13975), combustível de aviação (ASTM D1655}, ou biodiesel (ASTM D6751

Após a extração, os componentes de lipídios e/ou de hidrocarbonetos extraídos da biomassn mierobi&na descritos aqui pude ser submetido a tratamento químico para fabricar 10 um combustível para uso em transportadora a diesel e motores a Jato,

A< MM biodiesel é um líquido qtse varia na cor - entre o dourutio e marrom escuto dependendo da matéria-prima de produção. F. praticatnente imtscível com a água, tem um elevado ponto de ebulição e baixa pressão de vapor, O biodiesel refere-se a um combustível processado equivalente ao diesel pats utilização em transportador» eras· motor a diesel. O biodiesel ê biodegradável e não tóxico, Um benefício udiciot-al do biodiesel sobre o combustível diesel convencional á menor desgaste do motor,

Normalmente, o biodiesel é composto de C14-C18 tdqai; ésteres. Vários processos convertem a biomasra ou de um lipídlo produzido e isolado como descrito aqui em 20 combustíveis diesel. Um método preferido para a produção de biodiesel é a transesteriüeuçãu de lipídios como descrito aqui, Um alquii éster preferido pm uso como biodiesel ê um éster metüico ou éster etílico, biodiesel produzido por um método descrito uqui pode ser usado sozinho ou misturado ao diesel convencional em qualquer concentração em transportadora de motor a 25 diesel mais modernos. Quando misturado ao diesel conveneionul (diesel de petróleo), c biodiesel pode estar presente era cerca de 0.1% a cerca de 99.9%. Grande parte do mundo usa um sistema conhecido como fator 'Έ para indicar a quantidade <le biodiesel em qualquer mistura de combustível. Por exemplo, o combustível que contém 20% de biodiesel é rotulado B20. O biodiesel puro é denominado BlíHk

0 biodiesel também pode ser usado como combustível de aquecimento em caldeiras domésticas e comerciais. As caldeiras a óleo existentes podem coater panes de borracha e podem requerer a conversão para rodar em biodiesel. O processo de conversão nurmalraente é relatívomente simples, envolvendo s troca tias partes de borracha por partes sintéticas devido ao biodiesel ser um solvente forte. Devido a sua forte potência solvente, a 35 queima do biodiesel aumentará a eficiência das caldeiras,

O biodiesel pode ser usado como aditivo em funnulaçóes de diesei para aumentar a lubricidade do combustível Diesel com Teor de Enxofre Ultra-reduzido (ULSD), o que é vantajoso, pois niio tera praticamente nenhum teor de enxofre.

71/=27 biodiesel ç um melhor solvente do que o peirodiesel e pode ser utilizado parti quebrar os depósitos de resíduos nus linhas de combustível dos transportadora que já foram executados em petrodiesel.

L Produção de Biodiesel

O biodiesel pode ser produzido pela transesterificação de triglieerideus contidos na biomMsa rica cm óleo. Assim, em outro aspecto da presente invenção um método para a produção <íc biodiesel é fornecido. Em ema modalidade preferida, o método para a produção de biodiesel compreende os etapas de (a) cultivo de um microorganismos contendo lipídeo utilizando métodos aqui descritos, (b) hse- de um microorganismo 10 contendo íipidio para prodmàr um iisado, (c; isolamento do bpídeo do microorganismo Usado e (d) transestedfkação da composição lipídiea. por meio da qual o biodiesel d produzido.

Métodos paru >s crescimento <lu um microorganismo, lise de um microorganismo para produzir um ilsado, tratando o lísado era um meio que melui um solvente orgânico 15 para, formar uma mistura heterogênea c septtraudo o lisado tratado em uma composição iipídica foram descritos acima e também podem ser utilizados no método dc produção de biodiesel.

Às composições lipídicas podem ser submetidas a ran.sesl.erífieaeão para produzir ésíeres de ácidos graxos de cadeia longa fiteis como biodiesel. As reações de 20 transesteriiicaçüo preferidas vau descritas a seguir e incluem a transexterificaçâo catalisada por base c transesterificaçâo usando lipases recombinuntes.

Em um processo de traasestarificução catalisado por base, os triactlglkeróis sâo reagidos com um álcool. como metanol ou etanol, na presença de um catalisador alcalino, geralmente hidróxido de potássio. Esta reação forma ésíeres de media ou de etila e a 25 glicerina (glicexol) como um subproduto.

A), Processo Químico Geral óleos de ttni.tna.ts e vegetais são rrnrmalmente feitos de triglicerídeos. que são ésíeres de. ácidos graxos livres com o álcool triliídrico. glicerol. Na tramtesterificação. o glicerol em um foacilglícerideo (TAG) é auhafltiiidts com um álcool de cadeia curta, como 30 metanol ou etanol. Um esquema de reação típíers é o seguinte:

|||||ie0iiii||BÍIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII|Í|||||||^||Í|||Í||||||Í|Í|{i r-«.........W<» ...........J££-— ^Ri^c®^eíaM«-S«í-_s' '«e + |||||||||7d®®lllllllf|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Neste esquema, o álcool é desprotr.snado com ama base para torná-fe um titteleóflio mito; forte. Gora ame ate, o etaaal ou metanol é usado em vasto excesso {uté 50 vezes).

Noímalnxentó. esta reação procederá ou excessivameate lenta ou não procederá. O calor, bem como um ácido ou base pode ser usado para ajudar a reação a proceder mais rápido. O ácido ou base nào sàrs consumidos pela reação de transesteriíicaçâo, assim, eles não são reageníes, mas catalisadores. Quase todo biodiesel foi produz-do usando a técnica 5 catalisada por base puis requer apenas baixas temperaturas e pressões e produz mais de 9891. de rendimento de conversão (visto que o óleo de partida e baixo em teor de humidade e ácidos graxos livres).

b)< Usando Lipases Recombina»tes

A transesterificação também tem sido realizada experônentalmenre utilizando uma enzima, tal como uma opuse, em v«z de uma base. A transresterificação catalizada por lipase prate ser realizada, por exemplo, a urna temperatura entre a temperatura ambiente c. SÍF’ C. e uma razão molar da TAG para o álcool inferior maior que UI, preferivelmente cerca de 3:1.

As f-pascs adequadas para uso na transesierificuçào incluem, entre outras, as enumeradas na Tabela 9. Outros exmrtplo* de lipases díeis para a transestenficaçâo são encontrados em, por exemplo. Patentes US. Nos. 4,798,793; 4,940.845 Âl5ra963; 5.342,768; 5,776,741 e WO89/ÍH032.

Tabela 9, Upases adequadas para o uso na transesterificação.

AspergüVís? niger lipase ABG736l4.Cnndí<&t emmuvtira? lípase B (novozytn-435) CAA83l22.Cmi<sW« lipase AAR24O90.Cen</«fe upm'ytAvi lipase (Lipase L;

Amano Pharmaceutical Co.. Ltd.), Csmdb&s ragosn lipase (c.g., Lipase-Of·; Meno Satigyo Co,. Ltd.áíurau' miebet lipase (Lipozyme IM 20)Preu^,»n«vms fhiorescens lipase ΑΑΑ258Μ2ΛΛ««/ι«ί>ροη«.«Λ lipase (Lilipase A-10FG) Q7M4U7J.&Q~oraueor mie/iet lipase 334959,^,9^.(.7:00:0.^)^0^ hpc.re (Lipase F> ,AAF324O8.5emrrm nmreereen.í lipase | (SM Enzyme) ABItSS^LTheymomycei’ Ltnugiraxsit hpasc CAB585D9, Lipase P (Nagase ChemteX Corporation), e Lipase QLM (Meito Sangyo Co.. Ltd., Nagoya, Japan)_________________|

Um desafio ao uso de uma lipase para a produção de ásteres de ácidos graxas JO adequados para o brodiese! é que o preço ca lipase é muito superior ao preço do hidróxido de sódio (NaOH) usado pelo processo de base forte. Este desafio tem sido discutido, utilizando uma lipase imobilizada, que pode ser reciclada. Entretanto, a atividade da lipase imobilizada deve ser mantida após ser reciclada por um número mínimo de ciclos para permitir um processo a base de lipase para competir com o processo de base forte em 25 termos de custo de produção. As lipases imobilizadas xife sujeitas à intoxicação por álcoois inferiores nortnalmente usados na transesterilicação. A Fatenie US, No. 6.390.70/ lexpédida em 4 de junho de 2002 para Wu et ai.) descreve métodos para melhorar a atividade de lipases imobilizadas e regeneração <is lipases imobilizadas tendo atividade reduzida,

Em modalidades particulares, uma lipase recomhmante $ expressa nos mesmos microorganismos que produzem os liptdius nos quais a lipase age. As lipttses recombinames adequadas incluem aquelas bsí&das acima na Tabela 9 e/ou trade os números de acesso ao GertBank listados acima «a Tabela 9, ou um polipcptídeo que tem pdo menos 70% de identidade de arninoácídos com uma das lipases listadas acima na Tabela 9 e que exibe a atividade da lipa.se . Eco modalidades adicionais, a atividade enztmàtica está presente etn uma sequência que tem. pelo menus, cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%. pelo oteoos ceres de 85%, pelo menos, cerca de 99%, pelo menos, cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma das sequências acima descritas, todas as quais são incorporadas por referência conte se tossem plenatnente estabelecidas. O DMA que codifica a lipase e u marcador selecl ottável ê preferencialmente eDNA com eódoa otimizado. Os métodos de reeodiflcttçâo de genes para expressão em micrealgas são descritos na Patente US. ?. 135.299.

2. Padrões

O padrão internacional comum para o btotlíeseí é EM 1421», O ASTM Γ>6?51 è ò padrão de biodiesel mais comum referenciado sus Estados Unidos e Canadá. A Alemanha usa DIN BN 14214 e o Reino Unido exige o cumprimento do BS EN I»214.

Testes industriais básicos para determinar se os produtos cumprem esses padrões gerídmente incluem crom&tugrafla gasosa, HPLC. e outros, O biodiesel que. resperta os padrões de qualidade e muito não-toxico. com uma classificação de toxlcidaoe (l-fU;.,; superior a 50 mL/kg.

B,

O tiiessl renovável inclui alcanos. como o €16:0 e Cl 8:0 e, portanto, silo dísfinettoeis do biodiesel. O diesel renovável de alta qeaiidade está em conlonnidade cotn o padrão ASTM D975.

Os tipídios: produzidos pelos métodos da presente invenção podem servir como matéria-prima para produzir diesel renovável. Assim, em outro aspecto da presente invenção um método para a produção de diesel renovável é fornecido. O thesd renovável pode ser produzido pelo menos por três processos: processamento ftídtxitérmico (hldrotratamemok hidroprocessamemo e liquefaçãu indireta, Estes processos rendem destilados não-éster. Durante estes processos, os triacilgiiccrídeos produzidos e isolados como descrito aqui, são cmtverüdos cm aleanos.

Em uma modalidade preferida, o método para a produção de diesel renovável compreende, ia) cultivo de um microorganismos contendo lipl'deo utilizando métodos aqui descritos, (b) llese do microorganismo contendo lipídio para produzir um lixado. (c) isolamento do lipídeo do microorganismo Usado e td) desoxigenação e lãdrotratamemo do hpfdeo pata produzir um alcana, por meio da qual o dissel renovável é produzido.

Os Hpidios adequados para a fabricação de diesel renovável podem ser obtidos através da extração a partir da biomassa mrcrobkma, utilizando um solvente orgânico como o hexano, ou através de outros métodos, como os descritos na Patente US. 5.928.696.

Em alguns métodos, o iipídeo mierobiano é primeira craqueado em conjunto com u hidrotratamcnto para reduzir o comprimento da cadeia de carbono e saturar ligações duplas, respectivamente, O material é então isomerizado, lamném em conjunto com o hidrouatamento, A tração de nafta pode então ser removida através de destilação, seguida 5 pela destilação adicional para vaporizar e destilar os componentes desejados n» combustível diesel para atender a um padrao D975. enquanto deixa os componentes que são muis pesados do que os desejados para satisfazer um padrão D 975, O radrotratamento. hidroeraqueamento, desoxigenação e métodos de isomerização de óleos de modificação química, incluindo óleos de trigíicerideos, sào bem conhecidos na técnica. Veja por 10 exemplo os pedidos de patente Européia EPi/41768 (Al); EPI /41 /67 íA.i); EPI682466 (Al); EP1640437 (Al); EPI68133? (Al); EPI795576 (Al) e Patentes US. 7X38.277, 6.630.066,6.596,155,6.977.322. 7.041.866,6.217.746.5.885.440,6.881.873.

L Hidratratamento

Em uma modalidade preferida do método para produzir diesel renovável, o 15 tratamento do íipideo para a produção de um alcano c realizada pelo hidrotrataírisara da composição lípídica. No processamento hidrotérmico. normalmente, a biomasaa é reagida cm. água a urna temperatura elevada e pressão para formar óleos e resíduos sólidos. As temperaturas de conversão são tipicamente SELF a 66(55, com pressão suficiente para manter a água em primariamente como um liquido, 100 a l /1) atmosfera padrao yatmy Os 20 tempos de reação são da ordem de 15 ã 30 minutos. Após a reação «ar concíuwa, os orgânicos sào separados da água. Assim um destilado adequado para ti diesel é produzida.

2. II id wp r acessam e n to

Lím diesei renovável, conhecido como ''diesel verde'', pode ser produzido a partir de ácidos graxos pela tecnologia de hidroprocessaraento tradicional. Os óleos comendo 25 trigliuérídes podem ser hidropraeessados quer como eo-alimentaçâo com petróleo ou conto uma alimentação dedicada, O produto é um óleo diesel que está cm comortnio&oe com a especificação AST.M D975. Assim, em uma outra modalidade preferida do método para produzir diesel renovável, o tratamento da composição lipídics para produzir um aieano é realizado pelo hidroprocessamento da composição hpídícs.

Em algtms métodos de fabricação du diesei renovável, a primeira etapa dó tratamento de um triglícerídeo è hidssspttxcssamemo para saturar as ligações duplas, seguido pela desoxígenação a temperatura elevada na presença de hidrogênio e um catalisador. Era alguns métodos, a hidrogenaçâo e desoxigeoítçso ocorrem na mesma reação. Em outros métodos a desozigenaçào ocorre antes da hsdrogenaçào. A isomenzaçuo 35 é então opcionalmente realizada, também na presença de hidrogênio e um catalisador.

Componentes de nafta são preferencialmente removidos por destilação. Por exetnpto, veqt tts Patentes US. 5,475.160 (hídrogenação de trigliecrídeos); 3.091.116 (deswxigenação, hidrogenação e remoção de gás); 6,391,815 (hidrogenaçâo) e 5,888.947 (isomeriraçâu).

Refinarias de petróleo u«am o hidroprocessameatn para remover a> tmptirexas por *

tratamento de alimenuções com hidrogênio. Temperaturas de conversão do hi 6 reprocess atue η m são tipicamente 31X6' a 70ÍFF As pressões são tipicamente 40-100 aim. Os tempos de reação são tipicamente da ordem de 10 a 60 minutos.

Os catalisadores sólidos são utilizados para aumentar certas taxas de reação, melhorar a seletividade para determinados produtos, e otimizar o consumo de hidrogênio.

O hidrotratamento e hidroproeessamento finalmente levant a uma redução no peso molecular das alimentações, No caso dos óleos contendo tdglieerídeos, a molécula de triglioerídeo é reduzida a quatro moléculas de hidrocatboaero sob condições de W hidroproeessameuto; ema molécula de propttno e três moléculas de nidrocarbonetos mais pesados, geral mente na faixa de C8 aCl 8.

3, Liquefaçâo Indireta

O diesel com teor de enxofre uhra-reduzido tradicional pode ser produzido a partir de qualquer forma de biomassa por nm processo de duas etapas. Ffeimeiro, a biomassa é 15 convertida em um gàs de síntese, uma mistura gasosa rica em hidrogênio e monóxido de carbono. Em. seguida, o gás de sintesc Ci ca'.aliticamente convertido para líquidos, Normaimeste, a produção de líquidos ê feita usando a síntese Rscher-fropseb (FT). Esta tecnologia ê aplicável no carvão, gás .natural o óleos pesados. Assim, ainda em outra modalidade preferida do método para produzir diesel renovável, o tratamento da composição lipídlcs para produzir um alcana é realizado pela tiquefaçâo indireta da composição iípíclíca.

C. Combustível. de A yiacâa

O u»u anual dos ΕΛ1.Α de combustível de aviação em 2006 foi de cerca de. 21 bilhões de galões «cerca de 80 bilhões de litros). O combustível de avião é claro para cor dc 25 palha. O combustível mais comum é um combustível a base de óleo de paratina/nã» rotulado classificado como .Avião Al, qtie ê produzido para ran conjunto de e spec ill cações padronizadas 'mtemaeionalmcnte. O combustível de aviso c «ma imatura de um grande numero de hidrocatlxinetos diferentes, possivelmente até am mil ou mais. A faixa de seus tamanhos tpesos moleculares ou números de carbono) ê restrita pelas 30 exigências do produto, por exemplo, ponto de congelamento ou ponto de fumaça. Q combustível de avião tipo Querosene {incluindo Jato A e Jato A-l) tem ema distribuição de número de carbono entre cerca de 8 e 16 números de carbono.. O combustível de avião do tipo wide-vul ou nafta {incluindo Jato 8} geralmente tem urna distribuição de nranero de carbono entre cerca de 5 e 15 earironos.

Ambos o.s aviões {lam A e Jato B) podem conter ura numero de aditivos. Aditivos úteis incluem, entre outros, antioxidames, agentes anuestáucos, inibidores de oorruium. e agentes inibidores do congelamento do sistema de combustível (ES.1.1;. Os anüoxidantes impedem a gomifleação c, geralmente. são baseados em fenois alqullados, por exemplo.

ΛΟ-30. AO-31. ou AO-37. Os agentes antiestáticos dissipam a eletricidade estática e evitam faísca». O Síadis 450 com ácido dinontlnaftilsulfdfoco íDINNSAi como ingrediente ativo., é sm exemplo, hubídores de corrosão, por cxeraplo, DCI-4A siiu usados para consbustívcís civis e militares e Í.X.3.-5A é usado para combustíveis rmiitares. Agentes 5 ESIl, Incluem, por exemplo, Di -EGM.E,

Uma solução é misturar os combustíveis de algas cora combustível de jato existentes. A presente invenção fornece uma solução deste tipo. Os lípíclios produzidos pelos métodos da presente invenção podem servir como matéria-prima para produzir combustíveis de jato. Assim, em outro aspecto da presente, invenção um método para a 10 produção de combustível de jato e fornecido. Jiintamerae com dois métodos para produzir o combustível de jato a partir dos lipídios produzido» pelos tnélodos da presente invenção são fornecidos; craquearnento catalítico de fluido íFCC) c hidrodecxígenaçlfo OIDO).

L Craqueamento Cafoiítku Fluido

G Craqueatnento Catalítico Fluido (FCC) é um método que é utilizado pura 15 produzir olefmas, principalmente propileno de frações cruas pesadas. fiú relatas na literatura que os õlcos vegetais tais como o ôleo de canela poderíam ser processados através do FCC pura resultar em um fluxo de hidrocarbonetos útil como um combustível gasolina.

Cs hpídios produzidos pelo método da presente invenção podem ser convertidos 2Q em definas. 0 processo envolve o fluxo dos hpídios produzidos através de uma ?ons dst FCC e coleta dc uma conente de produto composta de olefinas, que é útil como um combustível de jato. Cs hpídios produzidos são contatados por cm catalisador de craqucamenio em condições de craqueamen-o para fornecer um fluxo de produto incluindo olcffoas e hidrocartxmetos úteis como combustível de jato,

Era uma modalidade preferida, o método para a produção de combustível de jato compreende (a? cultivo de um microorganismos contendo lipídeo utilizando métodos aqui descritos, tb} llse ds um microorganismo conteúdo lipídio para produzir um lisado. te> isolamento cio lipídeo do microorganismo Usado e (d) tratamento da composição lipídica, por meio dn qual o coimbustível de jato ê produzido.

Em uma modalidade preferida do método para produzir um combustível de jato, a composição lipídics pode ser fluida através de uma zuna dc eraqueamwto catalítico fluido, que. em uma modalidade, pode incluir a composição lipídica contato com um catalisador de craqvearnento em condições de craqueamerúo para fornecer um fluxo de produto uompsceadeado olefinàs Q-C»

Em cenas modalidades deste método pode ser desejável remover quaisquer contara mantes que podem estar presentes na composição lipídka. Assim, antes ds fluir a composição bpídiea através de uma zona de craqueamsnto catalítico fluido, a composição lipídka é pré-f:ratada, O prè-tratamento pode envolver o contato com a composição Epídlca ct>m «ma resma de trora idníctl. A resina de trova iõnica é «íiki resina de troca íônica A; ida, lal cosno Amherlysl^tM-l5 e pode ser usada corno um leito cm um reator através do qual a composição liptdíca é funda, tanto de fluxo descendente ou ascendente. Outros prétratamentos prtdem incluir lavagens ácido suaves, contatando a composição lipídiea com S um ácido, tal conto sulfórtco, acético, nítrico ui.t ácido clorídrico. Q contato é feito com uma solução de árodt; diluída normalmente à temperatura ambiente e pressão atraosfénca.

A composição lipfdsea, opcional mente pré-tralada, é fluida para uma zona de FCC onde os componentes hidrtrearbonâceos são craqueados pars olefinas. O eraqueanicnto catalítico è realizado pedo contato com a composição lipldlca cm uma zona de reação com 10 um catalisador composto de material partiettlado fmamente dividido. A reação é craqueada catalilicamente. ao contrário do hidrocr&queamemo, e é realizada na ausência de hidrogênio adicionado ou consumo de hidrogênio. Ã medida que a reação de craqueamento prossegue, quantidades substanciais de coque são depositadas no catalisador. O catalisador é regenerado a altas temperaturas, pela queima de coque do catalisador em tinta zuna de 15 regeneração. O catalisador contendo coque, aqui referida corno catalisador eoqueado, é cotitmusimeníe transportado tia zona de reação para a zona de regeneração a ser regenerada e substituído essenciainienle pelo catalisador regenerado livre dc coque da zona de regeneração, A tduidização das partículas de catalisador por várias correntes gasosas permite o transporte do catalisador eulre a z.íma de reação e zona de regeneração. Os 2Q métodos para o etaqueamenío de nidrocarboneios, tais corno os da composição lipídica descrita aqui, cm um fluxo fluidizndo rio catalisador, transportando o catalisador entre as zonas de reação e regeneração e fazendo a combustão do cuque no regenerador são tem conhecidos pw aqueles versados na técnica de processos de 1 CC. .Aplicações de FCC exemplares e catalisadores diets para o craqueamento da composição lipídka para produzir 25 olefinas CjXA são descritas mis Fat, US. Nos 6,338,16)2 7,288,685, que são incorporadas em sua totalidade por referetteia.

Em orna modalidade, e craqtieamento da composição lipidica da presente invenção, ocorre na seção ascendente, ou, alieniattvamente, ntt seção de íçamenlo, dst zona de FCC. A composição lipfdlca é introduzida na ascendente por um ideo resultando na evaporação 30 rápida da composição í ipídlea Aitres de entrar em contato com o calnlisador, a composição lipídica terá rtorraaímemo ame temperatura de cerca de 149'’ C a. 316'X',' t3(X.r· F a 600* F,t. O catalisador é fiuldo de um recipiente de mistura para a ascendente., onde, contata a composição lipídica por um tempo de cerca de 2 segundos ou menos.

Os vapores do c&ralissdor misturado e da composição Hpidiea reagida são então 35 de^earregados a partir do topo da ascendenle através de uma saída « separados em um fluxo de vapor de produto craqueadu inciròndo olcftnns e uma cr.deta dmi partículas do catalisador cobertas com quantidades substanciais de coque e geralmente referidas como 'catalisador cuqueado, Em um esforço para minimizar o tempo de contato da composição lipídiea e do catalisador, o que pode promover a conversão adicional dos produtos desejados para outros produtos indesejáveis, qualquer arranjo de separadores, tais como ura arranjo de braço de redemoinho pode ser asado para remover o catalisador coqueado do fluxo de produto rapidamente. O separador, por exemplo, separador de braço de redemoinho, está localizado em uma porção superior de atua câmara cora uma zona de. separação situada na porção inferior da cântara. O catalisador separado pelo arranjo de braço de redemoinho desce para a sorta dc separação, O fluxo de vapor do produto cxaqoeado compreendendo os hidrocatbonetos craqueados, incluindo okdutas leves e algumas saídas de catalisador da câmara através de um conduto que está em comunicação coot os ciclones. Os ektlones removem as partículas catalisadores restantes do fluxo de vapor do produto para reduzir as concentrações de partículas para níveis muito baixos, O flttxo de vapor do produto, em seguida, sai do topo do recipiente de separação. O catalisador .separado pelos ciclones ê retomado para o recipiente de separação e depois para a zona de separação. A zona de separação remove os hidruearbunetus adsorvidos da superfície do catalisador, pelo contato oontta-ootrente com o vapor.

Λ baixa pressão parcial de hidrocarboneto opera para favorecer tt produção de olcfinas leves. Assim. a pressão ascendente 6 ajustada para aproximadamente de 172 a 241 kPa t.2.5 a 35 psta) com uma pressão parcial de hidroearhoneto dc cerca de 35 a 172 kPa (5 a 25 pala), com uma pressão parcial de htdrocsrboseto preferida de cerca de 69 a 53H kPa flü a 20 psnt). Esta pressão parcial relsüvamente baixa de hidrtxtarbonetos é conseguida através dst uso do vapor, corao uttt diluents na medido em que o solvente é 10 u 55 % em peso da composição lipídicra e preferivelmente de cerca de 15% em peso dtt composição de Itpídtos. Cubos solventes, como o gás seco podem ser usados para alcançar pressões parciais de hidíocmbooeto equivalentes.

Λ temperatura do fluxo craqueado na saída ascendente será de cerca de 510’% a 62Γ€ (95(51⁷ a 1150T). No entanto, as temperaturas tltt saída ascendente acima de 566%' (1050% fattens o gás mais seco e mais olefmas. Considerando que, as temperaturas da saída ascendente abaixo de 565% (IO5OT6 fazem menos de edlerto e propilcno. Assim, é preferível executar o processo de FCC. a uma temperatura preferida de cerca de 566C u 63ίΥ%, pressão preferida de cerca dc 138 kPa a cerca de 24Í.1 kPa (20 a 35 psla). Outra candtçãe para o processo é o catalisador para a rarilo da composição iipídiest que pode variar de 5 a cerca de 20 e, da preferência tie cerca de 10 a cerca de 15.

Em uma modalidade do método para, produzir ura combustível de jato, a composição lipídiea é introduzida na seção de içametxlo de o reator FCC A temperatura na seção de içameato será rnuilo quente, e variará de cerca de 700% (1292'T; a cerca de 700'%: (MOOT) es*m utn catalisador para a razão da composição liptdiea de aproximadamente IIX) a cerca de 150 Prevê-se que a introdução da composição bpídica na seção de içamento prodsizirã quantidades considera vás de proptleno e otlleao

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Qs produtos de hsdrocartsoneto gasosos e líquidos produzidos podem $er analisados pela ctomatourafia uasosa, HPLC. etc

2. Hidrode&oxigermçSo

Etn outra modalidade do método para produzir um combustível de jato utilizando a composição lipídlca ou os lipídios produzidos como aqui descrito, a estrutura da composição lipídica ou os lipídios ê quebrada por eus processo denominado h l d rode sox i ge t taç ao í ΗIX)).

HDO significa a remoção de oxigênio por melo de hidrogênio, ou seja, o oxigênio é removido ao quebrar s estruturado material. Ligações duplas olefínícas <ao hidrogenadaae 10 qualquer composto de enxofre e nitrogênio é removido. A remoção de enxofre é chamada Uidrogenodessulfurização (HDSp O pré-tratamento e pureza das matérias-primas ícomposição lipídica ou lipídios) contribuem para a vida útil do catalisador..

Geralmenfe na mapa de HIX)/HI'3$, o hidrogênio é misturado com o estoque de alimentação «composição llpidlea ou Hpídius} e, em seguida, a mistura ê passada através de 15 um lestet catalisador como um fluxo co-correntc, ou como uma tirnca fase ou uma fase de dois estoque de alimentação. Após a etapa dc 111X)/M1>5. a fração do ptodulu é separada e transferida para um reator de isontertzaçtto separado, tlm rearor de isomenzação de material de punida biológico ê desento na literatura (F.l 190 243} como reator cu-correute,

Q processo para & produção de um combustível pela htdrogenaçâo de uma 20 alimsmtação de hidrocarbonetos, por exemplo, a composição Hpídkít ou cs lipídios, também pode ser realizado pela passagem da composição lipídica ou lipídios como fluxo co-corrente com o gãs hidrogênio através de uma primeira zona de hidrogenação e, posteriormente, o efluente de hidrocarbonems é ainda hidrogeoade em uma segunda zona dc hidrogcnação, passando o gás de hidrogênio para a segunda zona de hidrogenaçào como 25 ura ilnxo contra-corrente cm relação ao efluente do hldrrjearbonelos. .Aplicações dc HIM) exemplares e catalisadores úteis para o eraqueamemo da composição lípídíca para produzir definas C;-C$ são descritas nu Pm. US. No. 7,232,935, que é incorporada em sua totalidade por referência.

Nermaímenle, na etapa de hidrudesoxigeaação. a estrutura do componente 30 biológico. como a composição lipídica ou lipídiov. è decomposta, compostos de oxigênio, nitrogênio, fósforo e enxofre e. hidrocarbooetos levas, como gás são removidos, g s.s ligações ofefímcas são hidrogeuadaa. Na segunda etapa do processo, ou seja, oa etapa chamada de isomerização, a isomerízaçào é realizada pela ramificação da cadeia de hidrocaxboneio e medmra do desempenho da parafina cm baixas temperaturas,

Na primeira etapa, l.stu ê, etapa ΗΓΧ) do processo dc sraqueamento. o gã.s de hidrogênio e a composição íipidka ou lipídios que são paru ser hidrogeraidos rifo passados para, um sistema de leito cahdtsudor de HDO, quer como fluxos coreursente. ou contraeooente, tal sistema de leito catalisados' compreendendo um ou mais catalisadores de leito.

wi2?

de preferência I-3 leitos catalisadores. <9 etapa HDO normalmcnte ê operada em uma traineira co-corrente. No caso de ura sistema de leito catalisador HIX> compreendendo dois o» maix leitos catalisadores, um «m mais leitos podem ser operados usando o princípio do fluxo contra-corrente.

Na etapa de FIDO, a pressão varia entre 20 e 150 bar, de preferência entre 50 e 100 bar e a temperatura varia entre 200 e 50(FC, de preferência na faixa de X.KM00°C.

Na etapa de HDO, catalisadores de hidrogetiação conhecidos, contendo metais do Grupo V.l.1 e/ou VIB do Sistema Periódico podem ser usados. Preferivelmente. os catalisadores de hitbogeaação são Pd. Pt. Ni. NiMo suportados ou um catalisador CoMo. o 10 suporte sendo de alumina e/oe silica, Nurmaimente, catalisadores Ntfdo/AljQr e CoMo/AhO.í são utilizados.

Antes da etapa de HDO. s. composição lipidica ou lipítítos podem, opcionalmenre. ser tratados pela prehidrogenação sob condições mais suaves, evitando reações colaterais das ligações duplas. Tal prebidregenação é realizada na presença de uni catalisador de 15 preliidrogeaaçâo a temperaturas de 50 40QT e cm pressões de hidrogênio dc 1 290 bar. dc preferência a uma temperatura entre 1S<Pe 25(PC e a uma pressão dc hidrogênio entre 10 e 100 bar. O catalisador pode conter melais do Grupo VHl c/ou VIS do Sistema Pedódko. Prefcnvelraeule, o catalisador de prehidrogenaçãu ê um Pd. Pt, Ni. NiMo suportado ou um catalisador CoMh. o suporte sendo dc aitimumi e/ou silica.

Um fluxo gasoso a partir da etapa de HDO contendo hidrogênio é resfriado e, em seguida, o monóxido de carbono, dióxido dc carbono, nitrogênio, fósforo e compostos de enxofre, hidrocarbonetos leves gasosos s outras impurezas são removidas do mesmo. Apôs a compressão, o hidrogênio purificado ou hidrogênio reciclado s devolvido para o primeiro leito catalisador e/ou entre os leitos catalisadores para compensar o fluxo de gás retirado. A 25 água ê retirada do líquido condensado, Ü liquido é passado para o primeiro leito catalisador nu entre os isitus catalisadores.

Após a etapa de HDO, o produto <* submetido a uma etapa dc ísomerizaçlio Ê importante para q processo que. a* impurezas sejam removidas >> mais eompíemmente possível ames que os htdrocarboneios sejam contatados com o catalisador de isomerizaçâo. 30 A etapa de isomerização compreende uma etapa de divisão opcional, onde o produto da reação da etapa de HDO pode ser purificado pela divisão com vapor de água ou um gã» adequado, tal como hidrocarixmeto leves, nitrogênio ou hidrogênio, A etapa de divisão opcional ê realizada em forma de contra-corrente em uma unidade a mcníauíe do catalisador de isomeriração, onde o gàs e liquido estão eni contato am com o outro, ou 35 antes do reator de isomerizaçãu real em unia unidade de divisiio separada utilizar o princípio contra-eoreente.

Após α etapa de divisão do gás de hidrogênio e composíç&o Iipidiuo hidrogen&da ou lipídios, c opcional mente., uma mistura dc n-paxaíma» srio passados para uma unidade dc ísomerizsçào reativa compreendendo um ou vários leitos catalisadores. Os leitos catalisadores da etapa de isomerização podem operar tanto de maneira eiKwrrtilr ou corara -corrente.

E importante para o processo que o princípio do fluxo cumra-corrente seja aplicado aa etapa de isoraerízação. Na etapa de. i^omerízaçâo isso é feito através da realização on da etapa de divisão ou etapa de reação de isoraerização ou ambas, em forma conira-corrente,

A etapa de isoracri ração e a etapa de FIGO pode?» ser realizadas ao mesmo rccípirauc de pressão, ou mesmo era recipientes de pressão separados, A prehidrogenação opcional pode ser realizada em tim reciplerae de pressão separado ou no mesmo recipiente 10 de pressão do que o das etapas de isomerizaçãtt e HDO.

Na etapa de isomerização, a pressão varia entre 20 e 150 bar, de preferência na faixa de 20 KX1 bar e a temperatura varia entre 20(1 s 500'C, de prelcrêtreiit na fttixtt de

Na etapa <k isotneriraçào, os catalisadores de isoraetização conhecidos na técnica 15 podem ser usados. Os catalisadores de isomerização adequados content peneira trmtetulat e/ou um metal do Grupo Vil e/ou «m transportador. lAefcreticiídmranc, o catalisadot de ísomeriração contém SAFO-11 ou S.APO41 ou ZS.M-22 ou ZSM-23 ot; ürricrita p Pt, Pd ou Ni e Al_:;Q? ou SK)_:i. Catalisadores de isomer-zaçào típicos são. por exemplo. 1VSAPO1 l/AhO.>, FuZSM-22?ANO₃, Pt/ZSM-23/AbO:_k e Pl/SAFQ-n/SiO_s.

Como o produto, ura componente de hidrocarbonetos de alta qualidade de origem biológica, utli eorao ura combustível diesel par» motores ou um componente do mesmo, é obtido, a densidade, o índice de cetane e desempenho em baixas temperadas do componente de. hídrocaxbunetos sendo excelente».

I.X., ENGENHARIA DE MICRÓBIO

Couto mencionado acima, em certas modalidades da prescrtlc invenção é desejável modificar geneticamente not microorganismo para aumentar » produção de lipidios. modificar as propriedades ou as proporções dos componentes gerados pelo microorganismo, ou para melhorar ou fornecer características de creseiuiento de novo era uma variedade de materiais de matérias-primas, CVífervfhtt, particiíl&rmenre Ctóveòo pmiorhccon/e.r, <.'Μλ?5ϊ OiiWnAt çoroéõtían^, CA/mWAi rílipso/deri,

C/i/orN/w .>/>,. e O/ora&i emerarmif são microorganismos preferido para o uao dos método» de engenharia genética aqui descritos, embora outras espécies de Chhw&i, assim como outras variedades de microorganismos podem ser uttiizadoa.

Promotores, <N.>:NAs e 3'UTRs, beto cento outros elementos dos setores, podem ser 35 gerados através de técnicas de clonagem a partir de fragments isolados de forties nativas (ver, por exemplo Molecular Ckmrag: A Laboratory Manual, Sambrook et al. {3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press; e Patente US, 4,683,202). Alwniativamente. os elementos podem ser gerados sintetícameme utilizando métodos conhecidos (ver, por exemplo, Gene. 1995 Oct 16:164(1):49-53).

Q DNA codificando um polipepíídeo a ser expresso em um microorganismo, por 5 exemplo. uma lipase e marcador seleeionávei são preferencial me me cDNA de eódonotimizado, Gs métodos de recodificação de genes para expressão em raicro&lgas são descritos na Patente GS. 7335.290, informações complementares para a otimização do cõdon estão disponíveis, por exemplo, no banco de dados de aso de codon do GenBank, Como exemplos não-Hmitantes do uso do cddoa, em C/aGre/íu pjrew/dosm fAmmhGG.

Wrâ<<\ e C/r/orei/a pro/arÃecwá&s sào apresentados nas Tabelas 10, 1.1 e 12. respectivamente.

'Fabela 10. Uso dtscódon em C/dore/âz pyrouídam'.

Põe	UGU	39(0.32}		Ser	GCG 50(1.04}
	uuc	56(1.18)		ucc	(BiiiÉIilillliillllí
Leu	UGA	10 (0.20}			GCA 6 < 0.96}
	GUG	46(0.91)			UCG 43 (0.89)
Éiii	UAI?	15 (0.59)		Cvs	UGU 46(0.77?
	UAC	36 (1.41)		ÜGC
	UAA	9 (0.00?		ter	UGA 43 (O.OOí
	GAG	15 (0.00)		Txp	GGG 69(1.00)
Leu.	cuu	49 (0.97)	Oro	CCG	lOilÉBlIlllllllllll
	cue	73 (1.45)		ecc
	CCA	22 (0.44)		CCA	?Í3ÍlÍdf?Í?Í?Í?Í??i
	CUG	103 <2.04}		CCG
MÉil	CAU	50 (0.88)	Arg	CGU	?í39:OWiÍÍIÍÍÍÍ)llÍÍ
	CAC	3 ÍÍ.12)		CGC
Gin	CÂÀ	59 (0.84)		CG A
	CAG	2 (1.16)		CGG
	AUG	24 (0.69)		'Fhr	.ACU 32 (0.67)
	ÀUC	61 (1.76)		ACC
	AUA	19(0.55)			ACA 41 (036)
Met	AUG	42 (1,00)			ACG 41 <0.86}
Asn	AAG	26 (0.75)		Ser	AGG 23 (0.48)
	AAC	3 (i.25)		AGC	(ilieilllllllll
Lys	AAA	32 (0.54)		Arg	AGA 51(1.00)
	AAG	86 (.1.46)			AGC 61 G.19)
Vai	GUU	36 {0.75)		Ala	GCG 57 (0.79)
	ÜUC	54 (1.13)		GCC
	GUA	30 10.63)			GCA 89(1.23)
	GUG	71 (1.49)			GCG 47(0.65)
Asp	GAG	60 10.95 i		Gly	GGU 35 (0.60)
	GAC			GCC	ílIlCB):::::::::)
Glu	GAA	41 (0.68)			GGA 54(0.92)
	GAG	80(132)			GGG 67(1.15)

Tabula 11 Uso do Cddun Preferido rm ZJamsheBo srnbTre.
7TC (Phe· TGG (Trp) CKi (Leu) ?XAC (Atm) GCC (Ala? GAG (Glu)	TAG sTyr) CCC (Pro) CAG (Gin) AGC (Sen GAC (Asps	TGC (CyG CAC (MB) ATC (lie) ATG (Met) GGC (Gly t	TAA CGC ACC ÀAG GTG	illilill ^®ll!!l liillill
Tabela 12.	Uso do codon preferido	em Cids -rel.G ’mr/sresddva.
'FTC (FhM	TAG (Tvr)	TGC <Cvs)	TGA (Stop)
TGG (Tsp)	CCC l Pso)	CAC (His	CGC {Ara)
CTG (bm)	CAG (Gin)	ATC (lie;	ACC (Thr)
GAG (Asp)	TCC (Ser)	ATG (Met)	À.ÀG (Lvs)
GCC í Ahn	A AC (Asst)	GGC (Gly)	GTG (Vai)
GAG (Gin)

IL Prootistores (0001] Mmtos promotores sâo ativos em mleroalgas, incluindo promotores que Lio endógenos pare as sdgtts sendo transformadas, hem como promotores que uào Mo endógenos às algas rendo transformadas (ou seja, os promotores de outras algas, os promotores de plantas superiores, e os promotores da vírus de planta ou vírus de algas), Os promotores exógeaos e/ou euddgenos que são ativos em microslgas, e os genes de 10 rcsistèstcM a asuibMtio>s funcionais um microalgsis silo descritos, por exemplo, Curr Microbiol. 1997 Det;35(6):356-62 (Chlorella vulgaris?, Max Bioieehaol (N¥χ 2i'Xl2 Jan;4( )):63-73 (Chksrelia ellipsoides); Mol Gen Genet. 1996 Get 16,253(5x572-9 tPhaeodactylum tricornutom); Plaxtt Mol Bird. 1996 Apr:3l(l):l -12 (Volvos casteri); Ptoc Natl Acad Sei U 5 A. 1994 Nov 22:91(24):11562-6 (Volvos carters}; Faíeiamre A, Caxotft 15 R, Ubtane C, Abreseia C, Bowler C, PM1D: 19383998. 1999 May;1 (,3):239-251 (Laboratory of Molecular Plant Biology. Staxione Zoologies, Villa Comnnaíe, 1-81)121 Naples, Italy) (Phaeodaciylnm triconiutum and Thalassiossra svmssHognj; Plant Physiol. 2(.8)2 May:129(1):7-12, (Porphyridium sp.): Proc Nat) Acad Sei 1.1 S A. 290.3 Jan 21;l(X)(2):43?F42. (Chlamydomonas reiitbardtii); Proc Natl Acad Set (.1 S A, 1999 20 Feb;87(3.X 1238-32. (Cidamydomoaas rerêhtudtii}; Nucleic Acids Res, 1993 Jun

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O promotor usado para expressar urn gene exógeno pode ser o promoter naturabnentc ligado àquele gene ou pode ser um gene heterólogo. Alguns promotores sào ativos em mats de uma espécie dc niicroalgas. Outros promotores sito específicos dc espécie Os promotores preferidos incluem promotores como RBCS2 de C/iármyrtrwwmm' refo.foí.ofo? e promotores virais. como o viras do mosaico de couve-flor (CMV) c virus chiorella. que foram mostrados ativos em múltiplas espécies de microalgas (ver, por exemplo.Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-l 1):727-35:.) Microbiol. 2ÍX)5 Aug;43(4):361-3; Mar Biotechnol (NY), 2002 Jan;4( 1):63-73). Em outras modalidades. u promotor da mulato desidrogenase ^íuryotOcruí, como um ácidn nucléico compreendendo qualquer parte da SEQ ID NQ: 3. ou o promotor RBCS2 de Cé/uwydemon/ts reritofa) (SEQ LO NG: 4} pode ser asado. Opcíonalmente, pelo menos. 10, 20. 30, 40. 50 ou 60 nucleotídeos ou mais dessas sequências contendo um promotor sào utilizados, Gs promotores preferidos endógenos a espécie» du gênero Odoreltó sâo SEQ ID NO: l e SEQ ID NG: 2,

Os promotores preferidos useis para a expressão de genes exdgeuos em OtròreQ? sâe- listados na listagem de sequência deste pedido, tal como o promotor da gene Cá/oro/Yi HUPí (SEQ ID ΝΏ: l) e o promotor de nnrato redutase de Otròre&j e/i/prorn'en (SEQ ID NO: 2). Os promotores do vírus Cbloreila também podem ser usados para expressar genes na CMwílu, tal como as SEQ .10 NOs: 1-7 da Patente US. 6,395,965, Promotores ativos adidcmiia na CrosxreYrj podem ser encontradas, por exemplo, em Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14:204(1): 187-94; plant Mol Biol. 1994 Oet:26( I ):83-93: Virology, 2004 Aug 15:326(1): 150-9; and Virology, 2004 Jan 8;318(1 ):214-23,

CQualquer de uma grande variedade de marcadores sedeeionávei» podem ser empregados em um cosrstrueto tratixgénicn útil para transformar Cà/oreZfe, Exemplos de marcadores selecionáveis adequado incluem o gene do nitrato tedusase. o gene èa hlgromicina fosfinrausferase (I-1PT). u gene da neomsema fosíotransferaxe e o gene bie, que confere resistência ã fleomicina. Métodos de determinação da sensibilidade aos antibióticos de rraeroalgas xâo bem conhecidos. Por exemplo, Mui Gen Genet, 1996 Oct 16:252(3 ):572-9.

Mais espeeificamente, Dawson et si. M997). Current Microbiology 35:356-362 «'incorporado por referência, em sua totalidade?, descreveu o uso do gene nitrato redutase (NR) a partir da Oiróra/Rf vuígnris reino mn marcador selecsonáve! para mutantes de CÃforcífo szwAwrma deficientes em NR. Kím et al (2(X12), Mar Biotechnol. 4:63-73 5 (incorporada per referência, em sua totalidade}, descreveu a utiliragífo do gene HPT corno um marcador scleeioaáve! para transformar Chood/íí eífi^nãréa. Huang et al 12007), Appl Mtctohiol Bloteclrool. 72:197 -205 linemporado por reíercucia, cru sua totalidade?. relatou o tro dc Sh bie coroo um marcador seleelonável para Còròrefm xp. ΡΓ.

D. Expressão Induzívd

A presente invenção também fornece o uso de um promotor induzível para expressar um gene de interesse. Em particular, o uso de um promotor induzível para expressar um gene de lipase permite a produção da lipase, após o crescimento do microorganismo quando as condições foram ajustadas, se necessário, para aumentar a transesterificação. por exemplo» seios o rompimento das células. redação do teor de água da mistura da reação, e/ou adição de álcool suficiente para acionar a conversar! de TAGs para os êsteres de ácidos graxos.

Promotores induzíveis úteis na invenção incluem aqueles que medram a transcrição de um gene ligado operavalmente em resposta a um estímulo, como ama pequena molécula fornecida exogenameate {por exemplo, glicose. como na SEQ ID NO: l). temperatura 20 tcaior ou frio? luz, etc. Promotores adequados podem ativar a transcrição de um gear silencioso essencialmemc ou supet-regular, dc preferência, substanclalrnente. a transcrição de utn gene operavelmentc ligado que é transcrito em um baixo nível, Neste último caso. o nível de transcrição da lipase preterivglmeate, não imerferc significativameme no crescimento do mkrorganismu no qual é expresso.

A expressão dos transgenes na Gt/oreífo pode ser realizada por indução através de promotores, ec>mo o promotor que aciona o gene transportador dc hexose Oforrilo t-SEQ ID NO: l). Esse promotor é fortemeate ativado pela presença dc glicose ao rocio de cultura.

& lx.iw^

Além disso, um microorganismo geneticamente modificados, como uma microalga.

pode compreender e expressar dois ou mais genes sxdgetios. como, por exemple, uma lipase e um gene liimo, por exemplo, ura codificando uma enzima de degradação de polissaearídeo. Uni ou ambos os genes poderá ser expressos usando um promotor reduzível. que permite o ainorcrásmu relativo da expressão desses genes a serem controlados para aumentar a produção de llpídios e conversão em estores dc ácidos graxas. A expressão de dois mais genes esogenos pude estar sob o controle do mesmo promotor reduzível ou sob controle de diferentes promotores induzíveis. Nesta última situação. a expressão de urn primeiro gene exógeno pode ser reduzido por uro primeiro período dc tempo (durante o qual a expressão de -mi segundo gene exógeno pode ou não pode ser iaduzida) e a expressão de um segundo gene exógeno pode ser induzida por um segundo período de tempo (durante o qual a expressão de um primeiro gene uxõgeno pode ou uào ser induzida.·, São fornecidos aqui vetores e métodos de engenharia de micróbios de 5 produção de lipídios para metabolizar a sacarose, que c ama característica vantajosa, pois permue que as células geneticamente modificadas convertam matérias-primas de canâ-dcaçàcar em iipldios.

Também sào fornecidas aqm cepas geneticamente modificadas de mimoorgamsrnos (per exemplo, micrualgas, levedura oleaginosa, bactérias ou fungos), que expressam dois 10 ou mais genes exigence, corno,, por exemplo, uma tíoesterasc aed-ACP graxa e uma aeiiCoA graxaÁddcido redutase, a ação combinada das quais produz um produto de álcool. Além disso, são fornecidas outras combinações de genes exõgenos, incluindo, sem limitação.: uma tioestera.se act FACE graxa e uma reduiase íum-OuA graxa para gerar aídeídos. Além disso, este pedido fornece a combitntçáo de uma ’loesterasc adlACP 15 graxa, unis redulase acil-CoA graxa, e um aldeído decarbonilasc graxo para gerar alcanos.

Uni ou mais dos genes exógeuos podem ser expressos através de ura promotor indszlvel.

Exemplos de modificações adicionais adequadas pana o uso na presente invenção $âo incluir cepas geneticamente modificadas de oúcro&lg&s para expressar dois ou mais ganes exógenos, um codificando um transportador ds uma fonte de carbono fixa (como a 20 saexrose) e um segundo codificando uma enzima sscarose invertase. Os organismos fermentavais resultantes produzem hidnxiarbonetos no menor custo da produção do que foi obtido pee métodos previamente conhecido -de produção tie hidroeurbotreíos biológica, A Inserção de dois genes exógenos descritos acima pode ser combinada com a divirilo da biossintese dos polissacarideos através da mmagèncse direcionada dou aleatória, quo 25 indtiz o fluxo de carbono cada vez maior na produção dc hidrocarbouctos. Individualmente e cm combinação, a conversão ttófiea, eitgcahatia para alterar a produção dc hidrocarbonefos e tratamento com saziuiau exdgattas alterara a composição de hidrocarbotmtos produzida por uni rnlctoorgmiisrao. A alteração pode ser uma mudança na quantidade da hldrocarbonetos produzida, a quantidade dc uma ou mais espécies de 30 hidrocarboneios pxoduzlda era ralação a outros hidrocarbonetos, e/ou os tipnx de espécies de htdrocarfxmetos produzidos no microorganismo. Por exemplo, as mlcroalgas podem ser projetadas para produzir uma maior quantidade e/ou percentagem de TAG»,

F, Expressão Uoqmariimeníada

A presente invenção também fornece s expressão couipartinisratada de urn gene de 35 interesse. Em particular, prale scr vnmajoso, cm modal idades particulares, direcionar a expressão da Upare. para um ou mais compartimentos celulares, rmde ê seqdestrado da íuaiorra Óo.s .lipidcoa celulares até a Início da reação de transesrerlficação. As urgandas preferidas para direcitmamento são clomplastos, mttocôndnas e .retréulíx tmdoplaxtnáüco.

1.Expressão em Cloroplastos

Em uma modalidade da presente invenção, a expressão de um polipepudeo de um microorganismo é destinada aos cloroplastos. Métodos para direcionamento da expressão de um gene heterõlogo para o eloroplasto são conhecidos e podern ser utilizados na 5 presente invenção. Os métodos de direcionamento de produtos de genes estrangeiros em cloroplaslos são descritos em Shrier et aí, EMBO J. 11985) 4:25 32. Veja também Tomai et ai. Gen. Biol Chem. (1988) 263:15104 15109 e Pat US. No. 4.940.835 para o uso de peptídeox de trânsito para & transposição de produtos dc gene nueiear para o ckuoplasto. Os métodos para direcionar o transporte de proteínas para o eloroplasto também são IO revistos cm Kenauf T1BTECH (1987; 5:40 47, As seqüênaas de direcionamento de cloroplastos enddgenas a CTtfereZàr são conhecidas, tais como genes no genoma nuclear da CWortoí que codificam proteínas que são direcionadas para o eloroplasto. ver. por exemplo, números de acesso ao GenBartk AY646I97 c AF499684.

Wageniagen URPIant Research International vende um veto? 15 l.MFv\C'lVECrORL-l_; que utiliza a sinal de secreção da proteína da snbmédítdu pequena de do Chrysanthemum morifolium para entregar anta proteína heteréloga rto ambiente de estrema do eloroplasto (ciíoplâsmjco), transportando através de um sistema de membrana dupla. A proteína é fundida os primeiros 11 aminoàcidos da proteína de rubtsco madura, a fnn de permitir o processamento adequado do sinal do peptideo (Wong et al. Plant 20 Molecular Biology 20: 81-93 (.1992)). O sinal do peptídeo contém um intron natural do gene RbcS.

Em outra abordagem. o genoma do eloroplasto ê geneticamente modificado para expressar a proteína heteréloga. A transformação estável dos cloroplastos de C/t/uBsyírówíWtó' reán.Wriró' (tuna alga verdes asando o bombardeamento de células 25 receptoras com mícroprojéieis de tungsténiu de alta velocidade revestidos com DNA estrangeiro foram descritas. Veja. por exemplo, Boynton et al. Science (1988) 24t): 1534 1538: Blowers et al. Plant Ceil (1989.· 1:123 132 e Debtrchy et ai., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809. A técnica de transformação, usando micrioprcyéteis de fungstênóx ê descrira cm Klein et al.. Nature (London; (1987) 7:70 73. Outros métodos de transformação de 30 cloroplastos de ambas as plantas e microalgas são conhecidos. Ver, por exemplo, as Patentes US. 5.693.507, 6.680.426 « Plant Physiol. 2002 Mity;l29í 1):7-12: and Plant Biotecbnol 1. 200? May;5(3).402ri2.

Conforme descrito aa Patente US No. 6.320.101 (expedida em 20 de novembro de 2(X)1 para Kaplan et aí.; que é incorporada aqui por rcfeíímetaX as células podeus soí' 35 tratadas quimicamente. de modo a reduzir o numera de eloraptastos por célula para ccrea de um. Em seguida, o ácido nucléieo heterúíogo pede ser inrroduzido dentro das células através de bombardeamento de partículas, com o objetivo de introduzir pelo menos ama molécula de ácido nucléico heterdlogo nos eloroplastos. C) ácido nucléico heterúlogo é selecionado lai qua seja integrável no genoma do cloroplasto através de recombinaçao homóloga, que c fácilmente efetuada por enzimas inerentes ao cloroplasto. Para esse efeito, o ácido nucíêico heteróíogo inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma seqtiéncia cie ácido nucleko que ê derivada du genome do cloroplasto. Além disso, y ácido 5 nucléico heterólogo normalracnte inclui um marcador selecionâvel. Mais detalhes relativos a esta técnica são encontrados nus Patentes (JS. Nos. 4.945.050 e 5.603.507, que siso incorporadas aqui por referenda. Um polipeptídeo pode ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto.

A Pítteute US, No. 7.135.620 (expedida em 14 de novembro de 2006 para Daniell et 10 ah; mcotporada aqui pm referência) descreve vetores de expressão do cloroplasto e métodos relacionados. Cassetes de expressão são eosstructos de D.NA, incluindo uma seqüêneia cie codificação e seqüéncias tie controle adequadas para fornecer expressão própria da sequência de codificação na cloroplasto. Cassetes de expressão típicos incluem as seguintes componentes: a região 5 ' não traduzida de um gene de microorganismo ou 15 gene de cloroplasto como psbA que irá fornecer a transcrição e tradução de ama seqtiéncia de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse do cloroplasto. ama sequência de DNA que codifica ura polipeptídeo de interesse e uma região de terminação de translaçâo < de transcrição, tais como uma região de repetição 3‘ invertida cie. um gene de cloroplasto que pode estabílirar o RNA dos genes introduzido*. reforçando assim a expressão do gene 25 estrangeiro, O cassete pode opcionalmente incluir um gene de resistência a antibióticos.

Normalmenle, o cassete de expressão è tlanqueado por sítios de restrição convenientes para a inserção em tnn genoma adequado. O cassete de expressão pode ser Üanqueado por sequências de DNA a partir do DNA do cloroplasto para re.cil.itar & integração estável do cassete de expressão no genoma do cloroplasto, em especial por 25 recombmsção homóloga. Altemativamente, o cassete de expressão pode permanecer não integrado, nesse caso, o cassete de expressão lipíctrarettin inclui uma origem tie replicaçáo do cloroplasto, que é capaz de fornecer a replicaçáo do DNA neterélogo no cloroplasto.

O cassete de expressão em geral, inclui utna região promotora de ura geuc capaz da expressão no cloroplasto. A região promotora pode incluir os promotores obteníveis dos 30 genes do cloroplasto, como o gene psbA do espinafre oti ervilha, ou ã região promotora rbcL a atpB de milho e promotores de Rrna. Exemplos de promotores são descritos em Haniev-.Bovvf.loia e Chua, TIBS (1987) 12:57 70; Mullet et s.1. Plant Moíec Biol. ti 985) 4: 39 54; Haníey-Bowdoin (1986; PhD. Dissertation, the Rockefeller University.·; Krebbers st al„ Nucleic Acids Res. 11982) )()_: 4985 5002; Zurawaki st al.. Nucleic Acids Res. 11981) 35 9:3251 3270; e Zurawsks et al,, Prue, Nat‘1 Acad Sei. U.S.A, t'1982) ?9; 7699 77()3, Outros promotores potfem rer ideatii'iettdns e a força relativa dos promotores assim ideais ficados avaliada, pela colocação de um promotor de interesse 5’ em um gerre de marcadot sem promotor ? observação da sua eficácia era relação a transcrição obtida a partir de, pox

89/127 exemplo, promotor do gene pshA. um promotor de doroplasto relativ&mente forte, A rilciicíít da expressão do gene heterológo adicionaimente pode ser melhorada por qualquer uma de uma variedade de técnicas. Estes iaeiuem o uso de vários promotores inseridos em tandem 5' para a gente heterdloga, por exemplo, um promotor de psbA duplo. a adição de 5 sequências intensificadciras e similares.

Numerosos promotores ativos no eloroplaxto de Cúínrídío podem ser usados para a expressão de genes exógenos no cloropíasto de Cáferc/Zs . tais como aqueles encontrados nu numero de acesso ao GenBaak NC„OO 186.5 (cloropíasto Otloreífe i-a/gorór. genonta completou

Ottde for desejado fonteoer a expressão mduzível do gene hetetologo, um promotor reduzível e/ou tuna região não traduzida 5’ contendo uma sequência» que fornecera regulação no nível dc transcrição e/ou tradução (na extremidade 3') pode ser incluída ao cassete de expressão Por exemplo, a região não traduzida 5' pode ser de um gene onde a expressão ê regulável pela luz. Da mesma forraa. a.s regiões repetida* invertidas ,V 15 poderíam ser usadas para estabilizar o RN A de genes heteréiogos. Os genes induzívm podem ser identificados pela expressão aumentada em resposta a um estímulo particular de interesse e expressão baixa ou ausente na falta de estímulo. Por exemplo, um gene iaduzível pela luz pode ser identificado, onde a expressão intensificada ocorre durante a irradiação com luz, enquanto a expressão substancialmente reduzida ou nenhuma 20 expresvãu ocorre em baixa, ou nenhuma luz. ProrautOtes regulados pela luz a partir de rmcroülgtut verdes são conhecidos (ver. por exemplo. Mol Gene· Genomics, 2005 Dcc;274(6):625-36>.

A região de tenmnaçüo que é empregado será prmcipalmcnte ume de conveniência, já que a região de terminação parece ser relativamente iatercumbiáveí entre cloropiastos e 25 bactérias. A região de íersttittaeão pode ser tntti va da região de iniciação do transcrição, pode ser nativa ds sequência do ÜN.A de interesse, ou pode ser obtida de outra, fonte. Ser, por exemplo. Chet; and Orozco. Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411..

Ox cassetes de expressão podem ser transformados em anta célula vegetal de interesse por qualquer um dos vários métodos, Estes métodos incluem, por exemplo, os 30 métodos bioltsõcos (Ver, por exemplo. Sanford, Trends in Biotech. í 1988} 6:299 302, Patente U.S. No. 4.945.050; eletroporação t'Eromm et al. Proc Nath. Acad. Sei. USA,} (1985·ι 82:5824 5828}, uso de um feixe de laser, microinjeçào ;m qualquer outro método eapaz.de introduzir o DN.A em um cloropíasto.

Descrições adictonais de vetores de expressão dc cloropíasto adequados para uso 35 em mlcrorg&nismos como microaigas são encontrados nas Patentes US- Nos, 708156?

(expedida era 25 de julho de 2006 para Xue et al.n, 66804'26 (expedida cm 20 de janeiro de 2004 para Dauiràl et al.) e ,5693507 {oqxdids em 2 de dezembro de 1997 para Daniell et lllllilllllllllllllllllllllllllillli^

9ÍV127

As protómas expressas no genoras nuclear de Chtore/fo podem ser direcionadas para o clotopíaste usando sinais de direcionamento de cloropiasu). As sequências de díree-iortameπιβ de elorophtstos endógenas a Chlorella são conhecidas, tais corno genes no genorna nuclear da Chlorella que codificara proteínas que são direcionada.* para o 5 cloroplasto, ver, por exemplo, números ds acesso au Genfiank AY646197 e AF499684. As proteínas também podem ser expressas nu eloroplasto de Cãforeik pela inserção ds genes diretamente no genoma dc eloroplasto. A transformação do cluroplastos ocorre noanalmente através de reeombinação homóloga, e pode ser realizada se as sequências do genoma do clotoplasto forem conhecidas pm criação de vetores de direcionamento (ver, 10 por exemplo, a sequência do gcaoma completa de um eloroplasto de Chfore/fo; número de acesso go Genfiank NCJXH865). Veja as seções anteriores pare mais dentfhcs da transformação do eloroplasto.

2. Expressão n» Mitoeõndri»

Em outra modalidade da presente invenção, a expressão de um polipeptídeo de um 15 microorganismo é destinada á mitocôndria. Métodos para direcionamento de produtos de gene estrangeiro na mitocôndria (Boutry et al. Nature (London) (1987} 328:340 342) foram descritos, inclusive em micrcalgas verdes (ver. por exemplo, Mol Gen Genet. 1993 foa;236( 2-3):235-44).

Por exemplo, um vetor de expressão que codifica um sinal de secreção adequado 20 pode ter tomo alvo uma proteína heterofologs para a mitoeóudria. O vetor IMPACT VECTOR 1.5, de Wageningon UR-Pbrat Research International, usa o sinal de seer-r.çào CoxlV da levedura. que foi mostrado para fornece·· proteínas na matriz mltocondrial. A proteína é fundida os primeiros 4 amlnoácidos da proteína CaxIV da levedura, a fim dc permitir o processamento adequado do sinal do peptídeo (Kohler et al.

Plant J lí: 613-021 (1997)1. Outras seqUêneuts de direcionamento mitucondriais são conhecidas, incluindo aquelas funcionais em mictoalgas verdes. Por exemplo, vsr FEES Utt. 1990 Jan 29:266(2): 165-8: e J Biol Chem. 2602 Feb 22:277(6):6031 -8.

As proteínas expressas no genoma nuclear de Cfeforafo? podem sei direcionadas para a mitocóndia usando sinais de direcionamento mitocôndrrais Consulte as seções 30 anteriores aqui para mais detalhes do direcionamento e transformação da proteína mitoctmdrial.

3. Expressão no Retícufo Endoplaamútico

Em otnra modalidade da presente invenção, a expressão de um polipeprideo de um microorganismo é destinada ao retículo endoplasmático. A inchísâo de trata retenção 35 adequada ou sinal de- classificação em um vetor de expressão garante que a,s proteínas são retid&s no reticule- endoplaaraático (ER) e não vão a jusante. no Golgi. Por exemplo, o vetor IMPACTVECTOR 1.3, de Wageningen UR-Plant Research Interactional, inclui o sinal de ehtsstlicaçâo e retenção KDEL bent conhecido. Com esto vetor, a retenção de ER tem uma vantagem prática «a medida em que foi relatada por melhurat «5 ni'v<ux de expressão sm 5 vezes ou mais. Λ principal razão para isso parece ser que o ER contém concentrações mais baixas e/ou diferentes proteases responsáveis pela degradação póstraducíonal das proteínas expressas que estão presentes no citoplasma. Os sinais de 5 retenção do HR fottcional cm micraalgas verdes são conhecidos. Por exemplo, ver Free

Natl Acad Sei U S A. 2005 Apr 26:10207):6225-30.

G. Transformação

As células podern ser transformadas através de qualquer técnica adequada, ínchàudtj, por exemplo, biolfstrea, eletroporaçãs, transformação de comas dç vidro e 1Q transformação de fio de carbeto de silício. Ver, por exemplo. Exemplos aqui.

Qualquer técnica conveniente para a introdução de nm transgene em CTtoreOu pude ser empregada na presente invenção. Dawson et al. (199?) (supra) descreveu o nso de bombardeios de mtcroprojêteis para introduzir o gene nitrato redutnse (NR; da Chh>re/fo vuigctm' em mutante» de CA/ore/fo .roro&nàma deficiente» em NR, resultando em 15 iransformaores estáveis. Resumidamente, esferas de ttragstênio de 0.4 micron foram revestidas com plasmideo; 3 X 10' células de C. .w?ro«fofom? foram espalhadas ao terceiro centro de uma placa de ágar não-seletiva e bombardeadas com o sistema PDS-lOOO/He Biolistic Particle Delivery^ (Bio-Rad).

Um método preferido para a introdução de um transgene em Oíforef&t é o método 20 descrito por Kirn et al. (2002λ Afor. ^fo/ec/mof. 4:63-73. Kim relata a transformação dos prouipíaxtos de C'/iorc/fo EiVipxmJejr utilizando CaCh c polietilcuo glicol (PEG). Em particular. o» protoplasms foram preparados pela crescimento da células de C.

para ama densidade do 1-2 X ItFvMi. As célula* foram recuperadas c lavadas por ecnirifugação por 5 minute* a I6íã) g, e re*s«spaa*a.s cm 5 Ml <1c tampão de fusfaiu (pH 25 6.0) contendo 0,6 M de sorbitol, 9.6 M de manitol . 4¾ (peso/volumei de celulose (Cnlblochem), 2% fpeso/volume) macerase (Calblochenv, e 50 unidades de pectraase (Sigma). A suspensão celular foi incubada a 25T por 16 horas no escuro, com agitação suave. Os protopiastos resultantes foram recuperados pela cemrifugnção a 40Q g por 5 minutos. A pelota foi cuidadosamente ressuspensa em 5 Ml de meio i?2 contendo 0,6 M de 30 sorbitol e 0,6 M de manitol e centrifugada a 4C0 g por 5 minutos. Esta pelota foi ressuspensa em 1 Ml de solução de 0,6 M sorbitol/mamtoi contendo 5U tnMCaCI;. Então, 5 mg de DNA do transgene foi adicionado, jnntamente com 25 g do DNA tímo de bezerro (Sigma), a 10 -10' protoplasms cm 0,4 Ml. Depois dc. 15 minutos a temperatura ambiente, 200 t. dc PNC (4056 de pídietileno allcol 4000, 0,8 M NaCí. 50 roM CaClj) f<?i adicionado 35 e misturado suavememe durante 30 minutos cm temperatura ambiente. Depois disso, 0.6

Mi do meio f/2 suplementado com 0,6 M de solução de sorbitoi/mamtol, 1% de extrato de levedura e l % de glicose .foi adicionado, e as células transformadas foram incubadas a 25T por 12 horas no escuro para a regeneração da parede, celular. Um método semelhante foi utilizado por Huang et al. (20<)7.> (supra) para introduzir um tr&nsgene codificando mercúrio redut&se em Cbforeffa sp. ΖΧΓ.

A eletroporação também iam sitio empregada para transformar CAoreiZn. Conforme relatado por Marayama et al. (20()4), Biotechnology Techniques S 821-826 (incorporado por referencio, em sua totalidade), esta técnica foi usada para introduzir um transgene em protoplastos de Cérére/fe .mcehoropáds c.-211-lo preparados a partir de células na fase exraelonária . A expressão transiente do plasmldec introduzido foi observada em um campo de força entre 660 e 900 Vfem, e uma duração de pulso tie cerca de 400 ms. onde st alia permeabilidade da membrana de 7(bkDa PÍTC-dextrano foi constatada.

Exemplos de expressão de transgenes em Ch/oreZZn podem ser encontrados na literatura iver. por exemplo Current Microbiology Vol 35 ( 1997), ρρ, 356-362: Sttertg Wu Grmg Cheng Xue Bao. 2000 .JuU6í4!;443-6; Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp.

335-34.1; .Appt Microbiol Biotechuol (2096) 72: 197-205; Marine Biotechnology 4, 6373, 21X12; Current Genetics 39:5., 365-370 (2001); Plan? Cell Reports 18:9, 778-7811, 15 (1999); Biologia Plarcantmt 42(2); 209-216, (1999); Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (260(¾.

Veja também exemplos aqui.Exemplos de expressão de transgenes em levedura oleaginosa (por exemplo, Frtrríwrâ (jpo&frèd) podem ser encontrados na literatura (ver, por exemplo.

Bordes ei si. J Microbiol Methods, Jun 27 (2007)). Exemplos da expressão de transgenes em fungos (por exemplo. áfordere/Zrt n//.we. Mrexra c/remc/ZonAo· e AqwgiZhc?

ofúraceux) também podem ser encontrados na literatura (ver, por exemplo, Microbiology, .lul, 153 (Pt. 7):2013-2.5 <2007); Mol Genet Genomics, Jun, 27ltfo:595-6Ü2 (214-4), Cttrr

Genet, Mar;21(3):215-23 (1992); Current Microbiology. 30(2):83-86 (T95); Sakuradani, N1SR Research Grant, Studies of Metabolic Engineering ot Useful Lipid-pmducing Microorganisms (2QfM); c PCTZB^OfeUO12021). Exemplos de expressão de genes 25 exôgenos em bactérias ccmo a E. rob sâo bem conhectdus; ver, por exemplo Molecular

Clonmg; A Laboratory Manual, Sambmok et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor illliiifewitttilttttttlitíttttttttttttttttttttttittttttttttttttttttttttttttií

Vetores para a transformação de microorganismos, de acordo com a presente, invenção pedem ser preparados por meto de técmeas conhecidas familiares àqueles 30 versados na técnica. A sequência de rivcieotfdeos do construe to utilizado para a transformação de várias espécies de CWore&< corresponde, a 5EQ ID NO: 25. Em uma modalidade, ura projeto de vetor exemplar para a expressão de um gene tie lipase em um microorganismo como uma o-ícroalga contém um gene qtsu codifica a ma fepâse em ligação opcrâvcl com um promete»? ativo nas raferoalgM. Àlfcrnatív&mentc, se o vou.tr não contém 35 um promotor cm Ugação opcrével com o gene de interesse, o gene pode ser transformado £>8 células de tal forma a tornarem-se operacional mente ligados a urn promt-ior endôgeno no ponto de mtegr&ção do vetor, O método sere, promoter de- transformação foi comprovado por oaballrar ern microalgas (ver, por exemplo Plan? Journal 14:4, (1998), pp.441 -447Q vetor também pode conter um segundo gene que codifica uma proteína que, por exemplo, confere resistência « um anlihiótíoo ou herbicida. ou seja, um marcador sclcckmfocl. OoetomtImente, um ou ambos os genes fsi é/sào seguidos por unu sequência 3^: não traduzida contendo um sinal de poliadeniltíção. Cassetes de expressão que codificam 5 doi® genes podem estar fisicamente ligados no vetor ou em vetores distintos. A cotransform&ção de microalgas também pode ser usada, na qual as moléculas de vetores distintos são simultaneamente usadas para transformar células (ver, por exemplo Protist 2094 Dec (155(4):381-93). As células transformadas podem ser opcionalmente selecionadas com base na capacidade de crescer na presença do antibiótico ou de outro 10 marcador selecionável, em condições em que as células sem o cassete de resists mutt não iriam crescer,

Todas as referência.® citadas neste documento, Incluindo patentes, pedidos dc patentes e publicações, silo incorporadas por referência em suas totalidade®, se previamente especificamenta incorporadas ou não. As publicações aqui mencionados silo citadas a fim 15 de descrever e divulgar os reagentes, metodologias e conceitos que podem ser utilizados em conexão com a presente invenção. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que estas referências sau técnica anterior em relação às invenções aqui descritas.

Embora esta invenção tem sido descrita em conexão com modalidades específicas 20 da mesma, será entendido que esta é capaz de outras modificações. Este pedido destina-se a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguintes, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais saídas da presente descnçào como vêm dentro da prática conhecida ou habitual dentro da técnica ã qual tt invenção pertence e como as características essenciais acima estabelecidas podem ser aplicadas.

X. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas nau limitar, a invenção reivindicada,

EXEMPLO 1

Cepas de £7>Luf?(Y<x da coleção de cultura da l.hiivetxidade do Texus foram testadas 30 para o crescimento em glioerol e glicose. As seguintes espécies e cadeias de Orionr/fe foram cultivadas: C.è/<?reÀ^fa tos/eri fcepas 263. 397, 398, 2223): Cúirneíht som&mímo (cepas 1663. 1665, 1669, 1671, 1819): Qt/ore/ín mecéarepM/d (2911, 2469u CAMvvíín prmotAecmdes (3Í,249, 250.264). Cada cepa foi moculada em meios sólidos em 25 ml de meio de base líquida (2g/L de extrato de levedura, 2,94mM de, NaNOj, 0.1 ?mm de 35 CuClj’SffjG. 0.3 mM de MgSO₄»7í-l₂O. 0.4mM de Kd-lPO^ l.2SroM de KH₂PO₄,

9.43rnM dc NaCi) c crescida em agitação a 27*0 por 72 horas seis uma imensidade de luz de 75 μ Em'S’’. Essas culturas foram utilizadas para moeular cadu cepa pura uma densidade final dc 1x10' células pur ml em placas de 24 poços contendo 2ml de (a; meio de base

94/127 somente. tbi meio de base mais 0,1 0- de gbeose e (c) meio de base mais 0.5% de glicerol de grau resgeníe iEM Science, catalog 4 GX0185-6). Às placas foram colocadas tio escuro e cultivadas por 72 horas. agitandas a 27^rtC, As amostras de cada cepa cultivada em trôs condições foram diluídas 1,9:1 em 1120 destilada e a absotbârtcia foi lida a hOOmn em um

Molecular Devices SpectraMax 340PC, Todas as linhagens apresentaram um crescimento na presença de glicose e glicerol. cm comparação aos meios de base somente.

EXEMPLO 2;

Cepas e Meio: Cúiureffo prortu/ierwW-s # 1 (CEPA 250), # 2 (CEPA 264} e Cã/mr/M ta&n í* 1 (CEPA 398) foram obtidos a partir da Coleção de Cultura de Algas 10 na Universidade do Texas (Austin, TX, E.Ç.A.). As culturas em estuque foram mantidas em meio de Proteose modificada. Q meie de proteose modificado consistiu (g/L) em 0.25 g de NaNO_?, 0.09 g K₂HPO^, 0.175 g KH₂PO₄ 0,025 g, 0.025 g de CaCl?»2HA 0.075 g MgSG._s»7H;;O e 2g de extrato de levedura por litro. Os resíduos de glicetoi da produção de biodiesel (glicerol acidutado (AG) e glkertd não-acidulado (NAGii foram obtidos da 15 Imperial Western Products (Selma, CA, E.U.A.). Giicetxil puro” ot; de grass reagente foi da EM Science (mna divisão da Merck K.GA), catalog # GX0185-6,

Projeto Experimental e Medição de Crescimento: Para cada cepa. I m) do seguinte meio diferente foi preparado em placas de 24 poços.

.Proteose 4· 1% de glicerol puro

2. Proteose r 1% de glicerol acidulado

S.Píoteose * 1% alkanol não-acidulado

4. Proteose -s- 1% de glicerol puro 4- 1% de glicose (adicionados após 72 horas í

5. Proteose + 1% de gllcetoí acidalado -t- 1% de gheose (adicionados apds 72 horas) ó.Pr»tcose + ΙΆ de gliiCrHl não acídelado -r IA de glicose (adicionados após 72 botas)

Cada cepa foi inoculada com diferentes meios para a concentração de 5 x 10’ cGtdas/ml. As culturas foram mantidas na escuro e foram agitada* pelo agitador orbital da Lahnet (Berkshire. UK) a 430 rpm. Após 72 h de crescimento inicial. 1% Cp/v) de glicose foi adicionado às amostras # 4. 5 e 6 e cultivado por outras 24 horas. Para medir o peso 30 celular seco. I ml de cada emitira foi peletizada por centrifugação a 5.000 rpm por 5 min em uma centrifuga Eppeudorf 541 SC. Após retirar o sobresiadante, pelotas de célalas foram congeladas a -.MFC e litifilizadas cm um secador de gelo em escala laboratorial (Lahconco. MO, ΕΛλΑ.). Os tesuhados são mostrados ira Figura i.

ΕΧΕΜ.Ρ1Ό 3

Cepas e Meios; Chiorella protothecoides « 1 (CEPA 250). # 3 (CEPA 249) e

Chlorella kessleri # 2 f'Ccpa397) foram obtidos a panic da Colação de Cuhuras de Algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As culturas foram mantidas em meio de proteose modiüeado (ves' exemplo 2).

Disposição experimental e Meio de Crescimento: Para cada cepa, I trd do seguinte tneio diferente foi preparado em 24 poços.

Proteose + 1% de glreerol purr; ♦· 1% de glicose

Proteose * 1% de çlíeerol aeiduíado + 1% de glicose

2.

3. Proteose -t- I^s* de gliuerol aão-acidulan» * 1% «e gltcose

Cada cepa foi inoeuiada coto diferentes meios de â x l(F eèíalas/ml de concetttração. As culturas foram mantidas ao escuto s agitadas por agitador orbital de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm. .Após 96 h, o crescimento celular foi medido para o peso seeo de células (ver exemplo 2,t, Os resultados são mostrados na Figura 2.

EXEMPLO 4

O-gplD A Meios: Cblurella protothecoides 4 3 (CEPA 249). # 4 (CERA 31) e Chíorelte kesaleri 4' 2 (Cepa397.> foram obtidos; a partir da Coleção de Culturas de Algas na Universidade dc· Texas (Aestin. TX, EUA;. A» culturas fbram mantidas em mero de proteose modificada (ver exemplo 2), <*da cepa, i rnl d<? seguinte meio diferente foi preparado em 24 poços.

1. Proteose +· 1 % de glicerol puro * l % de glicose

2. Proteose r 1% de glicerol acidulado 4- 1% de glicose

3. Proteose * 1% de· glicerol não-eciduludo -r 1% de glicose

Cada cepa fui inoculada a um meio contendo diferentes gliceróia {puro, acidttktdu ou nãuacídulado.! para concentração de 5s ÍÜ^? celulas/ml. As ca horas foram mantidas tw escuro e agitadas por agitador orbital de Labnet (Berkshire. Reino Unido) a 430 rpm. Os iipidios foram medidos apôs 96 h. Para medir a quantidade de teor de llpídios nas células. 100 μ! de culturas foram coletadas e lavadas uma vez com o mesmo volume do rocio, Para cada tubo. foram adicionados 5 μ; de- células lavadas e 2(H) rnL de ácido sulfdrico 18 M. Os rubos foram incubados u 90'C em banho-maria por 30 mia» e l ml de reagente de vatrilina ácido fosfóóco üú adicionado aos tubos e incubado a 37^<;C p<« 13 min. Pura preparar o reagente de vaailina ácido fosfórioo, 0,12 g de vaatlína foi adicionado & 20 ml de ágttn, e o volume ajustado para 101) ml com 85% de ácido Ibsfórico, A densidade óptica α 530 um foi lida eirs uma cuveta de vidro contra um tubo de referência cotn 5 pi de água amostra. Os resultados são mostrados na Figura 3.

EXEM.PI..0 5

Çeoas e Meios: Chiarei lit protuthecoides 4 2 (CEPA 264) e Chlorella kesslerl 4 1 (Cepa 398) foram obtidos a patur dtt Coleção de Culturas de Algas na Universidade do Texas (Austin, TX. EUA). As culturas foram mantidas em meio de proteose modificado

Disposição experimentid s ensaia de üntdsos: Para cada cepa, l ml do seguinte meia diferente foi preparado em 24 poços.

Proteose -t-1% de glkernl puro

Proteose *- l A glkvmí riâo-acidubído

Prnleose ·*· 1% de glkerrd puro * 1% dc glicose (adicionada após 72 hr)

Proteose * KL de gfteorol ndo-aciduiado ~ 1¾ de glicose (adicionada após 72 bn

Cada cepa foi inoctdada a um meio contendo diferentes gliserób (puro ou nãoacidulado) para concentração de 3x K) células/ml, As culturas foram mantidas no escuro s 10 agitadas por agitador orbitai de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 439 rpm. Após 72 h de crescimento inicial, 1% de glicose foi adicionado à amostra 4 3 e 4 4 e cultivada por outras 24 horas. O teor dc lipfdio* foi medido em toda.* as amostras «ver exemplo 4). A deoxidade óptica k dig; nm também foi medida para verificar absorvãncia não especifica e subtraído de O.D. 530 nm para calcular a quantidade dc lipídios. A curva de referência ó composta 15 de Trioleína dissolvida em clorofórmio variando dc l a 10 mg. Os resultados sâo mostrados na Ftgtira 4.

EXEMPLO 6

Cepas g. Mb O $1 Chlorella prokithecoides 4 3 (CEPA 249) e Chloral la kessleri 4 2 (Cepa 397) foram obtidos a partir da Coleção de Culturas de Algas na Universidade do 20 Texas f Austin. TX, EUáí. As culturas foram mantidas em meio de proteose modificado (ver exemplo 2.·,

Di.speslcãp...expurimenbtl e emairè de bcidios: Para cada cepa, l ml de seguinte maio diferente foi preparado em 24 poços.

Proteose s- 1% de glict-rol puro * 1% de glicose (adicionada apôs 72 hr} 25 Proteose * 1% de glicerol acidulade + 1% de glicose, (adicionada após 72 hr)

Proteose 4 1¾ de glicerol não-aeidulado + 1% de glicose (adicionada np6s 72 hrs

Cada cepa foi inoculada a um meio conteúdo diferentes gliccróis (puro, aeldulado ou não-acidulado,í para concentração de M 105 célu1as/re.l. As culturas foram mantidas no escuto c agitadas par agitador orbitai de l..obtiel (Berkshire, Reims Unido) a 430 tptn. Apôs 30 72 h de crescimento inicial. 1% cie glicose foi adicionado e cultivado por muras 24 horas.

O peso seco das células e teor dc lipídics foi medido em todas as amostras (ver exemplos 2 e .5;, A porcentagem de hpídiu foi calculada a partir da quantidade total dc lipídios dividido pelo peso seco das cémlas. Os resultados são mostrados na Figura 5.

EX.EMPl.X3 7

OepggxMciüs; Chlorcila pmtotbecoides # 2 (CEPA 264) e Chlorella kessleri # I (Cepa 393) foram obtidos a partir da Coleção d« Ctdltiras de Algas na Universidade do

Texas (Austin. TX, EUA). As culturas forum mantidas em melt? da proteose modthcado (ver exemplo 2).

Para cada cepa, 1 ml do seguinte nevo diferente foi preparado soo 24 poços.

Proteose *· 1% de gíicerol puro 4 '1% de glicose (sdicloonda após 72 hr)

Proteose * de glicerol nâo-aciduhdo 4 1% de glieose íadíciouada após 72 hr) Foi inoculadu em cada cepa meios contendo 1% de gíicerol puro ou 1% de ghcerol não-aeidulado a 5 x H? células/ml de concentração. As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbital de Eabnet (Berkshire. Reins? Unido) st 430 rpm. .Após 72 h de crescimento tutelai, 1¾ de glicose foi adicionado e cultivado por outras 24 horas. 0 peso seco das células e reru de liptdios ibi medido em todas as amostras (ver exemplos l e 4}. A porcentagem de lipklío foi calculada a partir da quantidade total de lipnifos dividido peto peso seco das células. Os resultados são mostrados a& Figura 6.

EXEMPLO 8 .ÇeXB§.,,Èi...M.S.ííiâ·. Chlorella proiothesoides # I tCEPA 2511), « 4 (CEPA 3 b e

Chlorella kksleti # 2 tCcpn 397} foram obtidos a partir da Coleção de Culturas de Algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As cubaras foram ntamidas em meio de proteose modificada (ver exemplo 2).

Pura cada cepa. I ml do seguinte 2Ό meio diferente foi preparado em 24 poços.

Proteose 4 .2% de glicose

2. Proteose 4 1% de glíccrol 4 1% de glicose

Cada cepa roí inocuiada com diferentes meios de 5 x 105 célubsZml de concentração. As culturas foram mantidas ao escuro e agitadas por agitador orbital de 25 Labnet {Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm, Após 96 h de crescimento lateral, o teor de lipidios foi medido focr exemplo fo. Os resultado» silo mostrados na Figura 7.

EXEMPLO 9 <'Míís..Ç.....Mríos: Chlorella prototheeoídea # 3 (CEPA 249), s 4 (CEPA 31) e Chíorella Eessleti # l (Cepa 398) foram obtidos a partir da Coleção de Culturas de Algas 30 na Universidade do Texas (Austitt, TX, EUA). As culturas foram mantidas em meto de proteose modificado (ver exemplo 2).

cada cepa, I ml do seguinte meio diferente foi preparado em 24 poços.

I. Proteo&e 4 293 de glicose

2. Proteose * l % de gliceroi 4 1% de glicose

3. Proteose 4 1% de glicerol 4 1% de glicose (adictonada «pós 72 br)

98/127

Cadê cepa foi inoeulads com diferentes meios de .5 x 105 células/ml de conceníraçào. As euharas foram mantidas no escoro e agitadas por agitador orbital de Labnm (Berkshire, Reino Unido} a 430 rpm. Após 72 h de crescimento micial, l % iwZv) de glicose foi adicíortado so rocio da amostra ~ 3 c cultivado por outras 24 horas. O peso seco das células e teor de hpidios (oi medido ern iodas as amostras (ver exemplos 2 e 5j, A porcentagem de lipídío foi caluniada a partir da quantidade total de Hpídios dividido pelo peso seco das células. Os resultados são mostrados na Figura 8,

EXEMPLO 10

CcpM.A.Mdp$; Chforella promtheeoides 4 i (CEPA 250';.. # 3 (CEPA 249) e Quorella kessled ft 2 (Cepa 397.! foram obtidos a partir da Coleção de Culturas de Algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As culturas foram mantidas em meio de proteose modificado (ver exemplo 2).

^4ra uada cepa, l m) do seguinte melo diferente fcá preparado em 24 poços,

Proteose 4 1¾ de glicerol puro + 1% de glicose

2. Proteose 4 1¾ de glkerol puro a- 1% de glicose tndieíoaada após 72 hr)

3. Proteose 4 1¾ de glicerol acidulado 4 1 % de glicose

4. .Proteose 4 1% de glicerol acidulado t 1% de ghcose (adicionada após 72

Hllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

5. Proteose + 1% de glicerol não-uctdulado 4- 1% de glicose

6. Proteose 4 1% de glicerol nàmaciduLdo t- 1% de glicose (adicionada apms lillllllllllllllllllllllllllllll

Cada eepa foi inoculada com diferentes meios de 5 x 11)5 uélulas/ml de concentração. As culturas foram mantidas no escuro s agitadas por agitador orbital de Labuet (Berkshire. Reino Uanloi u 430 rpm. Após 72 h de crescimento inicial, 1% (w/v? de glicose foi adicionado ao meio da amostra # 2, 84 o 46 e cultivado por outras 24 horas. O teor de lipfdios foi medido em todas as amostras (ver exemplo 5). Os resultados são mostrados na Figura 9.

EXEMPLO 11 < Chforella prototbecoides 4 1 (CEPA 250?, # 3 fCEPA 249;, (CEPA 31) e Chlorella kesxleri # '2 (Cepa 397} foram obtidos a partir da Coleção de

Culturas de Algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As culturas foram mantidas em melo de proteose modificado t ver exemplo 2).

Para cada cepa, ; ml do seguinte rncio diferente foi preparado ens 24 poços,

1. Proteose 4- 1% glicerol puro 4 1 % de glicose

99í 127

2, Ftoteose -t- 1¾ de gfccuj: pure * IQ de glicose «udieíonada após 72 hr?

3, Froteose a- I % de giicerol acidulado * 1 % de glicose

4, Proteose f 1% de giicerol addtilado a- IQ? de glicose (adicionada após 72 liflltfllflflflff^^

5. Proteose * IQ: de giicerol não-acidulado * 1 % de glicose

6. Proteose *- EQ. de giicerol não-acidulado > 1% de glicose (adicionada após

Cada cepa fui inoctilada com diferentes meios de 5 x 105 eélulaVml <ie uonusatração, As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbitai <k·. 10 Uubnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm. Após 72 h de crescimento tnicial, 1 % tsvZv) de glicose foi adicionado an meio da amostra » 2, #4 e #6 e cultivado por outras 24 horas, O teor de íipfdios foi medido em todas as amostras (ver exemplo 2), Os resultados .são mostrados na Figura 10.

EXEMPLO 12 ygiOL&Ê9SSíni^

Um fragmento BatuHl-Saeil contendo o promotor CMV. um cDNA resistência á bigrois-ieina. e um CMV 3’ UTR (SEQ l'D NO: .5, nota subseqüência do vetor pCAMBlABEO, Cambia, Canberra, Australia foi cloaado cm BamHf e Sacil sftjos de pBlueacrip e é aqui referido coma pHyg,

Os transportadores de ouro S550d Seashell Technology foram preparados de acordo com u protocolo do fabricante. O plasmídeo pHyg linearizado (20 mg) fot misturado com 5íQí de tampão de ligação e 60 μΐ <30 mg) de transportadores de ouro S550d e incubados no gelo por i min. Tampão de precipitação (100 pl) foi adicionado, e a mistura (oi 25 incubada em gek< por mais um 1 min. Após o vórtice, as partículas revestidas cum DNA furam granuladas por roiitçik- de 10.009 rpm em uma mteroeenlxífnga Eppendorf 54I5C por 10 segundos, O granule de ouro te-i lavado uma vez com .500 ut de etare.d 100¾ frò}, revestidos por breve rotação na microeentrifuga, e ressuspenso com 50 pl de etanol frio. Depois tie ttuut breve (la 2 seg.) sonicaçâo, 10 ml de partícula revestidas com DNA foram 30 imediaiametun transferidas para a membrana transportadora,

Chlorelta cultura prowtheeoides (Universidade do Texas Culture Collection 25Ί)) foi cultivada em meio de proteose (2 g de extrato de levedura/ L, 2.94niM NaNO3, Ô.I7mm CaCll * 2H2G, 0,3 mM MgSO4 * 7.H2O, 0.4mm K2HPQ4, l.28ram KH2PO4, 0,43mm NaCl) em um agitador giratório sob lua contínua de 75 mmol iótons m s'\ até 35 chegar a tuna densidade de células de 2>; IOfoélulasMd. As células foram colhidas, lavadas uma vez com água destilada estéril, e ressuspensas em 50 pl de meio, l x 10 células foram

190/127 espalhadas no terceiro centro de tw.a placa de tael·:) de proteoses nâo-reletivo. As células foram bombardeadas com o sistema de liberação de partículas biobalística PDS-1090/He (Bio-Rad). Os dtscos de ruptura (l 100 e 1350 psi) foram usados, e as placas foram colocadas 9 e 12 centünetros abaixo da tsla/conjunto ntacrotransportador. As células 5 puderam se recuperara 25X por 12 a 24 h. Ap&s a recuperação, as células fontm raspadas das placas com uns» espátula de borracha, misturadas com 190 pl de meio e espalhadas sobre placas comendo higmmlcina 1290 tng/ml ?. Após 7 a 10 dias de incubação a 25X, as colônias representando células transformadas foram visíveis nas placas de 1100 e 1350 psi discos de ruptura e de 9 e 12 cm de distância. As colônias foram escolhidas e manchadas 10 em placas de ágar seletiva para uma segunda rodada de seleção.

Chlurella cultura protorhecoides foi eultivãda cru meio de ptoteose em um agitador giratório sob luz contínua de 75 mmol fôtons nf' s'\ até chegar a trata densidade de células citt 2rbF célulasZral. As células foram colhidas, lavadas uma vez eom água destilada 15 estéril, e ressuspettsas em tampão tris-fosf«to (20m M Tris-HCÍ. pH 7_;9, I mM de fosfato dc potássio?, comendo 50 mM de sacarose a uma densidade de 4x10* células/ml. Cerca de 250 μΐ de suspensão de células (1x10* células) foi colocada em uma eubeta de eletroporaçào descartável de 4 mm de abertura. Para a suspensão da célula, 5 g de DNA ptasmldtsl Imearizado pHyg e 299 pg de DNA transportador f DNA de esperma de salmão 20 laminado) fot adicionado. A eubeta de eletmporaçáo foi. então, encubada em banho-maria a 16^aC por 10 tnreuins. Um pulso elétrico (1100 V/cm? foi então aplicado â célula em uma eapacitâneia dc 25 mF (uilo foi usado sraperimetro para a eletroporação). utilizando um aparelho de elet-Opoxuçào gene pulser 11 (Bio Rad l-abs, Hercules, CA). A célula fot etnão incubada era temperatura ambiente por 5 minutos, em seguida a suspensão celular foi 25 transferida para 5Q mi de meio de proteose e agitada em um agitador giratório por 2 dias.

Depois da recuperação, as células foram colhidas por cenlrifugação a baixa velocidade, ressuspensas em meio proteose e banhadas em baixa densidade em placas suplementadas cotn 200 tng/ml higromicinít. Às placas furam incubadas sub luz contínua de 75 mmol fótons ra' §‘\ Transformatjtes apareceram como colônias em l a 2 semanas. As colônias 30 foram escolhidas e manchadas em piam de iígar seletiva para uma segunda rodada de seleção.

Um subconjunto de colônias, que sobreviveu a uma segunda rodada de seleção, Ibi cultivado e colhido um pequenos volumes, Grânulos dc aproximadamente 5 a 10 uL de 35 volume foram rsssuspensos em 50 uL de lOmM Na.EDTA em vórtice e ern seguida meubadss u bWC por 10. Os tubos foram então centrifugados rapidamente e sonicados por 10 segundos, em seguida, centrifugados a 12.009 x g por l minuto. 2 uL do sobreuadame conto modelo foi utilizado em uma reação de PCB 50 ul. Primers utilizados para a genotipagem foram SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. As coadiçdcs de PCK foram as seguintes: 95 * C 5 min x 1 ciclo, dc 93^{1 2}C 30 seg. · 58 ^s C 30 seg. 72 ' C I min 30 seg x

35 ciclos; 72*0 10 min x 1 ciclo. O fragmento de 992 pb esperado foi encontrado em 6 das colônias <iu método de biohalfsttca s eletroporação de uma única colônia. Uma banda in&spesífíca de tamanho menor esteve presente em todas as pistas. Os resultados são mostrados na Figura 16. Para confirmar a identidade do fragmento amplificado 992bp. duas bandas de biobalística e a banda de eletroporação foram excisados d» gel e IÜ seqüendado individualmente. A xeqiiêmda de três bandas correspondeu ao fragmento esperado de 992 pb (DNA ladder: Bioncxus^ All Purpísse Hi*Lo^e DNA ladder catálogo f? BN205O).

EXEMPLO 13

Oep.gs..&..Msiqs'. ia? Splralirut píatensls (UT.EX 23-10) e t b.i Navlculn pralkndosa 15 ί'Ι.ΠΈ,Χ 667) foram obtidos a partir da coleção de culturas de algas na Universidade do Texas (Austin. TX, EUA). A cultura de Sptruiitta foi mantida em meio de Spirulma e a Navicula foi mantida em meio de extrato de solo (MBV). O meto de· Sptruhna consistiu de 162 mM NaHCOs, 38 mM Na₂CO._?. L9 mM K_SHPO«. 29 mM NaNO?, 3,75 mM KjSCQ 17_: i mM NaCI. 0.8 mM MgSChQHA 0,25 mM GaCipJHjO. 2 mM Na-EDTA, 0,36 m.M 2G PeCh'6H-A 0.21 mM. MnCEOFLQ. 0,037 mM Zn€l₂,0.0085 mM CuCl _r6H₂0.0.017 mM

NaMoO«-2HA 0.78 pM CuSCV5H_;O, 0,15 uM ZnSO.c7H₂G. 10 μ.Μ HdEKh, e O/XH m.M Vitamina 8u. O meio de extrato de solo consistiu de 2.94 m.M NaNOx, 0,17 mMCaCh-2H₂.O. 0,3 mM MgSO-VHjO, 9.43 mM KjHPlX 1.29 mM KHjPCL, 0,43 mM N&Cl, e extrato de solo. Resíduos de glicerol da produção de biodiesel (glicerina aeidtilada 25 (AG) e glicerol ttáo-ticldulttdo tNAGi) foram obtidos a partir de imperial Western Products I Selma, CA, EUA).

Di^msiçikLeS99):Í.mGE6l.e MsM.de Crascímento: Pítra cada cepa, l ml do strasràtte meto diferente foi preparado em '24 poços. liiiiiiottttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttti

7. Spirahnst média ·*· 2% de gbeose

8. Meio de pirulina 4 2% de gltcmxM de. grau reagente

9. Meio de Spirulina * 2(6 de glicerol aim-acidul&do

10. .Meio de Spintbna * 1% de glicerol aim-acidulado -t- 1% de glicose

1. SEM t 2% de glicose

2. SEM 4 2% de glicerol de grati reagente

3. SEM -t-1% de glicerol de grxu reagente *· 1% de glicose

4. SEM * 2% de glicerol acidulado

5. SEM+ Ifodeglmerol acidulado * 1% de glicose

SEM 4 2% de glfeerol não-acidulado

7. SEM * l%de giicerol náoxcldulado 4 1% de glicose

Cada tapa fot inocul&da com diferentes meios de 5 x 105 eululaUml de concentração. As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbital de Labnet (Berkshire. Reino Unido} a 435 rpm. Os lipídios foram medidos após 96 h. Para medir a quantidade de teor de liptdios nas células, 100 pl de culturas foram coletadas e lavadas uma vez com o mesmo volume do meio. Para cada tubo, foram adicionados 5 id de células lavadas e 200 ml., de ácido sulftírico 18 M. Os tubos foram Incubados a 90'C em banho-maria por 30 min, e 1 ml de resgente de vaniitna ácido fosforíeu foi adickmado aos tubos e incubado a 37X por IS min. Para preparar o reageme de vanilina ácido lusfóríco, 0.12 g de vanilina foi adicionado a 20 ml de água, e o volume ajustado para 100 ml com 15 85fo de ácido fosfórico A densidade óptica a .530 ma foi lida em anta cuveta de vidro contra um tubo de referência com 5 pi de água amostra. A curva de referência ê composta de Tnoieína dissolvida ern clorofórmio variando de l a 10 mg.

Paia medir o peso seco das células, 0,5 ml de cada cultura foi granulada por cunmfogaclfo a 5000 rpm por 5 min. Após retirar o sobicnadante, os agiotrterados de 20 células foram congelados a -80A' e secos durante a noite sm utn sistema de congelamento (Urbconco, MO, EUA). .A porcentagem de lipídio foi calculada a partir dts montante total de Epídeos dividido pelo peso seco de células. Os resultados gão mostrados na Figura 11

EXEMPLO 14

Cepas e Meios: Seensdesntus armatus (UTEX 2552» foi obtido a partir dtt coleção 25 de culturas de algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As culturas foram muatidíts em meio de proteose modificada. O meio de proteose modificado consistiu (g/L.) de 0.25g NaNGs, (Wg KjHKfo 0,1 75g KH₂PO₄ 0,625g, 0.025g de CfoCl· 2H_;.0, 0,075g MgSOj 7H;O e 2g de extrato de levedura por Htro.

Pítra cada condição de 30 crescimento, 1 ml do seguinte meio diferente foi preparado em 24 poços.

1. Pírtlehâe 4- 2% de giieo.se

2. Proteose 4- 2% de glíeerol

3. Proteose 4 2% de glicerol acidulado

4. Proteose 4· 2% gltcerol náo-acidulado

5. Proteose -« 1% de glicerol nâm-acidulado t 1% de gheose

Seenedesmus axmatus tl-ΠΈΧ 2552) foi inoculada com diferentes meios de 5 x l(P célul&sZml de concentração. As culturas foram mantidas ao escuro e agitadas por agitador orbital de l.abnet (Berkshire, Reino Unido) a 436 rptyt. Após 96 h. o crescimento celular foi medido por peso de células secas, e o teor de liptdios foi medido por ensaio de vtmilina de 5 fõsfoxo. (ver exemplo 3>. A porcentagem de Itpfdlo fol cakulada a paror do mont&nte total de Hphfeos dividido pelo peso seco de células. Os resultados situ mostrados mt Figura 12.

EXEMPLO 15

Cepas e Meios: Navicula pelliculusa (UTEX 667) foi obtido a partit da eoleçào de culturas de algas na Universidade do Texas (Austin, TX, EUA). As ettltora» foram 10 mantidas em meio de extraio de solo (ver exemplo 13).

Para cada condição de crescimento. I ml do seguinte meio diferente foi preparado em 24 poço».

1. SEM * 2% de glicose

2. SEM -t- 2% de glieero)

3. SEM -t- 2% de glicero) aeidulado

SEM s- l % de glicerol aeidulado * I ^?re de glicose

5. SEM -t- 2% de glicexol nào^cidulado

6. SEM 4 1% de glieerol treo-aeidulado + 1% de glicose

Navicula pe.llicuk-.su (Ι.ΠΈΧ 662?) foi inoculada u um meto con-ertdo diferentes 20 gbceróis (puro, aeidulado ou nãoraciduiado) para concentração de 5x H'/ céktlas/ml. As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbital de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm. Após 96 h. o crescimento celular foi medido por peso seco de células f ver exemplo 13.·. Os resultados são mostrados na Fsgura 13,

EXEMPLO 16

Ççpase Meios: Splrulina phtensis (UTEX 2552) e (b) Navicula pdlkufea. (UTEX

667) foram obtidos a parttr da coleção de culturas de algas nu Universidade do Texas íAusúm TX. EUA). As culturas foram manadas em médio de proteose modificado para Sccírediísmus armatus e meio de extrato de solo para extrair Navtcula pelliculosa (ver exemplo l).

cada cepa, I ml do segumte meto diferente foi preparado em 24 poços.

Scenedesmus armarás

5. Proteose t 1% de glíeert>l aeidulado t· 1% de glicose

6. Proteose * l % de glicetol aeidulado t- I'% de glicose (adicionada apos 72 35 hr)

Navicula psi lículosa

1. SEM * 1¾ de glteerrd aciduhdo + I % de glicose

2. SEM * 1% de glicerol acididado * 1 % de glicose (adicionada após 72 hr?

Cada cepa foi inoculada com diferentes meios de 5 x 105 céltilax/ml de concentração, As culturas foram mantidas no escoro e agitadas por agitador orbital de 5 Labnct (Berkshire, Reino Unido} a 430 rpm. Após 72 h do erescímemo hticid, í% de glicose foi adicionado à amostra k 2 a cultivada por-outras 24 horas, O crescimento celular foi medido por peso soco de células íver exemplo 13}. Os resultados silo mostrados na Figura 14.

EXEMPLO 17

Cepas, e. Meios: Cblorelkt proíotbeeoides tlíTEX 3h foi obtido a partir da coleção de culturas de algas na Universidade do Texas (Austin. 'ΓΧ, EUA). .As culturas foram mantidas em meio de proteose modificada (ver exemplo I).

cada condição. 1 ml do seguinte melo diferente foi preparado e.m 24 poços.

4. Proteose

5. Proteose 10,5% de glicose

6. Proteose 4 0,5% de glicose

7. Proteose 4 0.25% de glicose +· 0,25%· de xílosc

Chlorella protothecuidcs # 4 (UTEX 31} foi úwiòado para o mefo comendo diferentes açúcares (glicose, xilose) e .3 x Rf células/ml de concentração. As culturas foram, mantidas no escuro e. agitadas por agitador orbital de l..a.baei (Berkshire, Remo Unido? a 430 rpm. As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbital de Labnet (Berkshire. Reino Unido t a 430 rpm. Os resultados sào mostrados na Figura 13.

EXEMPLO 1H

QdoreBa pmtothecoides cepas «l, #3 e M foram, obtidas u partir da coleção de culturas de algas na Universidade do 'Texas (Austin, TX, EUA s. As euluiras foram mantidas em estoque médio de proteose modificado (ver exemplo 1·. Para cadn condição, foram preparados, em 24 poços, l ml dos diferentes meios a seguir.

1. Proteose

3D 2. Proteose 4· 1 % de glicose

3. FrulCõse * I % de. frntose

Cada eepa foi hiceidadã corn diferentes açucares tgOcuxe ou fmtose? para l s IO'^S eGulsis/uil de concentração. As culturas foram mantidas no escuro e -agitadas por agitador orbital de Lnbaet (Berkshire, Reino Unido} a 430 rpm. .Após 96 horas de crescimento, a 35 densidade da célula foi medida por contagem de ítóraere dc ediuias para cada cultura. Os resultados são mostrados na Figura 20,

ÍÜ5/127

EXEMPLO 19

Materiais <f M?fodo>; Chlorella prolothecoides (ÍJTEX 249} foi inoculado em três 50nu frascos dc racio de protease com 1% de sacarose (2.94mM NaNOj. 0.42bmM 5 KjHPCX, 1 ,28mM K.lLRfo. 0,427mM NaCl_; 0, 17mM CaCh-2HA 03 mM MgSO₄-7H₂O. proteose peptone lg/L.) para uma densidade de celular final de 4x10' celular por ml. A invertase (Sigma# 14504) foi adicionada a duas das culturas em O.OlU/ml e 0.05U/rm. As três culturas foram cultivadas no escuro por - 60hrs agitando em ilõdrpm.

Resultado»: As contagens de células finais foram realizadas em todas as três 10 culturas após - bObrs de agitação ao escuro. O frasco de controle alcançou 4,4x ItF células por ml, enquanto os frascos de O.OlU/nd e O.OSUrml atingiram demãdades celulares de l x; t? e 3xi0'\ respectivameítte· No final do experimento, cada frasco foi verificado quanto à contaminação por tmálise microscópica e todos estavam limpos.

EXEMPLO 20

Culturas de Chlorella kessleri ({a; üTEX 39'7 e (bj ΙΠΈΧ 398} e Chioreila fosca t(a) Ι.ΠΈΧ 251 e lb) Ι.ΓΙΈ.Χ 1801) foram maculadas de culturas de líquidos autotróficos em lOtnl de proteose -* 1% de meio de sacarose em frascos de 50 ml a l x 10* células/ral. As culturas de controle também foram moculadas com a mesma densidade com someme 20 meio de proteose. As cullaras foram crescidas a 28*C no escuro com agitação de 250 rpm durante 7 dias, nos quais o ponto de densidade das células foi medido por hemocitómeiro Como mostrado nas iigtmis 21 c 22. todas as quatro cepas cresceram em sacarose. em comparação com a densidade celular iuieial e o controle somente de proteose.

HXEMPl.G 21 toáHl««fodgC|yorglloE^^

Uma cultura de líquido lü ml d& Chlore.lla foi iniciada retirando o inóculo de uma placa de proteose sólida. As culturas foram crescidas era hra por cerca de 2 dias a 26^ftC. O crescimento foi medido utilizando um demidúmero óptico (1X>· a 7.50 nm, determinando o peso seco das células.

l&'»a solução dc 5% foi preparada cora glicose, sacarose e melaço de rrés amostras diferentes (rotuladas BSl BS2 « HTM) obtidas a partir do processamento industrial da cana em açúcar, como mostrado na Tabela 13. Verificou-se que o pH de todas as unidades estavam na faixa de 6 a 6.6. e os estoques foram então autoclavados.

106/127

Tabela 13.

:o e

1 Melaço	% Açúcar	5% de açúcar dií. em l Ofonls
i-ITM
| BSl íH.)	Ollillllíilii)	ΙΙ·1ΙΙ^ΙίΙΙΙΙΙΙΙΐ^|ϊ)
I BS2 tAÜ)
1 Sacarose	lt>3
1 Glicose	ItX)

17pparaçao de Sol ueào de m w nase: Uma solução de invertase de 40 unidades/nfi rôí preparada pela reconstituição de l mg de uma Invertase (Sigma) 4?X.s tmid/mg em 10 5 mililitros de âgua desfilada.

i*l de euitmas foram preparadas., rada «f!;s composta de 1% de meíaço/concentreção de açúcar final, 0,05 natdades/ml de invertase e í .0 x IO⁵ células por ml de Chlorella prototheemdes em um melo de protease de base. As culturas foram numeradas da seguinte· forma; t1} controle apenas de meio; (2? I W HTM%; tsj I BSl%; pi) l BS2%; (5) 1 7s dc glicose e (6) 1% dc sacarose. Um conjunto de controle semelhante t&mhém foi preparado sem a adição dc invertase. As culturas foram cultivadas no escuro pu? cinco dias com agitação de 250 rpm a WC

Resultados; O crescimento das células de Chlorella protothecoides foi avaliado após cinco dias de incubação sobre a respect-va matéria-prima na escuridão. Como 15 mostrado nas figuras 23 e 24, as células podem ser cultivada» em melaço, na presença de uma invertase snearose com rendimento* comparável ao do c reset mento da glicose grau de. reageme puro.

EXEMPLO 22 gãtoãJo»»

Cepas e Meios: CbloreUa protolhrcoidcs {UT.EX 250) foi obíidu a partir da coleção de culturas de algas na Universidade do Texas {Austin. TX. EUA). As culturas forem mantidas em meio de proteose modificada. O meio de proteose modtficadc consistiu de 0,25g hlaNO> 0,09g KM-IKfo 0.175g KH^PO^ Q.025g, O.O25g de CaUl; 2HA 0,075g 25 MgSfX 7HzO e 2g de extrato de levedura por litro (g/L).

Coi^EURiÒL jde^T^smídem Para expressar a forma segregada de Invertase em Chlorella protoihecnides, um gene SVC2 Saccharomyces eeravisiae fm colocado sub o controle de tfos promotores diferentes: Fhonwior 35$ de viras mosaico da eouve-flor (CMV), promotor de vírus Cblorelkt. (NC-lAg e promotor tiUPl Chlorella, Um gene de

107/127 levedura SUC2 foi sintetizado para acomodar o uso do codon otimizado para C. prototheeoldes s inclui otna seqliència de amai necessária para dirigir a secreção de invertase extraeelular. Cada construção foi construída em pBLUESCRlPT K5+, e IkoRl/ASCí, Ascí/Xhol e sítios Xhoí/BamHl foi introduzida para cada promotor, gane da 5 invertase e CMV 3’UTR, respeotivaraenK por arnpüfieaçdo PCR utilizando perimes específicos. Produtos de PCR purificados foram dorados cm seqüõncia. Uma ilustração da construção fired ft mostrada na Figura 25,

.....ás......ÇMrereig......B.9í9.lte».ides: Uma cultura de Chlorella protothecoides foi cultivada em meio de proteose cm rets agitador giratório sob luz 10 contínua de 75 rnumou fótuns m ^J a'^s, até chegar a. uras densidade de células de 2xlf?'' eéluWrrâ.

Para a transformação btolísiiíra, os transportadores de ouro S550d Seashell lechttokígy foram preparados dc acorda com o protocolo do fabricante. Resumidamente, uma construção lineaõzada (2b ggi por Bani foi misturada cora 50pl dc tampão de ligação 15 e 69 pl (3 mg) de transportadores de ouro S.550d e incubados no gelo por l min. Tamptio de precipitação (199 μ 9 foi adicionado, e a mistura foi incubada em gelo por mais um | min- Após o vórtice suave, as partículas revestidas de DNA foram granulados por rotação de IfkíjíX) rpm em uma microocntrífega Bppendorf 5415C por 10 segundos. G grânulo de oure» foi lavado uma vez com 59(1 ul de cranol l()()% frio, tcvesòdos pot breve rotação na 20 nricrocentrífuga, e reasuspenso coto 59 p.l cie etanol frio. Depois de tuna breve (1-2 seg ) sonieaçâo, 10 ml de partículas revestidas cum DNA foram imcdíatamente transferidas para a mentbraca transportadora. As células furam colhidas, lavadas uma vez com ágt-a destilada estéril.· ressuspensas em 50 pl de meio (l x 10' células), e foram espalhadas no terceiro centre de urna placa de- protease não-seletiva. As células foram bombardeadas com 25 o sistema de liberação dc praricuias biotxrâsítca PDS-iÔOO/He {Bto-Rad), Os discos de ruptura lí 100 e 13511 psi) foram usados, e as placas forarn colocadas 9 e 12 ran abaixo da tola/conjunto macroíranspuríador. As células se recuperaram a 25X pot 12 a 24 horas. Sob recuperação, as células foram raspadas das placas cura uma espátula de borracha, misturadas com ftX) pl de meio e espalhadas sobre placas de proteose modificada com 1% 30 de sacaross. .Após 7 a Í0 dias de incubação a Sís^C no escuro, as colônias que representam células. transformadas eram visíveis nas placas.

Para transformação com eletroporação. ae eêinlas furara colhidas. Invadas uma vez com água destilada estéril, e ressnspensas em tampão tris-fosfatu (29ra M Tris-HCl. pH 7.0, l m.M de fosíulo de prâásskd. comendo 59 m,M de xacarose a uma detKldmíe de 4x11/ 35 oéirâtís/nd. Cerca dc. 250 pl de suspensão de células (I x 19B células) foi colocada em uma cubeta de eletroporação descartável de 4 mm de abertura. Foi adicionado 5 pg de DNA p’axnntdsui iinearizado pHyg e 200 ug de DNÀ transportador (DNA de espcs-m» de salmão laminado) para a suspensão de células. A cubeta de elelroporaçâo foi, então, incubada em banho-maria a 16X por 10 minutos, Um pulso elétrico (I100 V/çm) foi então aplicado à célula em uma capacitàttcia de 25 mF (não foi asado amperimclro para a eletroporaçéo), 5 utilizando um aparelho de eletroporaçSct gene pulser 11 (Bio-Rad Labs. Hercules, CA). Λ cuveta foi então Incubada etn temperatura ambiente por 5 minutos, em seguida a suspensão celular foi transferida para 50 ml de meio de proteose e agitada em um agitador giratório por 2 dias. Depois da recuperação, as células foram colhidas em baixa velocidade üpm 4(44)), ressuspemtas em meio de proteose, e laminadas à densidade baixa em placas de 10 proteose com 1% de sacarose. Após 7 a 10 dias de íticubaçãti a 25^eC no escuro, as colônias que representam células transformadas eram visíveis nas placas.

rmnsfo^^^ As colônias foram colhidas de placas de protease modificada crescidas no escuro com 1% de aae&rose, e aproximadamente a mesma qutmtidade de células foram transferidas para 24 poços contendo l ml de meio 15 líquido de proteose mod)ficada com 1% de sacarose. As culturas foram mantidas no escuro e agitadas por agitador orbitai de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm por 5 dias.

Para verificar a presença do gene da inveitaxe introduzida cm transfonnantes de Chlorclla, o DNA de cada transformante foi isolado e amplificado com um conjumcs de primers de gene-específico (construção CMV; Forward primer 20 (GAACCAGGTCfTCAAAGCÁA) (SEQ R> NO: 6) / primer reverso ('rCCGGTG'fGrrGTAAGTCCA) (SEQ ID NC; 9), construtor de CV; primer anterior (TTGTCGGAATGTCATATCAA) (SEQ U3 NO: 10) / primer reverso (TCCGGTGTGTTGTAAG'IX'CA) (SEQ ID NO: li.i, e emjsrruyão de fUJEl: primer anterior (AACGC.'CTTTOTACAACT’GCA) (SEQ ID NO; 12) > primer reverso 25 t'ffJCGGTiHG'n'GTAAGTCCA) (S.EQ ID NO: 13)). Bars o isolamento rápido do DNA.

um volume de células (aproximadamente 5 a 10 uL em tamanho) foi ressuspenso em 50 uL de K) mM Na-EDTA. A suspensão celular foi incubada a 100%.'. por 10 ®a e soaicada por 10 seg. Apôs centrifogação a 129000 pur 1 min. 3 ut do sobrertatbtnte foi tuslizadu para a reação dc PCR. Λ amplificação de OCR foi realizada tto termocíclarfor de DNA (Perkin30 Ebner GctseAmp 96(41). A mistura de reação (50 ut) contmha 3 ut de DNA extraído. 109 pmol de cada um dos respectivos primers descritos «cima. 209 uM de dNTP, Ô,5 unidades de Taq DNA polimerase (NEB) e tampão de Taq DNA pnlimerase acordo com as instruções do fãbric&me. A desnararação du 13NA foi realizada a 95^<:C por 5 min para o primeiro ciclo, e depois de 30 seg. O recozimento do primer c as reações dc extensão 35 foram refereados & 58^i!C por 39 seg. e 72^C por I min, respectsvamente. Os produtos de

PCfe foram visualizados em 1% de géis de agarose corado com brometo de etídlo. Λ figura mostra cs resultados dtí gertótipct da PCR dc fransformames C. prototheco'des usando o primers gene específicos acima identificado. As setas mostram o tarnttnno esperado do produto da PCR. e as estrelas representara amostras de DNA de cada transformante mostrando o produto de PCR correspondente ao tamanha esperado (V: Apenas vetores, 5 WT: üpo selvagem).

Ç.ygsffmgatp...ep? Odtura Líquida: Após cinco dias de crescimento no escuro. o transformantc geuótipo-pmutivo apresentou crescimento positivo em meio de proteose liquids mínima * de sacarose no escuro, enquanto células de tqxí selvagem não apresrmt&ram crescimento act mestnct meia act escuro.

EXEMPl.,0 23 lGuisrôriníj£ã<L.dg..Xt^^^

Lgf«vtsmg:

Ifoããlissç.segrgtada: Um gene codificando uma sacarose ravertase secretada (Banco de Gene acessâo NP„.012l()4 de Saccharomyces cerevisiae) foi smtetizado de novo, conto 15 um fragmento bp 1599 ASC LXho que postenormeste foi subclonado em um derivado pUC19 possuindo o promotor 353 do virus do mosaico da couve-flor e 3 ‘UTR como cassetes EcoR l/Ase e Xho/Sac .1, respectivamente.

meio trtiítzado nesses experimentos foi o meio de base líquida (ver Exemplo )) e melo de base sólida U- 1,5% de agarose? que contêm 20 carbono fixo na forma de sacarose ou glicose feomo desjgnados) a 1% de concentração final. As cepas ttulusadas neste experimento não cresceram uo escuro em meio tie base na ausência de uma fonte adtcíonal de carbono fixo. As espécies foram riscadas em placas, e cresceram uo escuro a 28^C'C. Colônias únicas foram colhidas e utilizadas para inoeular 500 mL de meio de base ItqGda contendo 1% de glicose e conseguiram crescer no escuro ate a fase de 1og utédio, medindo a contagem celular a cada dia. Cada uma das segtttni.es eepas foram previameme testadas quanto act crescimento da sacarose no escuro como urna dnlea fonte de carbono c uào apresentaram nenhum crescimento, e assim foram escolhidas para a transformação de uma invertase .secrelada: Gj Chiorella prolothecoides (UTEX 31); t2j Chlorelia nüuuimtma (UTEX 2341}; e t'3) Chiorella ememnii (CCAP 211/15).

cultura suficiente foi crerttrifngada para obter eerea dc Líxií.^ células totais. O grânulo resultante foi las ado com os meios de ba^e vem adição de fonte tie carbono fixo. As células foram novamente eentnfugadas e o grânulo foi re.ssuspen.se' em volume de meios de base suíimente para obter 5 x llf a 2 s l()^% células/ml. 250-L090 pi de células foram então colocadas era placas em meios de base sólida suplementadas com 1% dc sacarose e deixadas par secar sobre « placa em uma tampa estéril. O DNA plasnndtal foi precipitado sobre as partíctdès de ouro dc acotxlo com as reeomendaçi^es do fabricante (Seashell Teehnology, La .Jolla, CA), As transformações foram realizadas utilizando um sistema de liberação de partículas BioRad Ele PD.8M0ÍM utilizando discos de ruptura 1350 RS1 com e, conjunto nracroeatregador fixado a 9 centímetros do suporte de disco de ruptura. Na 5 sequência de transformações, as placas foram incubadas no escuro a 28X. Todas as ce-pas geraram várias colônias transfoiwntcs. As placas de. controle transformadas sem inserção dc invertase, utas preparadas de outra maneira idêntica. nã» continham colônias,

G DNA genômico fui extraído de células de Chlorella prorothecoides do tipo selvagem e d»S tolómas 10 transformardes da seguinte forma: As células foram resstjxpensaa em 100 uí de tampão de extração (87,5 m.M Tris Cl, p.H 8,0. 30 mM NaCI, 5 mM EDTA. pH 8,0, SDS 0.25%) e incubadas a 60 ^c C, com misturas ocasionais através de inversão, durante 30 minutos. Para a PCR, as amostras foram diluídas l: 100 em 26 mM Tris Cl, pH 8,5.

.A genniipagetn foi realizada em DNA genômíco extraído de WT. transformamos e 15 DNA plasmídi&l. As amostras foram genotipados para o gene marcador. Primers 2385 (5 'CTGACCCXlACCrATGfKrAGC'GCTCITCKiC 3') (SEQ m NO: 20) e 2279 (5 'CITGACITCOTGAGCTGGAATITGTCG 3\i (SEQ ID NO: 21) foram utilizados nesta geaotipugem de PCR. O perfil de PCR utilizado foi a segui me: dcsnàturação a 94^<!C por 5 mm, 35 ciclos de 94XN30 seg , 61FC-30 scg., 72X -3 min; '7PC -5 min. Uma Panda de 20 tamanho idêntico foi ampliado a partir dos controles positivos (plasmídeo) e dois transfortnantes de Chlorella protothecoides (UTEX 31), como mostrado na figura 27.

Análise da Chlorella niinutissinia e transformastes de Chloreíla emeraonii: G DNA genômico foi extraído de. Chloreila WT e dos transfortrrantes da seguinte forma: As células foram ressuspensas em .100 uí de tampão de extração (87.5 mM Tris Ci, pH 8,0, 50 mM 25 NaCI 5 mM EDTA, pH 8,0, SDS 0,25%) e irretibadas a 60 ^e C. com misturas ocasionais através de inversão, durante 30 minutos. Para a PCTL as amostras foram diluídas 1 ItM) em 20 mM Tris CL pH 8,0 À genotipagem foi realizada em DNA genúmleo extraído de WT, transRirm&ntea e DNA pla.srnidial. As amostras foram genotipados para o gene marcador, Primera 2336 (5’ GTGGCCATATGGAC'TTACAA 3'.i (SEQ ID NO;22) e 2279 30 (5' CI^GACTItrerCACXlÜGAA^TrGTCG 3^!) (SEQ ID N0:2l) foram designados grupo de primer 2 (produto esperado 1215 bps, ctxpranto primers 2465 t.5’ CAAUGGCIGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3') (XEQ U3 NO:23) e 2470 (SX.IACCXGTCGTCATG'n'CACGGAGCCCAGTGCG 3Ί f$EQ lü NO: 24? foram designados grupo primer 4 {produto esperado 1442 hp). G perfil de ÍXR 35 utilizado foi s seguinte: desaaiuraçãu s 94C por 2 mm, 29 ciclos de 94Ά7-30 se.g.. 60X05 seg.. 7TC M rtün, 30 seg.; ?2^<!(>5 min, Um controle de plasmfdeo contendo a inverta.se secretaria foi usado um controle de PCR. Figura 28 mostra a transformação de espécies de microaigas Chlorella minutissima <UTEX 2341) e Chlorelia emersnnii (CCAP 211/15) com o gene codificando uma invertase secretaria,

A seqüêucia da invertase construção corresponde a «SEQ 1D NO: 25.

EXEMPLO 24

As cepas de algas usadas neste estudo estão listadas na Tabela 14 abaixo, e foram cultivadas em meio de proteose com material cehtlásico 10 fornecido exogenamenie e, em slgutts casos, carbono fixo adicional sob a forma de gbcose. Vinte e cuatna cepas de algas foram utilizadas neste estudo, incluindo os cinco gêneros diferentes englobando onze espécies diferentes de Chlorella. duas de Parachlorella e Prototheca, e urn de cada Bmcteococt us e Pseudochloretla. Saecharomyecs c&revísiae (cepa PL89-4A) foi cultivada em meio YPD (por litro, lOg extrato de bacto levedura, 20g IS bacio peptorta e 20g glicose). Ambas as algas e leveduras foram cultivadas em 28 *C ao escure». O crescimento dessas cepas em meios de proteose no escuro na ausência de material celulôsico de carbono ou otnros adicionais fixos não ocotteu ou foi extremanrente reduzido.

Liberação da gheose a part-r de material celnlôsico via tratamento de 20 despulimerização enzimálica: O material de forragem de milho úmido e explodido foi elaborado pelo «National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO) pelo cozimento da forragem de milho etn uma solução de 1,4% de-ácido sulfúnco e pela desidratação ds pasta fluida resultante, Usando um antdisador de umidade Mettler Toledo, os sólidos seco» na plants, tie milho dmido foram determinados a 24%. Uma amostra utràda de TOO g fol 25 ressuspensa ern água deionizada para um volume final de 420 mi c o pH foi ajustado para 4,8 corn 10 Ν' NttOH, Celluclast™ (Novozymes) (urns celuluse) foi adicionado a uma concentração final de 4% e a pasta fluida resultante foi incubada com aguaçào a 50%) por 72 horas. O pH deste material foi então ajustado para 7,5 com NaGH (variação de volume desprezível), e$terili?pdo por fiitraçilo suraMs de um filtro Q,22mn e tmmuamtdo a -2()92, 30 A amostra foi reservada para determinação da corfcemração de glicose usando um kit baseado de hexotpúmtse de Sigma, eordorme descrito türalxo.

l>NemmíâSâlL<iiÍdd>Íl^ fercagfflT?. 94 E-ilbo úmido: As concentrações de glicoxe foram determinadas pein utilização de Reagente de Ensaio de Glicose Sigma # G3293. As amostras, tratadas como descrito 35 acima, foram diluídas 4(X.t vezes c 4üpl foi adicionada li reação. A preparação celulúsica tis forragem de milho foi determinada para conter aproximadamente 23 g/L de glicose.

Tabela 14. Cepas de algas cultivadas em matérias-primas ceíulósicas.

Braeteoctxreus menor
Chlorella ellipsoídca	sÍÍ®ÍÍfeíííííííss
Chloreíia kessleri	UTEX 1806
Chíorella kessleri	ÜTEX 397
Chlorella emersonii	CCAP2im5
Chlorella luteoviridis	SAG 2 i 33
Chlcrelb lutecviridit;	SAG 2198
C h 1 o re 11 u lu t eov i ridis	SAG 22 M
Chlorella lurcoviridis	llÉiiilijlliíííjlií
EraeíeoetKctis mvdionucleutus	IllEXIBliillillliBB
Chlorella minutissima	CCALA 21)024
Chlorella mituitissima	UTBX2341
Chlorella ovsilis	CCAP2U/21A
Chiorcila protoíbecoides	eiilllM
Chlorella protothecotdcs
Chlorella saecharophila	UTEX29H
Chlorella sorokimatra	ÜTEX 1230
Chlorella sp.	SAG 241A0
	stiiiiite
Parse hl ore 11 a ke ss le ri
Psraehlorella kesslen	SAG 27.87
Protothecs morifonnis
Prototheea morif ormi s	UTEX 1434
Pseudoc h lore d a uquatica	SAG 2149

Na Tabela 14, e cüwo aqui utilizado, 1.ΠΈΧ refere-se à coleta de culture de a'gas na Universidade do Texas (Austin. Texas. EUA). SAG tefere-se à coleção de culturas de 5 algas na Umvemdade de Gottingen (Gottingen, Alemanha), CCAP refere-se à coleta de cultura de algas e protozoários geridos peia Assocàaçào Escocesa de Ciências Marinhas ;Escócia, Reino Unido) e CCAI..A refere-se á coleta de cultura de laboratório de algas no Instituto de Botânica. (Tkbob, Repítblíca Tcheca).

Após o trataras ntn enzimàtico e a sacarificação de celulose em glicose. xtlose e outros açucares monossacarideo. o material preparado acima foi avaliado como uma matéria-prima para o crescimento de 24 cepas de algas ou S. cerevtsiae nos meios tie proteose ΥΡΠ respectlvamente. O meio de proteose foi feito para «ma concent ração fint-l de glicose de 23 g/l.. (concentração final de gliemre gerada utravé* do tratamento cahdolfòea de forragern de milho), como foi YPD para o crescimento de 8. cerevisiae, através da adição de quantidades variáveis de- glicose pum e/ou material celulósieo despolinierizado. As concentrações variáveis de material ceiciósico foram incluídos, fornecendo 0. 12.5, 25, 50 e 100% dos 23 g/L de glicose cm cada meio, os componentes dos quais sào apresentados na Taheb. 15 abaixo, Um ml do melo apropriado fed adicionado aos poços dc 24 poços. S. cereviâiae, crescida de forma heterotrófica 28®C em YBD. servia como indeulct (UL 20? para os poços de levedura. Vinte microlnros de inóculo para as 24 cepas de algas foram fornecidas por células de algas cultivadas traxotroficamente em meios proteose comendo g/L de glicose.

Tabela 15. Preparações <	e matérias -primas celulósicas.
Vol. YR.lde fi|i||||||||	Vol, Mediu Proteose de lllOllIllll	Vol. de 100% Celulóslco compensados para Meio de Protecfse (?D	Vol. de 100¾ Celuló.sico compensados para YP.Ü (ml)	Volume	Percentual |(lllril:l
0	1	0	iSlllllllillil	1111111	lOliillllllllIlil
0	0,815	0,125	9	l	ei(i(i(lll
11:1111111/111;	ͮilli;illli;ill	9,25	0	l	25
1111111111	0,5	0,5	(illllllilllil	l	59
	1111111111	lllllllll	1111111111	11IS111	’11111111
Í;ll;;ilillllill;i	illllllilllil	íis^n^n		liiiiii	iÉlililililililC
	lÉlHNlIllllilllli	iteiiiii	illiilífiíffil;!:	lllllllll	12,5
015	lllllllll	l/lllllllllll	IBlIlllllill	1111111	;:B:|llllilll:
9,5	0	0	9.5	I	50
ilillllllllli	0	0	1	l	190

A Tabela IS mostra o volume modificado de forragem de mrlho despoõmerizado W para, conter componentes dc meio proteose ou YPD que foram adicionados ao meio proteose ou YPD, respesúvameate, para produzir tnctos qyy contenham o percentual indicado dc esluiósteo. Os meios foram elaborados dc fonna a obter urna concentração de glicose final de 23 g/L em todos os casos. O volume du mere anterior à adíçào de 20 pl de levedura crescida da fase log médra ou de células de alga foi de l ml. As células foram 15 incubadas dois dias no escuro nas variadas concentrações de fontes de celulose em 21C cotn agitação (rpm 300,1 O crescimento foi avaliado pela medida da absorbância a 7S0nm cm um cspeotrofotbmclto UV, Sufprcendeuíemeaie, iodas as cepas cresceram no material ceiulósico preparado com Celluelast, incluindo condições de meios em que 100% de açócarcs fermcntâveis foram derivados dc celulose

EXEMPLO 25

Cepas de algas usadas oeste, exemplo estão listadas na Tabela 14 (acima} e foram culovadas em carbono fixo acrescido de adicionais reere de ptoteosc na forma de material eelulóster» despoliraerizado e/ou gbcose pura. Saccbaromyees cerevisiae (estirpe pMSMa) foi cultivada em meios YPl) carbono f;xo acrescido de adicionais aa forma de material ceiuiósicu despohmerizado e/ou glicose pura. Απ-bas as algas e leveduras foram cultivadas era 2AC no escuro.

δ Uteraçüq.....da....gjicsse....a.....B.rtír....dc..........

de spoli me rização. euzsrarara ís : O material de forragem de rallho explodido e úmido foi elaborado pelo National Renewable Energy Laboratory (Golden. CCA pelo cozimento de forragem de mslho em tuna solução de 1,4% de ácido sulluneo e de detodraração da pasta fltrakt resultante. A Poufouw Grgotnm também foi elaborada pelo National Renewable 10 Energy Utboraiory (Golden. CO?. utilizando o ntestno método de forragem de nulho. A polpa dc beterraba, gerada através do tratamento de pectinase, foi fornecida pela Atlantic Biomass. Inc. de Frederick, Μβ. Usando um aaalbador de umidade Mettler Toledo, os sólidos sceos foram de 24% nas forragens de miíbo úmida, 2ôG na fomúrtmt virçztruuí e 3.3% na polpa dc beterraba. Uma amostra de I00g de forragem de milho úmido ou de 15 Amfoum ytrgoram foi ressuspensa em Aura deionizada para um volume finai de 42.0 ml e o pli ajustado para 4,8 c«m 10 N N,t(>.li, Para a polpa dc beterraba, 8,8 gramas dc sólidos secos foram levados a 350 mi com âgua delemzada e o pH ajustado para 4,8 com NaOH •γ·^

WN, Para todas as populações animais, Accellerase 1009” (Geue-ncor) (complexo dc uma enzima celulase? fo; utilizado us proporção de 0,25 rui de enzima por grama de btoraassa 20 seca. .As amostras foram incubadas com agitação (l 10 rptnt a 51>*C pur 72 horas. O pH deste material foi erttão ajustedo para 7,5 com NaOH (varntçtto de volume desprezível), esterilizado por fdiraçã» através de um filtre 0.22um e usado cm expert memos de cmsmmettio descritos abaixo. A amostra foi reservada para determinação da concentração dc glicose usando um kit baseado em hexaquinase da Sigma, conforme descrito abaixo. O 26 mesmo conjunto de .fontes de celulose também fos preparado usando Celhtclas?’*'· (Novozymes) (eclulase umx conforme descrito nu exemplo anterior.

ÇRirs...AÇg.çlifeBãS...l^âl As- concenlraçõcs dc glicose foram determinadas utilizando o Raagsnte de, ensaio de glicose Sigma 8 G3293. As amostras, tratadas como descrito adma, 30 forara diluídas 400 vezes e -40uí foi adicionada a reação. As preparações de celulose de forragem dc -oilbo. xAmúrará vfognr«tn e polpa ds beterraba foram determinadas para conter cerca de 23.6, 17,1 e 13,7 g/L de glicose, respectivamente.

Depois da despolnne.rização enzunática de fontes de celulose para glkose. xilose e outros monossacarideos, os 35 materiais preparados anteriormente foram avaliados eomo material prim as para ο crescimento das 24 cepas de algas na Tabela 14 e S. cerevtsiue em meios de proteose on ία

YPD, respectivamente. (Κ meios foram concebidos para conter uma concentração de glicoro consistente du rente a variação du quantidade de materiel eelulósicu derivado de ferrugem de milho. P«n/r.«m virgoram ou potpa de beterraba. Uni primeiro conjunto de raeio de. proteose e YFD cotttiaha 23,6 g/L de glicose pura, enquanto u.m segundo conjunto de meios despolimerízadox continha forragem de milho, Pctnt<«m e polpa de beterraba, eada uma das quais continha 23,6 g/L de glicose. Os meios de Pitmcam ví/gíjtum e de polpa de beterraba for&m suplementados com 6,5 c 9,9 g/L de glicose pura para normalizar a glicose em todos os meios de celulose em 23.6 g/L. Um ml do melo apropriado foi adicionado aos poços de 24 poços, S. cerevísi&e, crescidas heterotroficameme a 28*C em YPD serviu corno móculo (20 ul) para os poços de levedura. Vinte microlitros dc iaóculo para as 24 cepas de algas foram fornecidas por células de algas que cresceram mixotroficamenie em meios de proteose contendo 20 g/L de glicose. Todas as células foram incubadas dois dias no escuro nas variadas concentrações de fontes de celulose a 2M⁸C com agitação (309 rpm), O crescitneato foi avaliado pela medida da absorbãneia a 75foim em um espectrofotômeíro ÜV. Surpreendentemertte, íucias as cepas cresceram rto material de forragem de milho, /Wtw e polpa de beterraba, preparados com Accellerase 1000^Ϊ!''^: mu Celluelast' ^v\ mcítdndo condições de meios cm que l(X)% de açúcares fermentáveis fixam derivados de celulose. Sob nenhuma combinação de matérias-primas celulósicas e enzimas despolimerização. S. cerevisiae superou crescimento cm uma quantidade equivalente de glicose pura, indicando que os inibidores do crescimento da levedura no material celulósico causaram um grande impacto sobre a produtividade da fermentação. As combinações de eepas <ic algas, enxiutas de despolinterfenção e matérias-prirnus cora .100% <lc motiossacarídeos derivado? de celulósicus que superaram 100% de glicose, pura são apresentados na Tabela 16.

I sfeela lt\ Cembmaçòes Jc alps. emttm.ts c reraertu^-primas

Matéria-pri ura e despei imerização enzimática	GÕnero/Espécíe	Fonte/ Cargo
forragem de mil hofee 11 uc lasiT M	Breeteococcus tratttu	UTEX 66
polpa de beterraba.'' aceslIeraseTM	C h 1 ot c 11 a $ 1.1 ipsoídea	SAG 2141
Panic u.m v í rg a tu m/ accellemseTM	Chlorella kessleri
polpa de beterraba/	Chlcrellit kesslert	UTEX 397
Panic um vi rgstitt m/ acccHeraseTM	Chlurelkt luteuvirldis	SAG 2133
polpa de beterraba/ aecelleraseTM	C h 11» re lia l u tec-v i rid I s	SAG 2133

Panicren virgatunV accelleraseTM	Chlorella luteovirídis	UTEX 22
polpa de beterraba/ accelleraseTM	Chlorella luteovindis
forragem de milho/ accellera.se TM	Chlorella Imeovirklis
polpa de beterraba/	Cblotella protothecuídes	Ι.ΠΈΧ 25(1
polpa de beterraba/ accelleraseTM	Chlorella sp.	5|ÍÍB|Í||||
polpa de beterraba/ accelleraseTM	Parachloreila tosieti
Panieum vhgatunt/ accelleraseTM	Frotoí beca mod form is	ÜTEX 144 i
polpa de beterraba/ iiccelleraxeTM	Protolheca moriformis
forragem de milho/ aceelleraseTM	Pr ototheea mori form i s	UTEX 1441
forragens de milho/ celfoclastTM	Ft ototheca mod forra i s	UTEX 1441
forragem de milho/scccBe raseTM	Prototheca mori form i s	llllillil
polpa de beterraba/ accelleraseTM	PseudochkJteHa aquat i c»	SAG 2149

EXEMPLO 26

L4pM...g_;..gP^ÍR6FE,JA,,ghÀLO;. As sementes das coltoras de vánas cepas de microalgas identificadas a seguir. foram mlctadus em I ml de culturas líquidas em 24 poços e cultivadas autotroficamente por 48 horas na luz. agitando a - 350 rpm. As placas foram preparadas com l.S% de meio de proteose sólida baseada em agarose contendo 1% de glicose, glicerol. xilose, sacatose, frutose, arabinose, mauose, galactose. ou acetato <omo única fonte de carbono fixo. Pars cada copa, 5p.l da cultura de 34 poços autotrôficos 1D foram manchadas para o meio sólido. As placas foram incubadas por 7 dias no escuro a 28®<- e examinadas para o crescimento em relação a uma placa de controle que nâo contêm carbono adicional fixo. O crescimento foi observado para cada ama das espécies testadas com cada mnté-ria-pnma respectiva, como mostra abaixo a Tabela 17. O crescmteuto dessas cepas em meios de proteose no escuro na ausência de carbono fixo adicional eu não 15 ocorreu ou foi extremamente reduzido.

lí?/127

Tabela 17. E.spéciex de algas cultivadas em várias matérias-primas de carbono fixes.

Fonte de carbouo rixo	Gênero/Espécte	Fome./ Cargo
Glicose	IQlÉOllii®
Glicose	Chlotclla kessleri	CTEX 397
Glicose	Cblorelía rerokiniana	UTEX 2805
Giieese	Parachlorellu kessleri	SAG 12.80
Glicose	Fxeuduehlí.íreila aquation	SAG 2149
G Hoose	Cblorelía reisigi ii	CCAP 11/8
Glicose	Bracteococcus medionuefest u\	IJTEX 1244
iBíoiefiiiiiiiiiiiiiiiii'	iWoihKC?· stagnom.	GTEX 1442
Glicose	Protolheca moriFormia	UTEX 1434
Glicose.		iioili»
Glicose	Scenedesmus rubeseens	)i®ee
Glicerol	Parachíorel la kesskri	SAG 12.80
Glicerol	Ch lord 1 a protoibecoítíc s	CCAP 21 l/8d
Gheerol	Bradeococeus otedionucicatus	l/TFX 1244
(Qiiéételiiii	Prototheca moriformis	1.ΠΈ.Χ 288
Glicerol	Protolhectt moriFormis	UTEX 1435
Glicerol	C h lore I la minut i ssima	GTEX 2341
Glicerol	Ch lord Ia sp..	CCAP 2ÍÍZ61
Glicerol	Ch lord 1 st sorokiutatut	UTEX 1663
ifiiMIO	Ch lore 11 a luteo vsridis	SAG 2 í 33
Xüotu?	Chíordla dl ipsoidea	SAG 2141
Xilo.se	Pseudochioreiia aquatiea	SAG 2149
Xsiose	Cblorelía sp.	CCAP 2Π/75
Xtíose	Prutotheca moriformis	GTEX 1441
Xiio.se	Prototheca moriformis	GTEX 1433
Sacarose	Chhreíla seccharopbt la
Sacaroae	Cblorelía lutcuviridls	iiiiililillllllllllli
Sacaro&c	Cblorelía sp.	GTEX ÉE102
Sacarose	Chíoreíla ímeovindis	SAG 2198
Ssearose	Bt adeocoecu» medionucleutiis	UTEX 1244
Ssc3Ki.se	C h lore l í a m i n ut i ss i ma	CCALA 20C24
Frtm-su	Clílorulla keoderí	GTEX 398
Frufose	Chíoreíla trebousdodes	lilBlillllllllllIlIs
Frutose	ParaeII lord í a kessieri	ÍÍ1ÍBI®|||||||||||)
Frulose	Cblorelía luteoviridis	SAG 2214
Fndose	Chíoreíla protothetoldes	GTEX 31
Frutose	Chiorella protoihecoídcs	ilÉieiilllilllllf
Frutose	Chlurdla reisiglil	íBiiiiilllllllllllli
Frutose	Cblorelía protodxxoldes
Frutose	Prototheca trusriiorrtús	GTEX 1435
Frutose	Sceuedestnus rubesceus	CCAP 232/1
Arabinose	Cblorelía sp	CCAP 211/73
		GTEX 263
Munose	CbloreHa saccharophiía	GTEX 2911
Mauose	Fítra c kl oi e l la ke ss le r í	SAG 12.80

Manose	Chlorelfa sp.	SAG 24LS0
Oãiifosllllsíillllllll	Chloíclta angestoell ipsoldca	lOiOiiilBiBiBiHilIlliliif
Manose	Chloreila elHpsoidea	BAGtlillllllillillll
Manose	Cblorella protothecoides	UTEX '2 5 0
M ariose	Chlotella emersocti	CCAP 2(1/15
Manose	Brac teoevccus tm cor	UTEX 66
Mauose	Prototheca stagnora	UTEX 1442
Manosc	Prototheca morifonnis	UTEX 1439
liiOdfoliiiliiiii	õiidrtiiiiM	ιΜΙΜλιΙιιιιιιιιι
Manose	Sceoedesrnas rubeseens	iÍÍMi2»||^l|^||lll||i
iG4lOfofo ill	8 rac cococc as m inor	UTEX 66
Galactose	P&rachlorella kasslcrí	SAG 14,82
Galactose	Parachlorella beiierinckii	SAG '2046
Galactose	ChloreUa protothccoidcs	ÍÉÍÍÍI2Í|I|||||(^|1|^||II|:
Galactose	Chlorella sorokiniana	UTEX 1602
Galactose	Parachlorella kessleri	SAG 12 80
Galactose	Pse ud e< bl ore 11 a a qpat tea	SAG 2149
Galacrove	Chloreba hsteoviridss	SAG 2214
ί^^^ϊ^^ΙΙίϊΙίϊίΙίϊίϊίϊίϊίϊίϊίΙΙΙ		liiitllM
Galactose		CCAP2U/5O
liiòoo	Chlorelia prototheaoides	lüiiisiiilsillíillllíííilllí:
Galactose	Chlorclàa prolothccoidcs	UTEX 264
Galactose	Bracteococcus toedionucleaitts	UTEX 1244
Galactose	Protothcca mw i form í s	UTEX I486
Galactose	Prototheca moriformís	UTEX 1441
iG®§i® iiiiiifiiiiiii		itiliSlillliliilii
Acetate	Chiorella sorokitúana
Acetato	Chlorelia sorokmíana	itiiiillillllllllllll^
Acetato	Chi ore lia; titeo v ir i d is	UTEX 22
.Acetato	Parachlorella kessíori	SAG 12.80
Acetato	Parttchlorella kcssfeti	SAG 27.87
Acciaio	Chlorelfa sp.	SAG 241A0
lAoBOllilililllil	íCilOBidOãBRdfelllllllllllll	iiiiillillllililillllllll
Acetato	Chloralki prototliecotdes	IÍÍBÍÉ||^||||lll^||ÍI|;
	Chloral la protulbeeoides	UTEX 411
lOiBfo:}||||||||||||||||	Chloral la elhpsoidea	Biliiliillllllllllli
IÔO®1Í	Chiorells ov&Hs	CCAP2I1/2IA
Acetato	ChlonsUa p rotoí hue oides	CCAP21 l/8d
Acetato	Prototheca stagttora	UTEX 144'2
Acetato	Chiorelia proto thecoidcs	UTEX 251}
Acetato	C b lore I ht s orok i th ana	UCALA 260
Acetato	Chioreíía vulgaris	CCAP2M/79
Acetato	Parach lorel la Kes sler	SAG 14.82

EXEMPLO 27

Iforófofo,dg..Cchija: Um lote E-Tank de Chlorella protothecoides fUTEX 250» (cerca de 1.2G) litres.! foi utilizado para gerar btomassa para processos de extração. O lote (# ZAÔ7126) fo: autorizado a funcionar por 100 horas, durante o controle dos nfuras de glicose em 16 g/L, depois que o tempo de alimentação do xarope de milho foi encerrado.

Os níveis de glicose residuais caíram pars <0 g/L, duas horas depois. Isto resultou em unia idade final de 102 horas. O volume do caldo final fot de 4.239.65 litros. Ambas as verificações eoutamínação do processo e uma análise minuciosa de uma amostra de caldo final não mostrou quaisquer sinais de contaminação. O t aldo fermentado foi cstHrifugado e secado em tabor. A células secadas em tambor foram resauspensas em hexano e 10 homogeneizados em cerca de 1000 bar. A extração de bezerro foi então realizada utilizando métodos padronizados, e o óleo de triglkerfdeos de. algas resultante foi determinado a ser livre de hexano residual.

O éleo de foglkafodcs de algas tinha mn perfil lipídico de cerca de 3% Cl8:0,71% Cl8:1, 15% Cl 8:2,1% Cl 8:3,8% C16:0 e 2% de outros componentes. O óleo foi primeiro submetido a hidroeraqueamerno, resultando em «nu perda de rendimento aproximado de 20% de água e gases. A hldroisome-rizaçâo foi então realizada, com uma perda de aproximadamente 10% na produção de gases. A primeira destilação, em seguida, foi realizada para, remover a fração nafta, deixando o produto desejado. Cerca de 20% do material foi perdido para a nafta tra primeira destilação. A segunda destilação foi então reahzada a utna temperatura suficiente para eliminar frações necessárias para satisfazer as especificações ASTM D975, mas deixam utras fração de fundo que. não chegaram ao ponto de 90% para uma destilação Í.7975. Cerca de 30%' do material foi deixado rta fração inferior na segunda destilação. O material resultante fot então testado para todas as especificações ASTM D975.

As figuras 29 e 30 ilustram um cromatógrafo a gás e um lote de distribuição de ebulição, resects varoente, do produto diesel renovável final produzido pelo método da invenção. A tabela 18 mostra a distribuição ponto de ebulição do produto diesel renovável resultante, e a. Tabela 19 mostra os resultados de uma análise do produto fmal para o cumprimento das espectfícações ASTM D975

Tabela 13. Ebulição couto de- distribuição tie produtos dieseteaovável.

íRílRO :$3OiÒ:	:::::::::011: '·;	% iÁ*$síf (((Oioi:	3Γ- (((((((O:(((	lllfOsl::: rV.«ÍX::'S<iS	»9 ' C		1118:1:1
IBP	Ϊ564	ΙΙΙίΛΙΙ	26·.§	$2 6	293 8	lIlBlll	3.1:5.$
ΙίίβΙΙ	163.4	09	264,6	53.6	394.9	79.0	316.4
ϊϊϊΟίίϊϊϊ	173.4	ϊ55ϊϊβ3ϊϊ	2M.2	ίίϊϊϊΐΟίΙϊϊ	360	?1.0	:1:»1
3.0	173,2	29.0	.268.2	55.9	305.5.	llliloisl	:1»Í
1:11:1:1:	(1015:	30.0	271.6	56.9	38.0	82.8	llill:
s.o	194.3	((((((iioliii	272.4	11:1:8111:1	386.9	8.3.9	3; 9.0
6.0	t86.6	IlisBili	2.23.4	38.0	366.4	84.0	319.6
l:í?ll:ll:	;9?.S	XO	236.2	59.0	366.6	8,5.9	35:8.2
g.íí	Í18141Í	sssííOíiss	2-86.0	llllOlil::	367.6	86.0	328.8
Islllil	(W15i	iiiiiiiilOll:	282.4	lllíOlill	307.4	87.0	'321.2
1181111	(lOlsi	36.6	28.5.2	iiidoii	397 6	88.9	32 s .8
n.o	(lòl:::	sssísBÉísí	287.8	S3 0	11Ó171	111O111	'322.2
12.0	2Π.6	32.6	289 8	64,0	398.9	111181:1:5	322Λ
13,0	221.4	39.9	2.81 ξ	60	398.8	91.0	32'2.8
1O1:551	230	sss34dÉí3í	2W.2	60	309.2	92.0	553 ?.
15.G	529.8	91..6	293.8	sssslOsss	309.6	93.0	324 4
íWlllís	.22'3.5	95.6	298.8	68.6	3Í0.2	90	,326.3
1218:511	2Ϊ5.8	93,6	297,6	llllÒOll:	l:l:te	lllOílll	339.4
lilRlll	536.8	M.C	298.4	111ÒI11	lllflll	96.9	1O11
liOlll	546.5	95.6	299,2	11101:11	111;211::::	9? .9	329,4
5818551	54X0	95.6	2,99.8	111B111	312.2	98.9	346.2
iiiiii	IgOoli	iillBll	3G0.-S	111O111	1111111	99.9	342.8
:::^21555	260 2	48.0	301.2	11:10111:	1111111	FB?	ϊΐβ:
501111	25.16	49.9	17382:11:	11:10111:	.314,2
24 0	255.2	30.6	302.6	lll»ill	1111111
(01(51:	258.8	31.G	113801:	11:1:081:1	.315.4

Tabela 19. Relatório .Analítico <k produto diesel renovável por meto de cspoeificaçôes

0975.

00090001:11:::			íj;SOSOs4<
bãOlllillIlIls	:)1:::10000	filfillllilil	ilBilil
WWWWWíO	Àrjys s Sobõe-BSí	íSSÇSssssssssSsssSss:	ííííVOWsíís
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W.3		SSWSSSSSSSSSSSSSO
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D513	hwrarcSeCôtaí»'	lll^illflslllllllllfí
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D524	Rosíqob òb Cíirtxw KBBíat.etkw	íSí®|í|ííj5s(3(sís|s	flílBillííí
dslllliiillll	Ponte òs ?ísns>n®Bia	ililiilililililillllflfl	1110111:1111
ÍCT	m & toste & tOb”'	iiiOiiiiiiiii	1:1:1019901
0011111:11111111:1:11		líBilllllliilI	ís:3ííí0Oísí:
Beiilllilsi	se; irspsçSo réosi ílsbi	113OibiEilÍ111311311
	| : li	l|:0ôi OBiiiiii li reovâ®	isíOiísii:::::::::
		sísOpbOssííííííísíí ^iasvaáo	:iil:1ÓiO::i::ll
ÉtWsíSSSsíSííSSSsi		.................................................................
DSÔt		.................................................................
WásS^rrgSgsgsíí	t.ubnokiree ífrsatsa ás áss^sss;	3S:®íSíSí“:SSí:::(íís	<:::::iOl:::::::31:::l·:

SEQUÊNCIAS

SEQTDNOJ

Promotor HUP de Chlurelia {subseqüêrteio do GertBrmk rtrtmero de aeevso

X55349;:

gatcagacgggcctgaccígcgagauatóaagtgeicgiaggcaacc^ictcagcagcrgcdggtgugggfetgca ggatagtgitgeagggccecaagg&cagcaggggaaettac&eeugte«cga<ax:agttaatg.g3gtgeangect<;aagagc ciagccggagcgcraggetacaiaengcegcaccggiatgaggggatatagtacicgcaagcgetgroiítgtgagatgggcagt gctgceeataaaeaawggctgeteageeamgUggcggav<a«mgggggggeeagc»itigccfgaettK-gggtagggtga aãac<gaácaaagactace«aaacagaattteueetecuggagguagegcuggecggeecgcctgcgcecacittggogctce gaaeaeetee&tagetglaag^cgeaaacai^eeggaetgUgtcugcaetcttteazggceataeaaggtcatgtegagattag igcigagta&gacaetatcaceceaigticgaug&agaegtgacdcatgccaaeetgceectgggcgtagcagaegtatgeeatc atgaceaetagcegacatgcgeigK-nbgcc&cc^ia^uaetggucaecgetugaagtcgtgccgcacaccteegggagtg agtecggcgâelcefoeceggcgggcegcggccetaccigg^agggtcgwaiaegcceaegaeeaaaegaegeaggagg ggartggggt&gggaatceeaaecageetaaccaagacggeacctataataataggtggggggacEiaeagecdatatogcas gcutgggigcctatcugagaagcücgugnggaglggcfgtgtauggtcgacectaaggtgggtgígccgcagccigaaaeaaa gcgtetsge;q^4genc?reaaigtgt<.agí.egtígtgtt.ícagtbttatigtat£';ctaitgtttg9cgtgutaggciggig<:aggue<: aectactgtggcgggecattggttggtgettgaaKgcctcaceatcluaggtctgaacgctcactcaaacgtxtttgtacaacígca g^ctuccttggcgctgcaaetacagtgtgcaaaccagcacatagcactcccttacnkacccagcagtacaaca

SEQ B> N0:2

Nitrato redutase promotor <fe ChíoreHa el lípurâfes pari ir de A Y397383:

«gctgcgca<:k'agggccgoKagctcgdgatgtcgctocaaatgeggtcci.'Ci'gamttt^tcUcaretieuxaech ggtggcdteuggccagggccttcagctgcatgcgcacagatxgttgagctcctgatcagcakckaggaggeccutgacaag caagcecct^gcMgcccattcacggggtaecagtggtgetgaggtagalgg^tgaaaaggatlgctcggtcgsttgctgctc atggaattggcatgtgeatgcaigucaca^atgco^eaggctdggagcaagagagcatgaatgccitcaggeaggdgaaagt W tcctgggggtgaagaggcagggccgaggartggagg^gaaagoakaaglcgtegotcatgctcatgtntçagtcagagittgc caag<tcacaggagcagagneaagamggotgcteaggtgtig<;ategtgtgtg?ggtgggggggggggggnaatacggtacg suíaigcacttggaâttcceaecteatgçcageggacce-deutgong&aucgaggeetgtggggtgagaàstgotcaractguec! cgügdgaggtaetkaggecgetgagcKa&agtegatgccdgekgtctatcagggcctgcauctctgggdgacoggetca gcctccacgcgggcaíggaguggcgucggcagegticatgiccgggcecagggcagcggtggígccataaatgicggtgatg 15 gtggggaggggggccgfcgceacaccattgccgitgclggctgacgcatgcaeatgtgg^ggcíggcàceggcagcactgg tetecageeagecagcaagtggctgtmaggaaageggeoaigftgttggtee&rgegcatgraanececagateaaaggaggga acagcttggattrgargta^gccea^cggaetg«atgtgcgatggcaggtccctngagkkccg&att«ctageagggí.adg tgacctascgcagcafgccsaccgcaaaaaaatgatigacagaaaalgadgcggtgigteualamgcigtaiUattcgithaaiea gcaasxaagHcga&acgcaaeíafcgtggtgatcaagtgaacctcutcagacttaectcgucggcaagguaacggaggeacca 20 aattceaattigatattatcgdtgccaagcugagctgatcntgggaaaccaaetgccagacagtggacigtgatggagigceceg i<gtggtggi!gct'klU'gaiiuggtit<gtcaitiK:i.aacg{gsiii.'uctcagtgaugggai:r.'at<.'iiga<.Citgre<aKa<.'uagsK'R'ct cdegaca^gagagaglgugcggcaglaggacgae-aag

SEQ ÍD NO:3

B, boiurüi 5T)TR maíaw desídrogenaae:

aattggauaccccgcgcaagaccgggttgtttggccgcctgaecggaaagggggggectgtcccgaagggggtctat creUgggggntgtcgggcgcggaaagtcgatgrtgatggacctctlcttcgiKCatgtvggggicWg^^g^'cgegtcc aatcgucgagttcatga?ggaggtgaatga&cgcategc<4»cegaíaígcgcc<tagaagcgggcgaocgatcg<x'cccgteg<.'t gcageoc«gccgaggaagtocggdg<tgg<gtt£;gaogagat§atgg<gí»egaaeag<o<ggacgeghigatcctgregcg gctgttcacôgcgotgatcgaggoggggg(gucgàkgkaçe^ctceaaocggo«gíxx;agggatoK!íatsagaacgggd eaaocgcgugcatttcdgcocKeawgcgctgatcg&ggcgcggdggacgigctggegfttgaaeggcocgaa-gaotatcg gcgcgaccggciggggcggeiggacacgtggtiggtgcccaatggccccu&ggegaegaRacc«gtcggcggeg.Rcttccg cctgaecgaclatccg^cgaggaigccgcgcatgtgcectctgaggaccigaaggigggcgggegegtgdgaatgtecccaa ggcgctgaagggcgtcg<'ggtcueu'g«caagcggítgtgeggugaagegcggggggeggcggamret.ggcggtcgcge ggggc«ecacae<.'g?í:atcetggtcggaateceeaagctgggggcggagaaocg.c&acgaggeggggegcba'^<xagetg atcgavg€g£retacgaaeataaggtcaagctgcicgccgeageug«tgecaguxxgccgaa«ctatg&aaceggegaeggc cggUcgagtttgagcgcagauagccggttggaagagatgcgctccgaggaRatctggcccanggcoalggdcggaggggc cttgaleaggcxniaalgcact&gCiurecaltoicgUluaaatUtaaacturtgtggaataacggUccocgacgecgeaatacacg uwgtccactaeggagtaggattgga

SEQ ID N0:4

Promotor RBCS2 de Chíamydomonas:

cgcttagaagautcgauaggegceagaaggsgvgcagccaaaccagg&tgatgingaiggggtafogagcacrtg caacccnatccggaagccccctggcccacaaaggciaggcgccaatgcaagcagUcgcatgcagcccctggagcggtgcoct cctgataaaccggecagggggectítfgitotuacmtttacaagagaagteactCíkcaK:Raa»oggtcttaagaagtctaic.cg lllllillllllllllllllllllllllllllllllllli

SEQ ID NO:5

W CMV-Hyg-CMV BamPU-SacH cassete a partir de pCAMBlA:

gg&tcsccgggaatU'ggcgegccgggeccaaoatggtggageacgacactetogtotocRX'aagaatateaaagat acagtctóagaagaecaaagggctattgagacitttcancaaagggtuatstcgggaaaccredcggaticcattgeceagetatct gtcacítoaicsaaaggacagtagaaaaggasggtggcaceucaaatgceatcaugcgataaaggaaaggctatogdcaagat gcctctgccgac:agtgguccaxagaigg8e<.cucagC£:acgaggagcategiggaaaiiagaagacg«e<.-aac«a<gK:ttoa 15 3agí?ítagtggatígargtgataacatggtggng<;acgacactctí?gtotàcte<aagaat.atouaag₅staeagicteugaagaeo _ivagggetaRgagactmcaaeaaagggraamcgggaaacctcctcggattceattgeecagelatofgtcac«eatoaaa&gg ac sg í agaaaagg a ag g t ggc acc taca&atgs cate at? g cgataaa ggaauggc tôt < g ί ic angaígcc tc t gcc gaeugtg gtcccaaagaiggacccceftcccacgaggagcatcgtggíiaaaagaagacgttccsaccacgicucaaagcaagiggadgat gtgataiclecauigacgisagggatgaegcacasteecacintíOUcgcaagíiectrectetataiaaggaagricatnsatttgga 20 g»ggacaogetgaaateaecagtctototmesaatc>atetototegagctttcge&gatoccggggggcaatgagiaratgsaaa aggctgítaetcaecgcgacgtítgicgagaagthírtgatogaaaagitegaeagegtetccgacuigatgcagctGoggagggc gaagaatc5.cgtgcfik.'agcttcgatgtaggagggcglggautgtc£tgcgggtaaatagclgcgecgatggttreiacasagstc gnatgtnatcggcactügcatcggeegcgcuccgaitccggaagtgcttgaeíittggggagtitagcgagagectgaeíruito cntctcccgccgtgencagggtgtcacgUgcaagacctgcetgaaacegaactgcccgeigttcuoaaccgglcgcggagget 25 atggatgcgategcigcggccgatetugecagacgagcgggtteggcccattcggaccgcaaggaatoggtoaaracaciaeat ggegtgarticimngegcgaOgdgaíOí-cuatgsgtatirtyrtggeaaíKJgtgatggacgacauegteagigcgtregtogugc aggctctogatgagotgatgctítgggougaggaotgceccgaagtecggeaeetogtgc&cgcggatttoggcíceaiKiWgt rotg3r:ggai.aaigguegcataa£.ag£ggtcattga<.'tggagcgaggcgatgiiegggga?t£ceaara£gaggtegccaacat arasfôtggaggíjcgtggdggctigiatggagc&goagavgcgí.tncdcgagcgga^atccggagcttgcaggntcgcca 30 cgaacegggcgtstatgctegcattg^cttgaccuactctateagagcnggttgscggcaamcgatgatgcagchj’ggcgc agggtogatgcgaegcaatcgtccggUkggagocgggacigtcgggcgtacaeaaafogcccgcagaagcgcgggogtotg ga£cgaiggtng{gt&gaagtaetog<regarag(ggaaaecgacgccgcagcactogfocgagggea&agaamgaglagatg ccgaceggaicigtcgatcgaoaâgctrgagntctocataataatgigtga^àgriccaagàíMagggaattagggtteetztagg gtttcgctcatgtgtlg&gcalata&gaaacccttagtatgraUtgtatttgtaairataotlctatcaatoaaaaictaaUectaaaacca 35 aaat£'cagla£taaaatceaga?txx'ccgaaUaaficggcgnasttoagracaaaaaaacgl<.'Cgcaaígigna«3agRgtcra agegtuaatttgíttacaecacaai&tarectgccaccagccâgcva^agctocccgaccggcagcfogggagaaaafoaccact akcggaagaacggcaaduagctgccgggtRga&auacggatgatctegcggagggt&geatgttgatigia&egatgacaga gcgUgutgectgtgatcaccgcgg

SEQ ID NG:6 <:(iacx>íiÇgteít.C;-iaagCíte

SEQ ID N0;7 ii ££ ίί &Ϊ <' § CM⁵* t

SEQ ID N0:8

ATGCTrcTrcAGcxxn^vnvn'nTcnvmK^vr<Km’mxrixx:cAAGAK:

AGCGCCTCTÀTGACGÀACGAAACCrCGGATAGACCAClTGTGCACITrACACC AAACAAGGGCfGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGAT GCCAAGTGGCATCTGTACFrrCAATACAACCCGxAACGATACTGTCTGCjGGG>AC GCCATrGTnXGGGCKCACGCCACGTCCGACGACOOACCAAITGGGAGGACC AA(X'AATAGCTATCG(.nX?CGAAGAGGAAiX?ACTCCGGAGCAITCTCCK.K?TTCC

ATGGTGiHTGAGTACAACAATACTrCCGGCmTTCAACGATACCATIGACCCG AGACAAiXKfrGCGTGGCCATATGGACTTACAACACACCGGAGICCGAGGAGC AGIACATCrCGTArAGCCrGGrXCGCjTGGrXTACACnTTACAGAGTA.re/\GAAG AACCCTGTGCTTGCTGCAAATrcGACTCAGTTCCGAG/XTCCGAAGGTCTTTrGG TACGACKICCTCGCAGAAGTCALATCATOACAGCGGCAAAGTCACAGGACTACA

AGATCGAAAl^nACTCGTCTGACGACCITAAATCCTÍKjAAGGrCGAÀTCCGGG 'FfCGCA AACGAGGGCT'ITUrCGGCT ALGA A IACGAàTGGUCACjGCGIGàTAGA <KrTCCCAACACUCK;AAGATCCCAGCAAGT<:crACrGGGTGATGrrr'ATrrCCA n'AATCCAGGAGCACCGGCAGGAGG’nvnTTAATCAGTAOTCGICGGAAGC TTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTTGATAACCAATCAAGAGTAGTTGAT’fTr

CKjAAAGGACTACrATGilGCTGCAGACrrTCTrCAATACTGACCGGACGTATGG

GACjíXKTrcnXXKIAlTGCGlXsCiCKTrCTAACrCOTAÜTAnGGGCATrCGlTCC TACAAACCCnXKyAGaKXnXXiATarCXXTCGTGACKMAATTCTCnxrrCAACAC

KrAGTACCAG<KX;AACX'CGGr\AACCGAAOTATAAACCrGAAAGa„'GAAa:G ATCCrGAACATOGCAACGCl'GGCOCCTGGAGCCGGTn'GCAACCAACACCAC

GTTGaCGíIAAGCCAxACAGCTACAACGTCGATCTTTCGAATAGCACCGGTACAC

TTGAATTTGAACTGGTGTATQCCGT(.:AATACCACCCAAACGATCTCGAAGTCG

GTGTCGiXKlACerCTCCCnXTrGGTTTAAAGGCCTGGAAGACCCCGAGGAGTA

CCTCAGAAT<KrG'mCGAGGTTTCT(KXrTCCTCCTrerrCOTGATCGCGGGA/K CAGCAAAGTAAAAnTGITAAfKIAGAACTXATATTHVXCCAACAGGATGAGCG

TrAACAACCAACCATrCAAGAGGGAAAACGACCTGTCGTACTAOAAAGTGTAr

GGTTTGCITGATC A AÀ A TATCCT GG.AACTCTACTIXA ACG ATGGTQ ATGTCGTG

TCCACC AACAC ATACFTCA TGACA ACCGGG A ACGCAC7GGGCTCCGTO AAC AT GACGACGGGTGTGGATAACClGTrcrACA'lWACAAATTCCAGGTGAGGGAAG TCAÁGTGA

SEQ ID NON

TCCGGTGTGTl'GTAAGTCCA

SEQ ID NO: If) 'n'GTCGGAATGTCATATCAA

SEQ ID NO: H

TCXCKHGTGTIG'FAAGTCCA

W SEQIDNO:12

AACGCCTTTGTAC A ACTGC A

SEQ 10 NO: 13

TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA

SEQ ID NG; 14 b’rrNETSDRPLVHFfPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYFQYNPNDTVW

GTPEFWGHATSDDLTNWEDQPIALAPKRNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDWP

RQRCVAlWT¥Nn>ESEEQ¥lS¥SllXK3YTFrE¥QKNPVLAAN$TQFRDPKVFWYE

PSQKWIMTAAKSQDYKlEIYSSDDLKSWKLESAFAN£GFT,G¥QYECK)LlEVFrEQ

DPSKSY W VMFlSFNKrAPAGGSFNQYF^GSFNGTHFEAFDNQSR VVDFG KD ¥ ¥ AL 20 QTFFNTDPTYGSALGlAWASNWEYSAFA^FrNPWRSSMSLVRK^LNlEYQAN^PET

EUNLKAEPÍLNISNAGPWSRFAWFFLTKANSYNVDLSNSTGTLEFISLYYAVNn-Q TISKSVFADLSLWFKGLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFrNR MSVNNQPFKSENDUS¥¥XVYGLI.,DQNILELYFNCJGDVVSTNTYFMTTGNALG<SV NMTTOVDNI^YIDKFQVREVK

SEQ IO NG: 15

MLLQAFLFLLAGFAAKISAS

SEQ ID NO: 16

MANKSLLLLELEGSLASG

SEQ ID NO: 17

MARLPtAALG

SEQ I» NO: 18

MANKLLLLLL1.LLLPLAASG

SEQ ID NO: 19

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SEQ ID NO: 20

CTGACCÇGACCTATGGGAGCGUTCrrGGC

SEQ 10 NO: 21 aTGAcrrcxxnrcAaorGGAAiTrGTCG

SEQ ID NO;22

GTGGCCATATGGAOTACAÀ

SEQ ID NO:23

IS CAAGGGCFGGATGAATGACCCCAATGGACTGTCKITACGACG

SEQ 10 NO:24

CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG

SEQ. 10 NO:25 gaanccccaacalggtggagcacgacacicicgK:iactccaagaatatesaagaiacagtocagaagaccaaaggg crangagacuncaacaaagggtóatatcgggaaacocLncgg&ftcc&ugaxxagetóiOgtcacncateaaaaggacagta gaaaaggaagglggcaccue^atgccateaitgegal&aaggaaaggcuKgitc&agatgecietgccgacagig^ccca aagatggaccccvacecacgaggagcWgtggu&aaagaagacgUecaaecacglctkíaíiagcaagtggartgatgtgaae atggtggagcacgacadcicgtetackXJíiàgaaialcaaagatócagtctcagaagaccaaagggcUttgagacftttc^icaa agggl<íaG.ii'.:gggaaae<:ícdcggíiU<Csmg£'c<'ag£'ias.<:l.gí£-.auitvíilcaíiaaggacagiagiiaaaggiia.ggtggeaí' ctacaamgccareaUgcgataaaggMaaggctatcgttCMagatgcetctgccgaGagiggicccaaagatggaeccecaceca egaggugcatcgtgga^aagaagacguceaaccacgudcaaagcaagiggattgmgrgatareu’c&ctgaegmagggm gaaguac.aaic.ec.ual.aO£:.ncg<.aagai.ci;t'Xeictauraag§aagimat9i;af9g.g'agaggaea2getgaastcai\:agt tnetctctauaaaOtatctcíggcgcgcearaic^rATC/dTnXTITChAGGCCd^riCTrTrrcrrcrFGCTG <TmTGCTGCCAAGATDACd2XlCCTCT.ATGACGA.ACGAAACCTCGGAl\AGAC(>\

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de produção de lipídios microbianos caracterizado pelo fato de compreender o cultivo de uma população de micro-organismos selecionados do grupo que consiste em microalgas, leveduras oleaginosas e fungos, na presença de uma fonte fixa de carbono selecionada do grupo que consiste em material celulósico despolimerizado, caldo de cana de açúcar e/ou glicerol ou qualquer combinação dos mesmos, em condições tais que os micro-organismos acumulam pelo menos 10% do seu peso seco na forma de lipídios.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais etapas adicionais de coleta dos micro-organismos, lavagem dos micro-organismos coletados e secagem dos micro-organismos lavados.
3. 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de quebra dos microorganismos por meios mecânicos.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de quebra forma um homogeneizado microbiano.
5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de separar os lipídios da biomassa microbiana.
6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de formação de um produto alimentício a partir dos micro-organismos ou lipídios

   2/6 obtidos deste.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de modificação química do lipídio por hidrólise do éster, transesterificação, hidrotratamento, hidrocraqueamento, desoxigenação e/ou isomerização.
8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é uma microalga selecionada do grupo que consiste nas microalgas listadas na tabela 1.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a microalga é selecionada do grupo que consiste em Bracteococcus, Chlorella, Parachlorella, Prototheca, Pseudochlorella e Scenedesmus.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a microalga é Chlorella protothecoides ou Prototheca moriformis.
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é uma levedura oleaginosa.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a levedura oleaginosa é selecionada do grupo que consiste em Cryptococcus curvatus, Cryptococcus terricolus, Candida sp. , Lipomyces starkeyi, Lipomyces lipofer, Endomycopsis vernalis, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis e Yarrowia lipolytica.
13. 13. Método de produção de combustível caracterizado pelo fato de compreender:

    (a) o cultivo de uma população de micro-organismos selecionados do grupo que consiste em microalgas, leveduras

    3/6 oleaginosas e fungos, na presença de uma fonte fixa de carbono, em que:

    (i) os micro-organismos acumulam pelo menos 10% de seu peso seco na forma de lipídios; e (ii) a fonte fixa de carbono é selecionada do grupo que consiste em glicerol, material celulósico despolimerizado, sacarose, suco de cana de açúcar, melaço, glicose, arabinose, galactose, xilose, frutose, manose, acetato e qualquer combinação dos mesmos;

    (b) o isolamento de componentes de lipídios dos microorganismos cultivados; e (c) a submissão de componentes lipídios isolados para uma ou mais reações químicas para gerar ésteres ou alcanos de ácidos graxos, por meio do qual o combustível é produzido.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que uma ou mais reações químicas são selecionadas do grupo que consiste em transesterificação, hidrotratamento, hidrocraqueamento, desoxigenação e isomerização.
15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a fonte fixa de carbono é um material celulósico despolimerizado, caldo de cana de açúcar, melaço, sacarose e/ou glicerol.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a fonte fixa de carbono é material celulósico despolimerizado derivado do bagaço da cana de açúcar.
17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das

    4/6 reivindicações 13, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o combustível é diesel renovável apresentando um número de cetano superior a 65.
18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é uma microalga do gênero Chlorella ou Prototheca.
19. 19. Composição caracterizada pelo fato de ser de alcanos ou ésteres de ácidos graxos produzidos a partir do método conforme definido na reivindicação 13.

    20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de ser uma composição de hidrocarbonetos líquidos que atenda a norma D1655 para combustível de jato. 21. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de ser uma composição de hidrocarbonetos líquidos que atenda a norma D975 para diesel renovável. 22. Composição, de acordo com a reivindicação 19,

    caracterizada pelo fato de ser uma composição de ésteres metílicos, que atende a norma ASTM D6751, BS EN 14214 ou norma DIN EN 14214 para o biodiesel.

    23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que os componentes lipídicos são submetidos à transesterificação para produzir ésteres de ácidos graxos e glicerina e o glicerol é adicionado a uma segunda cultura microbiana para uso como fonte de carbono.

    24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos

    5/6 utilizados para produzir os componentes lipídicos e os micro-organismos da segunda cultura microbiana são da mesma espécie de micro-organismo.

    25. Micro-organismo caracterizado pelo fato de que é

    5 selecionado do grupo que consiste em microalgas, leveduras oleaginosas e fungos que contenham pelo menos 10% do seu peso seco na forma de lipídios e ainda contém um ou mais dos seguintes procedimentos: um gene exógeno de utilização de sacarose, um gene exógeno da lipase, um gene exógeno da 10 enzima da via lipídica e/ou um gene exógeno da enzima de degradação de polissacarídeos e/ou que tenha sido geneticamente modificado para a regulação decrescente da expressão de um gene endógeno da enzima da via lipídica.

    26. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação

    15 25, caracterizado pelo fato de que contém um gene exógeno de utilização de sacarose, no qual o gene de utilização de sacarose codifica uma enzima sacarose invertase.

    27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
20. 20 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo contém um ou mais genes exógenos selecionado do grupo que é constituído por genes de utilização de sacarose, genes que codificam enzimas da via lipídica, genes da lipase, polissacarídeos e genes de 25 enzimas degradantes e/ou que tenha sido geneticamente modificada para a regulação decrescente da expressão de um gene endógeno da enzima da via lipídica.

    28. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o

    30 micro-organismo contém (i) um gene exógeno de utilização de

    6/6 sacarose selecionado do grupo que consiste em um gene frutoquinase, um gene glucoquinase, um gene hexoquinase, um gene sacarose invertase e um gene transportador de sacarose, ou (ii) um gene que codifica uma enzima exógena de via lipídica selecionado do grupo consistindo em um estearoil-ACP desaturase, um glicerolipídeo desaturase, um piruvato desidrogenase, um acetil-CoA carboxilase, uma proteína transportadora de acila, e um glicerol-3 fosfato aciltransferase, uma acil-ACP graxo tioesterase, uma acilCoA graxo redutase, uma aldeído graxo redutase, uma acilCoA graxo/aldeído redutase, um aldeído decarbonilase graxo; ou (iii) ambos (i) e (ii).

    29. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o microrganismo contém um gene exógeno que codifica uma enzima da via lipídica que é uma tioesterase que catalisa a divagem de um ácido graxo de 10 a 14 carbonos a partir de uma ACP.

    30. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo contém um gene exógeno que codifica uma enzima de via lipídica que é um tioesterase que catalisa a divagem de um ácido graxo de 12 carbonos a partir de uma ACP.