BRPI0807237A2 - Dna que codifica xilitol desidrogenase, construção de ácido nucléico, vetores, microorganismos e métodos para produzir xilitol desigrogenase e etanol - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA QUE CODIFICA XILITOL DESIDROGENASE, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NU- CLÉICO, VETORES, MICROORGANISMOS E MÉTODOS PARA PRODU- ZIR XILITOL DESIDROGENASE E ETANOL".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se ao DNA que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilitol desidrogenase, uma construção de ácido nu- cléico e um vetor que compreende o DNA, um micro-organismo transformado com o vetor para expressar o DNA, e um método para produzir xilitol desidroge- 10 nase. O micro-organismo, etc., da presente invenção podem ser usados em e- tapas industrialmente úteis tais como etapas de produção de etanol, etapas de produção de biomassa, e etapas de reciclagem de NADP+ a partir de NADPH. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A xilose é um carboidrato mais existente em biomassa vegetal e 15 madeira, e constitui aproximadamente 40% de substâncias lignocelulósicas. A xilose, em etapas da produção de celulose, é formada como produtos re- siduais a partir de hidrolisados de xilano, um componente principal de hemi- celulose. Deseja-se para uso eficaz de fontes de carbono que a xilose deve ser convertida em etanol ou biomassa para fermentação. Particularmente, o 20 etanol está sendo usado em grandes quantidades como combustível líquido.

Candida (Gong, C.S., Chen, L.F., Flickinger, M.C. e Tsao1 G.T., "Conversion of hemicelluloses carbohydrate", Adv. Biochem. Eng. 20:93-118 (1981); e Jeffries1 T.W., "Utilization of xilose by bactéria, yeast and fungi", Adv. Biochem. Biotech. 27:1-32 (1983)), Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromy- 25 ces, Metschnokawia, Pachysolen, Paeciiomyces (Wu, J.F., Lastick, S.M., Up- degraff, D.M., "Ethanol production from sugars derived from plant biomass by a novel fungus", Nature 321:887-888 (1986)), Pichia (Maleszka, R. e Schmei- der, H., "Fermentations of D-xylose, xylitol and D-xylulose by yeasts", Can. J. Microbiol. 28:360-363 (1982)), e similares são conhecidas como leveduras 30 que podem utilizar pentose (por exemplo, xilose ou D-ribose) ou similares.

Em geral, a conversão de pentose (por exemplo, xilose) para etanol em organismos é mediada pela fosforilação de pentose, e a pentose fosforilada resultante é convertida em etanol através de uma via de pentose fosfato. A fosforilação de pentose requer primeiramente a redução de pento- se acompanhada por conversão de NADPH em NADP+, e esta reação é ca- talisada por redutase. Pentitol, que é formado pela redução de pentose, é 5 subsequentemente submetido à oxidação acompanhada de conversão de NAD+ em NADH. Esta reação é catalisada por desidrogenase. A D-pentulose é formada através de reação em duas etapas e fosforilada por cinase para formar pentose fosfato (Barnett, J.A., “The utilization of sugars by yeasts. In: “Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry”; editado por Tipson, 10 R.S. e Horton, D.; New York: Academic Press, 1976, páginas 125-235).

S. cerevisiae, uma levedura usada predominantemente na pro- dução de bioetanol, pode utilizar xilulose (pentulose) convertida a partir de xilose, embora esta levedura não possa fermentar pentoses (Jeffries, T.W., “Emerging technology for fermenting D-xylose”, Trends in Biotechnology 15 3:208-212 (1985)). O que é importante é que S. cerevisiae contém genes que codificam proteínas que fermentam pentose, mas não expressa estes genes.

Acredita-se que a fermentação de pentose por S. cerevisiae seja possivelmente realizada disponibilizando uma via de utilização de xilose a paritr de um micro-organismo que metaboliza xilose. Muitas tentativas foram feitas em S. cerevisiae para expressar genes de xilose isomerase bacteria- na, e a fermentação de xilose, entretanto, terminou de forma mal sucedida, presumivelmente devido à expressão insuficiente dos genes estranhos (Sartny, A.V., McConaugh, B.L., Lodo, Z., Sundstrom, J.A., Furlong, C.E. e Hall, B.D., “Expression of Escherichia coli xylose isomerase gene in S. cere- visiae'’, Appl Eur. Microbiol. 53:1996-2000 (1987); Amoer, R., Wilhelm, M. e Hollenberg, C.P., “The fermentation of xylose - an analysis of the expression of Bacillus and Actonoplanes isomerase genes in yeast”, Appi Microbiol. Bio- technol. 30:351-357 (1989); Chan, E.-C., Ueng1 P.P. e Chen, L.F., “D-xylose fermentation to ethanol by Schizosaccharomyces pombe cloned with xilose isomerase gene”, Biotech. Lett. 8:231-234 (1986); Chan, E.-C., Ueng, P.P. e Chen1 L.F., “Environmental effects on D-xylose fermentation by Schizosac- charomyces cerevisiae”, ΑρρΙ. Biotechnol 20:221-231 (1989)).

Por outro lado, foram feitas tentativas como métodos que usam genes de levedura em outra levedura para isolar genes que codificam redu- tase e xilitol desidrogenase a partir de Pichia stipitis que tem a capacidade de utilizar xilose, e para expressar os genes em S. cerevisiae (patentes n°s JP 3122153 e 3193917). Além disso, foram feitas tentativas para isolar o gene de xilose redutase (Govinden, R., Pillay, B.van Zyl, W.H. e Pillay, D., “Candida shehatae xylose reductase gene, complete Eds.”, GenBank direct submission, Acesso AF278715 (2000)) e purificação de xilitol desidrogenase (Yang, V.W. e Jeffries, T.W., “Purification and propertites of xylitol dehydro- genase from the xylose-fermenting yeast Candida shehatae”, Appi Biochem. Biotechnol. 26:97-206 (1990)) a partir de Candida shehatae, outra levedura que tem a capacidade de utilizar xilose. Entretanto, nenhum dos casos foi sucedido em isolar genes de xilitol desidrogenase a partir de Candida sheha- tae.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é fornecer DNA que codifica xilitol desidrogenase inusitada, que pode ser usado na tecnologia da conver- são eficiente de xilose em etanol ou biomassa, e um método que usa o mesmo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção tem as características abaixo.

(1) Um DNA que codifica um polipeptídeo selecionado entre:

(a) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1, e tem uma atividade de xilitol desidrogenase;

(b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que tem 90% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e tem uma atividade de xilitol desidrogenase; e

(c) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que compreende substituição, deleção, inserção ou adição de um ou

vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e tem uma atividade de xilitol desidrogenase. (2) O DNA de acordo com (1), onde o DNA compreende a se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2.

(3) O DNA de acordo com (1), onde o DNA compreende uma seqüência que difere da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 devido

à degeneração do código genético.

(4) O DNA que codifica qualquer um de (1) a (3), onde o DNA é de uma levedura.

(5)0 DNA de acordo com (4), onde a levedura é Candida sheha- tae.

(6) O DNA de acordo com (5), onde a levedura é Candida she-

hatae CBS5813 (NBRC1983).

(7) Uma construção de ácido nucléico que compreende um DNA de acordo com qualquer um entre (1) a (6) e uma seqüência reguladora ca- paz de regular a expressão do DNA em uma célula hospedeira.

(8) A construção de ácido nucléico de acordo com (7), onde o

DNA codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(9) A construção de ácido nucléico de acordo com (8), onde o DNA compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

(10) A construção de ácido nucléico de acordo com qualquer um

de (7) a (9), onde a seqüência reguladora é da célula hospedeira.

(11) A construção de ácido nucléico de acordo com qualquer um de (7) a (9), onde a seqüência reguladora é um promotor.

(12) A construção de ácido nucléico de acordo com (11), onde o promotor é um promotor constitutivo ou um promotor induzível.

(13) A construção de ácido nucléico de acordo com (11) ou (12),

onde o promotor é selecionado no grupo que consiste nos promotores A- DH1, ADH2, PDC, GAL1/10, TDH3, e PGK1.

(14) Um vetor que compreende um DNA de acordo com qual- quer um de (1) a (6) ou uma construção de ácido nucléico de acordo com

qualquer um de (7) a (13).

(15) O vetor de acordo com (14), onde o vetor é um plasmídeo.

(16) Um micro-organismo que compreende um DNA de acordo com qualquer um de (1) a (6), uma construção de ácido nucléico de acordo com qualquer um de (7) a (13), ou um vetor de acordo com (14) ou (15), de tal modo que o micro-organismo expresse um polipeptídeo que tem uma ati- vidade de xilitol desidrogenase.

(17) O micro-organismo de acordo com (16), onde o micro-

organismo é uma levedura ou bactéria.

(18) O micro-organismo de acordo com (17), onde a levedura ou bactéria é selecionada no grupo que consiste em leveduras do gênero Sac- charomyces, Schizosaccharomyces, Sehwanniomyees, Kluyveromyees, Pi-

chia, Hansenula, Candida, Debaryomyees, Metsehnikowia, Paehulosen, ou Paecilomyees e bactérias do gênero Zymomonas.

(19) O micro-organismo de acordo com (18), onde o micro- organismo é Saccharomyees cerevisiae.

(20) O micro-organismo de acordo com (18), onde o micro-

organismo é Saccharomyces pombe.

(21) O micro-organismo de acordo com qualquer um de (16) a (20), onde o DNA ou a construção de ácido nucléico é incorporada no ge- noma do micro-organismo hospedeiro.

(22) Um método para produzir xilitol desidrogenase, compreen-

dendo as etapas de:

(a) cultivar um micro-organismo de acordo com qualquer um de

(16) a (21) em um meio; e

(b) coletar um produto que tem uma atividade de xilitol desidro- genase a partir do micro-organismo ou do meio.

(23) O método de acordo com (22), compreendendo ainda a e-

tapa de selecionar um micro-organismo apropriado para a fermentação de xilulose.

(24) Um método para produzir etanol usando um micro- organismo de acordo com qualquer um de (16)a (21).

(25) Um vetor que compreende um cassete de expressão do

gene de xilitol desidrogenase, que compreende um DNA de acordo com (1), um cassete de expressão do gene de xilose redutase, e um cassete de ex- pressão do gene de xilulocinase.

A presente invenção fornece o DNA que codifica a enzima xilitol desidrogenase referente à fermentação de xilulose, um micro-organismo (por exemplo, uma levedura) que expressa de forma recombinante o DNA, etc. O DNA e o micro-organismo são úteis na produção de bioetanol, produção de biomassa, indústria alimentícia, e similares.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

A figura 1 ilustra uma delineação de procedimentos para cons- truir um vetor de expressão que compreende um gene de xilitol desidroge- nase a partir de Candida shehatae.

MELHOR MODO PARA CONDUZIR A INVENÇÃO

A presente invenção fornece o DNA que codifica um polipeptí- deo que tem uma atividade de xilitol desidrogenase.

A xilitol desidrogenase (EC1.1.1.9) é uma enzima que catalisa uma parte de um processo de fermentação de xilulose, usando xilose como uma matéria-prima. A primeira metade do processo é uma reação através da qual xilitol é formado de forma redutora a partir de xilose. Esta reação redu- tora é catalisada por uma enzima xilose redutase. A última metade do pro- cesso é uma reação através da qual a xilulose é formada de forma oxidante a partir de xilitol. A reação oxidante é catalisada por uma enzima xilitol desi- drogenase. A atividade de xilitol desidrogenase é dependente de NAD(P)+. Foram feitas tentativas para introduzir os genes de xilose redutase e também xilitol desidrogenase em células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), melhorando desta forma a capacidade de produzir etanol (vide patente US n° 6.582.944).

O DNA da presente invenção é um DNA que codifica um poli- peptídeo selecionado entre:

(a) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1 e tem uma atividade de xilitol desidrogenase;

(b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá-

cidos que tem 90% ou mais identidade com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e tem uma atividade de xilitol desidrogenase; (c) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que compreende substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e tem uma atividade de xilitol desidrogenase.

5 O DNA que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é de uma

levedura e especificamente de Candida shehatae, e particularmente Candida shehatae CBS5813 (NBRC1983).

Na presente invenção, o polipeptídeo pode consistir em apenas a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou pode compreender a dita 10 seqüência de aminoácidos bem como uma seqüência adicional, por exem- plo, no terminal amino ou carbóxi do polipeptídeo. Tal seqüência de aminoá- cidos adicional é, por exemplo, uma seqüência sinalizadora de peptídeo que proporciona secreção extracelular de proteínas maduras.

Alternativamente, o polipeptídeo engloba também uma variante, homólogo, análogo, ou similar,que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que tem 90% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Neste contexto, o termo “identidade” significa a proporção (%) do número de aminoácidos completamente equivalentes ao número total de aminoácidos na seqüência de aminoácidos alinhada com ou sem lacunas introduzidas nela. Tal polipeptídeo compreende genericamente uma seqüên- cia de aminoácidos que compreende substituição, deleção, inserção, ou adi- ção de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e tem de preferência 92% ou mais, ou 93% ou mais, mais preferivel- mente 95% ou mais, ou 97% ou mais, ainda mais preferivelmente 98% ou mais, ou 99% ou mais de identidade de seqüência à dita seqüência de ami- noácidos.

A proteína que tem uma seqüência que tem 90% ou mais de i- dentidade com ela pode ser buscada, por exemplo, acessando uma base de dados conhecida nessas técnicas (GenBank, EMBL, etc.). Por exemplo, um 30 algoritmo conhecido nessas técnicas, tal como BLAST ou FASTA, pode ser usado como um sistema de busca. Os procedimentos específicos da opera- ção para essa busca estão descritos, por exemplo, “Introduction to Geno- meNet Databases”, 2- edição, editado por Toshiba Takagi e Minoru Kanehi- sa (1998), Kyoritsu Shuppan Co. Ltd. (Tóquio, Japão).

Alternativamente, o polipeptídeo engloba também uma variante que compreende uma seqüência de aminoácidos que compreende substitui- 5 ção, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Neste contexto, o termo “vários” signi- fica um número inteiro de aproximadamente 10 ou menos, por exemplo, um número inteiro de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, ou 2 a 3.

A variante que compreende substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácidos está englobada dentro do âmbito da presente inven- ção, desde que ela seja inusitada e tenha uma atividade de xilitol desidroge- nase.

A variação de aminoácidos no polipeptídeo codificado pelo DNA da presente invenção é, de preferência, uma mutação em um sítio que não afeta adversamente, na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, a es- trutura tridimensional (ou conformação) de um domínio catalítico associado à atividade de xilitol desidrogenase ou um domínio ligante de coenzima sobre o qual as coenzimas atuam. Entretanto, uma mutação pode ser introduzida mesmo no domínio catalítico ou no domínio ligante de coenzima, a menos que ela reduza significativamente a atividade da enzima. Os exemplos de aminoácidos que constituem o domínio ligante de coenzima incluem Asp207, Ne208, Phe209, Asn21, e Lys212 na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Os exemplos de aminoácidos que constituem o domínio catalítico incluem Cys41, His66, Glu67, Ser961 Ser99, Tyr102, e Cys110 na seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:1. A introdução de mutação ou mutações fornece, por exemplo, uma variante que tem atividade mais alta, por exemplo, 1,5 vez ou mais alta, 2 vezes ou mais alta, 2,5 vezes ou mais alta, 3 vezes ou mais alta, vezes ou mais alta, 7 vezes ou mais alta, 10 vezes ou mais altas, 15 vezes ou mais alta, 20 vezes ou mais alta, 30 vezes ou mais alta, 40 vezes ou mais alta, ou 50 vezes ou mais alta, do que aquela do tipo selvagem. Alternativa- mente, a introdução de mutação ou mutações pode melhorar também a es- tabilidade térmica da enzima. Os exemplos de variações incluem variações como aquelas descritas em Watanabe, S. et ai, J. Biol. Chem. 280(11): 10340-10349 (2005).

Particularmente, a substituição entre aminoácidos pode ser uma substituição conservativa entre aminoácidos similares em propriedade estru- 5 tural ou química ou pode ser uma substituição não-conservativa entre ami- noácidos que diferem nessa propriedade. Os aminoácidos similares em pro- priedade estrutural ou química podem ser classificados da seguinte maneira: um grupo de aminoácido hidrofóbico inclui alanina, leucina, iso- leucina, valina, metionina, e prolina.

Um grupo aminoácido polar inclui serina, treonina, glicina, glu-

tamina, asparagina, e cisteína.

Um grupo aminoácido aromático inclui fenilalanina, tirosina, e

triptofano. tico.

Um grupo aminoácido ácido inclui ácido glutâmico e ácido aspár-

Um grupo aminoácido básico inclui lisina, arginina, e histidina.

O DNA da presente invenção compreende um DNA de filamento único ou filamento duplo, que tem uma seqüência de nucleotídeos que codi- fica qualquer um dos polipeptídeos mencionados acima. O DNA da presente 20 invenção engloba, por exemplo, DNA natural, cDNA, DNA quimicamente sintetizado, DNA obtido por reação de polimerase em cadeia (PCR), e DNA que compreende dois ou mais destes DNA's em combinação.

Especificamente, o DNA da presente invenção é um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Além disso, 25 outro DNA da presente invenção é um DNA que compreende uma seqüência variante da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 pela degeneração do código genético. Por exemplo, um códon ótimo para uma espécie de or- ganismo diferente daquela da origem do tipo selvagem pode ser selecionado baseado na degeneração do código genético e incluído no DNA. A sequên- 30 cia variante significa uma seqüência que compreende variações pelas quais a seqüência de nucleotídeos resultante difere da seqüência de nucleotídeos originais, embora elas codifiquem as seqüências de aminoácidos idênticas. O DNA da presente invenção pode ser preparado usando técni- cas conhecidas nessa área científica, tais como técnicas de recombinação de DNA, PCR, hibridização, clonagem, e mutagênese direcionada a sítios. Tais técnicas estão descritas detalhadamente, por exemplo, em Sambrook et 5 a/., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e Ausubel et ai, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, 1998, e podem ser usadas para a preparação do DNA da pre- sente invenção.

Primeiramente, Candida shehatae é desenvolvida, por exemplo, vascolejando a cultura a aproximadamente 25°C, em um meio que contém peptona, glicose, extratos de levedura, e similares, tais como meio YPD ou YM, e em seguida, extração do DNA genômico. Iniciadores diretos e rever- sos com 19 a 25 bases de comprimento são desenhados e sintetizados, ba- seado, por exemplo, na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Estes iniciadores são usados para realizar ampliação por PCR na presença de po- Iimerase termoestável e Mg2+, usando o DNA genômico de interesse como um modelo. As condições da PCR envolvem a realização, por exemplo, do tratamento a 94°C por 1 minuto, e subsequentemente, cerca de 35 ciclos de ampliação, cada um envolvendo 94°C por 30 segundos (desnaturação), 55°C por 30 segundos (anelação), e 72°C por 3 minutos (reação de alonga- mento), e em seguida, tratamento final a 72°C por 7 minutos. A ampliação exitosa do fragmento do DNA de interesse pode ser confirmada por eletrofo- rese em gel de agarose.

O fragmento de DNA de interesse ampliado é inserido, depois da 25 introdução de sítios de restrição nele, caso necessário, em um vetor (por exemplo, um plasmídeo), que é por sua vez introduzido em uma célula hos- pedeira apropriada para clonar o fragmento de DNA. O vetor pode conter adequadamente um promotor, uma origem de replicação, um sítio Iigante de ribossomas ou seqüência de Shine-Dalgarno, um terminador, um sítio de 30 multiclonagem, um sinal de poliadenilação, e similares. Os vetores para pro- cariotas tais como bactérias, ou vetores para eucariotas tais como leveduras ou fungos, podem ser usados como vetor. Como vários vetores estão co- mercialmente disponíveis, um apropriado pode ser selecionado para uso. Além disso, os exemplos de célula hospedeira incluem bactérias (por exem- plo, E. coli) e leveduras.

A técnica de mutagênese direcionada à sítio envolve sintetizar 5 um iniciador que contém um sítio de variação e realizar a PCR usando este iniciador e, como modelo, um vetor que contém o DNA de interesse. A vari- ante do DNA que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 pode ser preparada usando esta técnica.

A presente invenção fornece ainda uma construção de ácido nu- cléico que compreende o DNA descrito acima e uma seqüência reguladora capaz de regular a expressão do DNA.

Na presente invenção, a seqüência reguladora é uma seqüência de nucleotídeos capaz de regular a expressão do DNA da presente invenção e inclui, por exemplo, um promotor, um intensificador, um sinal de poliadeni- 15 lação, uma origem de replicação, um sítio Iigante de ribossomas ou seqüên- cia de Shine-Dalgarno, e um terminador. A seqüência reguladora é, de prefe- rência, uma seqüência que contém um promotor ou uma seqüência que con- tém um terminador.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, a se- 20 quência reguladora é da célula hospedeira. Particularmente, quando a se- qüência genômica que contém a seqüência reguladora de 5' e 3' de um ge- ne que codifica xilitol desidrogenase originalmente portada por uma levedura como hospedeira é deixada flanquear o DNA heterólogo da presente inven- ção para preparar um vetor, a seqüência de DNA heteróloga da presente 25 invenção pode ser incorporada no genoma da célula hospedeira por recom- binação homóloga.

O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. O promotor não está particularmente limitado, e pode ser selecio- nado, por exemplo, no grupo que consiste em ADH1, ADH2, PDC, GAL1/10, 30 TDH3, e PGK1. Dependendo dos promotores selecionados (por exemplo, promotores fortes selecionados), o DNA da presente invenção pode ser ex- pressado em um nível de expressão que excede o nível de expressão natu- ral em seus micro-organismos hospedeiros originais.

A presente invenção fornece ainda um vetor que compreende qualquer um dos DNA's descritos acima ou qualquer uma das construções de ácidos nucléico descritas acima.

5 Os exemplos do vetor incluem plasmídeos, cosmídeos, fagos,

fogomídeos, BAC1 YAC1 e vírus. Em uma modalidade preferível, o vetor é um plasmídeo. O vetor é apropriado para replicação no micro-organismo hospedeiro desejável, e assim sendo, pode conter, por exemplo, um promo- tor, um intensificador, um sinal de poliadenilação, uma origem de replicação, 10 um sítio Iigante de ribossomas ou seqüência de Shine-Dalgarno, e um termi- nador, selecionado adequadamente. Além disso, um marcador seletivo, tal como um gene de resistência a fármaco (por exemplo, um gene de resistên- cia à ampicilina), pode ser introduzido no vetor.

A presente invenção engloba também um vetor que compreende não apenas um cassete de expressão de xilitol desidrogenase, mas também opcionalmente um cassete de expressão do gene de xilulocinase e/ou um cassete de expressão do gene de xilose redutase. O gene de xilitol desidro- genase pode ser, por exemplo, uma seqüência de DNA que codifica o poli- peptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência de DNA que codifica uma va- riante, homólogo, ou análogo do polipeptídeo como descrito acima. O gene de xilulocinase pode ser, por exemplo, uma seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 26 ou uma seqüência de DNA que codifica uma variante, homólogo, ou análogo do polipeptídeo como descrito acima. O gene de xilose redutase pode ser, por exemplo, uma seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24 ou uma seqüência de DNA que codifica uma variante, homólogo, ou análogo do polipeptídeo como descrito acima.

Na presente invenção, o “cassete de expressão” é uma constru- ção de ácido nucléico que é preparada ligando operacionalmente a sequên- cia gênica de interesse a um promotor e um terminador e outras seqüências reguladoras necessárias para a expressão gênica em uma hospedeira. A construção é introduzida em uma hospedeira, permitindo desta forma que a hospedeira expresse o gene de interesse. Na presente invenção, o termo “ligado operacionalmente” significa que as seqüências reguladoras são liga- das ao gene de interesse de tal modo que elas sejam capazes de atuar so- bre a expressão do gene de interesse da maneira desejada. A expressão de 5 cada gene pode ser continuamente ou simultaneamente. Uma construção exemplificativa de tal vetor da presente invenção está ilustrada na figura 1. O vetor pode ser usado eficazmente para a produção de etanol usando xilose ou similares como matéria-prima.

A presente invenção fornece ainda um micro-organismo que compreende qualquer um dos DNA's descritos acima, qualquer uma das construções de ácidos nucléicos descritas acima, ou qualquer um dos veto- res descritos acima, de tal modo que o micro-organismo expresse um poli- peptídeo que tem uma atividade de xilitol desidrogenase.

Uma abordagem rotineira, tal como transformação ou transdu- ção, é usada para introduzir o vetor na célula hospedeira. Tal abordagem engloba, por exemplo, métodos com fosfato de cálcio, eletroporação, proto- plastos, e esferoplastos.

Os exemplos de micro-organismos incluem, porém sem limita- ções, leveduras, fungos, e bactérias. De preferência, o micro-organismo é 20 selecionado no grupo que consiste em leveduras dos gêneros Saccharomy- ces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Pichia, Han- senula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia, Pachulosen, ou Paeci- Iomyces e bactérias do gênero Zymomonas. De preferência, o micro- organismo é Saccharomyces cerevisiae, ou Schizosaccharomyces pombe.

Para o micro-organismo, o DNA ou a construção de ácido nu-

cléico pode ser incorporada no genoma do micro-organismo hospedeiro. A incorporação no genoma pode ser realizada ligando as seqüências do ge- noma do micro-organismo hospedeiro a montante e a jusante do DNA ou da construção de ácido nucléico. Um método apropriado para a incorporação da 30 seqüência de nucleotídeos no genoma da célula hospedeira é genericamen- te conhecido pelos versados nessas técnicas. O vetor pode ficar localizado também separadamente do genoma da célula hospedeira na célula. Neste caso, o vetor deve ser capaz de replicar de forma autônoma.

O micro-organismo da presente invenção pode conter ainda um DNA que codifica outra enzima que medeia o processo de conversão de xi- lose em etanol. A outra enzima é, por exemplo, xilose redutase, ou xiluloci- 5 nase, de preferência, xilose redutase. Tais enzimas podem ser de um micro- organismo da mesma origem que aquela da enzima xilitol desidrogenase de acordo com a presente invenção ou pode ser de um micro-organismo de uma origem diferente dela. Além disso, o micro-organismo pode ser subme- tido a um tratamento de mutação para intensificar a atividade da enzima ou a 10 estabilidade térmica (por exemplo, o micro-organismo é irradiado com raios de alta energia tais como raios UV, raios-gama, ou feixes de íons de elé- trons, ou tratado com um mutágeno químico tal como nitrosoguanidina, ni- trosouréia, ou ácido nitroso).

A presente invenção fornece ainda um método para produzir xili- 15 tol desidrogenase. Este método compreende as etapas de: (a) cultivar qual- quer um dos micro-organismos descritos acima em um meio; e (b) coletar, a partir do micro-organismo ou do meio, um produto que tem uma atividade de xilitol desidrogenase. A coleta do produto a partir do micro-organismo pode ser realizada, por exemplo, rompendo com ultrassom a célula do micro- 20 organismo. A coleta do produto a partir do meio requer, depois da tradução no polipeptídeo dentro da célula do micro-organismo, secretar de forma extrace- Iular este polipeptídeo. Para este propósito, por exemplo, o polipeptídeo pode ser expressado com um sinal de secreção do terminal amino ligado a ele.

As condições da cultura do micro-organismo podem ser selecio- 25 nadas arbitrariamente dentre as condições apropriadas para o tipo do micro- organismo. O meio contém genericamente uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e um sal inorgânico. Os exemplos de fonte de carbono inclu- em glicose, maltose, sacarose, lactose, amido, e outros açúcares. Os exem- plos de fontes de nitrogênio incluem sais inorgânicos que contêm nitrogênio 30 (por exemplo, sulfato e nitrato de amônio), peptona, extratos de malte, e ex- tratos de levedura. Os exemplos de sal inorgânico incluem sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos, e sais de metais do grupo do fer- ro. As maneiras de cultura englobam cultura estática, cultura com vascole- jamento, cultura com aeração, cultura contínua, e similares. A temperatura da cultura é aproximadamente 15 a 60°C, usualmente aproximadamente 25 a 40°C, embora não limitada a esta faixa.

5 A atividade da enzima formada pode ser medida, por exemplo,

medindo a redução de NAD(P)+ a 340 nm a 35°C (Rizzi, M. et ai, J. Fer- ment. Bioeng. 67:20-24 (1989)). A mistura do ensaio padrão é uma solução que contém MgCb 50 mM e xilitol 300 mM dissolvidos em Tris-HCI 50 mM (pH 9,0). A reação é iniciada pela adição de 100 μΙ_ de de NAD(P)+ 20 mM 10 em um volume final de 1,0 mL. A atividade da enzima pode ser indicada, por exemplo, usando, como 1 unidade, uma atividade da enzima que produz 1 μηιοΙ de NAD(P)H por minuto.

A enzima xilitol desidrogenase pode ser purificada usando abor- dagens genéricas de química de proteínas em combinação. Os exemplos 15 dessas abordagens incluem, porém sem limitações, filtração em gel, croma- tografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de intera- ção hidrofóbica, HPLC, eletroforese, focagem isoelétrica, precipitação de sais, fracionamento com sulfato de amônio, e ultrafiltração.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, o méto- 20 do pode compreender ainda a etapa de selecionar um micro-organismo a- propriado para fermentação eficiente de xilulose. Como resultado, pode ser obtido um polipeptídeo que catalisa a fermentação de xilulose mais eficien- temente. A feiciência da fermentação de xilulose é avaliada, por exemplo, cultivando o micro-organismo em um meio que contém xilose ou xilitol por 25 um dado período e depois medindo a concentração de xilose contida no meio.

A presente invenção fornece ainda um método para produzir e- tanol usando qualquer um dos micro-organismos descritos acima. O micro- organismo pode ser imobilizado sobre uma fase sólida que permite o cres- 30 cimento do micro-organismo. Os exemplos de tal fase sólida incluem, porém sem limitações, polímeros tais como poliuretano e derivados dos mesmos, e polissacarídeos tais como alginato e carragenina. Um carboidrato mais preferível para a produção de etanol é xilo- se. Assim sendo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, e/ou uma cepa de Zymomonas capaz de fermentar xilose são muito vantajo- sas para a produção de tanol. As cepas de leveduras da presente invenção 5 têm a capacidade de fermentar uma solução concentrada de carboidrato, um alto nível de resistência ao etanol, e a capacidade de produzir etanol em uma concentração elevada. Estas cepas de leveduras têm alta viabilidade celular para reciclagem repetitiva e apresentam resistências ao pH e tempe- ratura. Em etapas da produção de xilose, a xilose é formada como produto 10 residual a partir de hidrolisados de xilano. O xilano é um componente princi- pal de hemicelulose. Assim sendo, o uso de xilose para a produção de eta- nol e/ou biomassa é muito vantajoso. Além disso, a introdução de um gene de xilose redutase dependente de NAD(P)H no micro-organismo da presente invenção facilita a conversão de xilose em xilulose. Neste caso, para a rea- 15 ção redutora, esta enzima xilose redutase é particularmente apropriada para, por exemplo, carregar ou reciclar (de NADPH para NADP+) as coenzimas correspondentes em biorreatores para a produção de aminoácidos. EXEMPLOS

A presente invenção será descrita adicionalmente fazendo refe- rência aos exemplos abaixo. Entretanto, o âmbito da presente invenção não está limitado a eles.

Exemplo 1

Isolamento e sequenciamento do gene de xilitol desidrogenase a partir de Candida shehatae isolamento do DNA cromossomal Candida shehatae NBRC1983 foi adquirida do Departamento de

Biotecnologia, Instituto de Tecnologia e Avaliação. Saccharomyces cerevisi- ae ATCC60715 foi adquirida da American Type Culture Collection. Estas leveduras foram desenvolvidas separadamente em meio YPD (2% de pepto- na, 1% de extratos de leveduras, e 2% de glicose) a 25°C até um estágio 30 quiescente. Os DNA's cromossômicos foram isolados a partir delas usando Dr. GenTLE (Takara Bio Inc., Otsu-shi, Siga, Japão), de acordo com o proto- colo aqui incluído. Determinação da seqüência de nucleotídeos do gene de xilitol desidrogena- se de Candida shehatae

As seqüências das xilitol desidrgenases dos DNA's de Pichia stipitis e Candida tropicalis (n°s de acesso DD278642 e DQ201637, respec- tivamente) foram obtidas a partir da base de dados GenBank de seqüências de ácidos nucléicos, e submetidas a uma comparação de seqüências usan- do o software de análise de genes Genetyx (Genetyx Corp1 Tóquio, Japão) para obter as seqüências de SE I NOS: 3 e 4 a partir de regiões altamente similares. Estas duas seqüências foram usadas como iniciadores para reali- zar a PCR usando o DNA cromossômico de Candida shehatae NBRC1983 como modelo, TaKaRa Ex Taq (Takara Bio Inc.) e GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystemas Japan). O programa da reação foi o seguinte: 94°C por 1 minuto (94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 3 minutos) x 35 ciclos, e 72°C por 7 minutos. O produto da PCR obtido passou por eletroforese sobre um gel da agarose a 1%. Como resultado, foi observado um fragmento de DNA ampliado com um tamanho de aproxima- damente 900 pb.

O fragmento assim obtido foi clonado usando o Kit de Clonagem TOPO TA (Invitrogen Corp., Tóquio, Japão). Os plasmídeos foram coletados 20 a partir do transformante obtido e submetidos a uma reação de sequencia- mento usando o Kit de Sequenciamento em Ciclos Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystemas, Tóquio, Japão). A seqüência de nucleotídeos foi de- terminada usando o Analisador Genético de DNA 3100 (Applied Biosyste- mas, Tóquio, Japão). As seqüências de SEQ ID NOS: 5 e 6 foram obtidas a 25 partir da seqüência de nucleotídeos resultante.

O DNA cromossômico de Candida shehatae NBRC1983 foi cli- vado com várias enzimas de restrição e autoligado, e os produtos da autoli- gação foram coletados por precipitação com etanol. A PCR foi realizada u- sando este produto como modelo, as seqüências de SEQ ID NOS; 5 e 6 co- 30 mo iniciadores, e TaKaRa Ex Taq (Takara Bio Inc.). O programa da reação foi o seguinte: 94°C por 1 minuto (98°C por 20 segundos e 68°C por 10 mi- nutos) x 30 ciclos, e 72°C por 7 minutos. O produto da PCR obtido passou por eletroforese sobre um gel da agarose a 1%. Como resultado, foi obser- vado um fragmento de DNA ampliado com um tamanho de aproximadamen- te 2.300 pb.

O fragmento assim obtido foi clonado usando o Kit de Clonagem 5 TOPO TA (Invitrogen Corp., Tóquio, Japão). Os plasmídeos foram coletados a partir do transformante obtido e submetidos a uma reação de sequencia- mento usando o Kit de Sequenciamento em Ciclos Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystemas,Tóquio, Japão). A seqüência de nucleotídeos foi de- terminada usando o Analisador Genético de DNA 3100 (Applied Biosyste- 10 mas, Tóquio, Japão).

A seqüência de nucleotídeos obtida foi montada com a seqüência de nucleotídeos obtida anteriormente de aproximadamente 900 pb correspon- dente à seqüência parcial do gene de xilitol desidrogenase para obter a se- qüência de nucleotídeos de uma região codificadora no gene de xilitol desidro- 15 genase de Candida shehatae. O resultado está ilustrado em SEQ ID NO: 2. Exemplo 2

Construção do vetor de expressão de xilitol desidrogenase a introdução na levedura do mesmo

Um vetor de expressão de xilitol desidrogenase foi construído de 20 acordo com os procedimentos ilustrados na figura 1. Aqui doravante a cons- trução será descrita detalhadamente. Neste contexto, as condições da PCR descritas abaixo são as seguintes: 94°C por 1 minuto (94°C por 30 segun- dos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 10 minutos) x 35 ciclos, e 72°C por 7 minutos.

pBluescript Il KS+ (Stratagene) foi digerido com Kpnl e Saci, e o

fragmento mais curto foi removido usando Chroma Spin TE100 (Invitrogen Corp.). Por outro lado, os oligo DNA's de SEQ ID NOS: 7 e 8 foram desnatu- rados aquecendo a 95°C por 5 minutos, e depois deixados à temperatura ambiente para anelação espontânea. Este produto de anelação foi clonado 30 no sítio Kpnl-Sacl no pBluescript Il KS+ para construir um vetor pBSNS que compreende os sítios Nhel e Spel inseridos entre os sítios Kpnl e Sacl do pBluescript Il KS+. Os iniciadores (SEQ ID NOS: 17 e 18) para ampliar o gene de xilitol desidrogenase de Candida shehatae foram preparados baseado na seqüência de SEQ ID NO: 2. Os oligo DNA's de SEQ ID NOS: 6 a 16, 19, e 20 foram preparados baseado na seqüência genômica de Pichis stipitis.

Um fragmento do promotor TDH3 (PsTDH3p) foi obtido da se-

guinte maneira: uma combinação dos oligo DNA's de SEQ ID NOS: 9 e 10 e uma combinação dos oligo DNA s de SEQ ID NOS: 11 e 12 foram usados separadamente como iniciadores para realizar a PCR1 usando o DNA cro- mossômico de Pichis stipitis como modelo. Os iniciadores foram removidos 10 dos respectivos produtos obtidos usando colunas de filtração com gel. Estes dois produtos forma misturados e usados como modelo na PCR1 usando os olgo DNA's de SEQ ID NOS: 9 e 12 como iniciadores para obter um frag- mento do promotor TDH3. O fragmento de promotor obtido tem Nhel na ex- tremidade 5'e os sítios BamHI e apal nesta ordem na extremidade 3' e é a- 15 inda isento de Nhel dentro da seqüência do promotor.

Um fragmento terminador de TDH3 (PsTDH3t) foi obtido por PCR usando uma combinação dos oligo DNA's de SEQ ID NOS: 13 e 14 como iniciadores e o DNA cromossômico de Piehis stipitis como modelo. O fragmento terminador obtido tem os sítios BamHI e Apal nesta ordem na ex-

tremidade 5' e um sítio Spel na extremidade 3'.

Estes fragmentos são desenhados de tal modo que a extremida- de 3' do fragmento do promotor TDH3 se equipare com a extremidade 5' do terminador TDH3. Estes dois fragmentos foram misturados e usados como modelo na PCR usando os oligo DNA's de SEQ ID NOS: 9 e 14 como inicia- 25 dores para preparar um fragmento que compreende o promotor TDH3 e o terminador de TDH3 ligados por intermédio dos sítios BamHI e Apal. O fragmento obtido foi inserido por intermédio de um sítio Nhel na extremidade 5' e um sítio Spel na extremidade 3' até o sítio Nhel-Spel do pBSNS para construir pPsExpBS.

A PCR foi realizada usando o DNA cromossômico de Candida

shehatae como modelo e os ologo DNAs de SEQ ID NOS: 17 e 18 como iniciadores para obter o fragmento do gene de xilitol desidrogenase de Can- dida shehatae (CsXYL2). A PCR foi realizada usando o DNA cromossômico de Pichis stipitis como modelo e os oligo DNA's de SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores para obter um fragmento do gene de xilose desidrogenase de Pichis stipitis (PsXYLI; SEQ ID NO: 23). A seqüência de aminoácidos da 5 proteína de xilose redutase traduzida a partir da seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA obtido está ilustrada em SEQ ID NO: 24.

Um fragmento do gene de xilulocinase de Pichis stipitis (PsX- YL3; SEQ ID NO: 25) isento de um sítio Xbal originalmente presente na se- qüência foi obtido da seguinte maneira: uma combinação dos oligo DNA's de SEQ ID NOS: 19 e 20 e uma combinação dos oligo DNA's de SEQ ID NOS:

21 e 22 foram usados separadamente como iniciadores para realizar a PCR1 usando o DNA cromossômico de Piehis stipitis como modelo. Os iniciadores foram removidos dos respectivos produtos obtidos usando colunas de filtra- ção com gel. Estes dois produtos forma misturados e usados como modelo 15 na PCR1 usando os olgo DNA's de SEQ ID NOS: 19 e 22 como iniciadores para obter um fragmento do gene de xilulocinase de Piehis stipitis (PsXYL3; SEQ ID NO: 25). A seqüência de aminoácidos de uma proteína de xiluloci- nase traduzida a partir da seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA obtido está ilustrada em SEQ ID NO: 26.

Cada um dos fragmentos gênicos obtidos CsXYL.2, PsXYLI, e

PsXYL3 tem um sítio BamHI na extremidade 5' e um sítio Apal na extremi- dade 3'. Cada fragmento gênico foi inserido por intermédio destes sítios de restrição em um sítio BamHI-ApaI do vetor pPsExpBS. Os vetores obtidos foram designados como CsXYL2ExpBS, PsXYLI ExpBS1 e PsXYL3ExpBS, respectivamente.

O CsXYL2ExpBS foi digerido com Spel e subsequentemente submetido a uma reação de desfosforilação. Um fragmento Nhel-Spel (con- tendo o cassete de expressão de PsXYL3) preparado a partir de CsX- YL3ExpBS foi ligado ao sítio Spel do CsXYL2ExpBS digerido, para obter um 30 plasmídeo CPxBS que compreende o cassete de expressão de PsXYL3 in- serido na extremidade 3' do cassete de expressão de CsXYL2 na mesma orientação. A seguir, CPxBS foi digerido com Spel e subsequentemente submetido a uma reação de desfosforilação. Um fragmento Nhel-Spel (con- tendo o cassete de expressão de PsXYLI) preparado a partir de PsX- YL1 ExpBS foi ligado ao sítio Spel do CPxBS digerido para obter um plasmí- deo CPPxBS que compreende o cassete de expressão de CsXYL2, o casse- 5 te de expressão de PsXYL3, e o cassete de expressão de PsXYLI inseridos nesta ordem na mesma orientação.

CPPxBS foi digerido com Nhel e Spel, e o fragmento Nhel-Spel que contém o cassete de expressão de CsXYL2, o cassete de expressão de PsXYL3, e o cassete de expressão de PsXYLI foi purificado e inserido no sítio Spel de pYES2 (Invitrogen Corp.) para obter CPPxYES.

Uma cepa variante de ura3, KY1094, foi obtida de acordo com um método-padrão usando Wine Yeast Kyokai N0 3 (The Brewing Society of Japan). CPPxYES ou pYES2 foi introduzido em KY1094 por um método de lítio. Como resultado, um transformante de Saccharomyces cerevisiae que 15 compreende o vetor (CPPxYES) que compreende o cassete de expressão de CsXYL2, o cassete de expressão de PsXYL3, e o cassete de expressão de PsXYLI nesta ordem na mesma orientação, bem como um transformante de Saccharomyees cerevisiae (controle) que compreende o vetor pYES2 isento destas inserções de cassetes de expressão, foi obtido.

Exemplo 3

Medição da atividade de xilitol desidrogenase

Os transformantes de Saccharomyces cerevisiae obtidos foram submetidos à medição da atividade de xilitol desidrogenase como indicado abaixo.

Para a pré-cultura, as cepas foram inoculadas em 2 mL de SD-

ura (2% de glicose) por tubo de ensaio e cultivadas sob vascolejamento a 25°C por 24 horas. 200 μί da solução de pré-cultura contendo as cepas fo- ram inoculados em 5 mL de SD-ura (2% de glicose) por tubo de ensaio e cultivados à mão (main-cultured) a 120 rpm a 25°C por 24 horas. Depois da 30 cultura, as leveduras foram coletadas por centrifugação, lavas com uma so- lução de tampão de fosfato de sódio 100 mM (pH 7,0), EDTA 1 mM, e mer- captoetanol 5 mM, e depois colocadas em suspensão em 1 mL da mesma solução de tampão. A esta suspensão de leveduras adicionou-se 1 g de Pé- rolas de Vidro de 212-300 mícrons (Sigma), e as leveduras foram rompidas a 4°C por 15 min, usando MIX-TOWER A14 (Taiyo). Depois de centrifugação a 120 rpm 4°C por 5 min, o sobrenadante foi coletado e usado como uma so- 5 lução de enzima bruta. Solução de enzima bruta foi medida quanto à con- centração de proteína pelo método de Bradford. Albumina de soro bovino foi usada como proteína-padrão.

Uma reação foi realizada a 30°C por 10 min em uma sistema de reação que contém Rris-HCI 100 mM (pH 8,0), cloreto de magnésio 5 mM, 10 NAD+ 3 mM, xilitol 100 mM, e 5% (v/v) de solução de enzima bruta. A absor- vância foi medida em um comprimento de onda de 340 nm. Uma curva de calibração foi preparada usando NADH, e 1 unidade da atividade de enzima foi calculada como um nível de enzima (atividade específica) que produz 1 μητιοΙ de NADH por 1 minuto por miligrama de proteína. O resultado está in- 15 dicado abaixo. Neste contexto, o valor numérico é indicado em média ± des- vio-padrão a partir de 9 lotes.

Tabela 1

Cepa Atividade Específica ^mol/minmg de proteína) CPPxYES 1,878 ±0,166 pYES 0,000 ± 0,008 A atividade da enzima foi detectada apenas na cepa transforma- da com o vetor portador de cassetes de expressão que incluem o gene de xilitol desidrogenase de Candida shehatae. Isto demonstrou que a proteína expressada a partir do gene de xilitol desidrogenase de Candida shehatae tem uma atividade desejada.

Aplicabilidade Industrial

O DNA e o micro-organismo da presente invenção são úteis na produção de bioetanol, produção de biomassa, indústria alimentícia, e simila- res.

Texto Livre na Listagem de Seqüências

SEQ ID NOS: 3, 4, e 7 a 22: iniciadores. Seqüência de Listagem

<110> Kirin Holdings Kabushiki Kaisha

<120> DNA que codifica Xilitol Desidrogenase

<130> PH-3469-PCT

<150> JP2007-024666

<151> 2007-0202

<160> 26

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> Candida shehatae <400> 1

Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys He Asp Asp He Thr

1 5 10 15

Phe Glu Ser Tyr Asp Ala Pro Glu He Thr Glu Pro Thr Asp Val Leu 20 25 30

Val Glu Val Lys Lys Thr Gly He Cys Gly Ser Asp He His Tyr Tyr 35 40 45

Ala His Gly Lys He Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu 50 55 60

Gly His Glu Ser Ser Gly Val Val Thr Lys Val Gly Thr Gly Val Thr 65 70 75 80

Ser Leu Lys Val Gly Asp Lys Val Ala He Glu Pro Gly He Pro Ser 85 90 95

Arg Phe Ser Asp Ala Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His 100 105 110

Met Cys Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Thr Glu Gly Glu Pro Asn Pro 115 120 125

Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val 130 135 140

Lys Leu Pro Glu His Val Ser Leu Glu Met Gly Ala Leu Val Glu Pro 145 150 155 160

Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Ala Ser Val Arg Phe Gly 165 170 175

Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala 180 185 190

Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Ile Asp Ile 195 200 205

Phe Asp Asn Lys Leu Gln Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His 210 215 220

Ile Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Asp Ala Ala Ala Leu Val Lys Ala 225 230 235 240

Phe Asp Gly Arg Glu Pro Thr Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu 245 250 255

Pro Cys Ile Asn Gln Gly Val Ala Ile Leu Ala Gln Gly Gly Arg Phe 260 265 270

Val Gln Val Gly Asn Ala Pro Gly Pro Val Lys Phe Pro Ile Thr Glu 275 280 285

Phe Ala Thr Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe 290 295 300

Asn Asp Tyr Lys Thr Ser Val Asp Ile Met Asp Thr Asn Tyr Lys Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Lys Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg 325 330 335

Phe Lys Phe Asp Asp Ala Ile Lys Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly 340 345 350

Ser Gly Ala Val Lys Cys Ile Ile Asp Gly Pro Glu 355 360

<210> 2 <211> 1095 <212> DNA

<213> Candida shehatae <400> 2 atgactgcta acccatcgct cgtgcttaac gatgccccag aaatcaccga gccaacagac tgtggttccg atatccacta ctacgcccac ccaatggttc ttggccacga atcctcaggt 5 tcgctcaagg taggtgacaa ggtcgccatt gcctacaaga gcggtcacta caacttatgt tccaccgagg gcgagccaaa cccaccaggt gacttcttgg tcaagttgcc agaacacgtt ttgtccgtcg gtgtccacgc ctccaagttg 10 gttttcggtg ccggtccagt cggtctctta aagggtgtca ttgtcattga cattttcgac gctgctaccc acatcttcaa ctccaagacc ttcgacggcc gcgagccaac cgtcgtcttg caaggtgtcg ctatcttggc ccaaggtggt 15 ccagttaagt tcccaatcac tgaattcgct agatacggtt tcaacgatta caagacctct ggtaaggaaa aggccccaat tgacttcgag gacgccatca aggcctacga cttggtcaga gacggtcctg agtaa

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador

<400> 3

agaaaaccgg tatctgtggt tccga

<210> 4

<211> 25 <212> DNA

<213> Artificial <220>

aagatcgacg acatcacctt cgagtcgtac 60 gttctcgtgg aagtcaagaa aaccggtatc 120 ggtaagatcg gtaacttcgt gttgaccaag 180 gtcgtcacca aggtcggtac cggcgtcacc 240 gagccaggta ttccatccag attcagtgac 300 ccacacatgt gcttcgccgc cactccaaac 360 accttatgta agtacttcaa gtccccagag 420 tccttggaaa tgggtgctct tgtcgagcca 480 gcttccgtca gattcggtga ctacgtcgct 540 gctgctgccg tcgccaagac cttcggtgcc 600 aacaagttgc aaatggccaa ggacattggt 660 ggtggtgacg ccgctgcctt ggtcaaggct 720 gaatgtactg gtgctgagcc atgtatcaac 780 cgtttcgtcc aagtcggtaa cgccccaggt 840 accaaggaac tcaccttgtt cggctctttc 900 gtcgacatca tggacaccaa ctacaagaac 960 caattgatca cccacagatt caagttcgac 1020 gctggtagtg gtgctgtcaa gtgtatcatt 1080 1095 25 <223> iniciador <400> 4

tgaacttgta tctgtgggtg atcaa <210> 5 <211> 30 <212> DNA

<213> Candida shehatae <400> 5

tagtggatat cggaaccaca gataccggtt <210> 6 <211> 30 <212> DNA

<213> Candida shehatae <400> 6

caattgatca cccacagata caagttcaaa

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador <4 00> 7

aaaaaaaaaa cgctagcccc gggactagtg agct <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> iniciador <4 00> 8

cactagtccc ggggctagcg gtac <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 9 cggctagcga tgactctgta <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 10 ctggaaagtg ctcgcaaaaa <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 11 aggctttttt gcgagcactt <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 12 38

25

25

tgttgggccc ttttggatcc gccgaaaccg ttaataccaa tcttg 45

<210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <4 00> 13 ggcggatcca aaagggccca <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 14 ggactagtag gggtatccac <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 15 cgggatccga ggtgaccgat <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 16 44

33

37

cggggccccc ttcttagacg aagataggaa tcttgt 36

<210> 17 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> iniciador <400> 17

cgggatccta gtccgctcta gttataccct acaaa

<210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <4 00> 18 cggggcccgt ccaattattt actcaggacc gtcaa

<210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 19 cgggatccaa atactcacgt agttgacact cacaa

<210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 20 ctcggccgtt ctggaccagt atacc <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> iniciador <400> 21

ggtatactgg tccagaacgg ccga 24

<210> 22 <211> 33 <212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador <400> 22

cggggcccta acgtctatcg tgatattcgc aca 33

<210> 23 <211> 957 <212> DNA

<213> Pichia stipitis <220>

<221> CDS <222> (1) .. (957)

<220>

<223> PsXYLl <400> 23

atg cct tct att aag ttg aac tct ggt tac gac atg cca gcc gtc ggt 4 8

Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly 15 10 15

ttc ggc tgt tgg aaa gtc gac gtc gac acc tgt tct gaa cag ate tac 96

Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr 20 25 30

cgt gct ate aag acc ggt tac aga ttg ttc gac ggt gcc gaa gat tac 144 Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr

40 45

gcc aac gaa aag tta gtt ggt gcc ggt gtc aag aag gcc att gac gaa

Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu 50 55 60

ggt atc gtc aag cgt gaa gac ttg ttc ctt acc tcc aag ttg tgg aac

Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn 65 70 75 80

aac tac cac cac cca gac aac gtc gaa aag gcc ttg aac aga acc ctt

Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu

85 90 95

tct gac ttg caa gtt gac tac gtt gac ttg ttc ttg atc cac ttc cca

Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro 100 105 110

gtc acc ttc aag ttc gtt cca tta gaa gaa aag tac cca cca gga ttc

Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe

115 120 125

tac tgt ggt aag ggt gac aac ttc gac tac gaa gat gtt cca att tta

Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu 130 135 140

gag acc tgg aag gct ctt gaa aag ttg gtc aag gcc ggt aag atc aga

Glu Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Lys Ala Gly Lys Ile Arg 145 150 155 160 tct atc ggt gtt tct aac ttc cca ggt gct ttg ctc ttg gac ttg ttg Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu

165 170 175

aga ggt gct acc atc aag cca tct gtc ttg caa gtt gaa cac cac cca

Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ser Val Leu Gln Val Glu His His Pro 180 185 190 tac ttg caa caa cca aga ttg atc gaa ttc gct caa tcc cgt ggt att Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Ser Arg Gly Ile

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

195

200

205 gct gtc acc gct tac tct tcg ttc ggt cct caa tct ttc gtt gaa ttg Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu 210 215 220

aac caa ggt aga gct ttg aac act tct cca ttg ttc gag aac gaa act Asn Gln Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr 225 230 235 240

atc aag gct atc gct gct aag cac ggt aag tct cca gct caa gtc ttg Ile Lys Ala Ile Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln Val Leu 245 250 255

ttg aga tgg tct tcc caa aga ggc att gcc atc att cca aag tcc aac Leu Arg Trp Ser Ser Gln Arg Gly Ile Ala Ile Ile Pro Lys Ser Asn 260 265 270

act gtc cca aga ttg ttg gaa aac aag gac gtc aac age ttc gac ttg Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser Phe Asp Leu 275 280 285

gac gaa caa gat ttc gct gac att gcc aag ttg gac atc aac ttg aga Asp Glu Gln Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Leu Asp Ile Asn Leu Arg 290 295 300

ttc aac gac cca tgg gac tgg gac aag att cct atc ttc gtc taa Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe Val 305 310 315

<210> 24 <211> 318 <212> PRT <213> Pichia stipitis <220>

<223> PsXYLl <400> 24

Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly

1 5 10 15

Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr 20 25 30

672

720

768

816

864

912

957 Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr 35 40 45

Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu 50 55 60

Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn 65 70 75 80

Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu 85 90 95

Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro

100 105 110

Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe 115 120 125

Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu 130 135 140

Glu Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Lys Ala Gly Lys Ile Arg 145 150 155 160

Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu 165 170 175

Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ser Val Leu Gln Val Glu His His Pro 180 185 190

Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Ser Arg Gly Ile 195 200 205

Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu 210 215 220

Asn Gln Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr 225 230 235 240

Ile Lys Ala Ile Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln Val Leu 245 250 255

Leu Arg Trp Ser Ser Gln Arg Gly Ile Ala Ile Ile Pro Lys Ser Asn

260 265 270

Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser Phe Asp Leu 275 280 285 Asp Glu Gln Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Leu Asp Ile Asn Leu Arg 290 295 300

Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe Val 305 310 315

<210> 25

<211> 1872 <212> DNA <213> Artificial <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1872)

<220>

<223> PsXYL3_CDS_XbaI(-)

<4 00> 25

atg acc act acc cca ttt gat gct cca gat aag ctc ttc ctc ggg ttc 48

Met Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ala Pro Asp Lys Leu Phe Leu Gly Phe 15 10 15

gat ctt tcg act cag cag ttg aag atc atc gtc acc gat gaa aac ctc 96

Asp Leu Ser Thr Gln Gln Leu Lys Ile Ile Val Thr Asp Glu Asn Leu

20 25 30

gct gct ctc aaa acc tac aat gtc gag ttc gat age atc aac age tct 144

Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Val Glu Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser 35 40 45

gtc cag aag ggt gtc att gct atc aac gac gaa atc age aag ggt gcc 192

Val Gln Lys Gly Val Ile Ala Ile Asn Asp Glu Ile Ser Lys Gly Ala 50 55 60

att att tcc ccc gtt tac atg tgg ttg gat gcc ctt gac cat gtt ttt 240

Ile Ile Ser Pro Val Tyr Met Trp Leu Asp Ala Leu Asp His Val Phe 65 70 75 80

gaa gac atg aag aag gac gga ttc ccc ttc aac aag gtt gtt ggt att 288

Glu Asp Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Phe Asn Lys Val Val Gly Ile

85 90 95 tcc ggt tct tgt caa cag cac ggt tcg gta tac tgg tcc aga acg gcc Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr Trp Ser Arg Thr Ala 100 105 110

gag aag gtc ttg tcc gaa ttg gac gct gaa tct tcg tta tcg age cag Glu Lys Val Leu Ser Glu Leu Asp Ala Glu Ser Ser Leu Ser Ser Gln 115 120 125

atg aga tct gct ttc acc ttc aag cac gct cca aac tgg cag gat cac Met Arg Ser Ala Phe Thr Phe Lys His Ala Pro Asn Trp Gln Asp His 130 135 140

tct acc ggt aaa gag ctt gaa gag ttc gaa aga gtg att ggt gct gat Ser Thr Gly Lys Glu Leu Glu Glu Phe Glu Arg Val Ile Gly Ala Asp 145 150 155 160

gcc ttg gct gat atc tct ggt tcc aga gcc cat tac aga ttc aca ggg Ala Leu Ala Asp Ile Ser Gly Ser Arg Ala His Tyr Arg Phe Thr Gly 165 170 175

ctc cag att aga aag ttg tct acc aga ttc aag ccc gaa aag tac aac Leu Gln Ile Arg Lys Leu Ser Thr Arg Phe Lys Pro Glu Lys Tyr Asn 180 185 190

aga act gct cgt atc tct tta gtt tcg tea ttt gtt gcc agt gtg ttg Arg Thr Ala Arg Ile Ser Leu Val Ser Ser Phe Val Ala Ser Val Leu 195 200 205

ctt ggt aga atc acc tcc att gaa gaa gcc gat gct tgt gga atg aac Leu Gly Arg Ile Thr Ser Ile Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn 210 215 220

ttg tac gat atc gaa aag cgc gag ttc aac gaa gag ctc ttg gcc atc Leu Tyr Asp Ile Glu Lys Arg Glu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Ala Ile 225 230 235 240

gct gct ggt gtc cac cct gag ttg gat ggt gta gaa caa gac ggt gaa Ala Ala Gly Val His Pro Glu Leu Asp Gly Val Glu Gln Asp Gly Glu 245 250 255

att tac aga gct ggt atc aat gag ttg aag aga aag ttg ggt cct gtc Ile Tyr Arg Ala Gly Ile Asn Glu Leu Lys Arg Lys Leu Gly Pro Val

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816 260 265 270

aaa cct ata aca tac gaa age gaa ggt gac att gcc tct tac ttt gtc

Lys Pro Ile Thr Tyr Glu Ser Glu Gly Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Val

275 280 285

5 acc aga tac ggc ttc aac ccc gac tgt aaa atc tac tcg ttc acc gga

Thr Arg Tyr Gly Phe Asn Pro Asp Cys Lys Ile Tyr Ser Phe Thr Gly

290 295 300

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Asp Asn Leu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Leu Ala Pro Asn Asp Ala

305 310 315 320

ttg atc tea ttg ggt act tct act aca gtt tta att atc acc aag aac

Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val Leu Ile Ile Thr Lys Asn

325 330 335

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Tyr Ala Pro Ser Ser Gln Tyr His Leu Phe Lys His Pro Thr Met Pro

340 345 350

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Asp His Tyr Met Gly Met Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg

355 360 365

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Glu Lys Val Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Phe Asn Val Glu Asp Lys

370 375 380

aag tcg tgg gac aag ttc aat gaa atc ttg gac aaa tcc aca gac ttc

Lys Ser Trp Asp Lys Phe Asn Glu Ile Leu Asp Lys Ser Thr Asp Phe

385 390 395 400

aac aac aag ttg ggt att tac ttc cca ctt ggc gaa att gtc cct aat

Asn Asn Lys Leu Gly Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Asn

405 410 415

gcc gct gct cag atc aag aga tcg gtg ttg aac age aag aac gaa att

Ala Ala Ala Gln Ile Lys Arg Ser Val Leu Asn Ser Lys Asn Glu Ile

420 425 430

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864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344 Val Asp Val Glu Leu Gly Asp Lys Asn Trp Gln Pro Glu Asp Asp Val

435 440 445

tct tea att gta gaa tea cag act ttg tct tgt aga ttg aga act ggt

Ser Ser Ile Val Glu Ser Gln Thr Leu Ser Cys Arg Leu Arg Thr Gly

450 455 460

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465 470 475 480

cct caa cca gaa ggt gat ggt aca gat ttg cac aag gtc tac caa gac

Pro Gln Pro Glu Gly Asp Gly Thr Asp Leu His Lys Val Tyr Gln Asp

485 490 495

ttg gtt aaa aag ttt ggt gac ttg ttc act gat gga aag aag caa acc

Leu Val Lys Lys Phe Gly Asp Leu Phe Thr Asp Gly Lys Lys Gln Thr

500 505 510

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515 520 525

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Ala Ser Asn Asn Gly Ser Ile Ile Arg Lys Met Gly Ser Ile Leu Ala

530 535 540

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545 550 555 560

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Gly Gly Ala Tyr Lys Ala Ser Trp Ser Tyr Glu Cys Glu Ala Lys Lys

565 570 575

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Glu Trp Ile Gly Tyr Asp Gln Tyr Ile Asn Arg Leu Phe Glu Val Ser

580 585 590

gac gag atg aat ctg ttc gaa gtc aag gat aaa tgg ctc gaa tat gcc

Asp Glu Met Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Lys Trp Leu Glu Tyr Ala

595 600 605

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824 aac ggg gtt gga atg ttg gcc aag atg gaa agt gaa ttg aaa cac taa Asn Gly Val Gly Met Leu Ala Lys Met Glu Ser Glu Leu Lys His 610 615 620

<210> 26 <211> 623 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> PsXYL3_CDS_XbaI(-)

<400> 26

Met Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ala Pro Asp Lys Leu Phe Leu Gly Phe 15 10 15

Asp Leu Ser Thr Gln Gln Leu Lys Ile Ile Val Thr Asp Glu Asn Leu 20 25 30

Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Val Glu Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser 35 40 45

Val Gln Lys Gly Val Ile Ala Ile Asn Asp Glu Ile Ser Lys Gly Ala 50 55 60

Ile Ile Ser Pro Val Tyr Met Trp Leu Asp Ala Leu Asp His Val Phe 65 70 75 80

Glu Asp Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Phe Asn Lys Val Val Gly Ile 85 90 95

Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr Trp Ser Arg Thr Ala 100 105 110

Glu Lys Val Leu Ser Glu Leu Asp Ala Glu Ser Ser Leu Ser Ser Gln 115 120 125

Met Arg Ser Ala Phe Thr Phe Lys His Ala Pro Asn Trp Gln Asp His 130 135 140

Ser Thr Gly Lys Glu Leu Glu Glu Phe Glu Arg Val Ile Gly Ala Asp 145 150 155 160

Ala Leu Ala Asp Ile Ser Gly Ser Arg Ala His Tyr Arg Phe Thr Gly 165 170 175

1872 Leu Gln Ile Arg Lys Leu Ser Thr Arg Phe Lys Pro Glu Lys Tyr Asn 180 185 190

Arg Thr Ala Arg Ile Ser Leu Val Ser Ser Phe Val Ala Ser Val Leu 195 200 205

Leu Gly Arg Ile Thr Ser Ile Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn 210 215 220

Leu Tyr Asp Ile Glu Lys Arg Glu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Ala Ile 225 230 235 240

Ala Ala Gly Val His Pro Glu Leu Asp Gly Val Glu Gln Asp Gly Glu 245 250 255

Ile Tyr Arg Ala Gly Ile Asn Glu Leu Lys Arg Lys Leu Gly Pro Val 260 265 270

Lys Pro Ile Thr Tyr Glu Ser Glu Gly Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Val 275 280 285

Thr Arg Tyr Gly Phe Asn Pro Asp Cys Lys Ile Tyr Ser Phe Thr Gly 290 295 300

Asp Asn Leu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Leu Ala Pro Asn Asp Ala 305 310 315 320

Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val Leu Ile Ile Thr Lys Asn 325 330 335

Tyr Ala Pro Ser Ser Gln Tyr His Leu Phe Lys His Pro Thr Met Pro 340 345 350

Asp His Tyr Met Gly Met Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg 355 360 365

Glu Lys Val Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Phe Asn Val Glu Asp Lys 370 375 380

Lys Ser Trp Asp Lys Phe Asn Glu Ile Leu Asp Lys Ser Thr Asp Phe 385 390 395 400

Asn Asn Lys Leu Gly Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Asn 405 410 415

Ala Ala Ala Gln Ile Lys Arg Ser Val Leu Asn Ser Lys Asn Glu Ile 420 425 430 Val Asp Val Glu Leu Gly Asp Lys Asn Trp Gln Pro Glu Asp Asp Val 435 440 445

Ser Ser Ile Val Glu Ser Gln Thr Leu Ser Cys Arg Leu Arg Thr Gly 450 455 460

Pro Met Leu Ser Lys Ser Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser 465 470 475 480

Pro Gln Pro Glu Gly Asp Gly Thr Asp Leu His Lys Val Tyr Gln Asp 485 490 495

Leu Val Lys Lys Phe Gly Asp Leu Phe Thr Asp Gly Lys Lys Gln Thr 500 505 510

Phe Glu Ser Leu Thr Ala Arg Pro Asn Arg Cys Tyr Tyr Val Gly Gly 515 520 525

Ala Ser Asn Asn Gly Ser Ile Ile Arg Lys Met Gly Ser Ile Leu Ala 530 535 540

Pro Val Asn Gly Asn Tyr Lys Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Ala Leu 545 550 555 560

Gly Gly Ala Tyr Lys Ala Ser Trp Ser Tyr Glu Cys Glu Ala Lys Lys 565 570 575

Glu Trp Ile Gly Tyr Asp Gln Tyr Ile Asn Arg Leu Phe Glu Val Ser 580 585 590

Asp Glu Met Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Lys Trp Leu Glu Tyr Ala 595 600 605

Asn Gly Val Gly Met Leu Ala Lys Met Glu Ser Glu Leu Lys His 610 615 620

Claims (25)

1. DNA, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo selecionado entre: (a) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1, e tem uma atividade de xilitol desidrogenase; (b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que tem 90% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e tem uma atividade de xilitol desidrogenase; e (c) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cidos que compreende substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e tem uma atividade de xilitol desidrogenase.

2. DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

3. DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA compreende uma seqüência que difere da seqüência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 2 devido à degeneração do código genético.

4. DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o DNA é de uma levedura.

5. DNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a levedura é Candida shehatae.

6. DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a levedura é Candida shehatae CBS5813 (NBRC1983).

7. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende um DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e uma seqüência reguladora capaz de regular a expressão do DNA em uma célula hospedeira.

8. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o DNA codifica a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1.

9. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o DNA compreende a seqüência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 2.

10. Construção de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a seqüência regula- dora é da célula hospedeira.

11. Construção de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a seqüência regula- dora é um promotor.

12. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação11, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo ou um promotor induzível.

13. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação11 ou 12, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado no grupo que consiste nos promotores ADH1, ADH2, PDC, GAL1/10, TDH3, e PGK1.

14. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma constru- ção de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 13.

15. Vetor de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo.

16. Micro-organismo, caracterizado pelo fato de que compreen- de um DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, uma construção de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindi- cações 7 a 13, ou um vetor como definido na reivindicação 14 ou 15, de tal modo que o micro-organismo expresse um polipeptídeo que tem uma ativi- dade de xilitol desidrogenase.

17. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 16, caracte- rizado pelo fato de que o micro-organismo é uma levedura ou bactéria.

18. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 17, caracte- rizado pelo fato de que a levedura ou bactéria é selecionada dos grupos que consistem em leveduras do gênero Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomy- ces, Metschnikowia, Pachulosen, ou Paecilomyces e bactérias do gênero Zymomonas.

19. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 18, caracte- rizado pelo fato de que o micro-organismo é Saccharomyces cerevisiae.

20. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 18, caracte- rizado pelo fato de que o micro-organismo é Schizosaccharomyces pombe.

21. Micro-organismo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que o DNA ou a construção de ácido nucléico é incorporada no genoma do micro-organismo hospedeiro.

22. Método para produzir xilitol desidrogenase, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar um micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 21, em um meio; e (b) coletar um produto que tem uma atividade de xilitol desidro- genase a partir do micro-organismo ou do meio.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a etapa de selecionar um micro-organismo apropriado para fermentação de xilulose.

24. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que usa um micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações16 a 21.

25. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um casse- te de expressão do gene de xilitol desidrogenase, que compreende um DNA de acordo com a reivindicação 1, um cassete de expressão do gene de xilo- se redutase, e um cassete de expressão do gene de xilulocinase.