KR20130007687A - 향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물 - Google Patents

향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물 Download PDF

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Abstract

향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물, 상기 미생물에 도입하기 위한 벡터, 및 상기 미생물을 이용한 화학 물질의 생산 방법이 개시된다. 상기 변형 미생물은 전구체 미생물 보다 높은 수준으로 화학 물질을 생산할 수 있다.

Description

향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물{MODIFIED MICROORGANISM HAVING ENHANCED XYLOSE UTILIZATION}
향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물, 상기 변형 미생물을 제작하기 위한 발현 벡터, 및 상기 변형 미생물을 이용한 화학 물질의 생산 방법에 관한 것이다.
세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 환경오염 및 자원고갈에 대한 우려가 증가하고 있는 가운데, 생물학적 공급원으로부터 에탄올과 같은 화학 물질을 생산하는 것에 대한 관심이 고조되고 있다. 셀룰로오스계 바이오매스는 자연계에 풍부하게 존재하며 저렴하게 수확이 가능하므로 화학물질 생산을 위한 매우 현실적인 자원으로 여겨지고 있다.
하지만, 셀룰로오스계 바이오매스가 산업적인 규모의 화학물질 생산 공정에서 기질로 사용되지 못하는 원인 중 하나로, 셀룰로오스계 바이오매스의 가수 분해물에 다량 함유되어 있는 자일로스를 효과적으로 전환하는 미생물의 부재를 들 수 있다. 자일로스는 셀룰로오스계 바이오매스의 분해산물 중 약 25% 이상을 구성하므로, 이를 효과적으로 전환하는 균주의 개발이 필요하다.
현재, 바이오매스로부터 화학 물질을 생산하기 위해 사용되는 미생물 중에서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 널리 이용되고 있다. 그러나, 사카로마이세스 균주의 최적 성장 온도는 35℃를 넘지 못하며, 오탄당을 포함한 탄소원의 활용능이 낮아 화학 물질 생산에 많은 비용이 소요된다.
최근, 사카로마이세스 균주에 대한 대안으로서 클루이베로마이세스 균주(Kluyveromyces)가 주목받고 있다. K. 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 K. 락티스(Kluyveromyces Lactis)는 사카로마이세스와 마찬가지로, 미국 FDA로부터 인체에 대한 안정성이 인정된 GRAS (Generally Recognized As Save) 세포로 분류되어 있다.
K. marxianus는 47℃, 49℃, 및 심지어 52℃의 온도에서도 성장이 가능하며, 락토스, 이눌린, 셀로비오스와 같은 다당류 뿐만 아니라 자일로스, 아라비노스와 같은 오탄당의 활용능이 우수하다고 알려져 있다.
그러나, K. marxianus는 자일로스의 대사과정에서 야기되는 보조인자 불균형 (cofactor-imbalance) 현상에 의해 자일로스 대사의 부산물인 자일리톨이 축적되기 때문에, 자일로스를 이용한 에탄올과 같은 화학물질의 생산성이 낮아 산업적으로 이용하기에는 한계가 있다.
셀룰로오스계 바이오매스 유래의 자일로스를 효과적으로 전환하기 위한 생합성 경로를 포함하는 변형 미생물을 제공하고자 한다.
일 측면에 따르면, 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 포함하는, 변형 미생물이 개시된다.
다른 측면에 따르면, 프로모터, 상기의 활성들을 코드화하는 유전자, 및 터미네이터를 포함하는, 발현 벡터가 개시된다.
다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터가 도입된 미생물을 자일로스 함유 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 화학 물질의 제조방법이 개시된다.
상기 변형 미생물은 상응하는 전구체 미생물 보다 화학 물질의 생산성이 증가될 수 있다.
도 1은 자일로스의 대사 경로를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 제작된 발현 벡터를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어져서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수지 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에서 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어져서는 안된다.
<자일로스 대사>
셀룰로오스계 바이오매스 유래의 자일로스를 효과적으로 전환하기 위한 생합성 경로를 포함하는 변형 미생물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "생합성 경로(biosynthetic pathway)" 또는 "대사 경로(metabolic pathway)"는 숙주 세포내에서 일어나고 하나의 효소적 반응의 생성물이 다음 화학적 반응을 위해 기질이 되는 2개 이상의 일련의 효소적 반응을 의미한다. 대사적 경로의 각 단계에서, 중간체 화합물이 형성되고 다음 단계를 위한 기질로서 사용된다. 이들 화합물을 "대사 중간체"라 하고, 각 단계의 생성물을 "대사산물"이라 한다.
상기 변형 미생물은 생합성 경로로서 자일로스 대사 경로를 이용할 수 있다.
자일로스(D-xylose)는 다양한 생물체에 의해 유용한 생산물로 대사될 수 있는 탄소 5개의 단당류를 의미하며, 크게 2 단계를 거쳐 펜토스 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway, PPP)에 진입할 수 있다.
우선, 자일로스는 "자일로스 리덕타아제-자일리톨 데히드로게나제", 즉 "XR-XDH(Xylose Reductase-Xylitol Dehydrogenase)" 경로를 통해 자일룰로스로 전환된다. 자일로스는 보조인자로서 NADH 또는 NADPH에 의존하는 자일오로스 리덕타아제(XR)에 의해 자일리톨로 환원되고, 자일리톨은 보조인자로서 NAD+에 의존하는 자일리톨 데히드로게나제(XDH)에 의해 자일룰로스로 산화된다.
그 다음, "자일룰로키나제(Xylulokinase, XK)" 경로를 거치게 된다. XR-XDH 경로를 통해 생산된 자일룰오스는 자일룰로키나제에 의해 자일룰로스-5-포스페이트(Xylulose-5-Phosphate)로 인산화되고, 인산화된 당은 추가의 이화 작용(catabolism)을 위한 PPP 경로에 진입할 수 있다.
상기 자일로스의 대사 경로를 도 1에 나타내었다. 도 1을 살펴보면, 보조인자 불균형은, XR에 의한 반응은 적당량의 NADPH 또는 NADP를 사용하지만, XDH에 의한 반응은 상당량의 NADH를 생성하는 것에 의해 발생한다. XR에 의한 반응에서 NADH가 덜 사용되는 경우, XDH에 의한 반응에서 NAD+가 이용될 수 없다. 따라서, NAD+의 양이 불충분하여, 자일리톨이 축적되는 것이다.
일 실시예에서, 자일리톨이 원활히 대사될 수 있는 변형 미생물이 제작되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "기질" 또는 "적절한 기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 의미한다. 상기 기질은 단일 화합물뿐만 아니라, 용액, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 물질과 같은 화합물의 조합, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 또한, 바이오매스(biomass) 유도된 당과 같은 출발 물질로서 이용하기 적절한 탄소 공급원을 제공하는 화합물뿐만 아니라, 상기 변형 미생물과 연관된 경로에서 이용되는 중간생성물과 최종 대사산물을 포함한다.
상기 자일로스는 셀룰로오스계 바이오매스로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "셀룰로오스계 바이오매스" "리그노셀룰로오스계 물질", 및 "리그노셀룰로오스계 기질"은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등의 구성성분으로 이루어진 임의의 유형의 바이오매스를 의미한다. 목질계 바이오매스(woody biomass), 먹이풀(forage grass), 초본 에너지 작물(herbaceous energy crop), 비목질계 바이오매스(non-woody-plant biomass), 농업 폐기물, 농업 잔존물, 산림 잔조물, 산림 폐기물, 종이-생산 슬러지, 폐지 슬러지, 폐수-처리 슬러지, 도시 고형 폐기물(municipal solid waste), 습식 및 건식 제분 옥수수 에탄올 플랜트로부터의 옥수수 섬유, 및 설탕-가공 잔존물로부터 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
목질계 바이오매스는 리사이클링된 목재 펄프 섬유, 톱밥, 경질목재, 연질목재를 포함할 수 있고, 그래스는 스위치 그래스, 코드 그래스, 라이 그래스, 리드 카나리 그래스, 미스캔투스를 포함할 수 있고, 설탕-가공 잔존물은 사탕수수 버개스를 포함할 수 있고, 농업 폐기물은 볏짚, 왕겨, 보리짚, 옥수수 속대, 곡물짚, 밀짚, 카놀라짚, 귀리짚, 귀리껍질, 및 옥수수섬유를 포함할 수 있고, 스토버는 대두 스토버, 옥수수 스토버를 포함할 수 있고, 산림 폐기물은 리사이클링된 목재 펄프 섬유, 톱밥, 연질목재 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 리그노셀룰로오스계 물질은 하나의 섬유 종(species)을 포함할 수 있고, 또한 리그노셀룰로오스계 물질은 다양한 리그노셀룰로오스계 물질로부터 유래된 섬유들의 혼합물을 포함할 수 있다.
<변형 미생물>
일 측면에 따르면, 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 포함하는, 변형 미생물이 제공된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반한다. "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예를 들면, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함한다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 널리 알려져 있다.
따라서, 대사 "조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산된다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하는 능력을 획득한다.
예를 들면, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 결과한다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.
상기 구현예에서, 미생물은 자일로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는데 필요한 활성을 포함하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "활성", "효소 활성"은 유리한 조건하에서 생산되는 경우에 선택된 폴리펩티드에 정상적으로 기인하는 임의의 기능적 활성을 의미한다. 전형적으로, 선택된 폴리펩티드의 활성은 생산된 폴리펩티드와 관련된 전체 효소적 활성을 포함한다. 숙주 세포에 의해 생산되고 효소적 활성을 지니는 폴리펩티드는 세포의 세포내 공간에 위치하거나, 세포와 결합되어 있거나, 세포외 환경으로 분비될 수 있다.
상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성은 보조인자로서 NADPH 또는NADH를 이용하여 자일로스를 자일리톨로 환원할 수 있는 능력을 의미한다.
상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성은 자일로스 리덕타제(XR) 활성일 수 있다. 상기 XR 활성은 칸디다 세타태(Candida shetatae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 파치솔렌 탄노필러스(Pachysolen tannophilus)와 같은 자일로스-이용 효모로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 피키아 스티피티스 유래의 XR 활성이 이용되었다.
상기 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성은 보조인자로서 NAD+를 이용하여 자일리톨을 D-자일룰로스로 산화할 수 있는 능력을 의미한다.
상기 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성은 자일리톨 데히드로게나제(XDH) 활성일 수 있다. 상기 XDH 활성은 칸디다 세타태(Candida shetatae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 파치솔렌 탄노필러스(Pachysolen tannophilus)와 같은 자일로스-이용 효모로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 피키아 스티피티스 유래의 XDH 활성이 이용되었다.
상기 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성은 ATP를 이용하여 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 인산화할 수 있는 능력을 의미한다.
상기 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성은 자일룰로키나제(XK) 활성일 수 있다. 상기 XK 활성은 칸디다 세타태(Candida shetatae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 파치솔렌 탄노필러스(Pachysolen tannophilus)와 같은 자일로스-이용 효모뿐 아니라, 사카로마이세스 세레비지애(Shaccaromyces serevisiae), 치조사카로마이세스 폼베(Schizoxaccaromyces pombe), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 자일로스 비-이용 효모로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 XK가 이용되었다.
상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 미생물에 도입하는 것은 공지된 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 활성들을 갖는 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이러한 발현 벡터로 미생물을 형질전환시키는 방법을 이용할 수 있다.
<발현 벡터>
다른 측면에 따르면, 프로모터 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 명세서에 사용된, 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 미생물 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 잠재성 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주내로 형질전환되면, 상기 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제되어 기능을 하거나, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터로서 통상적으로 사용되기 때문에, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "플라스미드(plasmid)"와 벡터(vector)"는 상호교환적으로 사용된다.
그러나, 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다. 예를 들면, 벡터는 복제 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스 입자, DNA 구축물, 및 카세트를 포함할 수 있다. 용어 "플라스미드"는 복제 벡터로서 사용되는 환형의 이중 가닥 DNA 구출물을 의미하며, 많은 박테리아 및 일부의 진핵생물 내의 염색체 외의 자가-복제 유전적 요소를 형성한다. 상기 플라스미드는 상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 복수의 카피 플라스미드를 포함할 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 예를 들면, 발현 조절서열 및 해당 유전자는 선별 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우, 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 미치는 것을 의미한다. 상기"작동가능하게 연결된"은 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열이 인접함을 의미할 수 있다. 연결은 편리한 제한 위치에 묶어짐으로써 수행될 수 있다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 연결자(linker)가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "프로모터(promoter)"는 하류 유전자의 전사를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 목적 단백질의 발현을 가져오는 임의의 프로모터일 수 있고, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보여주는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 돌연변이, 절단된 및 혼성화 프로모터를 포함하고, 숙주 세포에 대하여 상동성 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 고유의 또는 이질적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "유전자(gene)"는 선행하는 및 이어지는 암호화 영역, 예를 들면, 각 암호화 조각(엑손) 사이의 개입 서열(인트론) 뿐만 아니라, 5' 미번역(5' UTR) 또는 리더 서열 및 3' 미번역(3' UTR) 또는 트레일러 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 폴리뉴클레오티스 서열을 의미한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머성 형태를 의미한다. 이는 단일 나선 DNA, 이중 나선DNA, 게놈 DNA, cDNA, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적, 생화학적으로 변형, 비-자연적 또는 유도화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 염색체 단편, ESTs, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 유전자 암호의 퇴화의 결과로서, 주어진 단백질을 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "터미네이터(terminator)"는 전사의 종료를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.
상기 프로모터는 PGK1(phosphoglycerate kinase 1), CYC(cytochrome-c oxidase), TEF(translation elongation factor 1α), GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ADH(alcohol dehydrogenase), PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, glucokinase,α-mating factor pheromone, GUT2, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, PGK1 프로모터가 사용되었다.
상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성은 XYL1 유전자에 의해 코드화된다. 상기 유전자는 서열번호 1 및 상기 서열번호 1에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다:
서열번호 1(957 bp)
1 ATGCCTTCTA TTAAGTTGAA CTCTGGTTAC GACATGCCAG CCGTCGGTTT
51 CGGCTGTTGG AAAGTCGACG TCGACACCTG TTCTGAACAG ATCTACCGTG
101 CTATCAAGAC CGGTTACAGA TTGTTCGACG GTGCCGAAGA TTACGCCAAC
151 GAAAAGTTAG TTGGTGCCGG TGTCAAGAAG GCCATTGACG AAGGTATCGT
201 CAAGCGTGAA GACTTGTTCC TTACCTCCAA GTTGTGGAAC AACTACCACC
251 ACCCAGACAA CGTCGAAAAG GCCTTGAACA GAACCCTTTC TGACTTGCAA
301 GTTGACTACG TTGACTTGTT CTTGATCCAC TTCCCAGTCA CCTTCAAGTT
351 CGTTCCATTA GAAGAAAAGT ACCCACCAGG ATTCTACTGT GGTAAGGGTG
401 ACAACTTCGA CTACGAAGAT GTTCCAATTT TAGAGACCTG GAAGGCTCTT
451 GAAAAGTTGG TCAAGGCCGG TAAGATCAGA TCTATCGGTG TTTCTAACTT
501 CCCAGGTGCT TTGCTCTTGG ACTTGTTGAG AGGTGCTACC ATCAAGCCAT
551 CTGTCTTGCA AGTTGAACAC CACCCATACT TGCAACAACC AAGATTGATC
601 GAATTCGCTC AATCCCGTGG TATTGCTGTC ACCGCTTACT CTTCGTTCGG
651 TCCTCAATCT TTCGTTGAAT TGAACCAAGG TAGAGCTTTG AACACTTCTC
701 CATTGTTCGA GAACGAAACT ATCAAGGCTA TCGCTGCTAA GCACGGTAAG
751 TCTCCAGCTC AAGTCTTGTT GAGATGGTCT TCCCAAAGAG GCATTGCCAT
801 CATTCCAAAG TCCAACACTG TCCCAAGATT GTTGGAAAAC AAGGACGTCA
851 ACAGCTTCGA CTTGGACGAA CAAGATTTCG CTGACATTGC CAAGTTGGAC
901 ATCAACTTGA GATTCAACGA CCCATGGGAC TGGGACAAGA TTCCTATCTT
951 CGTCTAA
상기 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성은 XYL2 유전자에 의해 코드화된다. 상기 유전자는 서열번호 2 및 상기 서열번호 2에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다:
서열번호 2(1,092 bp)
1 ATGACTGCTA ACCCTTCCTT GGTGTTGAAC AAGATCGACG ACATTTCGTT
51 CGAAACTTAC GATGCCCCAG AAATCTCTGA ACCTACCGAT GTCCTCGTCC
101 AGGTCAAGAA AACCGGTATC TGTGGTTCCG ACATCCACTT CTACGCCCAT
151 GGTAGAATCG GTAACTTCGT TTTGACCAAG CCAATGGTCT TGGGTCACGA
201 ATCCGCCGGT ACTGTTGTCC AGGTTGGTAA GGGTGTCACC TCTCTTAAGG
251 TTGGTGACAA CGTCGCTATC GAACCAGGTA TTCCATCCAG ATTCTCCGAC
301 GAATACAAGA GCGGTCACTA CAACTTGTGT CCTCACATGG CCTTCGCCGC
351 TACTCCTAAC TCCAAGGAAG GCGAACCAAA CCCACCAGGT ACCTTATGTA
401 AGTACTTCAA GTCGCCAGAA GACTTCTTGG TCAAGTTGCC AGACCACGTC
451 AGCTTGGAAC TCGGTGCTCT TGTTGAGCCA TTGTCTGTTG GTGTCCACGC
501 CTCTAAGTTG GGTTCCGTTG CTTTCGGCGA CTACGTTGCC GTCTTTGGTG
551 CTGGTCCTGT TGGTCTTTTG GCTGCTGCTG TCGCCAAGAC CTTCGGTGCT
601 AAGGGTGTCA TCGTCGTTGA CATTTTCGAC AACAAGTTGA AGATGGCCAA
651 GGACATTGGT GCTGCTACTC ACACCTTCAA CTCCAAGACC GGTGGTTCTG
701 AAGAATTGAT CAAGGCTTTC GGTGGTAACG TGCCAAACGT CGTTTTGGAA
751 TGTACTGGTG CTGAACCTTG TATCAAGTTG GGTGTTGACG CCATTGCCCC
801 AGGTGGTCGT TTCGTTCAAG TCGGTAACGC TGCTGGTCCA GTCAGCTTCC
851 CAATCACCGT TTTCGCCATG AAGGAATTGA CTTTGTTCGG TTCTTTCAGA
901 TACGGATTCA ACGACTACAA GACTGCTGTT GGAATCTTTG ACACTAACTA
951 CCAAAACGGT AGAGAAAATG CTCCAATTGA CTTTGAACAA TTGATCACCC
1001 ACAGATACAA GTTCAAGGAC GCTATTGAAG CCTACGACTT GGTCAGAGCC
1051 GGTAAGGGTG CTGTCAAGTG TCTCATTGAC GGCCCTGAGT AA
상기 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성은 XKS1 유전자에 의해 코드화된다. 상기 유전자는 서열번호 3 및 상기 서열번호 3에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다:
서열번호 3(1,803 bp)
1 ATGTTGTGTT CAGTAATTCA GAGACAGACA AGAGAGGTTT CCAACACAAT
51 GTCTTTAGAC TCATACTATC TTGGGTTTGA TCTTTCGACC CAACAACTGA
101 AATGTCTCGC CATTAACCAG GACCTAAAAA TTGTCCATTC AGAAACAGTG
151 GAATTTGAAA AGGATCTTCC GCATTATCAC ACAAAGAAGG GTGTCTATAT
201 ACACGGCGAC ACTATCGAAT GTCCCGTAGC CATGTGGTTA GAGGCTCTAG
251 ATCTGGTTCT CTCGAAATAT CGCGAGGCTA AATTTCCATT GAACAAAGTT
301 ATGGCCGTCT CAGGGTCCTG CCAGCAGCAC GGGTCTGTCT ACTGGTCCTC
351 CCAAGCCGAA TCTCTGTTAG AGCAATTGAA TAAGAAACCG GAAAAAGATT
401 TATTGCACTA CGTGAGCTCT GTAGCATTTG CAAGGCAAAC CGCCCCCAAT
451 TGGCAAGACC ACAGTACTGC AAAGCAATGT CAAGAGTTTG AAGAGTGCAT
501 AGGTGGGCCT GAAAAAATGG CTCAATTAAC AGGGTCCAGA GCCCATTTTA
551 GATTTACTGG TCCTCAAATT CTGAAAATTG CACAATTAGA ACCAGAAGCT
601 TACGAAAAAA CAAAGACCAT TTCTTTAGTG TCTAATTTTT TGACTTCTAT
651 CTTAGTGGGC CATCTTGTTG AATTAGAGGA GGCAGATGCC TGTGGTATGA
701 ACCTTTATGA TATACGTGAA AGAAAATTCA GTGATGAGCT ACTACATCTA
751 ATTGATAGTT CTTCTAAGGA TAAAACTATC AGACAAAAAT TAATGAGAGC
801 ACCCATGAAA AATTTGATAG CGGGTACCAT CTGTAAATAT TTTATTGAGA
851 AGTACGGTTT CAATACAAAC TGCAAGGTCT CTCCCATGAC TGGGGATAAT
901 TTAGCCACTA TATGTTCTTT ACCCCTGCGG AAGAATGACG TTCTCGTTTC
951 CCTAGGAACA AGTACTACAG TTCTTCTGGT CACCGATAAG TATCACCCCT
1001 CTCCGAACTA TCATCTTTTC ATTCATCCAA CTCTGCCAAA CCATTATATG
1051 GGTATGATTT GTTATTGTAA TGGTTCTTTG GCAAGGGAGA GGATAAGAGA
1101 CGAGTTAAAC AAAGAACGGG AAAATAATTA TGAGAAGACT AACGATTGGA
1151 CTCTTTTTAA TCAAGCTGTG CTAGATGACT CAGAAAGTAG TGAAAATGAA
1201 TTAGGTGTAT ATTTTCCTCT GGGGGAGATC GTTCCTAGCG TAAAAGCCAT
1251 AAACAAAAGG GTTATCTTCA ATCCAAAAAC GGGTATGATT GAAAGAGAGG
1301 TGGCCAAGTT CAAAGACAAG AGGCACGATG CCAAAAATAT TGTAGAATCA
1351 CAGGCTTTAA GTTGCAGGGT AAGAATATCT CCCCTGCTTT CGGATTCAAA
1401 CGCAAGCTCA CAACAGAGAC TGAACGAAGA TACAATCGTG AAGTTTGATT
1451 ACGATGAATC TCCGCTGCGG GACTACCTAA ATAAAAGGCC AGAAAGGACT
1501 TTTTTTGTAG GTGGGGCTTC TAAAAACGAT GCTATTGTGA AGAAGTTTGC
1551 TCAAGTCATT GGTGCTACAA AGGGTAATTT TAGGCTAGAA ACACCAAACT
1601 CATGTGCCCT TGGTGGTTGT TATAAGGCCA TGTGGTCATT GTTATATGAC
1651 TCTAATAAAA TTGCAGTTCC TTTTGATAAA TTTCTGAATG ACAATTTTCC
1701 ATGGCATGTA ATGGAAAGCA TATCCGATGT GGATAATGAA AATTGGGATC
1751 GCTATAATTC CAAGATTGTC CCCTTAAGCG AACTGGAAAA GACTCTCATC
1801 TAA
본 명세서에서 사용된, 용어 "상동성(homology)"은 서열 유사성 또는 서열 동일성을 의미한다. 상기 상동성은 당업계에 알려진 표준 기술 기술(예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482[1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984])을 사용하여 측정될 수 있다.
상기 터미네이터는 PGK1(phosphoglycerate kinase 1), CYC1(Cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, PGK1 터미네이터가 사용되었다.
상기 벡터는 선별 마커를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "선별 마커(selectable marker)"는 숙주 세포에서 발현가능한 뉴클레오티드 서열을 의미하고, 선별 마커의 발현은 발현된 유전자를 함유하는 세포에게 상응하는 선별제의 존재 또는 필수 영양소의 결핍시 성장하는 능력을 부여한다. 상기 선별 마커는 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kannamycin), 에리스로마이신(erythromycin), 액티노마이신(actinomycin), 클로람페니콜(chlorampjenicol) 및 테트라싸이클린(tetracyclin) 등과 같은 내항생제성 마커, 및 URA3(우라실 영양요구성), LEU2(루신 영양요구성), TRP1(트립토판 영양요구성) 및 HIS3(히스티딘 영양요구성)과 같은 영양요구성 마커를 포함할 수 있다. 즉, 선별 마커는 숙주 세포에서 내항생제성 및 영양요구성을 부여하여 외인성의 DNA를 함유하는 세포가, 형질 전환되는 동안 어떠한 외인성의 서열도 받지 않는 세포로부터 구별될 수 있도록 하는 유전자이다.
일 실시예에서, URA3 영양요구성 선별 마커가 사용되었다.
상기 벡터는 복제 개시점을 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "복제 개시점(replication origin)"은 숙주 세포내에서 플라스미드의 복제 또는 증폭을 지시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 복제 개시점은 효모 자기복제서열(autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있고, 상기ARS는 효모 동원체 서열(centromeric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다.
일 실시예에서, 클루이베로마이세스 마르시아누스의 ARS/CEN가 사용되었다.
<변형 미생물의 제작>
상기 발현 벡터는 적절한 미생물 숙주세포로 통상의 방법에 의해 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "숙주 세포(host cell)"는 상기 발현 벡터를 위한 숙주로서 수행하는 세포로부터의 적합한 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주세포일 수 있다. "야생형 숙주 세포(wide-type host cell)"은 재조합 방법을 통하여 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현된다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현되도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "전구체(precursor)" 또는 "부모(parent)" 세포는 변형 숙주 세포가 유도되는 세포를 의미한다. 상기 전구체 또는 부모 세포는 야생형 세포 또는 변화된 세포가 될 수 있다.
상기 구현예에서, 숙주 세포는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 또는 또는 에스케리치아(Escherichia) 속을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus), 및 클루이베로마이세스 써모토러란스(K. thermotolerans)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 클루이베로마이세스 마르시아누스 및 에스케리치아 콜리가 사용되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "도입된(introduced)"은 핵산 서열을 상기 숙주 세포내로 옮기는 임의의 적절한 방법을 의미한다. 도입의 방법은 원형질 융합, 감염(transfection), 형질전환, 컨쥬게이션, 형질도입을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(예를 들면, Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al,(eds.), (Bacillus), Plenum Publishing Corp., pages 57-72, [1989] 참조).
본 명세서에서 사용된, 용어 "형질전환된(tramsformed)" 및 "안정적으로 형질전환된(stably transformed)"은 게놈 내로 통합되는 비-고유의 이종적인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2 이상의 세대 동안 유지되는 에피솜 플라스미드에 존재하는 이종의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 의미한다.
상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자를 숙주 세포에 도입하는 것은, 플라스미드를 대장균으로부터 단리하고, 이를 숙주 세포에 형질전환하는 것에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 대장균과 같은 중매 미생물을 필수적으로 사용하여야 하는 것은 아니고, 벡터가 숙주 세포로 직접적으로 도입될 수도 있다. 상기 형질전환 방법은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
<화학 물질의 생산방법>
다른 측면에 따르면, 상기 변형 미생물을 자일로스 함유 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 화학 물질의 생산방법이 제공된다.
상기 변형 미생물을 배양하는 단계는 화학 물질을 생성하는데 적합한 성장 조건 하에서 수행될 수 있다.
세포 배양에 사용되는 상기 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그).
상기 구현예에서, 상기 배지는 탄소원으로서 자일로스를 포함하며, 자일로스는 그 자체일 수 있거나, 리그노셀룰로오스, 아라비난, 셀룰로오스 및 전분과 같은 자일로스 단위를 포함하는 올리고머성 또는 중합체성 탄수화물일 수 있다. 탄수화물로부터 자일로스 단위를 방출시키기 위해서, 적합한 카르보히드라아제 (예를 들면, 자일라나아제)를 반응 배지에 첨가할 수 있다.
상기 배양배지는 또한, 글루코오스 및 폐당밀과 같은 탄소원 암모니아, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄 및 우레아와 같은 질소원 인산 수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨, 황산 마그네슘과 같은 무기염 및 필요에 따라, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카사미노산, 비오틴, 티아민과 같은 각종의 비타민을 포함하는 영양분을 더욱 포함할 수 있다.
상기 변형 미생물은 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있다. 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용하며, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 만들어지고, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어난다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화된다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변한다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이른다. 처리되지 않으면, 정지상의 세포는 결국 죽는다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만든다.
표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가된다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용하다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 예측된다. 배치 및 공급-배치 발효가 일반적이고, 당업계에 알려져 있다.
계속적 발효는, 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지한다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작을 허용한다. 예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지된다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변한다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
배양 생성물을 회수하는 단계는 바이오프로세스에서 사용되는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 염석법, 재결정법, 유기 용매 추출법, 에스테르화 증류법, 크로마토그래피 및 전기투석법을 포함하며, 분리, 정제 또는 수집 방법은 화학 물질의 특성에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 구현예에서, 화학 물질은 유기산, 알코올, 아미노산 및 비타민 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기산은 아세트산, 락트산, 3-히드록시프로피온산, 아크릴산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살아세트산, 시트르산, 시스-아코니트산, 이소시트르산, 이타콘산, 2-옥소클루타르산 및 시키미산을 포함할 수 있고, 상기 알코올은 에탄올, 부탄올, 1,3-프로판디올, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨 및 1,4-부탄디올을 포함할 수 있고, 상기 아미노산은 발린, 류신, 알라닌, 아스파르트산, 리신, 이소류신 및 트레오닌을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 에탄올이 생성되었다.
상기 구현예에 따르면, 변형 미생물은 상응하는 전구체 미생물 보다 화학 물질의 생산성이 증가될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "증가된" 또는 "증가"는 전구체 미생물 또는 상이하게 변형된 미생물과 같은 대조 미생물에 비해 주어진 산물 또는 분자를 더 많은 양으로 생산할 수 있는 하나 이상의 재조합 미생물의 능력을 의미한다. "증가된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의적인" 양이며, 전구체 미생물 또는 상이하게 변형된 미생물에 비해 생산된 양이 10%, 20%, 30%, 40% 등의 증가를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 변형 미생물을 이용하여 생산된 에탄올의 최대 수율은 약 6.6% 이다. 예를 들면, KM8-5균주에서 자일로스 g 당 0.066g의 에탄올이 생성되었다.
이는 전구체 미생물에 의해 생성되는 것 보다 약 137% 이상, 약 275% 이상, 약 166% 이상의 에탄올 생산성이 증가된 것으로, 산업적으로 대량생산이 가능함을 의미한다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
균주 및 플라스미드
플라스미드의 증식 및 대량 추출을 위한 숙주로는 E.coli TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ- (Invitrogen, CA)를 사용하였다. 목적 단백질의 발현을 위한 효모 숙주 세포로는 Kluyveromyces marxianus var. marxianus 균주, 예를 들면 KM3(KTCT 17555), KM8(KTCT4155), 및 KM11(KTCT17724)를 사용하였다. 유전자 재조합 플라스미드는 pRS306 (ATCC 77141)을 사용하였다.
배지 및 배양 방법
E, coli는 암피실린 또는 카나마이신을 포함하는 LB(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효소 추출물, 1% NaCl) 배지에 접종한 후, 37℃에서 배양하여 사용하였다. 효모 숙주 세포와 재조합 효모는 YPD(1% 박토-효모추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스) 배지에서, 37℃의 온도 하에 2틀 동안 배양하여 사용하였다. 최소배지는 0.17 % 효모 질소 염기, 0.5 % 황산암모늄, 2 % 글루코스 또는 글리세롤, 38.4 mg/l 아르기닌, 57.6 mg/l이소로이신, 48 mg/l 페닐알라닌, 57.6 % mg/l 발린, 6mg/l 트레오닌, 50 mg/l 이노시톨, 40 mg/l 트립토판, 15 mg/l 티롭신, 60 mg/l 로이신, 4 mg/l 히스티딘을 포함한다.
[실시예 1] K. marxianus　균주의 발효 특성 분석
K. marxianus　균주 KM3(KTCT 17555), KM8(KTCT4155), 및 KM11(KTCT17724)를 LB에서 하룻밤 전배양하고, 추가로 10% 자일로스를 포함하는 동일 배지에 OD600 초기값이 1이 되도록 접종하였다.
20ml 시험관에서 약 10ml의 배양물을 회전식 진탕기에 수평선상에서 약 30° 각도로 기울여 위치시키고 3일 동안 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 발효액내에 함유된 자일로스, 자일리톨, 글리세롤, 에탄올의 함량을 HPLC로 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00001

상기 표 1을 참고하면, K. marxianus　균주는 자일로스의 대사 중간 산물인 자일리톨이 축적되어 에탄올이 생성되지 않음을 알 수 있다.
[실시예 2] 발현 벡터의 제작
A. pYip5XR 의 제작
S. cerevisiae의 PGK1 프로모터와 터미네이터, P. stipitis의 XYL1 유전자를 YepM4-XR(Microbiology, Microbiology (2007), 153, 3044-3054)을 주형으로 하여 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-CTAGCTAGCAAAGATGCCGATTTGGGCGCGAATC-3'
역방향 프라이머 5'-ACATGCATGCGTCGACCAGCTTTAACGAACGCAGA -3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 NheI과 SphI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 Yip5(ATCC37061)에 도입하는 것에 의해 pYip5XR을 제작하였다.
B. pYip5XRXDH 의 제작
S. cerevisiae의 PGK1 프로모터와 터미네이터, P. stipitis의 XYL2 유전자를 pPGK-XDH(Microbiology, Microbiology (2007), 153, 3044-3054) 을 주형으로 하여 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'- CCCAAGCTTAAAGATGCCGATTTGGGCGCGAATC-3'
역방향 프라이머 5'-CTAGCTAGCGTCGACCAGCTTTAACGAACGCAGA-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 HindIII와 NheI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pYip5XR에 도입하는 것에 의해 pYip5XRXDH을 제작하였다.
C. pAUR101 _ XRXDH 의 제작
S. cereivisiae의 PGK1 프로모터와 터미네이터, P. stipitis의 XYL1, XYL2 유전자를 pYip5XRXDH를 주형으로 하여 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-TCCCCCCGGGGACAGCTTATCATCGATAAGCTT-3'
역방향 프라이머 5'-CGCAAGGAATGGTGCATGC-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 XmaI과 SphI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pAUR101에 도입하는 것에 의해 pAUR101_XRXDH를 제작하였다.
D. pPGKXK 의 제작
S, cerevisiae의 XKS1 유전자를 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-CGGAATTCATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGA-3'
역방향 프라이머 3'-GCGGATCCTTAGATGAGAGTCTTTTCCA-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 EcoRI과 BamHI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pPGKXDH(Journal of biotechnology, Vol 130., 316-319, 2007)에 도입하는 것에 의해 pPGKXK를 제작하였다.
E. pAUR101 _ XRXDHXK 의 제작
S. cerevisiae의 PGK1 프로모터와 터미네이터, S. cerevisiae의 XKS1 유전자를 pPGKXK를 주형으로 하여 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-GACAGGCGCCAAAGATGCCGATTTGGGCGCGAAT-3'
역방향 프라이머 5'-TCCCCCCGGGGTCGACCAGCTTTAACGAACGCAG-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 NarI과 XmaI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pAUR101_XRXDH에 도입하는 것에 의해 pAUR101_XRXDHXK를 제작하였다.
F. pKM316 _ XRXDHXK 의 제작
S. cereivisiae의 PGK1 프로모터와 터미네이터, P. stipitis의 XYL1, XYL2 S. cerevisiae의 XKS1 유전자를 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-GGACTAGTAGCATCTTAGTGAAAAGGGTGG-3'
역방향 프라이머 5'-CCGCTCGAGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCA-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 SpeI과 XhoI을 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pKM316에 도입하는 것에 의해 pKM316_XRXDHXK를 제작하였다.
G. pKM316 _ XRXDHXK _ URA3 의 제작
S. cereivisiae의 URA3유전자를 55℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:
정방향 프라이머 5'-TCCCCGCGGTACCACAGCTTTTCAATTCAATTCA-3'
역방향 프라이머 5'-TCCCCGCGGTAGGGTAATAACTGATATAATTAAA-3'
그 다음, 상기 유전자를 제한효소 SacII를 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pKM316_XRXDHXK에 도입하는 것에 의해 pKM316_XRXDHXK_URA3를 제작하였다. 이를 도 2에 나타내었다.
[실시예 3] 변형 K. marxianus 제작
상기 실시예 2에서 제작된 발현 벡터를 K. marxianus 균주에 도입하였다. 발현 벡터 pKM316_XRXDHXK_URA3을 전기천공 방법으로 KM3, KM8, 및 KM11에 각각 형질전환하고, 실시예 1에서와 같은 방법을 이용하여 에탄올 생산량을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
상기 발현 벡터 pKM316_XRXDHXK_URA3가 도입된 KM3, KM8 및 KM11를 각각 기탁번호 KCTC11952BP, KCTC11951BP 및 KCTC11953BP 하에 기탁하였다.
[표 2]
Figure pat00002

표 2로 참고하면, XR-XDH-XK를 갖는 K. marxianus 균주들은 모두 전구체 균주에 비해, 자일로오스 이용능력이 향상되었으며, 자일로스 g당 자일리톨 g 생산량이 감소하였다는 것을 알 수 있다.
또한, XR-XDH-XK를 갖는 K. marxianus 균주들의 에탄올 생산량은 전구체 균주에 비해, 137% 이상, 275% 이상, 또는 166% 이상 증가하였다는 것을 알 수 있다.
따라서, 상기 실시예에 따라 제조된 XR-XDH-XK를 갖는 K. marxianus 균주들은 자일로스 대사 과정에서 자일리톨을 축적하지 않아서 에탄올의 생산성이 향상되므로, 산업적으로 이용할 수 있을 것이다.
이상 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11951BP 20110610 한국생명공학연구원 KCTC11952BP 20110610 한국생명공학연구원 KCTC11953BP 20110610
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> MODIFIED MICROORGANISM HAVING ENHANCED XYLOSE UTILIZATION <130> 2011-PP-146 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 957 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 atgccttcta ttaagttgaa ctctggttac gacatgccag ccgtcggttt cggctgttgg 60 aaagtcgacg tcgacacctg ttctgaacag atctaccgtg ctatcaagac cggttacaga 120 ttgttcgacg gtgccgaaga ttacgccaac gaaaagttag ttggtgccgg tgtcaagaag 180 gccattgacg aaggtatcgt caagcgtgaa gacttgttcc ttacctccaa gttgtggaac 240 aactaccacc acccagacaa cgtcgaaaag gccttgaaca gaaccctttc tgacttgcaa 300 gttgactacg ttgacttgtt cttgatccac ttcccagtca ccttcaagtt cgttccatta 360 gaagaaaagt acccaccagg attctactgt ggtaagggtg acaacttcga ctacgaagat 420 gttccaattt tagagacctg gaaggctctt gaaaagttgg tcaaggccgg taagatcaga 480 tctatcggtg tttctaactt cccaggtgct ttgctcttgg acttgttgag aggtgctacc 540 atcaagccat ctgtcttgca agttgaacac cacccatact tgcaacaacc aagattgatc 600 gaattcgctc aatcccgtgg tattgctgtc accgcttact cttcgttcgg tcctcaatct 660 ttcgttgaat tgaaccaagg tagagctttg aacacttctc cattgttcga gaacgaaact 720 atcaaggcta tcgctgctaa gcacggtaag tctccagctc aagtcttgtt gagatggtct 780 tcccaaagag gcattgccat cattccaaag tccaacactg tcccaagatt gttggaaaac 840 aaggacgtca acagcttcga cttggacgaa caagatttcg ctgacattgc caagttggac 900 atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaga ttcctatctt cgtctaa 957 <210> 2 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atgactgcta acccttcctt ggtgttgaac aagatcgacg acatttcgtt cgaaacttac 60 gatgccccag aaatctctga acctaccgat gtcctcgtcc aggtcaagaa aaccggtatc 120 tgtggttccg acatccactt ctacgcccat ggtagaatcg gtaacttcgt tttgaccaag 180 ccaatggtct tgggtcacga atccgccggt actgttgtcc aggttggtaa gggtgtcacc 240 tctcttaagg ttggtgacaa cgtcgctatc gaaccaggta ttccatccag attctccgac 300 gaatacaaga gcggtcacta caacttgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcctaac 360 tccaaggaag gcgaaccaaa cccaccaggt accttatgta agtacttcaa gtcgccagaa 420 gacttcttgg tcaagttgcc agaccacgtc agcttggaac tcggtgctct tgttgagcca 480 ttgtctgttg gtgtccacgc ctctaagttg ggttccgttg ctttcggcga ctacgttgcc 540 gtctttggtg ctggtcctgt tggtcttttg gctgctgctg tcgccaagac cttcggtgct 600 aagggtgtca tcgtcgttga cattttcgac aacaagttga agatggccaa ggacattggt 660 gctgctactc acaccttcaa ctccaagacc ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720 ggtggtaacg tgccaaacgt cgttttggaa tgtactggtg ctgaaccttg tatcaagttg 780 ggtgttgacg ccattgcccc aggtggtcgt ttcgttcaag tcggtaacgc tgctggtcca 840 gtcagcttcc caatcaccgt tttcgccatg aaggaattga ctttgttcgg ttctttcaga 900 tacggattca acgactacaa gactgctgtt ggaatctttg acactaacta ccaaaacggt 960 agagaaaatg ctccaattga ctttgaacaa ttgatcaccc acagatacaa gttcaaggac 1020 gctattgaag cctacgactt ggtcagagcc ggtaagggtg ctgtcaagtg tctcattgac 1080 ggccctgagt aa 1092 <210> 3 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60 tcatactatc ttgggtttga tctttcgacc caacaactga aatgtctcgc cattaaccag 120 gacctaaaaa ttgtccattc agaaacagtg gaatttgaaa aggatcttcc gcattatcac 180 acaaagaagg gtgtctatat acacggcgac actatcgaat gtcccgtagc catgtggtta 240 gaggctctag atctggttct ctcgaaatat cgcgaggcta aatttccatt gaacaaagtt 300 atggccgtct cagggtcctg ccagcagcac gggtctgtct actggtcctc ccaagccgaa 360 tctctgttag agcaattgaa taagaaaccg gaaaaagatt tattgcacta cgtgagctct 420 gtagcatttg caaggcaaac cgcccccaat tggcaagacc acagtactgc aaagcaatgt 480 caagagtttg aagagtgcat aggtgggcct gaaaaaatgg ctcaattaac agggtccaga 540 gcccatttta gatttactgg tcctcaaatt ctgaaaattg cacaattaga accagaagct 600 tacgaaaaaa caaagaccat ttctttagtg tctaattttt tgacttctat cttagtgggc 660 catcttgttg aattagagga ggcagatgcc tgtggtatga acctttatga tatacgtgaa 720 agaaaattca gtgatgagct actacatcta attgatagtt cttctaagga taaaactatc 780 agacaaaaat taatgagagc acccatgaaa aatttgatag cgggtaccat ctgtaaatat 840 tttattgaga agtacggttt caatacaaac tgcaaggtct ctcccatgac tggggataat 900 ttagccacta tatgttcttt acccctgcgg aagaatgacg ttctcgtttc cctaggaaca 960 agtactacag ttcttctggt caccgataag tatcacccct ctccgaacta tcatcttttc 1020 attcatccaa ctctgccaaa ccattatatg ggtatgattt gttattgtaa tggttctttg 1080 gcaagggaga ggataagaga cgagttaaac aaagaacggg aaaataatta tgagaagact 1140 aacgattgga ctctttttaa tcaagctgtg ctagatgact cagaaagtag tgaaaatgaa 1200 ttaggtgtat attttcctct gggggagatc gttcctagcg taaaagccat aaacaaaagg 1260 gttatcttca atccaaaaac gggtatgatt gaaagagagg tggccaagtt caaagacaag 1320 aggcacgatg ccaaaaatat tgtagaatca caggctttaa gttgcagggt aagaatatct 1380 cccctgcttt cggattcaaa cgcaagctca caacagagac tgaacgaaga tacaatcgtg 1440 aagtttgatt acgatgaatc tccgctgcgg gactacctaa ataaaaggcc agaaaggact 1500 ttttttgtag gtggggcttc taaaaacgat gctattgtga agaagtttgc tcaagtcatt 1560 ggtgctacaa agggtaattt taggctagaa acaccaaact catgtgccct tggtggttgt 1620 tataaggcca tgtggtcatt gttatatgac tctaataaaa ttgcagttcc ttttgataaa 1680 tttctgaatg acaattttcc atggcatgta atggaaagca tatccgatgt ggataatgaa 1740 aattgggatc gctataattc caagattgtc cccttaagcg aactggaaaa gactctcatc 1800 taa 1803

Claims (20)

  1. 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 포함하고, 자일로스를 이용하여 화학 물질을 생산하는, 변형 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성은 자일로스 리덕타제 활성이고,
    상기 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성은 자일리톨 데히드로게나제 활성이고, 그리고
    자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성은 자일룰로키나제 활성인 것인, 변형 미생물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 자일로스 리덕타제 활성, 자일리톨 데히드로게나제 활성, 및 자일룰로키나제 활성은 상기 미생물에 외래성인 것인, 변형 미생물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 자일로스 리덕타제 활성 및 상기 자일리톨 데히드로게나제 활성은 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터 유래한 것이고, 상기 자일룰로키나제 활성은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래한 것인, 변형 미생물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 변형 미생물은 에스케리치아 콜리(Escherichia coli, 대장균) 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)인 것인, 변형 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화학 물질은 알코올, 유기산, 아미노산 또는 비타민인 것인, 변형 미생물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것인, 변형 미생물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 변형 미생물은 전구체 미생물 보다 높은 수준으로 화학 물질을 생산하는 것인, 변형 미생물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 변형 미생물은 기탁번호 KCTC11951BP, KCTC11952BP 및 KCTC11953BP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 변형 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 변형 미생물을 제작하기 위한,
    복제 개시점;
    프로모터;
    자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자, 및 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자; 및
    터미네이터를 포함하는, 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서,
    자일로스를 자일리톨로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자는 서열번호 1 또는 상기 서열과 70& 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고,
    자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자는 서열번호 2 또는 상기 서열과 70& 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고
    자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 코드화하는 유전자는 서열번호 3 또는 상기 서열과 70& 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 복제 개시점은 ARS/CEN인 것인, 발현 벡터.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 프로모터는 PGK1 프로모터인 것인, 발현 벡터.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 터미네이터는 PGK1 터미네이터인 것인, 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 변형 미생물을 자일로스 함유 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 배양 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 화학 물질의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 자일로스는 셀룰로오스계 바이오매스로부터 유래한 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 화학 물질은 알코올, 유기산, 아미노산 또는 비타민인 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것인, 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 변형 미생물은 전구체 미생물 보다 높은 수준으로 화학 물질을 생산하는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 변형 미생물은 전구체 미생물 보다 화학 물질 생산성이 130% 이상 증가한 것인, 방법.
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