CN102292429B

CN102292429B - 具有在厌氧培养条件下在戊糖糖类上生长的能力的酵母菌株

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Publication number: CN102292429B
Application number: CN2009801551028A
Authority: CN
Inventors: 巴贝尔·哈恩-哈格达尔; 奥斯卡·本特松; 马里齐奥·贝蒂伽; 罗莎·加西亚·桑切斯; 大卫·伦德奎斯特; 玛丽-弗朗索瓦兹·戈瓦-格劳斯伦德
Original assignee: C5 Ligno Technologies Lund AB
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2008-11-24
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2029-11-20
Also published as: EP2358863A1; US20110294180A1; CN102292429A; AU2009318173A1; US8367393B2; ZA201104650B; WO2010059095A1; EP2358863A4; AU2009318173B2; CA2744426A1; RU2011121787A; CA2744426C; BRPI0916147A8; BRPI0916147A2; US20130196399A1

Abstract

本发明涉及在诸如木糖的戊糖碳源的厌氧发酵过程中显示增强的生存力和生长并产生诸如乙醇的发酵产物的改良的酵母菌株。

Description

具有在厌氧培养条件下在戊糖糖类上生长的能力的酵母菌株

发明领域

本发明涉及在诸如木糖的戊糖碳源的厌氧发酵过程中显示增强的生存力和生长并产生诸如乙醇的发酵产物的改良的酵母(Saccharomyces)菌株。

发明背景

通过面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)从可再生原料中产生生物乙醇已成为化石燃料的有吸引力的替代。然而，预计基于淀粉或蔗糖的原料诸如玉米粒或甘蔗的可利用性不足以满足未来世界范围对生物乙醇的需求(Gray等人，2006.Bioethanol(生物乙醇).Current OpinionChemical Biology.10(2)：141-146)。预期的解决方案是对木质纤维素原料的利用，诸如玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、木材等(

等人，2006.Bioethanol-the fuel of tomorrow from the residues of today(生物乙醇——来自今天的废料的明天的燃料).Trends Biotechnol.24(12)：549-556)。这需要克服与利用这些复杂的原料相关的新挑战。

木质纤维素原料的基本成分由戊糖、木糖和阿拉伯糖组成，它们需要被有效转化以使生物乙醇加工具有成本效益。酵母属不能原样地发酵这些戊糖而需要被改良以能够如此。然而，已尝试改良酵母菌株以用有效的方式来生产乙醇和其它发酵产物诸如丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯。已获得了可在木糖上需氧生长并使木糖发酵成乙醇的酿酒酵母，其中所述菌株具有来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖通路的基因或异源木糖异构酶(XI)基因且过表达内源性木酮糖激酶基因(

B，Karhumaa K，Fonseca C，Spencer-Martins I，Gorwa-Grauslund MF(2007))。这样的菌株不在作为单一碳源的木糖上厌氧生长。然而，厌氧生长对于工业发酵过程是关键性状，因为其使酵母具有生存力并且该生存力与酵母有效发酵的能力直接相关。通过随机进化工程策略在单倍体实验室菌株中实现了酿酒酵母的重组菌株的厌氧性木糖生长(Sonderegger M，Sauer U(2003)Evolutionaryengineering of Saccharomyces cerevisiae for anaerobic growth on xylose(用于在木糖上厌氧生长的酿酒酵母的进化工程).Appl Environ Microbiol 69：1990-8；Kuyper等人(2004)Minimal metabolic engineering of Saccharomycescerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：a proof of principle(用于有效厌氧性木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程：原理的证明).FEMSYeast Res 4：655-64)。通过随机策略获得的性状不易于被鉴定，且因此这种性状难以转移到其它菌株。并且实验室菌株不会使毒性的木质纤维素水解产物发酵(Karhumaa K，Garcia Sanchez R，Hahn-

B，Gorwa-Grauslund MF(2007)Comparison of the xylose reductase-xylitoldehydrogenase and the xylose isomerase pathways for xylose fermentation byrecombinant Saccharomyces cerevisiae(重组酿酒酵母木糖发酵的木糖还原酶-木糖醇脱氢酶通路和木糖异构酶通路的对比).Microb Cell Fact 6：5)。

并且，当应用于多倍体和非整倍体工业菌株时，随机策略常导致有限的改良。因此仍需要设计清楚界定的合理的代谢工程策略/技术，其传递为酵母属菌株提供厌氧生长和使戊糖糖类厌氧发酵的能力的性状，且该性状可被传递给任何其它多倍体和非整倍体酵母属菌株。

发明概述

本发明涉及方法和通过合理的代谢工程技术所获得的具有改良的生存力的新型酵母属菌株，该新型酵母属菌株在厌氧条件下在作为唯一碳源的戊糖糖类上生长并产生乙醇和其它发酵产物诸如丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯，和细胞物质(cellmass)。新颖菌株通过合理的代谢工程而获得且缺少自多拷贝质粒表达的基因的事实使得将所述性状特异性地传递给任何工业多倍体和非整倍体菌株成为可能

本发明涉及酵母属菌株，其是有生存力的且能够在厌氧发酵下在戊糖糖类上生长，并且其包含：基因组中具有NADH-偏好性的木糖还原酶(XR)基因，其中所述基因通过组成型启动子表达，和木糖醇脱氢酶(XDH)的提高表达。

通过使用组成型启动子或其部分比如其截短形式，比如TDH3、HXT7、TEF1和PGK1基因的启动子或其部分用于XR表达，和通过定点突变改变树干毕赤酵母XR辅酶偏好性，即，朝向NADH偏好性，首次使在厌氧条件下利用戊糖糖类诸如木糖作为唯一碳源获得细胞生长和乙醇发酵二者成为可能。

通过本发明，使酵母在通过XR的木糖至木糖醇转化中朝向NADH偏好性，以及通过XR进行的较高的组成型通量，其导致了在含有戊糖糖类作为唯一碳源的培养基中在不含空气和氧气下的生长，较高产量的乙醇和其它发酵产物诸如丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯和较少的副产物形成。

在第二方面，本发明涉及产生乙醇/细胞物质和其它发酵产物的方法，其包括以下步骤：提供含有木糖的培养基和以上所定义的酵母属菌株，向发酵反应器中添加所述培养基和菌株，在厌氧条件下使用所述菌株进行发酵，和利用碳源木糖并产生乙醇和其它发酵产物诸如丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯。

在第三方面，本发明涉及所发明的菌株和本文所公开的方法的用途。

附图简述

图1.在含50gl^-1木糖的YNB培养基中具有调控XR表达的ADH1启动子的酿酒酵母菌株TMB3321(◆)和具有调控XR表达的TDH3启动子的菌株TMB3325(■)的需氧生长。TMB3321的生长以不同的比例显示于子图中。

图2.在含20gl^-1葡萄糖或50gl^-1木糖的YNB培养基中菌株TMB3095的细胞生长和底物消耗。β-半乳糖苷酶活性测量的样品点由箭头指出。○：葡萄糖(gl^-1)；●：木糖(gl^-1)；□：OD620，葡萄糖培养；■：OD620，木糖培养。

图3.利用菌株Y-PsNative(A)；Y-PsK270M(B)；和Y-PsK270R(C)进行的20gl^-1葡萄糖和50gl^-1木糖的厌氧分批发酵的时程。图例：■木糖，□葡萄糖，▲乙醇，△木糖醇，●甘油，○乙酸酯。

图4.菌株Y-PsNative(■)；Y-PsK270M(□)；和Y-PsK270R(▲)在含有20gl^-1葡萄糖和50gl^-1木糖的厌氧分批培养中的生长。虚线指出了葡萄糖耗尽的时间。

图5.菌株TMB3415的两相需氧/厌氧发酵过程中的生物质产生的代表性图。

图6A.菌株A)对照-PPP-XYL，B)PGM2-PPP-XYL在具有20g/l木糖的确定成分培养基上进行的厌氧分批发酵的糖消耗和产物形成。图例：(□)木糖，(▲)乙醇，(○)生物质(DW)，(+)乙酸酯，(x)甘油，(-)木糖醇。

图6B.菌株(△)对照-PPP-XYL(Control-PPP-XYL)和(■)PGM2-PPP-XYL在具有20g/l木糖的确定成分培养基上进行的分批发酵的厌氧生长。

图7.具有过表达的PGM2和XYL1(K270R)的菌株的构建。

图8.在含20gl^-1葡萄糖的YNB培养基上预生长的细胞在含50gl^-1木糖的YNB培养基上的需氧生长。所用的菌株：对照-PPP-XYL(TMB3137)(□)，PGM2-PPP-XYL(TMB 3138)(■)，对照-PPP-XYL1(K270R)(TMB 3144)(△)和PGM2-PPP-XYL1(K270R)(TMB 3143)(▲)。

图9.在50gl^-1木糖和含20gl^-1葡萄糖的培养基上的预培养物上的需氧生长。所用的菌株：对照-PPP-XYL1(K270R)(TMB 3144)(△)和PGM2-PPP-XYL1(K270R)(TMB 3143)(▲)。

图10.具有PGM2过表达的木糖工业菌株的构建。

图11.在作为唯一碳源的木糖上的厌氧生长，XYL1基因分离自随机生成的序列文库。

发明详述

定义

在本申请和发明的文中使用了以下的定义：

术语“其类似物”意在表示多肽的部分或完整的多肽是基于非蛋白氨基酸残基，比如氨基异丁酸(Aib)、正缬氨酸γ氨基丁酸(Abu)或鸟氨酸。其它非蛋白氨基酸残基的实例可在http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.htm上查找。

在本文中，按照蛋白数据库(Protein DataBank，PNB)(www.pdb.org)所定义的来使用氨基酸名称和原子名称，其基于IUPAC命名法(IUPACNomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(residue names，atom names etc.)(氨基酸和肽的IUPAC命名法和符号表示(残基名称，原子名称等))，Eur J Biochem.，138，9-37(1984)及其在Eur J Biochem.，152，1(1985)中的修订。术语“氨基酸”意指来自由丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(GIu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(GIy或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)或其衍生物组成的组的氨基酸。

用于确定氨基酸位置的术语按如下来描述：K270表示由SEQ ID NO：1所示的序列编码的氨基酸序列中第270位被赖氨酸残基所占据。K270R表示第270位的赖氨酸残基已被精氨酸残基所置换。

术语“过表达(overexpression/overexpressing)”包括基因可能被上调或过表达。这包括内源性基因可能被上调和在启动子控制下的基因的新拷贝可能被整合到菌株中，任选地整合到基因组中，其中所述启动子任选地可以是组成型启动子。

术语“合理的代谢工程”意在表示导致诸如核苷酸序列的较高或较低的表达、缺失、定点变化而使其生物活性改变的基因靶向操作。因此，与随机菌株开发方法诸如诱变、进化工程和杂交育种相反，合理的代谢工程是可转移的且可在包括工业多倍体分离株和非整倍体分离株的任何选择菌株中进行重复。因此合理的代谢工程意在表示菌株工程方法，其中所得的菌株仅经过在基因特征方面的结果可由推理得知的修饰。此外，期望合理的工程菌株仅获得以下基因特征：已知其序列、以已知序列的质粒和/或DNA片段形式有意插入、但不必知晓该特定序列存在于新型菌株的次数。

发明

本发明涉及方法和由合理的代谢工程技术所获得的具有改良的生存力的新型酵母属菌株，其中该菌株在厌氧条件下在作为唯一碳源的戊糖糖类上生长并产生乙醇和其它发酵产物。

本发明涉及酵母属菌株，其是有生存力的且在厌氧发酵下在戊糖糖类上生长，并且其包含：基因组中具有NADH-偏好性的木糖还原酶基因，其中所述基因通过组成型启动子表达，和木糖醇脱氢酶的提高表达。一个实例是所述木糖还原酶基因来源于树干毕赤酵母并具有置换K270R(XRK270R)。另一个实例是所述木糖还原酶来源于树干毕赤酵母并具有组合的(XRN272DP275Q)或独立的(XRN272D；XRP275Q)置换N272D和P275D。

通过这样的新型菌株的开发，首次使在厌氧条件下仅利用戊糖诸如木糖作为糖能够生长、并仍产生高产量的乙醇的可生存的菌株成为可能，且因此能够在用于从戊糖和己糖碳源产生诸如生物乙醇的发酵中为商业目的使用该菌株。

在另一个实施方案中该菌株还可具有诸如通过用诸如以上所述的组成型启动子表达PGM2基因而获得的增高水平的葡糖磷酸变位酶，且因此能够以较高生产力产生乙醇。

作为替代可在本申请中使用所提及的基因中的任何一种基因的功能上等价的衍生物。术语功能上等价的衍生物包括对通过NADH氧化的方式将戊糖转化成对应的糖醇具有催化活性的蛋白或对葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖-6-磷酸具有催化活性的蛋白。

所发明的菌株将允许包括乙醇的发酵产物和细胞物质在厌氧条件下在木糖上的产生。厌氧生长提高了细胞生存力并允许细胞再循环，因此节省了用于乙醇和发酵产物生产的碳。其增加了乙醇和发酵产物的产生并提高了总体过程经济效果。

所发明的菌株还可过表达非氧化戊糖磷酸通路(PPP)中涉及的基因，过表达基因转醛醇酶(TAL1)、转酮酶(TKL1)、核糖5-磷酸酮醇异构酶(RKI1)和核酮糖5-磷酸差向异构酶(RPE1)。通过将具有NADH偏好性的XR的基因组整合过表达(XRK270R或XRN272DP275Q或XRN272D或XRP275Q)和/或组成型启动子下的PGM2与非氧化型PPP组合，与单独使用不同的修饰相比将提高木糖利用。

根据以上描述的酵母属菌株还可过表达其它基因，比如基因木酮糖激酶(XK)。这将进一步提高乙醇和其它发酵产物诸如乙醇、丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯的产生。

待导入/转化入酵母属菌株的感兴趣的基因可通过组成型启动子来表达，其将导致木糖被持续利用且包括乙醇产生的发酵产物形成的速率是高的。启动子的实例是基于以下酶/蛋白的启动子的序列：甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶3(TDH3或YGR192C)；主要易化超家族的高亲和性葡萄糖转运体(HXT7或YDR342C)的截短形式；3-磷酸甘油酸激酶(PGK1或YCR012W)；和翻译延伸因子EF-1α(TEF1或YPR080W)。一个实例是TDH3启动子被用来表达XRK270R基因，而截短的HXT7启动子被用来表达PGM2基因，其中所有基因被稳定整合到酵母属菌株的基因组中，因此能够使改良的性状直接转移到工业多倍体菌株和非整倍体菌株中。启动子可以是完整启动子以及其部分。表示TDH3与XRK270R基因相连接的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1中和表示HXT7与PGM2基因相连接的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：2中。

本发明的菌株可选自由酿酒酵母、贝酵母(Saccharomyces bayanus)和卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)组成的组。例如菌株可以是实施例中所用的酿酒酵母。除所发现的适宜于从木糖进行乙醇生产的任何多倍体和非整倍体工业酵母分离株以外，菌株的其它实例是酿酒酵母菌株DBY746、AH22、S150-2B、GPY55-15Bα、CEN.PK、TMB3500、VTT-A-63015、VTT-A-85068、VTT-c-79093和其衍生物以及酵母属Saccharomyces sp.1400、424A(LNH-ST)、259A(LNH-ST)。

所发明的菌株与野生型原始菌株相比具有改良的特性，即，较快地消耗较高量的木糖并较快地产生较高量的诸如乙醇的发酵产物。测定改良的特性的实例显示于以下的实施例中。

本发明还涉及产生细胞物质和发酵产物诸如乙醇、丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸和3-羟基丁内酯的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有木糖的培养基和以上所定义的酵母属菌株，向发酵反应器中添加所述培养基和菌株，和在厌氧条件下使用所述菌株进行发酵，和利用碳源木糖并产生乙醇。可在无空气、氧气和/或氮气添加下进行发酵，利用发酵过程中产生的二氧化碳形成厌氧环境。该方法可以是分批给料-分批、连续、或是利用细胞再循环的连续发酵的发酵方法。方法可使用作为唯一碳源的木糖或诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的碳源的混合物。不同的碳源的量取决于所用的原料，软木通常含较高量的己糖糖类：葡萄糖、甘露糖和半乳糖，而硬木和农作物含较高量的戊糖糖类：木糖和阿拉伯糖。发酵可在约30-45℃的范围中的温度，比如31、32、33、34、35、36、37、38、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃，44℃或45℃下，和诸如6-3的酸性pH下进行。使用所述所发明的酵母属菌株的所发明的方法中的乙醇产量将是自0.35g/g碳源，产量的实例为0.35、0.40、0.45、高至0.5g/g糖。乙醇产生的速率可以是至少0.1g/g生物质/h增高至0.6g/g生物质/h。木糖消耗速率可以是至少0.28g/g生物质/h增高至1g/g生物质/h。

最后本发明涉及酵母属菌株用于乙醇和如上所定义的其它发酵产物的产生的用途。

以下的实施例意在例证，而非以任何方式、形态或形式上明示或默示地限制本发明。

实施例

实施例1

对共消耗木糖和阿拉伯糖的酿酒酵母TMB3061(Karhumaa，Wiedemann等人.2006)进行进化工程方法以提高戊糖糖类的摄取。在所得的菌株TMB3130中，观察到了发酵产物分布和显著地XR-驱动的阿拉伯糖醇产生受到接种物制备(所用碳源的很大影响Garcia Sanchez R.，Karhumaa等人，已提交)。

消耗木糖和阿拉伯糖的酿酒酵母菌株TMB 3130衍生自菌株TMB3400，TMB 3130使用ADH1启动子控制编码XR的树干毕赤酵母XYL1基因的表达。(Wahlbom，van Zyl等人.2003；Garcia Sanchez R.，Karhumaa等人.已提交)。ADH1启动子已是酿酒酵母中驱动异源基因表达的常见选择(Ammerer 1983；Mumberg，Muller等人.1995)。并且，研究了副产物分布的变化是否由XR活性中的差异所导致。

从含20g/l葡萄糖、20g/l木糖、20g/l阿拉伯糖或20g/l木糖和20g/l阿拉伯糖的混合物的确定成分的培养基中生长的TMB 3130细胞中制备粗提取物，并测量XR和XDH活性。在实践中，用在含葡萄糖的YNB培养基上过夜生长的细胞接种含不同碳源的摇瓶培养：20g/L木糖、20g/L阿拉伯糖、20g/L葡萄糖，或20g/L木糖和20g/L阿拉伯糖的混合物。接着，在指数期收获细胞并用水洗涤两次。使用Y-PER试剂(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)来提取蛋白。利用考马斯加(Coomassie Plus)蛋白分析试剂(Pierce，Rockford，IL，USA)利用牛血清清蛋白作为标准测定蛋白浓度。如先前所描述地测量XR活性(Smiley和Bolen 1982；Eliasson，Christensson等人.2000)。如先前所报道的(Rizzi M 1989)改变XDH活性但利用pH 7的三乙醇胺缓冲液(Wahlbom，van Zyl等人.2003)。利用所提取的蛋白的不同稀释物以三份生物重复、两次重复测量进行实验。所有分析利用Ultrospec 2100pro分光光度计(Ultrospec 2100prospectrophotometer，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)来进行。

在葡萄糖上生长的细胞表现出0.72±0.06U(mg蛋白)^-1的比XR活性，而在木糖和阿拉伯糖上生长的细胞表现出显著较低的活性，分别为0.05±0.01U(mg蛋白)^-1和0.13±0.02U(mg蛋白)^-1，或在阿拉伯糖和木糖的混合物上生长的细胞为0.07±0.04U(mg蛋白)^-1(表1)。

对于菌株TMB 3130所示出的结果表明ADH1启动子并没有被戊糖糖类所高度激活。相比之下，对于全部三种糖培养基或在含木糖和阿拉伯糖的混合物的培养基中，该菌株中由PGK1启动子所控制的木糖醇脱氢酶(XDH)活性更为相似(表1)。基于这些结果，我们推断当对酿酒酵母进行戊糖发酵的工程改造时ADH1启动子不是最适合的，而PGK1启动子是适宜的启动子。当酿酒酵母在戊糖糖类上生长时ADH1启动子没有被强烈激活。

表1.来自在含有不同碳源(每种20g/L)的确定成分的培养基中生长的菌株TMB3130的粗蛋白提取物的XR和XDH活性U/mg蛋白。

Ammerer，G.(1983).“Expression of Genes in Yeast Using the AdciPromoter.”(利用Adci启动子在酵母中表达基因)Methods in Enzymology101：192-201.

Eliasson，A.，C.Christensson，等人.(2000).“Anaerobic xylosefermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1，XYL2，and XKS1 in mineral medium chemostat cultures.”(矿物培养基恒化培养中携带XYL1、XYL2和XKS1的重组酿酒酵母的厌氧木糖发酵)Appl EnvironMicrobiol 66(8)：3381-6.

Garcia Sanchez R.，K.Karhumaa，等人.(已提交).“Evolutionaryengineering of a D-xylose and L-arabinose co-utilizing industrial andrecombinant Saccharomyces cerevisiae strain.”(共使用D-木糖和L-阿拉伯糖的工业重组酿酒酵母菌株的进化工程)

Karhumaa，K.，B.Wiedemann，等人.(2006).“Co-utilization ofL-arabinose and D-xylose by laboratory and industrial Saccharomycescerevisiae strains.”(实验室酿酒酵母菌株和工业酿酒酵母菌株对L-阿拉伯糖和D-木糖的共利用)Microb Cell Fact 5：18.

Mumberg，D.，R.Muller，等人.(1995).“Yeast vectors for the controlledexpression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.”(用于不同遗传背景中异源蛋白的受控表达的酵母载体)Gene 156(1)：119-22.

Rizzi M，H.K.，Erlemann P，Bui-Thahn NA，Dellweg H(1989).“Purification and properties of the NAD±-xylitol-dehydrogenase from theyeast Pichia stipitis.”(来自酵母树干毕赤酵母的NAD+-木糖醇-脱氢酶的纯化和特性)J Ferment Bioeng 67：20-24.

Smiley，K.L.和P.L.Bolen(1982).“Demonstration of D-xylose reductaseand D-xylitol dehydrogenase in Pachysolen tannophilus.”(嗜鞣管囊酵母中D-木糖还原酶和D-木糖醇脱氢酶的证实)Biotech Lett 4：607-610.

Wahlbom，C.F.，W.H.van Zyl，等人.(2003).“Generation of the improvedrecombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae TMB 3400by randommutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis CBS 6054.”(通过随机诱变生成改良的重组的利用木糖的酿酒酵母TMB 3400及其与树干毕赤酵母CBS 6054在生理学上的比较)FEMS Yeast Res3(3)：319-26.

实施例2

构建了在ADH1和TDH3启动子下表达XR的酿酒酵母菌株，且评估了菌株在木糖上的生长。

菌株构建

构建中所用的质粒和菌株总结于表2中。将含ADH1p-XYL1-ADH1tPGK1p-XYL2-PGK1t的DNA盒插入到YIplac211(Gietz和Sugino，1988)中，构建了YIpOB2。通过利用XbaI进行消化从YIpOB2中移除XYL1基因，且进行自身连接以构建YIpOB3。引物序列中的限制性核酸内切酶识别位点由标下划线或斜体字母指出。利用含有限制性位点HinaIII、AscI(5’-GCATAAGCTT

AGTTTATCATTATCAATACTCGCCATTTC-3’)和XbaI(5’-GCATTCTAGAATCCGTCGAAACTAAGTTC-3’)的引物从载体p426GPD中扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶3(TDH3)启动子。通过利用限制性位点HindIII和XbaI用TDH3启动子PCR产物替代质粒YIpOB3中的乙醇脱氢酶同工酶1(ADH1)启动子而构建YIpOB7。将树干毕赤酵母XYL1基因片段从质粒YIpOB2中切除并利用XbaI限制性位点将其插入到YIpOB7中而构建YIpOB8。利用限制性分析和PCR对所构建的质粒进行分析以确认正确的插入。对所插入的部分进行测序以验证没有导入突变。利用限制性酶ApaI在URA3基因中切割YIpOB2并将其转化到TMB3044中(Karhumaa等人.，2005)，得到了菌株TMB 3321。利用限制性酶Eco32I在URA3基因中切割YIpOB8并将其转化到菌株TMB3044中(Karhumaa等人.，2005)，得到菌株TMB3325。

表2.实施例2中所用的质粒和菌株

生长速率

用无菌水洗涤的细胞接种酵母培养物至620nm下光密度(OD620)为0.2。使酿酒酵母菌株TMB3321和TMB3325在500ml带挡板的烧瓶中在30℃和200rpm下有氧生长，该500ml带挡板的烧瓶含有50ml YNB培养基，该培养基含有50gl^-1木糖和13.4gl^-1YNB，用50mM的邻苯二甲酸氢钾缓冲处理到pH 5.5。每个菌株以三个生物重复培养。通过利用HitachiU-1800分光光度计(Hitachi U-1800Spectrophotometer)(Hitachi Ltd.，Tokyo，Japan)测量OD620来测定生长。

含有组成型TDH3启动子的菌株TMB3325以0.18±0.01h^-1的稳定指数生长速率在木糖上有氧生长(图1)。相比之下，含有ADH1启动子的菌株TMB3321表现出仅为0.04±0.02h^-1的生长速率。24小时后TMB3321的生长下降且此后其表现出较慢的非指数生长(图1，子图)。

参考文献

Gietz，R.D.和Sugino，A.(1988).New yeast-Escherichia coli shuttlevectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pairrestriction sites(用缺乏6个碱基对限制性位点的体外诱变的酵母基因构建的新型酵母-大肠杆菌穿梭载体).Gene 74，527-534.

Karhumaa等人.(2005).Investigation of limiting metabolic steps in theutilization of xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae using metabolicengineering.Yeast(利用代谢工程研究重组酿酒酵母木糖利用中的限制性代谢步骤).Yeast.22(5)：359-368.

Mumberg，等人.(1995).Yeast vectors for the controlled expression ofheterologous proteins in different genetic backgrounds(用于不同遗传背景中异源蛋白的受控表达的酵母载体).Gene 156：119-22.

实施例3

构建了用于在不同碳源上评估TDH3启动子的报告菌株并在葡萄糖和木糖上进行检测。

菌株构建

引物序列中的限制性核酸内切酶识别位点由标下划线或斜体字母指出。通过全细胞PCR利用含HindIII限制性位点(5’-GCGCAAGCTTATGACCATGATTACGGATT-3’)和SalI限制性位点(5’-GTGAGTCGACTTATTTTTGACACCAGACC-3’)的引物从菌株BL21-DE3(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中扩增大肠杆菌(E.coli)LacZ基因。将PCR产物插入到载体p426GPD(Mumberg等人.，2005)中而构建质粒p4261ac(表3)。将质粒YIpOB1(表3)整合到菌株TMB3043(Karhumaa等人.，2005)中得到菌株TMB3320(表3)。利用质粒p4261ac转化TMB3320得到菌株TMB3095。菌株TMB3095能够在作为唯一碳源的木糖上生长且TDH3启动子的表达可按照β-半乳糖苷酶活性来测量。

在木糖或葡萄糖上有氧生长过程中报告基因活性测量

酿酒酵母菌株TMB3095能够在作为唯一碳源的木糖上生长并表达由TDH3启动子控制的LacZ报告基因，将其培养在含有补充50gl^-1木糖和13.4gl^-1YNB或20gl^-1葡萄糖和6.7gl^-1YNB的0.1 l YNB培养基的1 l带挡板的烧瓶中。按照生产商的说明利用酵母蛋白提取试剂(Yeast ProteinExtraction Reagent)(Y-PER)(PIERCE，Rockford，IL，USA)从指数生长期收获的细胞中制备粗细胞提取物。将粗蛋白提取物用于如前所述的β-半乳糖苷酶活性测量(Rupp，2002)。一个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每分钟水解1nmol 2-硝基苯基β-D-半乳糖苷所需的酶的量。

使TMB3095在含20gl^-1葡萄糖或50gl^-1木糖的YNB培养基中有氧生长(图2)。在指数期测定两种条件下的β-半乳糖苷酶活性(图2)。在葡萄糖和木糖中生长的细胞中的LacZ表达大致相似，且所测量的β-半乳糖苷酶比活性分别为501±36U(mg蛋白)^-1和498±3U(mg蛋白)^-1。因此TDH3启动子表现出适宜于不同碳源中生长下的组成型基因表达。

表3.实施例3中所用的质粒和菌株

参考文献

Karhumaa等人.(2005).Investigation of limiting metabolic steps in theutilization of xylose by recombinant Sαcchαromyces cerevisiae using metabolicengineering.Yeast(利用代谢工程研究重组酿酒酵母木糖利用中的限制性代谢步骤).Yeast.22(5)：359-368.

Rupp(2002).LacZ assays in yeast-Quantification of β-galactosidaseactivity(酵母β-半乳糖苷酶活性定量中的LacZ测定)，于Guthrie，C.和Fink，G(编辑)，Guide to yeast genetics and molecular cell biology(酵母遗传学和分子细胞生物学指南)，B部分，Academic Press，第128页-第129页。

实施例4

携带突变的XR或天然XR的遗传修饰菌株的构建

菌株、质粒和培养基

使用大肠杆菌菌株DH5α(Life Technologies，Rockville，MD，USA)用于克隆。质粒和酿酒酵母菌株总结于表4中。所有菌株均在-80℃下贮存于15％甘油中。使大肠杆菌在LB培养基中生长(Ausubel等人.，1995)。将来自新鲜划线的YPD平板(Ausubel等人.，1995)或来自确定成分的矿物培养基平板(Jeppsson等人.，2006)的酵母细胞用于接种。使酿酒酵母的液体培养物在YPD培养基中生长(Ausubel等人.，1995)或在确定成分的矿物培养基中生长(Jeppsson等人.，2006)。将含0.4gl^-1吐温80、0.01gl^-1麦角甾醇和0.5ml l^-1消泡剂(Dow

Antifoam RD Emulsion，VWRInternational Ltd，Poole，UK)的确定成分的矿物培养基用于厌氧发酵中。

遗传技术

利用GeneJET^TM质粒小量制备试剂盒(GeneJET^TM Plasmid MiniprepKit)(Fermentas UAB，Vilnius，Lithuania)制备质粒DNA。利用

凝胶提取试剂盒(

Gel Extraction Kit)(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)进行琼脂糖凝胶DNA提取。将来自MWG-Biotech AG(Ebersberg，Germany)的引物和来自Fermentas(Vilnius，Lithuania)的Pfu DNA聚合酶和dNTP用于聚合酶链式反应(PCR)。所用的引物列于表2。在GeneAmpPCR系统9700(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上进行PCR扩增。利用循环-纯化试剂盒(

Cycle-Pure Kit)(OmegaBio-tek Inc，Doraville，GA，USA)进行PCR产物纯化。使用

Terminator v1.1循环测序试剂盒(Cycle Sequencing Kit)(AppliedBiosystems)用于DNA测序反应。测序由BM labbet AB(Furulund，Sweden)来进行。将来自Fermentas(Vilnius，Lithuania)的限制性核酸内切酶、虾碱性磷酸酶和T4DNA连接酶用于DNA操作。来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的XYLl基因是商业上合成的(GenScript Corp.，Piscataway，NJ，USA)，具有用于酿酒酵母表达的优化的密码子。

如其它地方所描述的制备感受态大肠杆菌DH5α细胞并将其转化(Inoue等人.，1990)，并在含100mg l^-1氨苄青霉素(IBI Shelton Scientific，Inc.，Shelton，CT)的LB平板上选择转化的大肠杆菌菌株(Ausubel等人.，1995)。使大肠杆菌在含100mg l^-1氨苄青霉素的LB培养基中生长以用于质粒扩增。利用醋酸锂方法(Güldener等人.，1996)转化酵母菌株，并在含20g l^-1葡萄糖的确定成分的矿物培养基平板上选择转化的酵母菌株。

TMB 3200的构建

利用重叠延伸PCR方案(Ho等人.，1989)通过定点诱变生成携带K270R(Lys270Arg)突变的树干毕赤酵母XYL1基因。在第一步骤中，利用作为模板的质粒YIplac211PGK XYL1(K270M)(Jeppsson等人.，2006)、一个反应混合物中的引物5XYL1s和3K270R(表5)和另一个反应混合物中的引物5K270R和3XYL1s(表5)进行两个独立的PCR扩增。引物3K270R和5K270R彼此互补。在第二步骤中，将两种PCR产物与引物5XYL1s和3XYL1s混合并通过PCR融合在一起而形成XYL1(K270R)。利用BamHI切割PCR产物并在PGK1启动子之后将其插入到YIplac211PGK(Jeppsson等人.，2006)的BglII位点，得到YIplac211PGK XYL1(K210R)。通过测序验证突变。利用Bpu10I在URA3基因中切割YIplac211PGKXYL1(K270R)并将其转化到TMB 3265(Traff-Bjerre等人.，2004)中，得到TMB 3200。

TMB 3321、TMB 3322、TMB 3323和TMB 3324的构建

利用PCR使用引物pY7-XR-for和pY7-XR-rev(表5)扩增ADHlp-XYL1-ADHlt。使用引物pY7-XDH-for和pY7-XDH-rev(表5)扩增PGK1p-XYL2-PGK1t。在两种情况下使用质粒pY7(Walfridsson等人.，1997)作为模板。利用HindIII和PstI消化ADHlp-XYL1-ADHlt，和利用PstI和SacI消化PGK1p-XYL2-PGK1t。将所得的片段插入到YIplac128中(Gietz和Sugino，1988)而构建YIpOB1。利用HindIII和SacI切除含ADHlp-XYL1-ADH1t PGKlp-XYL2-PGKlt的DNA盒并将其插入到YIplac211(Gietz和Sugino，1988)中而构建YIpOB2。通过利用XbaI消化而将XYL1基因从YIpOB2移去并进行自身连接而构建YIpOB3。利用XbaI消化YIplac211PGK XYL1(K270M)、YIplac211PGK XYL1(K270R)和pUC57CpXR，并将XYL1(K270M)、XYL1(K270R)和XYL1(近平滑假丝酵母)片段插入到YIpOB3的XbaI位点，分别得到YIpOB4、YIpOB5和YIpOB6。通过限制性分析和测序来验证插入物的正确方向和序列。利用ApaI在URA3基因中切割YIpOB2、YIpOB4、YIpOB5、和YIpOB6并将其转化到TMB 3044中(Karhumaa等人.，2005)。这样分别得到菌株TMB3321、TMB 3322、TMB 3323和TMB 3324，此后称作Y-PsNative、Y-PsK270M、Y-PsK270R和Y-CpXR。

所构建菌株的描述

构建了表达树干毕赤酵母XR的K270R突变体的菌株TMB 3200(表4)以评估突变对重组酿酒酵母的木糖发酵的影响。在厌氧连续发酵中将该菌株与携带天然树干毕赤酵母XR、XDH和过表达的内源性XK的TMB3001(Eliasson等人.，2000)相比较。观察到增高的乙醇产量和下降的木糖醇产量，但木糖利用率没有提高(结果未示出)。猜测木糖利用率受除NAD(P)H-依赖的XR和严格的NAD⁺-依赖的XDH导致的辅因子不平衡以外的其它因素限制。

XK的过表达和非氧化戊糖磷酸通路提高了重组酿酒酵母的木糖利用(Karhumaa等人.，2005；Kuyper等人.，2005)。并且，内源性醛糖还原酶GRE3的缺失使背景XR活性最小化并降低了木糖醇形成(等人.，2001)。构建了具有这些特征的四种同基因的基于CEN.PK的菌株(表4)以评价XR的动力学特性如何影响重组酿酒酵母的木糖发酵。携带天然树干毕赤酵母XR的菌株Y-PsNative作为参照菌株。Y-PsK270M含有树干毕赤酵母XR的K270M突变体，先前已证明其在木糖发酵中降低了木糖醇产量并提高了乙醇产量(Jeppsson等人.，2006b)。Y-PsK270R含有用于酿酒酵母表达的优化密码子的表达树干毕赤酵母XR的K270R突变体，Y-CpXR含有用于酿酒酵母表达的优化密码子的合成的近平滑假丝酵母XYL1基因(Lee等人，2003)。

实施例5

利用携带突变XR或天然XR的遗传修饰的菌株的厌氧发酵

分析

通过利用Hitachi U-1800分光光度计(Hitachi U-1800Spectrophotometer)(Hitachi Ltd.，Tokyo，Japan)测量OD620跟踪生长。利用Aminex HPX-87H离子交换柱(Aminex HPX-87H ion exchange column)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)、折光率检测器(RID-6A，Shimadzu，Kyoto，Japan)和UV检测器(2487，Waters)通过高效液相色谱(HPLC；Waters，Milford，MA，USA)来测定葡萄糖、木糖、木糖醇、甘油、丙酮酸酯、乙酸酯、乙醇和琥珀酸酯的浓度。流动相为5mM H₂SO₄，温度45℃和流速0.6ml min^-1。通过二氧化碳和氧气监测器1308型(Carbon Dioxide andOxygen Monitor Type 1308)(Brüel&

Copenhagen，Denmark)监测输出气体的组成。通过以下用三个重复来测定细胞干重：将已知体积的培养基从0.45-μm450膜过滤器(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI，USA)中过滤，之后将过滤器在微波炉中干燥并称重。对连续发酵，测定生物质中的蛋白、多糖(Herbert等人.，1971)和RNA(Benthin等人.，1991)的成分。使用先前已开发的化学计量模型(Wahlbom等人.，2001)来评估连续发酵中的细胞内碳通量。

实验测定用于连续发酵的装置的乙醇蒸发。将乙醇添加到充有0.2 lmin^-1的氮气流的发酵罐，并随时间测量乙醇浓度。蒸发速率遵循等式(1)且比例常数k＝0.004。

dC_乙醇/dt＝-kC_乙醇 (1)

评估所有连续发酵的乙醇蒸发，乙醇蒸发和HPLC所测量的与乙醇共同构成总乙醇产生。

分批发酵

利用1升的工作体积在3-1ADI可高压灭菌生物反应器系统(3-1ADIAutoclavable Bio Reactor Systems)(Applikon，Schiedam，The Netherlands)中进行厌氧分批发酵。将细胞在含有20g l^-1葡萄糖的确定成分的矿物培养基中在摇瓶中进行预培养，用无菌水洗涤并将其接种到生物反应器中至620nm处的光密度(OD620)为0.2。使用的确定成分的矿物培养基具有双倍浓度的所有盐、痕量元素和维生素，含20g l^-1葡萄糖和50g l^-1木糖。温度为30℃，搅动设置为200rpm且通过添加3M KOH来维持pH 5.5。通过在接种前喷射含5ppm以下的O₂的氮气(AGA GAS AB，Sundbyberg，Sweden)来实现厌氧条件。在发酵过程中，通过经水锁扩散的所产生的CO₂来维持厌氧条件。至少以两份生物重复进行该实验。

在含20g l^-1葡萄糖和50g l^-1木糖的厌氧分批发酵中对比菌株Y-PsNative、Y-PsK270M和Y-PsK270R(参考实施例4)(图3)。表6总结了发酵117小时后的木糖消耗、乙醇浓度和产物产量。参照菌株Y-PsNative消耗了30.4g l^-1木糖并产生了16.7g l^-1乙醇而Y-PsK270R消耗了46.1g l^-1木糖并产生了25.3g l^-1乙醇。三个菌株中Y-PsK270M消耗了最少木糖(16.8g l^-1)并产生了最低的乙醇浓度(14.1g l^-1)。参照菌株Y-PsNative产生了0.33g乙醇g消耗的糖^-1的乙醇产量和0.26g木糖醇g消耗的木糖^-1的木糖醇产量。具有突变XR的两个菌株比参照菌株产生了较高的乙醇产量(0.38g乙醇(g消耗的糖)^-1)和显著较低的木糖醇产量(0.09g木糖醇(g消耗的木糖)^-1)。并且，Y-PsK270R在葡萄糖耗尽后在木糖上厌氧生长并产生生物质(图4)。在发酵117小时后Y-PsK270R已产生了3.4g l^-1生物质而Y-PsNative和Y-PsK270M产生了2.1g l^-1生物质。

连续发酵和通量分析

利用1升的工作体积在2-1A生物反应器(2-1

Abioreactors)(B.Braun Biotech International，Melsungen，Germany)中进行厌氧连续发酵。使用含有10g l^-1葡萄糖和10g l^-1木糖的确定成分的矿物培养基进行预培养和连续发酵。将在摇瓶中预培养并用无菌水洗涤的细胞接种到生物反应器中至0.2的OD620。在葡萄糖耗尽后以0.06到0.12h^-1的稀释速率开始连续发酵。温度为30℃，200rpm搅动且通过添加3M KOH来维持pH 5.5。通过在由质量流量计(Bronkhorst HI-TEC，Ruurlo，theNetherlands)控制的0.2l min^-1的恒定气流下喷射含5ppm以下的O₂的氮气(AGA GAS AB，Sundbyberg，Sweden)来达到厌氧条件。将废气冷凝器冷却至4℃，且用氮气持续喷射培养基贮器。在五次停留时间后认为达到稳定状态，且用两份生物重复进行实验。

在利用含10g l^-1葡萄糖和10g l^-1木糖的进料的厌氧连续发酵中比较Y-PsNative和Y-PsK270R(表7)。连续发酵结果与分批发酵结果总体上一致。在两个稀释速率下Y-PsK270R产生比Y-PsNative高4％的乙醇产量。在0.06h^-1和0.12h^-1的稀释速率下，与参照菌株Y-PsNative相比Y-PsK270R分别表现了高17％和9％的比木糖消耗速率并分别产生低60％和78％的木糖醇产量。在0.06h^-1和0.12h^-1的稀释速率下，Y-PsK270R也分别产生比Y-PsNative低17％和22％的甘油产量。

利用化学计量模型(Wahlbom等人.，2001)评估Y-PsNative和Y-PsK270R中通过的代谢通量。将通量值对100mmol g^-1生物质h^-1的总比糖消耗。对于两种菌株，在0.12h^-1的稀释速率下的总比糖消耗中的木糖分数均比0.06h^-1的稀释速率下的要小。根据模型，在0.06h^-1和0.12h^-1的稀释速率下，Y-PsK270R在XR反应中利用的NADH的分数(90和100％)分别比Y-PsNative利用的NADH的分数(59和74％)要多。模型还预测在0.06h^-1和0.12h^-1的稀释速率下，在Y-PsK270R中进入氧化戊糖磷酸通路的葡萄糖-6-磷酸的分数(11％和7％)分别比在Y-PsNative中进入氧化戊糖磷酸通路的葡萄糖-6-磷酸的分数(14％和12％)要小。

实施例6

突变树干毕赤酵母XR和天然树干毕赤酵母XR的动力学分析

天然XR和突变XR的酶活性和动力学特性

将用于酶活性测量的菌株培养在含20g l^-1葡萄糖的确定成分的矿物培养基中并在指数生长期将其收获。用无菌水洗涤细胞并利用酵母蛋白提取溶液Y-PER(Pierce，Rockford，IL，USA)进行处理。使用考马斯蛋白分析试剂(Coomassie Protein Assay Reagent)(Pierce)利用白蛋白标准(Albumin Standard)(Pierce)测定蛋白浓度。利用Ultrospec 2100pro分光光度计(Ultrospec 2100pro spectrophotometer)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)测定NAD(P)H依赖的XR活性，在30℃和340nm下进行操作(ε_NAD(P)H＝6220M^-1cm^-1)。使用三乙醇胺缓冲液(100mM，pH 7.0)，通过添加木糖而起始反应。如先前所描述的(Eliasson等人.，2000)利用200μM NAD(P)H和350mM木糖使用标准分析确认功能性XR表达。对来自菌株Y-PsNative、Y-PsK270M和Y-PsK270R(参考实施例4)的粗提取物中的XR动力学进行测定，其中木糖和NAD(P)H的浓度从小于相应的表观K_m值的一半到大于相应的表观K_m值的5倍的范围内变化至少五个等级。通过MatLab R2006a中的无约束非线性优化拟合起始速率为等式(2)，其描述了对于遵循强制有序三元络合机制(compulsory-orderternary-complex mechanism)(Cornish-Bowden，2004)的两底物反应的起始速率。

v＝V_max[A][B]/(K_iAK_mB+K_mB[A]+K_mA[B]+[A][B]) (2)

V_max是最大速率，[A]和[B]分别是NAD(P)H和木糖的浓度，K_mA和K_mB分别是NAD(P)H和木糖的米氏常数(Michaelis constant)，和K_iA是NAD(P)H的解离常数。

利用标准分析(200μM NAD(P)H，350mM木糖)对菌株Y-PsNative、Y-PsK270M、Y-PsK270R和Y-CpXR的粗提取物的功能性XR表达进行分析(表8)。与参照菌株Y-PsNative相比，Y-PsK270M仅表现出约34％的NADPH依赖的XR活性和约36％的NADH依赖的XR活性。相比之下，Y-PsK270R与Y-PsNative相比表现了高2.4倍的NADPH依赖的XR活性和高3.2倍的NADH依赖的XR活性。具有近平滑假丝酵母XYL1的Y-CpXR没有表现出任何显著的NADPH或NADH依赖的XR活性。在标准分析条件下两个树干毕赤酵母XR突变体与天然XR相比没有表现出辅因子偏好性的改变(表8)。

对来自菌株Y-PsNative、Y-PsK270M和Y-PsK270R的粗提取物进行动力学研究。按照等式(2)拟合数据，且所得的常数总结于表8中。与来自树干毕赤酵母的天然XR相比，K270M突变导致了NADPH和NADH的K_m值的显著增高。事实上，由K270M突变体催化的NADH关联反应的动力学参数甚至不能被测定，因为该突变体不能被NADH饱和。K270R突变将NADPH的K_m值提高了25倍，而NADH的K_m仅提高了2倍。

实施例7

菌株构建

利用XbaI限制性位点将XYL1(K270R)基因片段从质粒YIpOB5(表9)上切除并插入到携带树干毕赤酵母XDH基因的YIpOB7(表9)中，构建了质粒YIpOB9(表9)，质粒YIpOB9为含有TDH3启动子控制下的XYL1(K270R)基因和PGK1启动子控制下的树干毕赤酵母XYL2基因的整合型质粒。利用该整合型质粒YIPOB9转染菌株TMB3043(Karhumaa等人.，2005)，并将该新型菌株命名为TMB3662。利用整合型质粒YIplac128(Gietz和Sugino，1988)转染菌株TMB3662，并将该新型菌株命名为TMB3415。

表9-实施例7中所用的质粒和菌株

两相需氧/厌氧发酵

将菌株TMB3415用于两相需氧/厌氧发酵实验。

需氧生长带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer baffled flasks)和两相需氧/厌氧发酵在矿物培养基中进行(Jeppsson等人.，2006)。培养基含作为唯一碳源的60g l^-1木糖(Acros Organics，Geel，Belgium)。当用于生物反应器中的发酵时，培养基被补充以0.4g l^-1吐温80(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)、0.01g l^-1麦角固醇(Alfa Aesar，Karlsruhe，Germany)。

使酿酒酵母在充有最大至1/10的体积的培养基的带挡板的锥形瓶中有氧生长，在30℃下在200rpm的旋转震动培养箱(INR-200震动培养箱，Gallenkamp，Leicester，UK)中孵育。

在2l工作体积生物反应器(Applikon Biotechnology，Schiedam，TheNetherlands)中进行两相需氧/厌氧分批发酵，在30℃下在通过添加3MKOH自动控制的pH5.5下持续总共至少175小时。在接种前，通过在0.4lmin^-1流速下喷射无菌空气并伴随在500rpm下的持续搅拌而形成有氧条件。

使细胞在摇瓶中在确定成分的矿物培养基中有氧预生长(Jeppsson等人.，2006)，通过离心将其收获，在～10ml的无菌培养基中重悬并以0.2±0.02的起始O.D._620nm将其接种到发酵罐中。通过OD测量对在木糖上的有氧生长进行跟踪。在O.D._620nm＝1.0时将供气转换为N₂(＜5ppm O₂，AGA，

Sweden)以形成厌氧条件。通过测量废气组成和发酵罐中的溶解氧浓度而保证无氧条件。跟踪厌氧生长和乙醇产生至少165小时。至少两份重复进行实验。需氧条件和厌氧条件过程中生物质产生的代表性曲线描绘于图5中。

在每个取样点，在排放样品管死体积后从发酵罐吸取样品，通过离心快速分离细胞并在进一步分析之前将上清液贮存在-20℃。

通过高效液相色谱(HPLC)(Waters，Milford，MA，US)测定木糖、木糖醇乙酸酯、甘油和乙醇的浓度。利用Aminex HPX-87H树脂基柱(AminexHPX-87H resin-based columns)(Bio-Rad，Hercules，CA，US)和随后的Micro-Guard阳离子-H保护柱(Micro-Guard Cation-H guard column)(Bio-Rad，Hercules，CA，US)分离化合物。分离在45℃下进行，利用0.6mlmin^-1的流速的5mM硫酸作为流动相。通过UV或折射率检测(Shimadzu，Kyoto，Japan)来检测化合物。每种样品以至少两份重复来进行分析。

利用二氧化碳和氧气监测器1308型(Carbon Dioxide and OxygenMonitor Type 1308)(Brüel&

Copenhagen，Denmark)对发酵罐的排气口中的氧气和CO₂浓度进行持续监测。

对于每次发酵实验，在至少两个点进行干重测量，每个点三份重复。需氧阶段的终点(O.D._620nm＝1.0)和厌氧阶段中的点O.D._620nm＝4.0常包括在内。

对于每个发酵实验，在至少两个点进行干重测量，每个点三份重复。需氧阶段的终点(O.D._620nm＝1.0)和厌氧阶段的点O.D._620nm＝4.0始终包括在内。对于干重测量，将已知体积的细胞培养物经过干燥的预先称重的0.45μm的硝酸纤维素过滤器来过滤，随后将其在微波炉中干燥并称重。

从O.D._620nm对比时间的指数拟合中计算需氧阶段和厌氧阶段的最大比生长速率，μ。通过假定在指数厌氧生长过程中O.D._620nm＝1.0和O.D._620nm＝6.0之间的拟稳态来计算厌氧阶段的木糖摄取和产物形成的速率。通过在测量范围内观察恒定产物形成和底物消耗的速率来验证拟稳态。通过分析物和生物质浓度的测量值的非线性回归来计算产物形成和底物消耗的速率。所计算的速率的碳平衡接近95-105％。

对于需氧阶段所计算的最大比生长速率为0.2h^-1，而对于厌氧阶段所计算的最大比生长速率为0.0237h^-1。

所计算的速率记录于表10中，其中；r_x，比生物质产生速率；r_s，比底物消耗速率；r_e，比乙醇产生速率；r_g，比甘油产生速率；r_a，比乙酸酯产生速率；r_xol，比木糖醇产生速率；r_CO2，比CO₂产生速率；Y_SX，每单位消耗的底物产生的生物质；Y_se，每单位消耗的底物产生的乙醇；Y_sxol，每单位消耗的底物产生的木糖醇。

表10.TMB 3415的厌氧木糖生长期间的速率和产量

参考文献

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实施例8

过表达PGM2基因的菌株的构建

多拷贝质粒上的PGM2的表达

使用多拷贝质粒YEplacHXT(Karhumaa，Hahn-

等人.2005)将PGM2基因的多拷贝导入到菌株CENPK 113-11C(Entian和

1998)中。利用BamHI和PstI对YEplacHXT载体(Karhumaa，Hahn-

等人.2005)进行双重消化以使其在HXT7′启动子(Hauf，Zimmermann等人.2000)和PGK终止子之间线性化。利用切割的载体YEplacHXT转化酿酒酵母CEN-PK 113-11C生成菌株TMB 3126(表11)。利用具有与HXT7′启动子的末端同源的突出端(标下划线的)的引物

(5′TTTTTTAATTTTAATCAAAAAAGGATCCCCGGGCTGCAATGTCATTTCAATTGAAACG-3′)和具有与PGK终止子的起始同源的的突出端(标下划线的)的引物

(5′CCACCACCAGTAGAGACATGGGAGATCTAGAATTCCTTTAAGTACGAA CCGTTGG-3′)而从TMB3400(表11)(Wahlbom，van Zyl等人.2003)的基因组DNA中扩增PGM2基因，以在具有突出端的PGM2和线性化质粒之间形成双重组而形成质粒YEplacHXT-PGM2(表11)，并转化酵母而生成菌株TMB 3127(表11)。在含组氨酸的确定成分的培养基上选择转化体菌落且排除尿嘧啶以选择营养缺陷型的恢复。将从大肠杆菌JM101中提取的YDp-H质粒用作利用引物his3YDpH_prom 5′GCGATTGGCATTATCAC3′和his3YDpH-rev 5′GCAGCTTTAAATAATCGG 3′通过PCR扩增HIS3基因座的模板。将HIS3扩增子进行转化并整合到酵母菌株TMB 3126和TMB3127中，以分别生成菌株对照m(Control m)、TMB 3128，和PGM2m、TMB 3129(表11)。在不含补充物的确定成分的矿物培养基上选择转化体。拯救质粒并使其转化大肠杆菌DH5α以用于验证。所回收的质粒的分析型PCR确证了HXT7p′下的PGM2额外拷贝存在于PGM2m中但不存在于对照m菌株中。TMB 3129此后被称为PGM2m；且其对应的对照菌株，含有无结构基因PGM2的多拷贝质粒YEplacHXT的TMB 3128此后被称作对照m(表11)。

PGM2的基因组整合

为构建菌株对照i(Controli)、TMB 3135和PGM2i、TMB 3136(表11)，将HIS3扩增子转化到如上所述的酿酒酵母CEN-PK 113-11C中以生成菌株3144(表11)。在含尿嘧啶的确定成分的矿物培养基上选择酵母转化体。使用从菌株PGM2m中纯化的质粒YEplacHXT-PGM2(表11)作为模板，利用PWO-聚合酶PCR扩增待克隆到整合型质粒YIplac211(Gietz和Sugino 1988)(表11)中的具有突出端以包含SalI限制性位点的扩增子HXT7′p-PGM2-PGKt，所述扩增利用以下引物：与PGKt同源的PGK SalI(5’ATCTGTCGACGACATAGAAATATCGAATGG 3’)和与HXT7′p同源的HXT SalI(5’ATCTGTCGACAGGAACAATTTCGGGCC 3’)。利用限制性酶SalI切割PCR产物HXT7′p-PGM2-PGKt和载体YIplac211并用SAP酶进行处理。利用T4连接酶连接PCR产物HXT7′p-PGM2-PGKt和切割的载体YIplac211。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中并在含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。为验证携带YIplac211HXT-PGM2的阳性转化体，选择一些克隆并使其在含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基上过夜生长。提取质粒并利用限制性酶将其切割以验证所切割的片段的合适大小，且还通过分析型PCR进行验证。

将来自大肠杆菌的纯化的质粒YIplac211和YIplac211HXT-PGM2(表11)在URA基因座EcoRV中进行切割并用SAP处理。使用质粒靶向URA基因座转化酵母菌株TMB 3134。从而通过切割的YIplac211的整合而生成了菌株对照i，即TMB3135和通过YIplac211 HXT-PGM2的整合而生成了菌株PGM2i，即TMB3136(表11)。在不含补充物的确定成分的矿物培养基上选择转化体。

通过从对照i和PGM2i提取的基因组DNA的分析型PCR来验证HXT7′p-PGM2-PGKt的基因组整合。

利用木糖的菌株中的PGM2过表达

利用在URA基因座中用EcoRV线性化的质粒YIplac211和YIplac211HXT-PGM2(表11)转化已被工程修饰而提高木糖发酵(Traff，Otero Cordero等人.2001；Jeppsson，Johansson等人.2002；Karhumaa，Hahn-

等人.2005)的利用木糖的菌株TMB 3320(Bengtsson，Bettiga等人.已提交)(表11)，以分别生产菌株对照-PPP-XYL，即TMB 3137和菌株PGM2-PPP-XYL，即TMB 3138(表11)。

因此从具有较少的已知促进木糖利用的遗传修饰的菌株CEN PK113-11C构建其它利用木糖的菌株。从大肠杆菌DH5α中提取质粒YIpXR/XDH/XK(Eliasson，Christensson等人.2000)(表11)并在HIS3基因座中利用PstI进行切割。将线性化的质粒转化到酿酒酵母菌株CENPK113-11C中。在含尿嘧啶的确定成分的矿物培养基上选择转化体。通过在含50g/l木糖的确定成分的培养基上生长而验证编码木糖通路的基因的整合。利用已被EcoRV在URA基因座中切割的质粒YIplac211和YIplac211HXT-PGM2(表11)进一步转化含有整合的YIpXR/XDH/XK的菌株CENPK113-11C。含有整合的YIplac211和YIpXR/XDH/XK的菌株被称作对照-XYL、TMB 3139，而含有YIplac211HXT-PGM2和YIpXR/XDH/XK的菌株被称作PGM2-XYL、TMB 3140(表11)。在无营养素补充的确定成分的矿物培养基上选择转化体。阳性转化体恢复尿嘧啶营养缺陷型。

从对照-PPP-XYL、PGM2-PPP-XYL、对照-XYL和PGM2-XYL中提取基因组DNA并通过分析型PCR验证整合事件。

表11.实施例8中所用的质粒和酿酒酵母菌株

(*)最重要的基因特征的缩写显示于引号中

Bengtsson，O.，M.Bettiga，等人.(已提交).“Differential behaviour oftwo commonly used promoters in xylose utilizing recombinant Saccharomycescerevisiae.(两种常用启动子在利用木糖的酿酒酵母中的差别行为)”

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实施例9

利用表达PGM2的菌株的需氧培养

向酵母氮源基础培养基(YNB)(6.7g/l不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基(Difco Yeast Nitrogen Base)；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)补充50g/l木糖作为唯一碳源来评估生长。利用邻苯二甲酸氢钾(10.21g/l邻苯二甲酸，2.1g/l KOH，pH 5.5)对YNB液体培养基进行缓冲处理(Hahn-Karhumaa等人.2005)。当糖浓度大于20g/l时将YNB的浓度加倍以避免营养限制。在30℃下和180-200rpm振荡下(Gallenkamp INR-200，Leicester，UK)进行预培养和需氧分批培养实验。使用在含有约5ml生长培养基的50ml管中过夜培养至指数期中后期的生长于含20g/l葡萄糖的YNB中的预培养物以OD_620nm 0.1-0.2在含50ml生长培养基的棉塞阻隔的带挡板的500ml烧瓶中接种需氧分批培养物。至少以两份重复进行需氧生长培养。

当选择需要时，对于营养缺陷型菌株，向确定成分的矿物培养基(YNB)补充以氨基酸或环状含氮碱基。分别以40mg/L和20mg/L的浓度添加组氨酸和尿嘧啶(Hahn-

Karhumaa等人.2005)。

平板补充以20g/l葡萄糖和20g琼脂/l。对于消耗木糖的菌株在木糖培养基上测定_μmax(表12)。过表达非氧化型PPP并具有Δgre3的菌株，即菌株对照-PPP-XYL和PGM2-PPP-XYL在木糖上具有比菌株对照-XYL和PGM2-XYL(表12)高3至4倍的生长速率，证实了另外的遗传修饰增强了木糖消耗(Traff，Otero Cordero等人.2001；Johansson和Hahn-2002；Karhumaa，Hahn-

等人.2005)。菌株PGM2-PPP-XYL与对照-PPP-XYL相比在木糖培养基上具有增高的需氧μ_max。

表12.含50g/l木糖的需氧的确定成分的培养基中的最大比生长速率μ_max(h^-1)

菌株	μ_max(h^-1)
		对照-PPP-XYL	0.038±0.014
PGM2-PPP-XYL	0.041±0.008
		对照-XYL	0.012±0.002
PGM2-XYL	0.012±0.003

利用表达PGM2的菌株在木糖上的厌氧发酵

在确定成分的矿物培养基中进行厌氧发酵(Jeppsson，Bengtsson等人.2006)。培养基补充以0.4g/l吐温80和0.01g/l麦角固醇和20g/l木糖。

预培养培养基含20g/l葡萄糖，并利用邻苯二甲酸盐缓冲液(10.21g/l邻苯二甲酸，2.1g/l KOH，pH 5.5)对进行缓冲处理(Hahn-

Karhumaa等人.2005)。将第一预培养物进行接种并使其在50ml管的5ml培养基中生长直至指数期晚期。在1000ml棉塞阻隔的带挡板的摇瓶中使用培养物接种100ml的第二需氧预培养物。使来自第二预培养物的细胞进行生长直至指数期晚期，并在0.1-0.2的OD_620nm时将其用来接种厌氧分批培养。利用无菌水洗涤细胞两次并在5000rpm下离心10分钟。在30℃和180-200rpm(Gallenkamp INR-200，Leicester，UK)下使需氧预培养物进行生长。

在30℃和200rpm下，利用1.5L的工作体积在3L

Bio反应器(Bio Reactors，B.Braun Biotech International，Melsungen，Germany)或3L

Bio反应器(

Bio Reactors，Applikon，Schiedam，The Netherlands)中进行厌氧分批发酵，利用3M KOH将pH控制在5.5。通过自生物反应器的底部在由质量流量计(mass flow meters)(Bronkhorst HI-TEC，Ruurlo，the Netherlands)控制的0.2l/min的流速下冲入含小于5ppm的O₂的氮气(AGA Gas，Sundbyberg，Sweden)来达到厌氧条件。利用二氧化碳和氧气监测器1308型(Carbon Dioxide and OxygenMonitor Type 1308，Brüel&

Copenhagen，Denmark)对排气口二氧化碳和氧气浓度进行监测。

至少以两份重复进行厌氧发酵实验，且具有小于10％的差异。

利用菌株对照-PPP-XYL和PGM2-PPP-XYL在20g/l木糖上进行的厌氧分批发酵的糖消耗和产物形成结果显示于图6A中，且厌氧生长结果显示于图6B中。对于菌株对照-PPP-XYL，比生长速率为0.03±0.01(h^-1)，和对于菌株PGM2-PPP-XYL，比生长速率为0.07±0.01。过表达PGM2的额外拷贝的菌株提高了经木糖利用通路的通量。在菌株PGM2-PPP-XYL中，代谢物分布改变：生物质和乙醇产量增高，而甘油和木糖醇产量下降。

实施例10

葡糖磷酸变位酶的酶活性

对生长于含20g/l半乳糖或20g/l葡萄糖的YNB培养基上的细胞的粗提取物的PGM活性进行测定。对于每种菌株和条件，培养了至少3份独立培养物，并利用同一细胞提取物的不同稀释度进行了至少2次独立的酶法测量。在指数期收获细胞，在5000rpm下离心5分钟，用无菌水洗涤两次并用Y-PER(Pierce，Rockford，IL，USA)进行渗透处理。利用考马斯蛋白分析试剂(Coomassie Protein Assay Reagent，Pierce，Rockford，IL，USA)利用牛血清白蛋白作为标准测定蛋白浓度。在30℃下通过如前所述在340nm下监测NAPDH产生而测定葡糖磷酸变位酶活性(Bro，Knudsen等人.2005)。用来测定酶活性的化学药品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。

在相同的遗传背景下构建了具有基因PGM2的不同数目的拷贝的两种菌株(参考实施例9；表11)。在两个菌株中，PGM2在组成型启动子HXT7′的控制下被表达(Hauf，Zimmermann等人.2000)。一种菌株过表达来自多拷贝质粒的PGM2且被称为PGM2m。其对照菌株对照m携带无结构基因的同样的质粒。另一个菌株仅表达PGM2的一个额外的整合的拷贝，且被称作PGM2i。其对应的参照菌株为对照i(表11)。

在生长于半乳糖或葡萄糖上的细胞的粗提取物中评估PGM2拷贝数对PGM比活性的影响。关于生长于半乳糖的细胞，菌株对照m和对照i表现出相似的比PGM活性，分别为0.33U/mg蛋白和0.34U/mg蛋白，而PGM2m和PGM2i中的比活性分别提高至10.04U/mg蛋白和1.81U/mg蛋白。生长于葡萄糖的细胞中的比PGM活性具有比生长于半乳糖的细胞中较低的值。在生长于葡萄糖的细胞中，菌株对照m和对照i分别表现出0.23U/mg蛋白和0.10U/mg蛋白的比PGM活性，而PGM2m和PGM2i菌株中的比活性分别提高至4.29U/mg蛋白和1.47U/mg蛋白。

这是HXT7截短的启动子(Hauf，Zimmermann等人.2000)控制下基因剂量的研究的实例，且显示的效应为PGM2基因的额外拷贝产生PGM活性的增高。还评估了生长于葡萄糖上的细胞的比PGM活性，葡萄糖为木质纤维素水解物中常见的糖。

参考文献

Bro，C，S.Knudsen，等人.(2005).“Improvement of galactose uptake inSaccharomyces cerevisiae through overexpression of phosphoglucomutase：example of transcript analysis as a tool in inverse metabolic engineering.(通过葡糖磷酸变位酶的过表达对酿酒酵母中半乳糖摄取的改良：转录分析作为逆代谢工程中工具的实例)”Appl Environ Microbiol 71(11)：6465-72。

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实施例11

具有基因组整合的在组成型启动子下的PGM2和XYL1(K270R)的菌株的构建

菌株和培养基

本研究中所用的酵母菌株和质粒总结于表13中。使用大肠杆菌DH5α(Life Technologies，Rockville，MD，USA)用于亚克隆。所有菌株均在-80℃下贮存于15％甘油中。使大肠杆菌在含100mg.l^-1氨苄青霉素的LB培养基(Sambrook J，Fritch E等人.1989)中生长。将来自冷冻贮存的酵母菌株在补充有20g.l^-1葡萄糖、20g.l^-1琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)的YNB培养基(6.7g/l不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基(Difco YeastNitrogen Base)；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)上划线，并且当营养缺陷型菌株需要时，添加氨基酸的补充物(Hahn-

Karhumaa等人.2005)。利用50mM的邻苯二甲酸氢钾(Merck，Darmstadt，Germany)对含20g.l^-1葡萄糖的液体培养基进行缓冲处理至pH 5.5进行需氧培养(Hahn-

Karhumaa等人.2005)。

分子生物学技术

除另外指明，用于克隆和限制性切割的所有酶获自Fermentas(Vilnius，Lithuania)。利用Dream Taq^TM聚合酶(Dream Taq^TM Polymerase)进行分析型PCR，而利用高保真PCR酶混合物(High Fidelity PCR Enzyme mix)或Pwo聚合酶(Pwo Polymerase，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)来进行连接或测序前的制备型PCR。

利用来自Fermentas(Vilnius，Lithuania)的GeneJET^TM质粒少量制备试剂盒(GeneJET^TM Plasmid Miniprep Kit)从细菌中分离质粒DNA。利用

循环纯化试剂盒(

Cycle-Pure Kit，Omega Bio-tek Inc，Doraville，GA，USA)对限制性切割或PCR扩增后的DNA产物进行纯化。用于细菌转化的方法是氯化钙方法(Dagert和Ehrlich 1979)，且通过醋酸锂方法来进行酵母转化(Gietz，Schiestl等人.1995)。引物合成和测序由Eurofins MWG Operon(Ebersberg，Germany)来进行。通过酚/氯仿方法来进行酵母染色体DNA提取。

菌株TMB 3143和TMB 3144的构建

使用具有上调的非氧化戊糖磷酸通路和GRE3基因缺失的酿酒酵母菌株TMB 3043和TMB 3044作为背景菌株来分别构建菌株TMB 3143(“PGM2-PPP-XYL1(K270R)”)和TMB 3144(“对照-PPP-XYL1(K270R)”)(表13)(图7)。实践中，利用ApaI在URA3基因中切割质粒YIpOB9(表13)并将其用来转化酵母菌株TMB 3043和TMB 3044。分别在补充60mg.l^-1亮氨酸的YNB葡萄糖培养基(Hahn-Karhumaa等人.2005)和YNB葡萄糖培养基上选择转化体(图7)。

利用线性化的质粒Ylplacl28HXT-PGM2进一步转化具有整合的YlpOB9的TMB 3043的阳性克隆，并在YNB葡萄糖平板上进行转化体的选择。

从质粒Ylplac128和质粒Ylplac211HXT-PGM2的部分中进行Ylplac128HXT-PGM2的构建(表13)(图7)。利用SalI消化Ylplac128。PCR扩增DNA盒HXT7p PGM2 PGK1t，使用质粒Ylplac 211HXT PGM2(表13)作为模板，使用包括在所扩增的DNA盒的末端的限制性位点SalI的引物PGK SalI和HXT SalI(表14)。然后利用SalI限制性酶消化HXT7pPGM2 PGK1t的PCR产物。将SalI消化的Ylplac 128质粒与包括SalI位点的DNA盒HXT7p PGM2 PGK1t连接，得到质粒Ylplac128HXT-PGM2(表13)(图7)。

通过利用AatII酶限制性切割而将Ylplac128HXT-PGM2(表13)线性化，并将其用来转化已具有YlpOB9的整合的拷贝的菌株TMB 3043。

首先通过PCR扩增且然后通过染色体上整合的基因的测序来验证转化体，该染色体上整合的基因是利用校正读码DNA聚合酶从提取的基因座DNA中PCR扩增的。

表13.实施例11中所用的菌株和质粒

表14.引物列表

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实施例12

过表达PGM2和XYL1(K270R)的菌株的鉴定

需氧培养

将酵母氮源基础培养基(YNB)(6.7g/l不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基(Difco Yeast Nitrogen Base)；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)用于需氧培养。其被补充50g.l^-1木糖或20g.l^-1葡萄糖。对于液体培养基利用邻苯二甲酸氢钾(10.21g/l邻苯二甲酸，2.1g/l KOH，pH 5.5)对YNB液体培养基进行缓冲处理(Hahn-

Karhumaa等人.2005)，对于平板添加20g l^-1琼脂。当糖浓度大于20g/l时将YNB的浓度加倍。使用在含有约5ml生长培养基的50ml管中培养至指数期中后期的生长于含20g/l葡萄糖的YNB中的预培养物以OD_620nm 0.1-0.2在含50ml生长培养基的棉塞阻隔的带挡板的500ml烧瓶中接种需氧分批培养物。至少以两份生物重复进行需氧生长培养，且起始培养基为烧瓶体积的10％。

厌氧发酵

将细胞在确定成分的矿物培养基(Jeppsson，Bengtsson等人.2006)上需氧预培养，培养基含20g.l^-1葡萄糖，且利用50mM的邻苯二甲酸酯(Hahn-

Karhumaa等人.2005)处理至pH5.5。在同样的但含50g.l^-1木糖、0.4g.l^-1吐温80和0.01g.l^-1麦角固醇的确定成分的矿物培养基上进行厌氧发酵，且通过3M KOH的自动添加而控制pH。因为糖浓度超过20g.l^-1糖，所以将培养基成分的浓度加倍。

在30℃下使预培养物在180rpm的培养箱上(INR-200shake incubator，Gallenkamp，Leicester，UK)生长。使用用酵母新鲜划线的平板将第一5ml预培养物接种到试管中。在1000ml摇瓶中使用来自第一预培养物的指数生长细胞来接种第二预培养物。通过在4000rpm下离心5分钟来收获指数期晚期生长细胞，并在具有1.5l的工作体积的2-1

A生物反应器(2-1A bioreactors)(B.Braun Biotech International，Melsungen，Germany)中用作厌氧分批的接种物前用水洗涤。通过在由气体质量流量计(gas mass flow meters)(Bronkhorst HI-TEC，Ruurlo，the Netherlands)控制的0.2l min^-1的流速下喷射含小于5ppm的O₂的氮气(AGA GAS AB，Sundbyberg，Sweden)来达到厌氧条件。通过探针来监测溶解的氧气。通过INNOVA 1313发酵监测器(LumaSense Technologies，Ballerup，Denmark)来监测排气口二氧化碳和氧气。至少以两份生物重复来进行厌氧发酵实验。利用原养型菌株进行菌株的所有生理学鉴定，以用于所有参数的适当比较。

结果

构建菌株TMB 3143(“PGM2-PPP-XYL1(K270R)”)和TMB 3144(“对照-PPP-XYL1(K270R)”)以评估PGM2过表达对重组酿酒酵母菌株木糖利用的影响。PGM2和XYL1(K270R)的整合的拷贝的异源表达分别在组成型启动子截短的HXT7(Hauf，Zimmermann等人.2000)和TDH3p的控制下。

菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)在需氧条件和厌氧条件下都提高了经过木糖利用通路的通量。

在需氧分批发酵中菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)生长在含木糖(50g.l^-1)作为唯一碳源的培养基中，最大指数生长速率(μ^max)为0.180±0.027h^-1，而菌株对照-PPP-XYL1(K270R)具有0.123±0.029h^-1的μ^max(图8)(表15)。对于菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)，最终OD620_nm为48.0±0.5，且对于菌株对照-PPP-XYL1(K270R)，最终OD620_nm为34.9±1.8。且然后最终生物质比菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)高27％(图8)。

菌株对照-PPP-XYL(TMB 3137)和PGM2-PPP-XYL(TMB 3138)也被包括在含木糖(50g l^-1)的培养基上的需氧生长的对比实验中(图8)(表15)。野生型XR在木糖上显示了较低的生长能力。菌株对照-PPP-XYL1的μ^max为0.038±0.014h^-1且菌株PGM2-PPP-XYL具有0.041±0.008h^-1的μ^max(图8)(表15)。

结果显示了在组成型启动子控制下的PGM2和/或XYL1(K270R)的整合提高了在木糖培养基上的生长(图8)(表15)。这一效应在两个基因在同一菌株的基因组中整合时是累加的，在我们的示例中显示于菌株PGM2-PPP-XYL(K270R)(图8)。

在作为唯一碳源的50g.l^-1木糖上进行的厌氧发酵显示了菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)具有与菌株对照-PPP-XYL1(K270R)的生长速率(0.015±0.008h^-1)相比因数为4的提高的生长速率(0.060±0.025h^-1)，(图9)。另外具有组成型表达的PGM2基因的额外拷贝的菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)表现出在木糖上厌氧生长的进一步改善。

菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)的来自木糖的乙醇产量得到提高(表16)。从所检测的乙醇的原始数据中计算乙醇产量/浓度。对于菌株对照-PPP-XYL(K270R)，乙醇产量(g乙醇/g消耗的木糖)为0.33±0.03，且对于菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)为0.37±0.01。对于菌株对照-PPP-XYL1(K270R)的乙醇产量(g乙醇/g产生的生物质)为4.31±0.26，且对于菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)为9.38±1.88。对于菌株对照-PPP-XYL1(K270R)的最终乙醇滴定度为0.90±0.52，且对于菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)为3.17±0.57。

由于所消耗的总木糖的量较高(数据未示出)，菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)具有的木糖醇产量(0.22±0.01)高于菌株对照-PPP-XYL1(K270R)的木糖醇产量(0.08±0.07)(表2)。

菌株对照-PPP-XYL1(K270R)的生物质产量(g生物质/g消耗的木糖)(0.08±0.00)与菌株PGM2-PPP-XYL1(K270R)的生物质产量(0.04±0.01)相比是其二倍。

对于菌株对照-PPP-XYL1(K270R)和PGM2-PPP-XYL1(K270R)，来自木糖的乙酸酯和甘油产量非常相似。乙酸酯产量约为0.01g乙酸酯/g消耗的木糖量级，且甘油产量在0.03到0.04g甘油/g消耗的木糖之间。

表15.在含葡萄糖(20g l^-1)的YNB培养基上预生长的细胞在含木糖(50g l^-1)的YNB培养基上进行的需氧分批培养的最大比生长速率μ^max(h^-1)

菌株	μ_max(h^-1)
		对照-PPP-XYL	0.038±0.014
PGM2-PPP-XYL	0.041±0.008
		对照-PPP-XYL1(K270R)	0.123±0.029
PGM2-PPP-XYL1(K270R)	0.180±0.027

表16.在木糖上进行厌氧生长期间代谢物产生

参考文献

Hahn-

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实施例13

具有基因组整合的在组成型启动子的控制下的PGM2基因的工业木糖消耗菌株的构建

菌株和培养基

本研究所用的酵母菌株和质粒总结于表17中。使用大肠杆菌DH5α(Life Technologies，Rockville，MD，USA)用于亚克隆。所有菌株均在-80℃下贮存于15％甘油中。使大肠杆菌在含100mg.l^-1氨苄青霉素的LB培养基中生长(Sambrook J，Fritch E等人.1989)。将来自冷冻贮存的酵母菌株在含20g l^-1葡萄糖、20g l^-1琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)的YNB培养基(6.7g/l不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基(Difco YeastNitrogen Base)；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)或YPD(10g l^-1酵母提取物，20g l^-1蛋白胨)上划线。当需要时对YPD平板补充浓度为150或200mg l^-1的遗传霉素。利用50mM的邻苯二甲酸氢钾(Merck，Darmstadt，Germany)对含20g.l^-1葡萄糖的液体培养基进行缓冲处理至pH5.5用于需氧培养(Hahn-

Karhumaa等人.2005)。

分子生物学技术

用于克隆和限制性切割的所有酶获自Fermentas(Vilnius，Lithuania)。利用Dream Taq^TM聚合酶(Dream Taq^TM Polymerase)进行分析型PCR，而利用高保真PCR酶(High Fidelity PCR Enzyme)来进行连接、整合或测序前的制备型PCR。

循环纯化试剂盒(Cycle-Pure Kit，Omega Bio-tek Inc，Doraville，GA，USA)对限制性切割或PCR扩增后的DNA产物进行纯化。将凝胶提取试剂盒(

Gel Extraction Kit，Qiagen GmbH，Hilden，Germany)用于从琼脂糖凝胶中提取DNA。用于细菌转化的方法是氯化钙方法(Dagert和Ehrlich 1979)，且通过醋酸锂方法来进行酵母转化(Gietz，Schiestl等人.1995)。引物合成和测序由Eurofins MWG Operon(Ebersberg，Germany)来进行。

结果

质粒构建

以质粒Ylplac 211HXT PGM2(表17)作为模板，并利用引物PGK Sal1和HXT Sal1(表18)对DNA盒HXT7p PGM2 PGK1t进行PCR扩增，引物包括所扩增的DNA盒的末端的限制性位点SalI(图10)。然后利用SalI限制性酶消化HXT7p PGM2 PGK1t的PCR产物。将所得的纯化的DNA片段插入到也已被限制性酶SalI切割的质粒pUG6中，构建了pUG6HXT-PGM2(表17)(图10)。

菌株TMB 3147、TMB 3148和TMB 3149的构建

以质粒pUG6HXT-PGM2(表17)作为模板，并利用引物HIS3p-HXT7pFW和HIS3t-loxP RV(表18)对DNA盒HXT7p PGM2 PGK1t KanMX进行PCR扩增，引物包括与酵母HIS3基因的HIS3启动子和终止子同源的突出端以协助酿酒酵母基因组的HIS3基因座中的DNA盒的整合(图10)。

使用具有HIS3突出端的纯化的DNA盒HXT7p PGM2 PGK1t KanMX来转化酿酒酵母菌株TMB 3400、TMB 3500和TMB 3500XR/XDH/XK，分别得到菌株TMB 3147、TMB 3148和TMB 3149(图10)。

在含遗传霉素的YPD平板上选择转化体。首先通过PCR扩增且然后通过利用校正读码DNA聚合酶(proofreading DNA polymerase)从所提取的基因组DNA中PCR扩增的染色体整合的基因的测序来确认阳性转化体。

参考文献

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实施例14

通过随机诱变生成突变体XR和厌氧生长的选择

菌株和培养条件

本研究所用的酿酒酵母菌株和质粒总结于表19中。使大肠杆菌在含100mg.l^-1氨苄青霉素的液体或固体(15g/L琼脂)LB培养基中生长(Sambrook J，Fritch E等人.1989)。在固体培养基上使酿酒酵母在补充20g/L葡萄糖或60g/L木糖的YNB平板(6.7g/l不含氨基酸的酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base))上生长。使用确定成分的矿物培养基用于酿酒酵母的液体培养，且其由以下组成：木糖60g/L(除另指明外)；矿物盐((NH4)₂5O₄，5g/L；KH₂PO4，3g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L)；吐温800.4g l^-1；麦角固醇0.01g l^-1(Andreasen和Stier 1953)；维生素和痕量元素(Verduyn等人.1992)。将相同的培养基用于预培养和仪表化的生物反应器中的分批发酵，不同的是在前一种情况下添加pH5.5的邻苯二甲酸钾作为缓冲剂(Hahn-

等人2005)。利用2L工作体积在仪表化的生物反应器中进行分批培养。如前所述制备培养基并将消泡剂(Dow Corning，Midland，USA)以0.25mL/L的终浓度添加到反应器中。将温度维持在30℃且通过添加3M KOH而将pH控制在5.5。在需氧生长期间，将搅动速率设置到900rpm且以1L/min将空气喷入培养基。在厌氧培养期间，将搅动速率降低至200rpm并通过以0.2L/min喷入氮气来维持厌氧条件。通过INNOVA 1313发酵监测器((LumaSense Technologies，Ballerup，Denmark)来联机检测CO₂产生。对培养物进行取样以用于HPLC(高效液相色谱)、OD_620nm和细胞干重测量。

文库构建

通过易错PCR和用于全质粒合成的MEGAWHOP策略来生成树干毕赤酵母XYL1的随机文库(Miyazaki和Takenouchi 2002)。构建引物以扩增集中于XYL1的活性位点的+631bp-+870bp之间的区域。根据生产商的说明利用MutazymeII聚合酶(Stratagene，Cedar Creek，TX，USA)进行易错PCR。通过优化模板DNA的量来将PCR反应的突变频率设置到1.5-2核苷酸/扩增子并通过对7-10个转化体测序来验证错误分布。易错PCR之后，扩增的DNA利用E.Z.N.A循环-纯化试剂盒(Omega Bio-tek，Doraville，GA，USA)来纯化并用作重新构建模板质粒的“大引物(megaprimer)”。利用YIpOB8作为模板(表19)如前所述(Miyazaki和Takenouchi 2002)进行全质粒PCR。使用了以下浓度的试剂(在50μL中)：5μL10％pfu缓冲液、0.25mM dNTP、300ng模板质粒、250ng大引物和2.5U天然Pfu DNA聚合酶(Fermentas，Vilnius，Lithuania)。循环参数为：95℃2分钟；95℃30秒、60℃30秒、68℃2分钟/kb的15-17个循环；68℃7分钟。PCR之后，通过添加1μL FastDigest DpnI(Fermentas，Vilnius，Lithuania)并在37℃下孵育1小时消化模板DNA。重新构建的突变的质粒通过异丙醇沉淀来浓缩并用于转化大肠杆菌。利用80μL Electro-10Blue感受态细胞(Stratagene，Cedar Creek，TX，USA)和电穿孔(17kV/cm，200Ω，25μF)在0.1cm样品杯中进行转化(Dower等人.1988)。通过将少量的适当稀释的细胞铺在LB氨苄青霉素(100mg/L)平板上来测定文库的大小。将剩余的转化的细胞接种到2×250mL液体LB氨苄青霉素(100mg/L)培养基中并使其在30℃下过夜生长。将所得的大肠杆菌文库贮存在-80℃下的15％的甘油贮存液中，且利用QIAfilter质粒兆量试剂盒(QIAfilter Plasmid Mega Kit，Qiagen，Hilden，Germany)来收获质粒DNA。使用突变的质粒文库用于酿酒酵母菌株TMB 3044(表19)的大规模转化。利用EcoRV对突变的质粒文库进行线性化以用于整合型转化。

酿酒酵母XYL1文库的选择

TMB 3044(表19)的大规模转化后，将细胞接种在仪表化的生物反应器中以用于需氧条件期间液体矿物培养基(葡萄糖5g/L和木糖55g/L)中的选择。在约48小时之后，细胞生长达到～OD_620nm＝40且完成了转化的酿酒酵母文库的起始选择。为选择携带有益的XYL1突变的酿酒酵母转化体，将条件改变为厌氧生活，并泵出95％的培养基并用新鲜培养基(木糖60g/L)来替换。在厌氧选择过程中，通过CO₂产生速率、光密度(OD_620nm)和YNB-木糖平板上的需氧生长和厌氧生长来监测细胞生长。当通过CO₂产生速率所监测，反应器中的底物已被消耗时，将95％的培养基泵出并用新鲜培养基来替代。

通过严格厌氧条件下的10次连续的分批培养，已分离了具有同样的突变的XYL1基因的等基因群体。突变的XYL1序列(表20)含有接近先前所鉴定的K270R突变(参考实施例4、5、6、7)(Bengtsson等人.2009)的三个核苷酸点突变。在木糖作为唯一碳源的厌氧分批培养期间，突变的XYL1基因充分增加了厌氧生长和乙醇生产率(图11)。与具有先前最高的乙醇生产率和生长速率的含有XR K270R的菌株(参考实施例4、5、6、7)(Runquist等人.2009)相比，厌氧生长速率提高了三倍(图11)。因此现在的菌株是到目前为止可用于从木糖进行乙醇生产的最佳菌株。

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表19.实施例14中所用的酿酒酵母和质粒