BRPI0813710B1 - método de identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-coa no citosol de uma célula de levedura, vetor para a expressão de polipeptídeos heterólogos em levedura, célula de levedura recombinante e método de produzir um produto de fermentação - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO DE IDENTIFICAR UM POLIPEPTÍDEO HETERÓLOGO TENDO ATIVIDADE ENZIMÁTICA PARA CONVERTER PIRUVATO, ACETALDEÍDO OU ACETATO EM ACETIL-COA NO CITOSOL DE UMA CÉLULA DE LEVEDURA, VETOR PARA A EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS HETERÓLOGOS EM LEVEDURA, CÉLULA DE LEVEDURA RECOMBINANTE E MÉTODO DE PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO (51) lnt.CI.: C12N 15/81; C12P 7/16 (30) Prioridade Unionista: 19/02/2008 EP 08101747.7, 19/02/2008 US 61/064,120, 21/12/2007 EP 07123976.8, 23/07/2007 EP 07112956.3, 23/07/2007 US 60/935,031 (73) Titular(es): DSM IP ASSETS B.V.

(72) Inventor(es): ULRIKE MARIA MÜLLER; LIANG WU; LOURINA MADELEINE RAAMSDONK; AARON ADRIAAN WINKLER (85) Data do Início da Fase Nacional: 22/01/2010

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MÉTODO DE IDENTIFICAR UM POLIPEPTÍDEO HETERÓLOGO TENDO ATIVIDADE ENZIMÁTICA PARA CONVERTER PIRUVATO, ACETALDEÍDO

OU ACETATO EM ACETIL-COA NO CITOSOL DE UMA CÉLULA DE LEVEDURA, VETOR PARA A EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS

HETERÓLOGOS EM LEVEDURA, CÉLULA DE LEVEDURA RECOMBINANTE E MÉTODO DE PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção está no campo de produção de metabólitos em levedura utilizando sistemas de expressão heterólogos. Em particular, a presente invenção refere-se à engenharia metabólica de cepas de levedura capazes de produzir metabólitos que exigem acetil-CoA citosólico como precursor, como cepas de levedura que produzem butanol. A presente invenção refere-se a um sistema de ensaio para identificar enzimas heterólogas capazes de converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA citosólico quando expresso no citosol em levedura.

Antecedentes da Invenção

Acetil-coenzima A (CoA) é um intermediário essencial em inúmeras vias metabólicas, e é um precursor fundamental na síntese de muitos compostos relevantes industriais, como ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, aminoácidos, lipídeos, ésteres de cera, (poli)sacarídeos poliidroxi alcanoatos, estatinas, policetídios e ésteres acéticos (como acetato de etila e acetato de isoamila). Em particular, acetil-CoA também é o precursor do produto químico a granel industrialmente importante 1-butanol.

Em comparação com bactérias, como E. coli, células de levedura fornecem uma alternativa muito

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2/52 apropriada para produzir os produtos derivados de acetilCoA acima mencionados, em que levedura não é suscetível a fagos ou outra infecção uma vez que os produtos baseados em levedura podem ser feitos em pH baixo. Portanto, o uso de levedura não requer um processo estéril, desse modo reduzindo o preço de custo do produto de interesse.

Quando levedura natural (tipo selvagem) não é capaz de produzir o produto derivado de acetil-CoA de interesse, o uso de engenharia metabólica pode fornecer células de levedura que expressam genes heterólogos que podem suportar tal processo. Em tais casos, os produtos de gene heterólogo são normalmente direcionados para o compartimento citosólico de levedura. Como a biossíntese de produto derivado de acetil-CoA ocorrerá total ou parcialmente no citosol, o fornecimento de quantidades suficientes do precursor acetil-CoA no compartimento citosólico é crucial. Em Saccharomyces cerevisiae, a biossíntese de acetil-CoA ocorre em dois compartimentos separados. Em mitocôndria, acetil-CoA é sintetizado por decarboxilação oxidativa de piruvato catalisado pelo complexo de desidrogenase de piruvato (PDH), com a seguinte estequiometria de reação geral:

Piruvato (Pyr) + CoA + NAD⁺ = acetil-CoA + CO2 +

NADH + H⁺

Em citosol, acetil-CoA é sintetizado através do by-pass de desidrogenase de piruvato (PDH), envolvendo as enzimas descarboxilase de piruvato (PDC), desidrogenase de acetaldeído (ALD), e sintetase de acetil-CoA (ACS), com a seguinte estequiometria de reação geral:

Pyr + CoA + ATP + NAD(P)⁺ = acetil-CoA + CO₂ +

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NAD(P)H + AMP + PPi + H⁺.

Mutante de descarboxilase de piruvato negativo(Pdc-) da levedura S. cerevisiae não tem um by-pass PDH funcional, e não pode crescer em meio mínimo com glicose como a única fonte de carbono devido à incapacidade de fornecer acetil-CoA (suficiente) para crescimento (Flikweert e outros, (1996) Yeast 12:247-57). 0 by-pass de PDH é, portanto essencial na provisão de acetil-CoA no compartimento citosólico. Entretanto, o by-pass de PDH em levedura não é ótimo com relação ao equilíbrio de energia, como pode ser visto a partir da estequiometria de reação geral: 2 mols de ATP são necessários por acetil-CoA sintetizado através de by-pass de PDH uma vez que a reação de sintetase de acetil-CoA ATP é hidrolisada em AMP. Ao contrário, a via mitocondrial através de PDH não requer ATP. A exigência adicional de ATP do by-pass de PDH pode apresentar um problema para sintetizar o produto de interesse a partir do precursor de acetil-CoA citosólico, visto que mais fonte de carbono necessita ser desviada para geração de ATP, através, por exemplo, de fosforilação oxidativa e/ou fosforilação de substrato (por exemplo, glicólise), desse modo diminuindo o rendimento geral do produto em carbono.

Quando levedura é construída metabolicamente para produzirl-butanol, genes biossintéticos heterólogos de 1butanol podem ser expressos no citosol em células de levedura (WO 2007/041269). Em geral 1 mol de glicose origina 2 mols de acetil-CoA através de glicólise, que é o precursor de 1 mol de butanol; consequentemente um máximo de 1 mol de butanol pode ser sintetizado por mol de glicose

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4/52 se crescimento e manutenção de célula não forem considerados. Entretanto, quando o by-pass de PDH é utilizado em combinação com biossíntese de butanol, esse rendimento teórico máximo não pode ser obtido devido a desequilibro de energia; ao passo que 2 rnols de ATP são gerados por mol de glicose convertida em glicólise, um total de 4 rnols (2 vezes 2 mol) de ATP é necessário no bypass de PDH para formar 2 rnols de acetil-CoA, que são convertidos em 1 mol de butanol. Desse modo, há uma falta líquida de ATP se o by-pass de PDH fosse utilizado para sintetizar 1 mol de 1-butanol a partir de 1 mol de glicose.

Desse modo, há necessidade de identificação de rotas metabólicas alternativas possíveis para produzir acetil-CoA citosólico em levedura, para a produção de produtos derivados de acetil-CoA, em particular butanol, onde o by-pass de PDH não é exigido.

Butanol é um produto químico industrial importante e é apropriado como um combustível alternativo de motor tendo propriedades aperfeiçoadas em relação a etanol. Butanol também encontra uso como solvente para uma ampla variedade de processos químico e têxtil. Na síntese orgânica de plásticos, como intermediário químico e como solvente no revestimento e indústria de aromatizante e alimentos. Butanol pode ser produzido a partir de biomassa (biobutanol) bem como combustíveis fósseis (petrobutanol).

A síntese química de butanol em um de seus isômeros pode ser realizada por uma variedade de métodos disponíveis conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^a edição,

2003, Wiley-VCHVerlag GmbH e Co., Weinheim, Alemanha, vol.

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5, pág. 716-719). Esses processos têm a desvantagem de que são baseados no uso de derivados petroquímicos, são genericamente caros e não são favoráveis ao meio ambiente.

A síntese biológica de butanoi pode ser obtida 5 por fermentação utilizando o processo acetona-butanoletanol (ABE) realizado pela bactéria Clostridium acetobutylicum ou outra espécie de Clostridium. Uma desvantagem importante do processo ABE, entretanto, é que resulta em uma mistura de acetona, 1-butanol e etanol. Além disso, o uso de bactérias requer condições de processo estéreis e genericamente torna o processo suscetível à infecção por bacteriófagos. Células de leveduras fornecem, desse modo, uma alternativa muito apropriada como descrito acima.

Sumário da Invenção

Os presentes inventores identificaram agora rotas metabólicas alternativas para aumentar a produção de acetil-CoA citosólico em levedura que podem superar os problemas do by-pass de PDH.

Uma rota possível inclui a conversão direta de acetaldeído em acetil-CoA sem consumo de ATP, pelo uso de uma desidrogenase de acetaldeído de acetilação (E.C.1.2.1.10) (vide a figura 2, reação A, ACDH). Outra rota inclui a conversão direta de piruvato em acetil-CoA por uma enzima ou um complexo de multi-enzimas sem consumo de ATP, por exemplo, pelo uso de um piruvato: oxidorreductase de NADP (E.C. 1.2.1.51)vide a figura 2, reação C, (PNO). Nessas duas rotas possíveis, a formação de 1 mol de butanoi por mol de glicose resultaria na formação de 2 mols de ATP. Ainda outra rota inclui a conversão de

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6/52 acetato em acetil-CoA com 1 ATP consumido por acetil-CoA formado por uma enzima alternativa ou uma combinação de enzimas, por exemplo, pelo uso de acetato: CoA ligase (formação de ADP, E.C. 6.2.1.13), ou pelo uso de

ATP:fosfotransferase de acetato (E.C. 2.7.2.1) em combinação com acetil-CoA:Pi acetil transferase (E.C.2.3.1.8). Nessa rota, a formação de 1 mol de butanol por mol de glicose é equilibrado em ATP, isto é, nenhum ATP será formado. Os presentes inventores verificaram agora que tal alternativa ao by-pass de PDH pode resultar em síntese de acetil-CoA no citosol da levedura, e que tal acetil-CoA pode ser utilizado de forma biossintética para produzir quantidades mais elevadas de produtos de fermentação desejáveis, como butanol.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um método de identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA em (no citosol de) uma célula de levedura compreendendo:

- fornecer uma célula de levedura mudada, em que a mutação compreende uma inativação de pelo menos um gene do by-pass (PDH), selecionado dos genes que codificam as enzimas descarboxilase de piruvato (PDC), desidrogenase de acetaldeído (ALD), e sintetase de acetil-CoA (ACS);

- transformar a célula de levedura mudada com um vetor de expressão que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo heterólogo operavelmente ligada a um promotor funcional em levedura e pelo menos uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos um polipeptídeo candidato tendo atividade enzimática potencial

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7/52 para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetilCoA;

- testar a célula de levedura mudada recombinante em relação a sua capacidade para crescer em meio mínimo 5 contendo glicose como fonte de carbono única, e identificar o candidato polipeptídeo como polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído, ou acetato em acetil-CoA na (citosol de) célula de levedura quando crescimento da célula é observado.

Em uma modalidade preferida do método a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de nucleotídeo heterólogo é otimizada em códon (par) para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

Em outra modalidade preferida, a mutação compreende uma inativação do gene para isoforma de sintetase de acetil-CoA 2 (acs2).

Em outra modalidade preferida, pelo menos um polipeptídeo candidato tendo atividade enzimática para converter acetaldeído em acetil-CoA é uma desidrogenase de acetaldeído de acetilação (putativa).

Alternativamente, pelo menos um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA em (citosol de) uma célula de levedura pode consistir em duas ou mais enzimas que trabalham juntas para obter a conversão desejada de piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um vetor de integração para a integração em um genoma de levedura de uma sequência de nucleotídeo heterólogo que

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8/52 codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA, e a expressão subsequente do polipeptídeo heterólogo a partir do mesmo.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um vetor de expressão que expressa polipeptídeos heterólogos em levedura, o vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo heterólogo operativamente ligado a um promotor funcional em levedura e a sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA na (citosol de) célula de levedura.

Em uma modalidade preferida do vetor o polipeptídeo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA é identificado por um método de acordo com a presente invenção como descrito acima.

Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo é selecionado da SEQ ID NO: 19, 22, 25, 28, e 52 e homólogos funcionais do mesmo.

Em outra modalidade preferida, o vetor de expressão é para expressão em Saccharomyces cerevisiae, em que a sequência de nucleotídeo heterólogo é otimizada em códon (par) para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

Em outra modalidade preferida, a sequência de nucleotídeos heterólogos é selecionada da SEQ ID NO: 20, 23, 26 e 29.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma 30 célula de levedura recombinante que compreende o vetor de

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9/52 expressão da presente invenção como descrito acima.

Em uma modalidade preferida, a célula de levedura recombinante compreende ainda uma inativação de pelo menos um gene do by-pass (PDH), selecionado dos genes que codificam as enzimas descarboxilase de piruvato (PDC), desidrogenase de acetaldeído (ALD) e sintetase de acetilCoA (ACS).

Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo com a presente invenção compreende uma inativação de um gene que codifica uma sintase de acetil-CoA.

Em outra modalidade preferida, a célula de levedura recombinante compreende ainda uma inativação de um gene (sequência de nucleotídeo) que codifica uma enzima capaz de catalisar a conversão de acetaldeído em etanol, preferivelmente um gene que codifica um desidrogenase de álcool.

Como utilizado aqui, a inativação de um gene (sequência de nucleotídeo) que codifica uma enzima pode ser obtida por mutação, deleção ou ruptura de (parte de) um gene ou sequência de nucleotídeos codificando uma enzima.

Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo com a presente invenção mostra crescimento em meio mínimo contendo glicose como fonte de carbono único.

Em outra modalidade preferida de uma célula de 25 levedura da invenção, a célula de levedura compreende ainda um ou mais genes introduzidos que codificam uma via recombinante para a formação de 1-butanol a partir de acetil-CoA citosólico. Vias recombinantes apropriadas de acetil-CoA para 1-butanol são conhecidas na técnica. Tais vias são, por exemplo, conhecidas de WO 2007/041269.

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Preferivelmente um ou mais genes introduzidos codificam enzimas que produzem acetoacetil-CoA, 3-hidróxi butirilCoA, crotonil-CoA, butiril-CoA, butilaldeído e/ou 1butanol. As enzimas podem ser:

-acetil-CoA acetil transferase (E.C. 2.3.1.9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]; embora, enzimas com uma faixa de substrato maior (E.C. 2.3.1.16) sejam funcionais também), que converte 2 mols de acetil-CoA em acetoacetil-CoA;

- 3-hidróxi butiril-CoA desidrogenase dependente de NADH ou dependente de NADPH E.C. 1.1.1.35 ou E.C. 1.1.1.30, resp. E.C. 1.1.1.157 ou E.C. 1.1.1.36), que converte acetoacetil-CoA em 3-hidróxi butiril-CoA;

3-hidróxi butiril-CoA desidratase (também denominado crotonase; E.C. 4.2.1.17 ou E.C. 4.2.1.55), que converte 3-hidróxi butiril-CoA em crotonil-CoA;

- Desidrogenase de butiril-CoA dependente de NADH ou dependente de NADPH (E.C. 1.3.1.44 resp. E.C. 1.3.1.38 ou E.C. 1.3.99.2), que converte crotonil-CoA em butirilCoA;

- desidrogenase de aldeído dependente de NADH ou dependente de NADPH monofuncional (E.C. 1.2.1.10, ou 1.2.1.57) que converte butiril-CoA em butiraldeído, e

- Desidrogenase de butanol dependente de NADH ou dependente de NADPH (E.C. 1.1.1-), que converte butilaldeído em 1-butanol, ou

- desidrogenase de álcool/aldeído dependente de NADH ou dependente de NADPH bifuncional (E.C. 1.1.1.1/1.2.1.10), que converte butiril-CoA em 1-butanol através de butiraldeído.

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Em outra modalidade preferida da invenção uma célula de levedura é uma Saccharomyces cerevisiae.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método de produzir butanol, compreendendo as etapas de fermentar um substrato de carbono apropriado com uma célula de levedura de acordo com a presente invenção e recuperar o butanol produzido durante a fermentação.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é uma apresentação esquemática do by10 pass de PDH que mostra as enzimas descarboxilase de piruvato (PDC; E.C. 4.1.1.1), desidrogenase de acetaldeído (ALD; E.C. 1.2.1.3, E.C. 1.2.1.4 e E.C. 1.2.1.5) e sintetase de acetil-CoA (ACS; E.C. 6.2.1.1).

A figura 2 mostra uma rota metabólica esquemática para produção de butanol em Saccharomyces cerevisiae. As reações 1-6 são as etapas de biossíntese de butanol a partir de Clostridium acetobutylicum introduzido em levedura. A, B e C indicam reações alternativas para biossíntese de acetil-CoA no citosol. B indica parte do by20 pass de desidrogenase de piruvato (pdc, ald e acs), a fonte natural de acetil-CoA citosólico em levedura. Glc, glicose; EtOH, etanol; Pyr, piruvato; AA, acetaldeído; ACT, acetato; AcCoA,acetil-CoA; AACoA, acetoacetil-CoA; BuCoA, butirilCoA; Bual, butilaldeído; BuOH, butanol; NAD(P)(H), dinucleotídeo de adenina nicotinamida (fosfato) (em forma reduzida); ATP, trifosfato de adenosina; AMP, monofosfato de adenosina; ciclo TCA, ciclo de ácido tricarboxílico; PDH, desidrogenase de piruvato; pdc, descarboxilase de piruvato; adh, desidrogenase de álcool; acdh, desidrogenase de acetaldeído de acetilação; ald, desidrogenase de

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12/52 de acetil-CoA; pno, Conversões enzimáticas acetaldeído; piruvato:NADP acs, sintetase oxidorreductase.

indicadas por reação 1-6 indicam uma via de butanol heteróloga de Clostridium acetobutylicum: thlB (ou ThL) que codifica acetil-CoA acetil transferase ou tiolase [E.C. 2.3.1.9] (SEQ ID NO: 30); hbd, 3-hidróxi butiril-CoA desidrogenase [E.C. 1.1.1.157] (SEQ ID NO: 31); crt, 3hidróxi-butiril-CoA desidratase [E.C. 4.2.1.55] (SEQ ID NO: 32); ter, trans-enoíl CoA reductase; bcd, butiril-CoA desidrogenase [E.C.1.3.99.2] (SEQ ID NO: 33); elf αβ, flavoproteína de transferência de elétrons heterodimérica (etf α e etf β, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39, respectivamente); adhE/adhEl, desidrogenase de álcool/aldeído E e El [E.C. 1.1.1.1/1.2.1.10] (SEQ ID NO:

34 e 35, respectivamente); bdhA/bdhB, desidrogenase de butanol dependente de NAD(P)H A e B [E.C.1.1.1-] (SEQ ID NO: 36 e 37, respectivamente).

A figura 3 mostra o mapa de plasmídeo YEplacll2PtdhTadh. A sequência desse plasmídeo é fornecida na SEQ ID NO: 40.

A figura 4 mostra um exemplo de uma árvore de similaridade baseada em seqüências de aminoácidos de proteínas dos tipos 1 a 4, como descrito no exemplo 2 e indica as ramificações.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

O termo butanol se refere a n-butanol, ou 1butanol.

O termo levedura se refere a um grupo 30 filogeneticamente diverso de fungos de célula única, a

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13/52 maior parte do qual está na divisão de Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras de germinação (leveduras verdadeiras) são classificadas na ordem Saccharomycetales, com Saccharomyces cerivisiae como a espécie mais bem conhecida.

termo levedura recombinante, como utilizado aqui, é definido como uma célula que contém uma sequência de nucleotideo e/ou proteína, ou é transformada geneticamente modificada com uma sequência de nucleotideo que não ocorre naturalmente na levedura, ou contém cópia ou cópias adicional(is) de uma sequência de ácido nucléico endógena (ou proteína), ou contém mutação, deleção ou interrupção de uma sequência de ácido nucléico endógena.

O termo mutado, como utilizado aqui, em relação a proteínas ou polipeptídeos significa que pelo menos um aminoácido no tipo selvagem ou sequência de polipeptídeo ou proteína de ocorrência natural foi substituído com um aminoácido diferente, ou deletado da sequência através de mutagênese de ácidos nucléicos que codificam esses aminoácidos. Mutagênese é um método bem conhecido na técnica e inclui, por exemplo, metagênese dirigida ao local por intermédio de PCR ou através de mutagênese mediada por oligonucleotídeos como descrito em Sambrook e outros, Molecular-Cloning A Laboratory Manual, 2^a edição, vol. 1-3 (1989) . O termo mutado como utilizado aqui em relação a genes significa que pelo menos um nucleotideo na sequência de nucleotídeos daquele gene, ou uma sequência reguladora do mesmo, foi substituído com um nucleotideo diferente, ou foi deletado da sequência através de mutagênese, resultando na transcrição de uma sequência de proteína não funcional

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14/52 ou o nocaute daquele gene.

termo gene, como utilizado aqui, se refere a uma sequência de ácidos nucléicos que contém um gabarito para uma polimerase de ácido nucléico, em eucariotes, polimerase de RNA II. Os genes são transcritos em mRNAs que são então traduzidos em proteína.

termo by-pass de desidrogenase de piruvato (PDH) se refere à cascata enzimática de piruvato em acetilCoA no citosol de levedura, e que consiste nas seguintes enzimas: descarboxilase de piruvato (PDC; E.C. 4.1.1.1) convertendo piruvato em acetaldeído; desidrogenase de acetaldeído (ALD; E.C. 1.2.1.3, E.C. 1.2.1.4 e E.C. 1.2.1.5), convertendo acetaldeído em acetato; e sintetase de acetil-CoA (ACS; E.C. 6.2.1.1), convertendo acetato em acetil-CoA.

O termo ácido nucléico como utilizado aqui inclui referência a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, isto é, um polinucleotídeo, em forma de fita única ou dupla, e a menos que limitado de outro modo, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais em que hibridizam em ácidos nucléicos de fita única em um modo similar a nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo). Um polinucleotídeo pode ser de comprimento total ou uma subseqüência de um gene regulador ou estrutural nativo ou heterólogo. A menos que de outro modo indicado, o termo inclui referência à sequência especificada bem como a sequência complementar do mesmo. Desse modo, DNAs ou RNAs com espinhas dorsais modificadas para estabilidade ou por outros motivos são polinucleotídeos como aquele termo é

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15/52 pretendido aqui. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, como inosina, ou bases modificadas, como bases tritiladas, citando apenas dois exemplos, são polinucleotídeos como o termo é utilizado aqui. Será reconhecido que uma grande variedade de modificações foi feita em DNA e RNA que servem a muitas finalidades úteis conhecidas por aqueles versados na técnica. 0 termo polinucleotídeo conforme empregado aqui abrange tais formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, bem como as formas químicas de DNA e RNA característicos de vírus e células, incluindo entre outras coisas, células simples e complexas.

Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são utilizados de forma intercambiável aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados em uma proteína, aquela proteína é especificamente reativa a anticorpos eliciados para a mesma proteína, porém consistindo totalmente de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são também inclusivos de modificações incluindo, porém não limitadas a glicosilação, fixação de lipídeo, sulfatação, gamacarboxilação de resíduos de ácidos glutâmicos, hidroxilação e ADP-ribosilação.

Identidade de sequência é definida aqui como uma

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16/52 relação entre duas ou mais seqüências de aminoácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais seqüências de ácido nucléico (polinucleotídeo), como determinado por comparar as seqüências. Normalmente, as identidades de sequência são comparadas através do comprimento inteiro das seqüências comparadas. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre seqüências de aminoácidos ou ácidos nucléicos, conforme o caso, como determinado pelo casamento entre cadeias de tais seqüências.

Métodos preferidos para determinar identidade são projetados para fornecer o maior casamento entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador preferidos para determinar identidade e similaridade entre duas seqüências incluem BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F.e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), publicamente disponível a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S.

e outros, NCBI NLM NIH Bethdas, MD 20894) . Parâmetros preferidos para comparação de seqüências de aminoácidos utilizando BLASTP são gap aberto 11.0, gap extend 1, matriz de Blosum 62.

Toda sequência de ácidos nucléicos da presente invenção que codifica um polipeptídeo também, por referência ao código genético, descreve toda variação silenciosa possível do ácido nucléico. O termo variantes modificadas de forma conservativa se aplica as seqüências tanto de aminoácido como ácido nucléico. Com relação a seqüências de ácido nucléico específicas, variantes

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11/52 modificadas de forma conservativa se refere àqueles ácidos nucléicos que codificam variantes modificadas de forma conservativa ou idênticas das seqüências de aminoácidos devido à degeneração do código genético. 0 termo degeneração do código genético se refere ao fato de que um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são variações silenciosas e representam uma espécie de variação modificada de forma conservativa.

Expressão se refere à transcrição de um gene em

RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou RNA mensageiro (mRNA) com tradução subsequente em uma proteína.

Como utilizado aqui, heterólogo em referência a um ácido nucléico ou proteína é um ácido nucléico ou proteína que origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa na composição e/ou local genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual o gene estrutural foi derivado, ou, se da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode originar-se de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma original por intervenção humana deliberada.

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Como utilizado aqui promotor é uma sequência de DNA que dirige a transcrição de um gene (estrutural) . Tipicamente, um promotor é localizado na região-5' de um gene, próximo ao sítio de início de transcrição de um gene (estrutural). Seqüências promotoras podem ser constitutivas, induzíveis ou repressíveis. Se um promotor for um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução.

termo vetor conforme aqui utilizado, inclui 10 referência a um vetor de expressão autossomal e a um vetor de integração utilizado para integração no cromossomo.

O termo vetor de expressão se refere a uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um segmento codificando um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é, operavelmente ligado a) segmentos de ácido nucléico, adicionais, que fornecem sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir seqüências, promotora e terminadora, e podem incluir opcionalmente uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação, e similar. Vetores de expressão são genericamente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. Em particular um vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende na direção 5' para 3' e operavelmente ligado: (a) uma região de iniciação de translação e transcrição reconhecida por levedura, (b) uma sequência de codificação para um polipeptídeo de interesse, e (c) uma região de terminação de translação e transcrição reconhecida por levedura. Plasmídeo se refere ao DNA extra, cromossômico

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19/52 de replicação autônoma que não é integrado no genoma de um microorganismo e é normalmente de natureza circular.

Um vetor de integração se refere a uma molécula de DNA, linear ou circular, que pode ser incorporado no genoma de um microorganismo e provê herança estável de um gene que codifica um polipeptídeo de interesse. 0 vetor de integração compreende genericamente um ou mais segmentos compreendendo uma sequência de gene que codifica um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é operavelmente ligado a) segmentos de ácido nucléico, adicionais, que fornecem sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir seqüências promotoras e terminadoras, e um ou mais segmentos que acionam a incorporação do gene de interesse no genoma da célula alvo, normalmente pelo processo de recombinação homóloga. Tipicamente, o vetor de integração será um que pode ser transferido para a célula alvo, porém que tem um replicon que é não funcional naquele organismo. A integração do segmento compreendendo o gene de interesse pode ser selecionada se um marcador apropriado for incluído naquele segmento.

Como utilizado aqui, o termo operavelmente ligado se refere a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite aos mesmos funcionarem em seu modo pretendido. Uma sequência de controle operavelmente ligado a outra sequência de controle e/ou a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que a transcrição e/ou expressão da sequência de codificação é obtida sob condições compatíveis com a sequência de controle. Genericamente, operavelmente ligado

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20/52 significa que as seqüências de ácido nucléico sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

Por célula hospedeira se quer dizer uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor. Células hospedeiras podem ser células procarióticas como E. coli, ou células eucarióticas como células de levedura, inseto, anfíbio, ou de mamífero.

Preferivelmente, células hospedeiras são células da ordem de Actinomycetates, mais preferivelmente células de levedura, mais preferivelmente células de Saccharomyces cerevisiae.

Transformação e transformar, como utilizado aqui, se referem à inserção de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método utilizado para a inserção, por exemplo, absorção direta, transdução, f-mating ou eletroporação. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma de células hospedeiras.

O termo oligonucleotídeo se refere a uma sequência curta de monômeros de nucleotídeos (normalmente 6 a 100 nucleotídeos) unidos por ligações fosforosas (por exemplo, fosfodiéster, alquil e aril-fosfato, fosforotioato, fosfotiéster), ou ligações não fosforosas (por exemplo, peptídeo, sulfamato e outros). Um oligonucleotídeo pode conter nucleotídeos modificados tendo bases modificadas (por exemplo, 5-metil citosina) e grupos de açúcar modificados (por exemplo, 2'-O-metil ribosila,

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2'-0-metóxi etil ribosila, 2'-flúor ribosila, 2'-amino ribosila, e similar). Oligonucleotídeos podem ser moléculas de ocorrência natural ou sintética de DNA de fita dupla e única e RNA de fita dupla e única com formatos circular, ramificado ou linear e incluindo, opcionalmente, domínios capazes de formar estruturas secundárias estáveis (por exemplo, estruturas de stem-and-loop e loop-stem-loop).

termo polinucleotídeo como utilizado aqui se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Desse modo, esse termo inclui RNA e DNA de perda dupla e única.

O termo polinucleotídeo recombinante como utilizado aqui quer dizer um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, semi-sintética ou sintética que, em virtude de sua origem ou manipulação: (1) não é associado a todo ou uma porção de um polinucleotídeo com o qual é associado em natureza, ou (2) é ligado a um polinucleotídeo diferente daquele ao qual é ligado em natureza; ou (3) não ocorre na natureza.

O termo meio mínimo como utilizado aqui se refere a um meio quimicamente definido, que inclui somente os nutrientes que são necessários pelas células para sobreviver e proliferar em cultura. Tipicamente, o meio mínimo é livre de extratos biológicos, por exemplo, fatores de crescimento, soro, extrato pituitário, ou outras substâncias, que não são necessárias para suportar a sobrevivência e proliferação de uma população de célula em cultura. Por exemplo, o meio mínimo inclui genericamente como substâncias essenciais: pelo menos uma fonte de

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22/52 carbono, como glicose; pelo menos uma fonte de nitrogênio, como amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou uréia; sais inorgânicos, como hidrogenfosfato de dipotássio, fosfato-diidrogênio de potássio e sulfato de magnésio; e outros nutrientes, com biotina e vitaminas.

Descrição das Modalidades Preferidas

Um método da presente invenção provê um método para identificar enzimas heterólogas capazes de produzir acetil-CoA no citosol de uma célula de levedura. A enzima heteróloga pode produzir o acetil-CoA utilizando piruvato, acetaldeído ou acetato como substrato, preferivelmente em uma etapa de conversão única. Preferivelmente, a enzima heteróloga produz o acetil-CoA a partir de acetaldeído. Uma enzima capaz de catalisar a reação é desidrogenase de acetaldeído de acetilação (acdh; E.C. 1.2.1.10) também mencionado como acetaldeído:NAD+ oxidorreductase (CoAacetilação). A conversão de acetaldeído em acetil-CoA por desidrogenase de acetaldeído de acetilação é reversível e opera na direção de acetil-CoA quando acetaldeído acumula no citosol. Tal acúmulo pode ser, por exemplo, obtido por deleção de desidrogenase de álcool (adh, E.C.1.1.1.1).

A enzima heteróloga pode produzir também o acetil-CoA de piruvato. Uma enzima capaz de catalisar a reação é um piruvato:NADP oxidorreductase (pno; E.C.

1.2.1.51). A reação é estequiometricamente idêntica ao desidrogenase de piruvato mitocondrial exceto que pno utiliza NADPH como co-fator em comparação com PDH que utiliza NADH. Em comparação com acdh, uma desvantagem importante do sistema de enzima pno é que pno é sensível a oxigênio, e que é uma enzima multimérica grande, e

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23/52 consequentemente, sua incorporação genética bem sucedida (um gene de 5-6 kb) é muito mais difícil do que aquela de acdh. Por esse motivo, o uso de acdh é preferido em modalidades da presente invenção.

Uma característica importante de uma célula de teste capaz de revelar a atividade enzimática desejada de um polipetídeo de teste é que a célula é prototrófica como resultado do polipeptídeo introduzido. Com isso, se quer dizer que as exigências nutricionais da célula não excedem aquelas da cepa do tipo selvagem correspondente e que proliferará em meio mínimo (em contraste com auxotrofia). Na realidade, a produção de acetil-CoA como suportado pelo polipeptídeo de teste cancelará o efeito da deleção de pelo menos um gene do by-pass de PDH, causado pela deleção do gene para descarboxilase de piruvato (pdc; E.C.4.1.1.1), desidrogenase de acetaldeído (ald; E.C. 1.2.1.3, E.C. 1.2.1.4 ou E.C. 1.2.1.5), ou sintetase de acetil-CoA (acs; E.C. 6.2.1.1). Tais ensaios de complementação são bem conhecidos na técnica. Em aspectos da presente invenção o ensaio é utilizado para identificar as fontes apropriadas de enzimas heterólogas que são capazes de sustentar produção de acetil-CoA citosólico em células de levedura.

O ensaio de complementação se baseia na provisão de rotas alternativas para superar a atividade de enzima deletada do by-pass de PDH. Os métodos para efetuar deleção de genes em levedura são bem conhecidos na técnica, e podem ser, por exemplo, obtidos por mutagênese mediada por oligonucleotídeos. Bons resultados podem ser obtidos com o plasmídeo pUG6 contendo o cassete de ruptura de gene loxP30 kanMX-loxP (Guldener e outros [1996] Nucleic Acids Res.

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24(13): 2519024; no de acessão GenPept P30114). Desse modo, a pessoa versada será capaz de fornecer uma cepa de levedura tendo uma desidrogenase de acetaldeído deletado e/ou gene de sintetase de acetil-CoA para bloquear o by5 pass de PDH no mesmo.

Saccharomyces cerevisiae compreende duas isoformas de sintetase de acetil-CoA, Acslp e Acs2p. Ambos constituem a fonte nuclear de acetil-CoA para acetilação de histona. A produção de acetil-CoA citosólica também é necessária para a produção de lipídeos. A atividade de Acs é essencial, uma vez que um mutante nulo duplo acsl acs2 é não viável. Um mutante nulo acsl pode crescer com etanol como a fonte de carbono única. A célula de levedura mudada utilizada em aspectos da presente invenção tem preferivelmente uma inativação do gene acs2.

Mutantes de Saccharomyces cerevisiae que contêm uma inativação do gene acs2 não são capazes de crescer em glicose como fonte de carbono única, porque ACS1 é reprimido e a proteína é ativamente degradada. A complementação de tal mutante acs2 delta com um gene de acs baseado em plasmídeo recuperará a capacidade da célula de crescer em glicose como fonte de carbono única. Além disso, o crescimento de tal mutante é complementado pela expressão de genes que suportam rotas alternativas para a produção de acetil-CoA citosólico suficiente. Desse modo, a transformação do mutante acs2 delta com um plasmídeo do qual um acdh ou pno funcional (heterólogo) pode ser expresso recuperará a capacidade do mutante de crescer em glicose como fonte de carbono única. Deve ser entendido que além da remoção do local ACS2, pode-se remover também o

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25/52 local ACS1. Embora se acredite que isso possa em alguns casos evitar a ocorrência de meios de reversão (mutações no local ACS1 que levam à reversão do fenótipo acs2 delta) , isso não foi verificado, entretanto, como sendo essencial.

Mutantes duplos (cepas acsl/acs2A) seriam totalmente dependentes do gene acdh ou pno introduzido para a produção de acetil-CoA citosólico.

Uma vantagem importante de um ensaio de complementação da presente invenção é que pode ser executado como um ensaio de triagem de placa em que complementação bem sucedida é observada como crescimento de colônia. Isso é muito mais rápido do que experimentos que exigem a análise para a produção de um produto metabólico desej ado.

Para complementação da mutação, a célula de levedura tendo o gene ald e/ou acs inativado é então transformada com um vetor de expressão apropriado compreendendo uma sequência de nucleotídeos de um polipeptideo de teste heterólogo.

Vetores de expressão de levedura são amplamente disponíveis de uma variedade de fornecedores comerciais. Até a presente data, complementação funcional de mutações de levedura por homólogos estranhos se torna uma prática padrão na engenharia de Saccharomyces cerevisiae. Vetores de expressão apropriados para expressão de gene heterólogo podem ser baseados em promotores induzíveis, artificiais como o promotor GAL, porém se baseia preferivelmente em promotores constitutivos como o promotor TDH3. Sistemas apropriados são exemplificados nos exemplos abaixo. Em certos sistemas de produção, o uso de um promotor induzível

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26/52 pode ser preferido, visto que permitiría separação temporal de estágios para produção de biomassa (por motor não induzido) e produção de produto de fermentação (promotor induzido). Em outra modalidade altamente preferida em certos sistemas de produção, o vetor é um vetor de integração para integração estável dos genes heterólogos no genoma da cepa de produção de levedura.

Para obter expressão ótima em levedura, o uso de códon (par) do gene heterólogo pode ser otimizado utilizando qualquer um de uma variedade de pacotes de software de desenho de gene sintético, por exemplo, GeneOptimizer® de Geneart AG (Regensburg, Alemanha) para otimização de uso de códon ou otimização de uso de par de códon como descrito em W02008/000632. Tal adaptação de uso de códon assegura que os genes heterólogos, que são, por exemplo, de origem bacteriana, são eficazmente processados pela maquinaria de tradução e transcrição de levedura. A otimização de uso de par de códon resultará em expressão aumentada de proteína na célula de levedura.

As seqüências otimizadas podem ser, por exemplo, clonadas em um plasmídeo de expressão de levedura de cópia elevada, operavelmente ligado a um promotor (preferivelmente constitutivo) funcional em levedura. Bons resultados foram obtidos com o plasmídeo YEplacll2 (2μ

TRPl) (Gietz & Sugino [1988] Gene 74 (2) : 527-34) .

Genes heterólgoos que codificam um polipeptídeo candidato tendo atividade enzimática potencial para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA podem ser identificados in silico. Enzimas apropriadas descritas como possuindo a capacidade de converter

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27/52 acetaldeído em acetil-CoA são desidrogenases de acetaldeído de acetilação (E.C. 1.2.1.10). As seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de mais de 200 dessas enzimas a partir de uma variedade de origens microbianas são descritas em vários bancos de dados (por exemplo, o banco de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)).

Os presentes inventores selecionaram várias desidrogenases de acetaldeído de acetilação e testaram essas no sistema de ensaio baseado em mutante acs2 delta da presente invenção. Muitas dessas, embora nem todas, eram funcionais em S. cerevisiae quando uso de par de códon foi otimizado.

Homólogos funcionais para essas proteínas podem ser utilizados também em aspectos da presente invenção. O termo homólogos funcionais, como utilizado aqui, se refere a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, 22, 25, ou a parte de desidrogenase de acetaldeído de SEQ ID Nos: 28 e 52 na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos, e cuja proteína tem a mesma funcionalidade enzimática para conversão de substrato, por exemplo, um homólogo de desidrogenase de acetaldeído de acetilação é capaz de converter acetaldeído em acetil-CoA. Essa funcionalidade pode ser testada pelo uso de um sistema de ensaio que compreende uma célula de levedura recombinante que compreende um vetor de expressão para a expressão do homólogo em levedura, o vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos heteróloga operavelmente ligada a um promotor funcional em levedura e a sequência de nucleotídeos heterólogos codificando o

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28/52 polipeptídeo homólogo do qual atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil CoA na (o citosol de) célula de levedura deve ser testada, e executar um método para identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA em (citosol de) uma célula de levedura como descrito aqui utilizando o sistema de ensaio. Homólogos candidatos podem ser identificados utilizando análises de similaridade in silico. Um exemplo detalhado de tal análise é descrito no exemplo 2 abaixo. A pessoa versada será capaz de derivar a partir do mesmo como homólogos candidatos apropriados podem ser encontrados e, opcionalmente após otimização de (par) códon, será capaz de testar a funcionalidade exigida de tais homólogos candidatos utilizando o sistema de ensaio da presente invenção como descrito acima. Um homólogo apropriado representa um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de aminoácidos para uma desidrogenase de acetaldeído de acetilação maior do que 50%, preferivelmente maior do que 60%, mais preferivelmente maior do que 70%, 80%, 90% ou mais, por exemplo, tendo tal identidade de sequência de aminoácidos para SED ID NOS: 19, 22, 25, ou a parte de desidrogenase de acetaldeído das SEQ ID NOS: 28 e 52 e tendo a funcionalidade enzimática exigida para converter acetaldeído em acetil-CoA. Similarmente, enzimas descritas para a conversão direta de piruvato em acetil-CoA e os homólogos funcionais das mesmas, bem como enzimas descritas para a conversão de acetato em acetil-CoA e os homólogos funcionais das mesmas, também podem ser utilizados, similar ao descrito para desidrogenase de

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29/52 acetaldeído de acetilação acima.

Um método da presente invenção compreende ainda a etapa de testar a capacidade da célula de levedura transformada por proteína de teste e mudada para crescer no meio mínimo contendo glicose como fonte de carbono única. Como dito mais cedo, isso pode ocorrer adequadamente em meios sólidos (agar) em pratos Petri (placas) onde o crescimento pode ser observado como crescimento de uma colônia, entretanto, meios líquidos são igualmente apropriados e crescimento pode ser detectado por turbidez. Outros métodos para determinar crescimento da célula de levedura transformada por proteína de teste e mutada em meio mínimo contendo glicose, como fonte de carbono única, também podem ser utilizados.

Quando a célula de levedura transformada por proteína de teste e mutada é capaz de crescimento em meio mínimo com glicose, o polipeptídeo candidato é identificado de forma bem sucedida como um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA na (citosol de) célula de levedura. O crescimento pode ser adequadamente observado como formação de colônia em meio de crescimento sólido, em particular meio mínimo contendo glicose.

Um vetor de expressão para a expressão de polipeptídeos heterólogos em levedura, de acordo com a presente invenção pode ser qualquer vetor de expressão apropriado para transformar levedura. Inúmeros exemplos são disponíveis na técnica que podem ser apropriadamente utilizados para expressar seqüências de nucleotídeos heterólogos em levedura. Um vetor muito adequado em

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30/52 aspectos da invenção é um plasmídeo. Um plasmídeo altamente preferido é YEplac-112PtdhTadh (SEQ ID NO: 40).

Genericamente, a sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica o polipeptídeo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil CoA na (citosol de) célula de levedura, será colocada sob controle de um promotor funcional em levedura. Preferivelmente o promotor é um promotor constitutivo. O promotor no plasmídeo YEplacll2PtdhTadh é o promotor TDH3.

As seqüências de nucleotídeos heterólogos incorporadas no vetor de expressão da presente invenção podem ser qualquer enzima pno, acdh ou outra capaz de converter piruvato, acetaldeído ou acetato (respectivamente) em acetil-CoA no citosol da levedura.

Seqüências de nucleotídeo preferidas são aquelas como identificado aqui, a saber, as seqüências de nucleotídeo que codificam:

- a proteína de utilização de etanol amina EutE de E. coli HS (seqüências de nucleotídeo com SEQ ID NO:

18);

a proteína hipotética Linll29 de Listeria innocua similar à proteína de utilização de etanol amina EutE, (seqüências de nucleotídeo com SEQ ID NO: 21)

a desidrogenase	de	acetaldeído EDK33116	de
25 Clostridium kluyveri DSM	555	(seqüências de nucleotídeos
com SEQ ID NO: 24); e
- o homólogo de	adhE	de	S. aureus (seqüências	de
nucleotídeos com SEQ	ID	NO:	27) codificando	uma

desidrogenase de álcool/acetaldeído bifuncional em 30 Staphylococcus aureus subsp. Aureus N315, ou a parte

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31/52 funcional de desidrogenase de acetaldeído do mesmo.

- o homólogo AdhE de Piromyces sp. E2 (sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 51) codificando uma desidrogenase de álcool/acetaldeído bifuncional, ou a parte de desidrogenase de acetaldeído da mesma.

São também apropriados homólogos funcionais dessas seqüências de nucleotídeos, ou dos polipeptídeos que as mesmas codificam. Com esse se termo quer dizer que uma sequência de ácidos nucléicos tendo mais de 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com as seqüências de nucleotídeos codificando as enzimas acdh acima, ou tendo mais de 50%, preferivelmente mais de 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das enzimas acdh acima, com a condição de que os polipeptídeos codificados pelas seqüências homólogas apresentam atividade acdh enzimática funcional.

Como mencionado acima, essas seqüências de nucleotídeo podem ser otimizadas para expressão em Saccharomyces cerevisiae por otimização de uso de par de códon bem conhecido na técnica. Seqüências otimizadas de par de códon para a SEQ ID NO: 18, 21, 24 e 27 são fornecidas na SEQ ID NO: 20, 23, 26 e 29, respectivamente.

O vetor de expressão da invenção pode ser utilizado para transformar uma célula de levedura. Métodos de transformação incluem eletroporação, conta de vidro e transformação biolítica, todos os quais são bem conhecidos na técnica, por exemplo, descrita em Sambrook e outros, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2^a ed., vol. 1-3 (1989).

Uma célula de levedura, de acordo com a presente

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32/52 invenção compreende uma sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA na (citosol de) célula de levedura.

Preferivelmente, uma célula de levedura da invenção compreende um acdh ou pno heterólogo. A vantagem dessa célula de levedura é que pode produzir acetil-CoA por uma rota metabólica em que o by-pass de PDH não é necessário. Isso é energeticamente mais favorável sob condições anaeróbicas, e pode formar a base de qualquer processo de síntese biológica utilizando células de levedura sob condições anaeróbicas onde acetil-CoA é um intermediário. Além de compreender o acdh ou no heterólogo, a célula de levedura da invenção pode compreender várias deleções de gene ou suplementações de gene, dependendo do uso pretendido da levedura.

Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo com a presente invenção compreende uma inativação de uma sequência de nucleotídeos (gene) que codifica uma enzima capaz de catalisar a conversão de acetaldeído em etanol, preferivelmente uma desidrogenase de álcool, por exemplo, para otimizar acúmulo de acetaldeído na célula de levedura.

Se utilizado em um método de triagem para enzimas heterólogas de acordo com um método da invenção, a célula de levedura compreende uma deleção de pelo menos um gene do by-pass (PDH), selecionado dos genes que codificam as enzimas descarboxilase de piruvato (PDC), desidrogenase de acetaldeído (ALD), e sintetase de acetil-CoA (ACS), preferivelmente sintetase de acetil-CoA, mais preferivelmente acs2 .

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33/52

Se utilizado em um método de produzir um produto de fermentação, a célula de levedura pode compreender opcionalmente diversas suplementações de gene (heterólogas) que suportam a via metabólica de acetil-CoA para o butanoi.

Tal via pode consistir somente em produtos de gene heterólogo, ou pode fazer uso de uma mistura de produtos de gene heterólogos e endógenos. No caso do produto de fermentação ser butanoi, pode-se fazer uso de uma levedura que compreende genes que codificam enzimas para a via de butanoi, por exemplo, de Clostridium acetobutylicum, como descrito aqui, e na figura 2. No caso da célula de levedura de acordo com a presente invenção compreender genes que codificam enzimas para produção de butanoi, a levedura compreende preferivelmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma desidrogenase de butiril-CoA e pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma flavoproteína de transferência de elétrons heteróloga (ETF) . Verificou-se que uma célula de levedura compreendendo uma ETF além de genes da via de butanoi produz uma quantidade aumentada de butanoi.

Uma flavoproteína de transferência de elétrons heteróloga na célula eucariótica, de acordo com a presente invenção, pode ser uma proteína única ou a ETF pode compreender duas ou mais subunidades, por exemplo, uma subunidade alfa e uma beta. Preferivelmente, a ETF compreende uma ETF alfa (SED ID NO: 38) e uma ETF beta (SEQ ID NO: 39) . A flavoproteína de transferência de elétrons pode ser derivada de qualquer origem apropriada. Preferivelmente, a ETF é derivada da mesma origem que a desidrogenase de butiril-CoA. Preferivelmente, a ETF é

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34/52 derivada de origem procariótica preferivelmente de um Clostridium sp., preferivelmente um Clostridium acetobutylicum ou um Clostridium beijerinckii.

Um método para produzir um produto de 5 fermentação, de acordo com a presente invenção, compreende preferivelmente crescer uma levedura sob condições anaeróbicas em uma fonte de energia e carbono apropriada. Fontes apropriadas de carbono e energia são açúcares C5 e C6 (monossacarídeos) como glicose e polissacarídeos como amido. Outras matérias primas como cana de açúcar, milho, trigo, cevada, beterraba, semente de colza, e girassol são também apropriadas. Em alguns casos a matéria prima pode ser pré-digerida por tratamento enzimático. Mais preferivelmente a fonte de carbono é lignocelulose, que é composto principalmente de celulose, hemicelulose, pectina e lignina. Lignocelulose é encontrado, por exemplo, nos troncos, folhas, cascas, folhelhos e espigas de plantas. Hidrólise desses polímeros por tratamento enzimático específico libera uma mistura de açúcares neutros incluindo glicose, xilose, manose, galactose, e arabinose. Materiais lignocelulósicos, como madeira, material herbáceo, resíduos agrícolas, fibra de milho, papel de refugo, polpa e resíduos de fábrica de papel podem ser utilizados para produzir butanol. Enzimas de hidrólise são, por exemplo, glucanos ligados por beta para a hidrólise de celulose (essas enzimas incluem endoglucanases, celobioidrolases, glicoidrolases e beta-glicosidases) ; beta glicosidases hidrolisam celobiose; hemilelulases de atuação-endo e atuação-exo e celobiases para hidrólise de hemicelulose, e acetil esterases e esterases que hidrolisam ligações de

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35/52 glicosídeo de lignina. Esses e outros métodos para hidrólise de lignocelulose são bem conhecidos na técnica.

Variações e modificações das modalidades reveladas aqui são possíveis, e alternativas práticas para e equivalentes dos vários elementos das modalidades seriam entendidos por aqueles com conhecimentos comuns na técnica após estudo desse documento de patente. Essas e outras variações e modificações das modalidades reveladas aqui podem ser feitas sem se afastar do escopo e espírito da invenção.

A invenção será ilustrada agora por intermédio dos exemplos não limitadores a seguir.

Exemplos

Os seguintes exemplos ilustram a provisão de uma 15 cepa de Saccharomyces cerevisiae útil em ensaios e métodos da presente invenção, por exemplo, em métodos para identificar enzimas heterólogas capazes de formar acetilCoA citosólico em S. cerevisiae. Tais métodos são úteis na identificação de rotas/enzimas que permitem o fornecimento citosólico de acetil-CoA em S. cerevisiae sob condições anaeróbicas.

Para a formação de acetil-CoA citosólica na cepa de produção de butanol dos requerentes, um método de seleção foi montado para identificar enzimas heterólogas que formam acetil-CoA citosólica em S. cerevisiae. O sistema de teste se baseia em um mutante de levedura acs2 delta deficiente em biossíntese de acetil-CoA citosólico em glicose, tal cepa é incapaz de crescer em glicose como fonte de carbono única a menos que a formação de acetil-CoA citosólica seja complementada. Estudos de complementação em

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36/52 tal cepa podem revelar apropriadas para uso em Saccharomyces cerevisiae.

são quais enzimas heterólogas cepas que produzem butanol de

Desidrogenase de acetaldeído de acetilação foi 5 identificada como sendo um bom candidato para fornecimento de acetil-CoA citosólico em relação ao by-pass PDH homólogo porque nenhum ATP é dissipado. Doze desidrogenases de acetaldeído de acetilação putativas, identificadas com base em homologia de sequência, foram sintetizadas e verificadas em relação à complementação da levedura acs2 delta.

Os genes otimizados de par de códon dos homólogos eutE de E. coli, L. innocua e C. kluyveri e o homólogo adhE de S. aureus foram capazes de complementar os mutantes de levedura acs2 (4 entre 7), resultando em crescimento do hospedeiro S. cerevisiae acs2A. O objetivo é melhorar biossíntese de butanol em levedura por expressão de um ou mais genes assim identificados.

Para testar se essas rotas heterólogas para fornecimento de acetil-CoA citosólico funcionam em S.

cerevisiae, um sistema de triagem foi desenvolvido com base em mutantes de Saccharomyces cerevisiae contendo uma deleção do gene acs2. Essas células não são capazes de crescer em glicose como fonte de carbono única a menos que o mutante acs2 delta seja complementado com um gene acs baseado em plasmídeo ou complementado com a expressão de qualquer outro gene que gera acetil-CoA citosólico suficiente. Assim se fosse para ser transformado com um plasmídeo levando à expressão ativa de acdh ou pno, tal mutante deve ser capaz de crescer novamente com glicose como fonte de carbono única. Os estudos de complementação

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37/52 foram realizados em placas. Os seguintes experimentos foram realizados para montar e avaliar o sistema de teste.

Exemplo 1

Construção de cepa acs2 delta

A cepa deletada acs2 S.cerevisiae (cepa acs2A) foi produzida primeiramente executando um PCR em plasmídeo pUG6 (Guldener e outros, 1996, supra) com os seguintes oligonucleotídeos:

5’acs2:;Kanlox 5‘-tacacaaacagaatacaggaaagtaaatcaatacaataataaaaoagctgaagcttcgtacgc-3’ 10 3’acs2:;Kanlox 5'-tctoattacgaaatttttctcatttaagttatttctttttttgaggcataggccactagtggatctg-3'.

fragmento 1.4 kb resultante, contendo o marcador KanMX que confere resistência a G418, foi utilizado para transformar S.cerevisiae CEN.PK113-3C (MATA trpl-289) . Após transformação a cepa foi revestida em YPD (10 g 1^_1 de extrato de levedura (BD Difco) , 20 g 1^_1 de peptona (BD Difco) ) , 10 g l-¹ de glicose) com 200 mg/ml de

Geneticina (G418). Em transformantes resistentes, integração correta foi verificada por PCR utilizando oligonucleotídeos:

5’ACS2: 5'-gatattcggtagccgattcc-3'

3’ACS2: 5'-ccgtaaccttctcgtaatgc-3'

ACS2internal: 5'-cggattcgtcatcagcttca-3'

KanA: 5'-cgcacgtcaagactgtcaag-3'

KanB: 5'-tcgtatgtgaatgctggtcg-3'

O fenótipo foi verificado por testar crescimento em YP com 1% de glicose (YPD) ou 1% de etanolf 1% de glicerol (YPEG) como a fonte de carbono.

Um transformante que tinha as faixas PCR corretas

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38/52 e não cresceu em YP com glicose, porém cresceu com YP com etanol e glicerol como as fontes de carbono, foi coletado e denominado RWB060 (MATA trpl-289 acs2::Kanlox).

Exemplo 2

Identificação in silico de desidrogenases de acetaldeído de acetilação putativas para conversão direta de acetaldeído em acetil-CoA

Enzimas descritas para a conversão de acetaldeído em acetil-CoA são as denominadas desidrogenases de acetaldeído de acetilação (ACDH) (E.C. 1.2.1.10) catalisando a seguinte reação:

Acetaldeído (AA) + NAD⁺ + CoA <-> acetil-CoA +

NADH + H⁺

Da literatura quatro tipos de proteínas foram descritas que têm essa atividade:

1) Proteínas bifuncionais que catalisam a conversão reversível de acetil-CoA em acetaldeído, e a subsequente conversão reversível de acetaldeído em etanol. Um exemplo desse tipo de proteínas é a proteína AdhE em E.

coli (Genbank No.: NP_415757) . AdhE parece ser o produto evolucionário de uma fusão de gene. A região terminal-NH2 da proteína AdhE é altamente homóloga a aldeído:NAD⁺ oxidorreductases, ao passo que a região terminal COOH é homóloga a uma família de oxidorreductases NAD⁺:etanol dependente de Fe²⁺ (Membrillo-Hernandez e outros, (2000) J. Biol. Chem. 275:33869-33875). O AdhE de E.coli está sujeito à oxidação catalisada por metal e portanto sensível a oxigênio (Tamarit e outros (1998)J. Bio.. Chem. 273:302732) .

2) Proteínas que catalisam a conversão reversível

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39/52 de acetil-CoA em acetaldeído em microorganismos anaeróbicos estritamente ou facultativos porém não possuem atividade de desidrogenase de álcool. Um exemplo desse tipo de proteínas foi reportado em Clostridium kluyveri (Smith e outros (1980) Arch. Biochem. Biophys. 203: 663-675). Uma desidrogenase de acetaldeído de acetilação foi anotada no genoma de Clostridium kluyveri DSM 555 (Genbank no.: EDK33116). Uma proteína homóloga AcdH é identificada no genoma de Lactobacillus plantarum (Genbank no: NP_784141).

Outro exemplo desse tipo de proteínas é o produto de gene ald em Clostridium beijerinckii NRRL B593 (Toth e outros (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4973-4980, Genbank

No.: AAD31841).

3) Proteínas que são envolvidas em catabolismo de etanol amina. Etanol amina pode ser utilizado tanto como fonte de carbono como de nitrogênio por muitas enterobactérias (Stojiljkovic e outros (1995) J. Bacteriol. 177:1357-1366). Etanol amina é primeiramente convertido por liase de amônia de etanol amina em acetaldeído, subsequentemente, acetaldeído é convertido por desidrogenase de acetaldeído de acetilação em acetil-CoA. Um exemplo desse tipo de desidrogenase de acetaldeído de acetilação é a proteína EutE em Salmonella typhimurium (Stojiljkovic e outros (1995) J. Bacteriol. 177: 1357-1366,

GenBanK no.: AAL21357) . E. coli também é capa de utilizar etanol amina (Scarlett e outros (1976) J. Gen. Microbiol. 95:173-176) e tem uma proteína EutE (GenBank no.: AAG57564) que é homóloga à proteína EutE em S. typhimurium.

4) Proteínas que fazem parte de um complexo de desidrogenase - aldolase bifuncional envolvido em

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40/52 catabolismo de 4-hidróxi-2-cetovalerato. Tais enzimas bifuncionais catalisam as duas etapas finais da via de meta-clivagem para catecol, um intermediário em muitas espécies bacterianas na degradação de fenóis, toluatos, naftaleno, bifenilas e outros compostos aromáticos (Powlowski e Shingler (1994) Biodegradation 5, 219-236). 4hidróxi-2-cetovalerato é primeiramente convertido por aldolase de 4-hidróxi-2-cetovalerato em piruvato e acetaldeído, subseqüentemente acetaldeído é convertido por desidrogenase de acetaldeído de acetilação em acetil-CoA. Um exemplo desse tipo de desidrogenase de acetaldeído de acetilação é a proteína DmpF em Pseudomonas sp CF600 (GenBank no.: CAA43226) (Shingler e outros (1992) J. Bacteriol. 174:711-24) . E. coli tem uma proteína MphF homóloga (Ferrandez e outros (1997) J. Bacteriol. 179: 2573-2581, GenBank no.: NP_414885) à proteína DmpF em Pseudomonas sp. CF600.

Para identificar os membros da família de proteína de desidrogenase de acetaldeído de acetilação, as seqüências de aminoácidos da proteína AdhE bifuncional de E.coli (GenBank no.: NP_415757), proteína AcdH de L. plantarum (acetilação) (GenBank no. NP_784141), a proteína EutE de E. coli (GenBank no.: AAG57564) e a proteína MhpF de E. coli (GenBank No: NP_414885) foram individualmente passadas como uma sequência de consulta em uma busca BLASTp contra o banco de dados de proteína não redundante GenBank utilizando parâmetros default. Seqüências de aminoácidos com um valor-E menor ou igual a le-20 foram extraídas. Seqüências redundantes foram removidas e as seqüências restantes foram alinhadas e uma árvore de similaridade foi

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41/52 construída utilizando software analisador de proteína Genedata Physolopher, versão 6.5.2. Uma árvore de similaridade provê informações sobre similaridade de sequência de organismo. A árvore é criada independentemente do algoritmo ClustalW por comparação em pares das seqüências de aminoácidos por posição de resíduo. Em cada posição, a similaridade é classificada e somada para uma marcação geral para cada par de seqüências. Com base nessas marcações em pares um agrupamento hierárquico é executado, que organiza as seqüências em uma árvore. Observe que o produto de gene ald de C. beijerinckii (GenBank no.: AAD31841) agrupado juntamente com as proteínas EutE de E. coli e S. typhimurium. Dessa árvore de similaridade quatro ramificações principais poderíam ser definidas, cada ramificação contém uma sequência de aminoácidos que foi utilizada como uma consulta para a busca BLASTp. A figura 4 mostra um exemplo de tal árvore de similaridade, todas as seqüências que são mencionadas nesse exemplo.

Pelo menos uma sequência de aminoácidos foi selecionada de cada ramificação para testes de complementação em S.cerevisiae delta acs2. Preferivelmente, as seqüências de aminoácidos selecionadas têm evidência experimental de sua função bioquímica como desidrogenase de acetaldeído de acetilação. Tais evidências podem ser encontradas em bancos de dados públicos, como nos bancos de dados BRENDA, UniProt e NCBI Entrez.

Exemplo 3

Construção de plasmídeos de expressão e teste de complementação

Para testar se desidrogenases de acetaldeído de

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42/52 acetilação (ACDH) poderiam complementar a deleção de ACS2 em S. cerevisiae, vários genes que codificam para um ACDH (putativo) foram escolhidos de uma variedade de bancos de dados como descrito acima.

Para obter expressão ótima em levedura, o uso de códon de todos os genes foi adaptado por otimização de par de códon. Essas seqüências foram sintetizadas em Geneart AG (Regensburg, Alemanha).

As seqüências otimizadas foram clonadas no 10 plasmídeo de expressão de levedura de cópia elevada YEplacll2PtdhTadh (SEQ ID NO: 40 com base em YEplacll2 (2u TRPl) (Gietz & Sugino [1988] Gene 74 (2): 527-34)), permitindo expressão constitutiva do promotor TDH3.

YEplacll2PtdhTadh foi feito por clonar um 15 fragmento de Kpnl-Sacl de p426GPD (Mumberg e outros [1995] Gene 156(1): 119-22), contendo o promotor TDH 3 e terminador CYVl, em YEplacll2 cortado com Kpnl-Sacl. O plasmídeo resultante foi cortado com Kpnl e Sphl e as extremidades foram tornadas cegas a seguir ligadas para fornecer YEplacll2TDH. Para obter YEplacll2PtdhTadh, YEplacll2TDH foi cortado com Pstl-Hindlll e ligado a um fragmento PCR Pstl-Hindlll de 345 bp contendo o terminador ADHl (Tadh), desse modo substituindo o terminador CYC1 e mudando o poliligador entre o promotor e o terminador. O fragmento de PCR Tadh foi gerado utilizando os seguintes oligonucleotídeos:

MCS-5‘Tadh: 5'-aaggtacctctagactagtcccgggctgcagtcgactcgagcgaatttcttatgatttatgatt-3' Tadh1-Hind: 5'-aggaagcttaggcctgtgtggaagaacgattacaacagg-3'

PCR foi feito com polimerase DNA Vent^R, de acordo

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43/52 com as especificações do fabricante.

As construções sintéticas contendo os genes ACDH foram cortadas com Spel-Pstl e ligadas em YEplacll2PtdhTadh digeridas com as mesmas enzimas, resultando em pBOLO58 até pBOLO68 e pBOLO82. Os nomes dos plasmídeos finais e os genes que contêm são fornecidos na tabela 1.

Tabela 1: visão geral sobre desidrogenases de acetaldeído de acetilação putativos testados para complementação de cepa de S. cerevisiae acs2 delta. Os genes que resultaram em complementação são fornecidos em negrito. SEQ ID Nos são fornecidos para a sequência de DNA do gene do tipo selvagem, a proteína expressa a partir do mesmo, e a sequência de DNA otimizada de par de códon.

Tabela 1

Organismos	ΗοπκΞ	Grupo	* tamanho	SEQ ID NO.
			uw	DNA/PRT/OPT
Aschenchía	adhli	1	2.6
Entamocba histolytica	adh2	1	2.6	48/50/49
Staphylococeua a tuaua	adhE	1	2.6	27 /28 / 29
Piromycea ap.E2	adhE	1	2.6	51/52
Clostridimn kJuyveri	EDK33116	2	1.5	24 / 25 / 26
Lactobacillus plantarum	acdH	2	1.4
Eschenchia coE	EutE	3	1.4	18 / 19 / 20
Liateria innoctta	Linll29	3	1.4	21 / 22/23
Ps&udomonãs putídâ	YP 001268189	4	1.0
*Grupo se	refere	ao	grupo	de proteínas tendo
atividade ACDH como	definido	no	Exemplo	2. Grupo 1: similar
a AdhE de E. coli	bifuncional	(tipo	AdhE de proteínas);

grupo 2: proteínas tendo similaridade a AcdH de Lactobacillus plantarum (tipo AcdH de proteínas); grupo 3: similar a E. coli EutE (tipo EutE de proteínas), grupo 4: similar a MhpF de E. coli (tipo MhpF de proteínas).

Todos os plasmídeos foram utilizados para

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44/52 transformar a cepa de levedura acs2 delta RWB060. Como controle negativo, o vetor vazio YEplacll2 foi utilizado. Transformantes foram revestidos em meio mineral (Verduyn e outros [1992] Yeast 8 (1992), pág. 501-517) contendo 1% de glicose (MYD) ou 1% de etanol + 1% de glicerol (MYEG) como fonte de carbono única.

Embora para todas as construções vários transformantes pudessem ser selecionados em meio mineral com etanol/glicerol, esse não foi caso nas placas contendo glicose.

Tabela 2: resultado de um experimento de complementação para desidrogenase de acetaldeído de acetilação putativa em cepa de S. cerevisiae acs2 delta RWB060. Os genes resultando em complementação são fornecidos em negrito. Colunas de MYEG e MYD indicam número de transformantes em placas MYEG (etanol/glicerol) e MYG (glicose) .

Organisioos	Gene (GenPept )	plasmídeo	MYEG	MYD
	nane	ΎΕρ1ίΚΐ12	75	0
Escherichia coli	adhE	pBOL059	6	0
Entamoeba histolytica	adh2	PBOL061	54	0
Staphylococcus aureus	adhE (BAB41363)	pBOL064	36	39
Piromyces sp, E2	adhE	pBOL139	32	3
Clostridium kluyveri	AY7A3//72^(EDK33116)	pBOL065	21	8
Lactobacillus piantarum	acdH	pBOL058	6	0
Escherichia coli	£i/Éfi'(ABV06849)	pBOL066	24	18
Listeria innocua	7x7Z?772á> (CA C96360)	pBOL067	28	8
Pseudomonas putida	YP 001268189	PBOL068	32	0

Nas placas contendo glicose, transformantes poderíam ser selecionados somente para plasmídeos pBOLO64, pBOLO65, pBOLO66 e pBOLO67, não o vetor vazio. Houve também uma clara diferença em tamanho de colônia, dependendo do

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45/52 plasmídeo utilizado. Embora a construção pBOLO66 (E. coli eutE) resultasse em colônias maiores, colônias de pBOLO67 (L. innocua linll29) pareciam um pouco menores e pBOLO65 (C. kluyveri edk3116) mostrou colônias menores. Plasmídeo pBOLO64 (S. aureus adhE) e plasmídeo pBOLl39 (Piromyces sp. E2, adhE) foram feitos em uma data posterior, desse modo não puderam ser comparados diretamente. Colônias contendo pBOL64 pareciam ser similares a colônias compreendendo pBOLO66 e colônias compreendendo pBOLl39 pareciam ser similares a colônias compreendendo pBOLO65.

Para assegurar que esses resultados não surgiram de meios de reversão espontâneos, experimentos de transformação foram repetidos para alguns dos plasmídeos, fornecendo os mesmos resultados. Além disso, para quase todos os plasmídeos quatro transformantes foram selecionados aleatoriamente das placas MYEG e riscados novamente em placas MYD e MYEG.

Em todos os experimentos nenhum crescimento foi visto em glicose com o vetor vazio (YEplacll2), enquanto somente pBOLO65, pBOLO66 e pBOLO67 forneceram repetidamente bom crescimento em glicose. O plasmídeo pBOLO64 não foi testado novamente desse modo após o resultado muito positivo inicial.

A partir desses resultados, concluiu-se que os genes otimizados de par de códon dos homólogos eutE de:

E. coli (SEQ ID NO: 20) codificando uma proteína hipotética utilizando proteína EutE de E. coli HS;

L. innocua (SEQ ID NO: 23) codificando uma proteína hipotética de L. innocua similar à proteína de utilização de etanol amina EutE; e

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46/52

C. kluyveri (SEQ ID NO: 26) codificando desidrogenase de acetaldeído de acetilação em Clostridium kluyveri DSM 555;

e o gene otimizado de par de códon do homólogo adhE de

S. aureus (SEQ ID NO: 29) codificando uma desidrogenase de álcool/acetaldeído bifuncional em Staphylococcus aureus subsp. Aureus N315;

e o gene não otimizado de par de códon do 10 homólogo adhE

- Piromyces sp. E2 (SEQ IDNO: 51) codificando uma desidrogenase de álcool/acetaldeído bifuncional

São capazes de complementar os mutantes de levedura acs2. Esses genes codificam uma atividade enzimática que permite a formação de acetil-CoA citosólico de acetaldeído em levedura.

Conclusões

Acredita-se que o fornecimento de acetil-CoA citosólico seja um problema na produção de butanol em levedura. Para identificar genes heterólogos que codificam para enzimas que formam acetil-CoA citosólico em S.

cerevisiae um sistema de teste baseado em um mutante de levedura acs2 delta foi estabelecido.

Devido a sua deficiência em biossíntese de 25 acetil-CoA citosólico em glicose, a cepa acs2A é incapaz de crescer com glicose como fonte de carbono única.

desidrogenases de acetaldeído de acetilação putativas identificadas como candidatos para fornecimento de acetil-CoA citosólico a partir de acetaldeído foram expressas na levedura acs2A. No total, 5 desses 9 genes

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4Ί/52 complementaram crescimento da cepa acs2A com glicoses como fonte de carbono única. Com a mesma, o uso da cepa acs2 delta como ferramenta de pré-seleção para rotas exeqüíveis para fornecimento citosólico de acetil-CoA foi mostrado.

4 de 5 desidrogenases de acetaldeído de acetilação identificadas até o presente, homólogos eutE de E. coli, L. innocua e C. kluyveri e o homólogo adhE de S. aureus, e Piromyces sp. E2 foram integrados com sucesso em cepas de produção de butanol de S. cerevisiae. 0 efeito sobre a produção de butanol foi pesquisado como descrito nos exemplos abaixo.

Esse sistema de teste também pode ser utilizado, para analisar se oxidorreductase de NADP:piruvato pode ser superexpresso com sucesso em levedura. Devido à sensibilidade de oxigênio, esse teste tem de ser executado de forma anaeróbica.

Os exemplos 4-6 abaixo descrevem o teste de 4 dos 5 genes ACDH selecionados do exemplo 3 para aperfeiçoamento de produção de butanol.

Exemplo 4

Construção de uma cepa de levedura que produz butanol e nocaute de genes ADHl e ADH2

Os seis genes de Clostridium acetobutylicum envolvidos em biossíntese de butanol de Acetil-CoA são listados na Tabela 3. Os genes foram otimizados em par de códon para S. cerevisiae como descrito em W02008/000632 e expressos a partir de promotores e terminadores de levedura como listado na Tabela 3.

Dois vetores de integração de levedura (pBOL34 [SEQ ID NO: 41] e pBOL36 [SEQ ID NO: 42]), cada um contendo

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48/52 dos seis genes otimizados em par de códon de Clostridium acetobutylicum envolvido em biossíntese de butanoi, foram projetados e sintetizados em Geneart.

Os genes ThiL, Hbd e Crt são expressos de pBOL34 5 contendo um marcador de seleção AmdS. Os três genes finais, Bcd, BdhB e AdhE foram expressos a partir de um vetor de integração com um marcador de seleção AmdS denominado pBOL36.

Tabela 3: genes utilizados para produção de 10 butanoi em S. cerevisiae incluindo o promotor (1000 bp) e terminador (500 bp).

gene	atividade	Promotor	Terminador
ThiL	Acetil CoA c-acetil transferase [E.C. 2.3.1.9]	ADH1	TDH1
Hbd	3-hidroxi butiril-CoA desidrogenase [E.C.1.1.1.157]	ENO1	PMA1
Crt	3-hidroxi butiril-CoA desidratase [E.C. 4.2.1.55]	TDH1	ADH1
Bed	Butiril-CoA desidrogenase [E.C. 1.3.99.2]	PDC1	TDH1
BdhB	Desidrogenase de butanoi dependente de NADH [E.C.1.1.1.-],	ENO1	PMA1
adhE	Álcool/acetaldeído CoA desidrogenase [E.C.1.1.1.1/ E.C.:1.2.1.10]	TDH1	ADH2

Para integração no local ADH2, pBOL36 foi linearizado por uma digestão BsaBI. S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52) foi transformado

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49/52 com o fragmento linear e crescido em placas com YCB (Difco) e 5 mM de acetamida como fonte de nitrogênio.

marcador AmdS foi removido por recombinação pelo crescimento dos transformantes por 6 horas em YEPD em tubos de 2 ml a 30°C. Células foram subsequentemente revestidas em 1,8% de meio agar contendo YCB (Difco) e 40 mM f luoroacetamida e 30 mM de tampão de fosfato pH 6,8 suportando crescimento somente das células que perderam o marcador AmdS. A integração correta e recombinação foram confirmadas por PCR. A integração correta do fragmento à montante foi confirmada com os seguintes iniciadores:

Pl: 5'-GAATTGAAGGATATCTACATCAAG-3' e

P2: 5'-CCCATCTACGGAACCCTGATCAAGC-3'.

A integração correta do fragmento à jusante foi confirmada com os seguintes iniciadores:

P3: 5'-GATGGTGTCACCATTACCAGGTCTAG-3' e

P4: 5’-GTTCTCTGGTCAAGTTGAAGTCCATTTTGATT

GATTTGACTGTGTTATTTTGCGTG-3’ .

A cepa resultante foi denominada BLT021.

pBOL34 foi linearizado por uma digestão PsiL e integrado no local ADHl de BLT021. Os transformantes foram cultivados em placas contendo YCB (Difco) e 5 mM de acetamida. Para remoção do marcador de seleção de AmdS, colônias foram inoculadas em YEPD e cultivadas por 6 horas em tubos de 2 ml a 30°C. As células foram revestidas em YCB (Difco) e 40 mM de fluoroacetamida, e 0,1% de sulfato de amônio.

Integração correta e recombinação foram confirmadas por PCR. A integração correta do fragmento à montante foi confirmada com o seguinte conjunto de

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50/52 iniciadores:

P5: 5'-GAACAATAGAGCGACCATGACCTTG-3' e

P6 : 5’-GACATCAGCGTCACCAGCCTTGATG-3’ .

A integração correta do fragmento à jusante foi 5 confirmada com o seguinte conjunto de iniciadores:

P7: 5'-GATTGAAGGTTTCAAGAACAGGTGATG-3' e

P8: 5’-GGCGATCAGAGTTGAAAAAAAATG-3’ .

A cepa resultante foi denominada BLT057.

Exemplo 5

Introdução de ETFa e ΕΤΕβ em BLT057

Os genes de ETF e os genes de Acdh como listado na tabela 4 foram otimizados em par de códon para S. cerevisiae como descrito em WO 2008/000632 e expressos a partir de promotores e terminadores de levedura como listado na Tabela 4.

Tabela 4: promotores e terminadores utilizados para expressão de genes ETF otimizados de par de códon e genes Acdh em S. cerevisiae

	promotor	Terminador
Etfa(CpO)		Tefl	Tdh2
EtfP(CpO)		Tdh2	Tefl
Acdh64 S.aureus)	(AdhE	Tdh3	Adh
Acdh65 (Clostridium)		Tdh3	Adh
Acdh66 E. coli)	(EutE	Tdh3	Adh
Acdh67 (lin Ec)	1129	Tdh3	Adh

Os vetores de integração que expressam ETFa e

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ΕΊΈβ somente (pBOLll3, [SEQ ID NO: 43]) ou ETFa e ΕΊΈβ combinado com Acdh64 (pBOL 115, [SEQ ID NO: 44]), Acdh65 (pBOL 116, [SEQ ID NO: 45]), Acdh66 (pNOLH8, [SEQ ID NO:

46]) ou Acdh67 (pBOLl20, [SEDQ ID NO: 47]), foram sintetizados por Geneart AG.

Os vetores pBOL 113, pBOLH5, pBOLH6, pBOLH8 e pBOL 120, foram linearizados com Stul e integrados no local ura3-52 da cepa BLT057. Os transformantes foram cultivados em YNB(Difco) sem aminoácidos + 2% de galactose para selecionar cepas prototróficas de uracila. As cepas derivadas da cepa BLT057 com pBOLH3/114/116/118/120 integradas no genoma foram designadas cepas: BLT071, BLT072, BLT073, BLT074 e BLT075, respectivamente.

Exemplo 6

Produção aperfeiçoada de butanol por expressar genes Acdh positivos

As cepas BLT071 até BLT075 como preparado no exemplo 5 foram cultivadas em meio Verduyn (Verduyn e outros (1992) levedura 8: 501-517) no qual o sulfato de amônio é substituído por 2 g/1 de uréia e que contém ainda 4% em peso de galactose. Células foram cultivadas em frascos de agitar de 100 ml contendo 50 ml de meio por 72 horas a 30°C a 180 rpm em um agitador giratório.

A concentração de butanol foi determinada no sobrenadante da cultura. Amostras foram analisadas em um

HS-GC equipado com um detector de ionização de chamas e um sistema de injeção automático. A coluna J&W DB-1 comprimento 30 m, id 0,53 mm, df 5 pm. As seguintes condições foram utilizadas: hélio como gás portador com uma taxa de fluxo de 5 ml/min. A temperatura da coluna foi

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52/52 ajustada em 110°C. O injetor foi ajustado em 140°C e o detector executado a 300°C. Os dados foram obtidos utilizando software de Chromeleon. As amostras foram aquecidas a 60°C por 20 min. no amostrador de espaço superior. Um (1) ml dos voláteis de espaço superior foi automaticamente injetado na coluna.

A produção de 1-butanol das várias cepas foi como a seguir:

BLT057: 120 mg/1

BLT071: 450 mg/1

BLT072: 500 mg/1

BLT073: 600 mg/1

BLT074: 670 mg/1

BLT075: 700 mg/1

Os resultados mostram que a introdução de flavoproteínas de transferência de elétrons (ETF alfa e ETF beta) e/ou introdução de desidrogenase de acetaldeído de acetilação como identificado por um ensaio de complementação do exemplo 3, aumenta o nível de produção de butanoi.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimãtica para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA no citosol de uma célula de levedura, caracterizado por compreender:

   - fornecer uma célula da cepa Aacs2 de S. cerevisiae;

   - transformar a referida célula com um vetor de expressão que compreende uma das sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 20, 23, 26, 29 e 51 operavelmente ligada a um promotor funcional na levedura;

   - testar a célula de levedura mudada recombinante em relação a sua capacidade para crescer em meio mínimo contendo glicose como fonte de carbono única, e identificar o candidato polipeptídeo como polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimãtica para converter piruvato, acetaldeído, ou acetato em acetil-CoA no citosol da referida célula de levedura quando crescimento da célula é observado.
2. 2. Vetor para a expressão de polipeptídeos heterólogos em levedura, o vetor caracterizado por compreender uma das sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 20, 23, 26, 29 e 51 operavelmente ligada a um promotor funcional na levedura.
3. 3. Célula de levedura recombinante da cepa Aacs2 de S. cerevisiae, caracterizada por compreender um vetor como definido na reivindicação 2.
4. 4. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender ainda uma inativação de um gene do bypass (PDH) consistindo no gene que codifica a

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   2/2 sintetase de acetil-CoA (ACS).
5. 5. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura compreende uma inativação de um gene que codifica uma sintase de acetil-CoA.
6. 6. Célula de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que a célula mostra crescimento em meio mínimo contendo glicose como fonte de carbono único.
7. 7. Célula de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada por compreender ainda uma inativação de um gene que codifica uma enzima que catalisa a conversão de acetaldeído em etanol, preferivelmente uma desidrogenase de álcool.
8. 8. Método de produzir um produto de fermentação, caracterizado por compreender as etapas de fermentar um substrato de carbono apropriado com uma célula de levedura de qualquer uma das reivindicações 3 a 7 e recuperar o produto de fermentação produzido durante a fermentação.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é butanol.

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   1/4 glicose etanol i u glicólise descarboxilase _co de piruvato 4 ² piruvato _ acetaldeído