BRPI0720566A2 - Produção de butanol através de levedura metabolicamente projetada - Google Patents

Description

“PRODUÇÃO DE BUTANOL ATRAVÉS DE LEVEDURA METABOLICAMENTE PROJETADA”

Campo da Técnica

Este Pedido reivindica o benefício de (1) Pedido de Patente Provisório dos Estados 5 Unidos Número de Série 60/871,427, depositado em 21 de dezembro de 2006, por Jun Ura- no, et al., para BUTANOL PRODUCTION BY METABOLICALLY ENGINEERED YEAST; (2) Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número de Série 60/888,016, depositado em 2 de Fevereiro de 2007, por Jun Urano, et al., para N-BUTANOL PRODUCTION BY METABOLICALLY ENGINEERED YEAST; e (3) Pedido de Patente Provisório dos Estados 10 Unidos Número de Série 60/928,283, depositado em 8 de maio de 2007, por Uvini P. Guna- wardena, et al., para BUTANOL PRODUCTION BY METABOLICALLY ENGINEERED YEAST. Cada um dos Pedidos acima-identificados está pelo presente incorporado aqui por referência.

Campo da Invenção

15 A presente invenção refere-se às células de levedura metabolicamente projetadas

para a produção de n-butanol em alto rendimento como um combustível alternativo e reno- vável de transporte, e para outras aplicações. As leveduras da invenção são projetadas para *r compreender um caminho metabólico que converte uma fonte de carbono tal como glicose e/ou outros carboidratos metabolizáveis, bem como biomassa e os similares, a n-butanol.

20 Fundamento

Atualmente, aproximadamente 140 bilhões de galões de gasolina são consumidos nos Estados Unidos e aproximadamente 340 bilhões de galões são consumidos mundial- mente por ano. Estas quantidades de consumo são apenas crescentes. O Ato Institucional de Polícia Energética (Energy Policy Act) de 2005 que 7,5 bilhões de galões de combustí- 25 veis renováveis sejam utilizados em gasolina até 2012. Em seu Estado do Endereço de Uni- ão de 2007, o Presidente chamado para aumentar o tamanho e expandir o escopo do pa- drão de combustível renovável (RFS) exige 35 bilhões de galões de combustíveis renová- veis e alternativos em 2017. O Departamento de Energia tem estabelecido uma meta de repor 30 por cento do consumo atual de gasolina dos Estados Unidos com biocombustíveis 30 para 2030 (a iniciativa “30X30”). Em março de 2007, o Brasil e os Estados Unidos assinaram “o Acordo Etanol”, para promover o desenvolvimento de biocombustíveis nas Américas, u- nindo os maiores produtores de biocombustíveis no mundo - atualmente somando para 70 por cento da produção de etanol do mundo.

Os biocombustíveis possuem o potencial de não somente reduzir a dependência 35 dos Estados Unidos em importar óleo estrangeiro, o qual é vital para segurança da pátria, porém para também diminuir dramaticamente as emissões do gás estufa associado ao a- quecimento global. Os biocombustíveis podem ser obtidos a partir da conversão de carbono baseado em mantimento. Mantimentos agrícolas são considerados renováveis porque, ape- sar de eles liberarem dióxido de carbono quando queimados, eles capturam aproximada- mente uma quantidade equivalente de dióxido de carbono através de fotossíntese.

Nos Estados Unidos, etanol está sendo mais e mais utilizado como um suplemento de oxigenato para gasolina padrão, como uma substituição para metil t-butil éter (MTBE), o produto químico que é difícil de recuperar da água subterrânea e contaminação do solo. Em uma mistura de 10%, o etanol reduz a probabilidade de batida de motor, levantando a avali- ação do octano. O uso de 10% de etanol da gasolina é mandado em algumas cidades onde a possibilidade de níveis danificados de emissões de auto é possível, especialmente durante os meses de inverno. Veículos Norte-Americanos de aproximadamente 1980 carros para frente correm em 10% etanol / 90% gasolina (isto é, E10) sem modificações.

Para que o etanol seja utilizado em concentrações mais altas, portanto, um veículo deve ter seu sistema de motor e combustível especialmente projetado ou modificado. Veícu- los de combustíveis flexíveis (FFVs) são desenhados para sem moverem à gasolina ou uma mistura de acima de 85% de etanol (E85). Portanto, uma vez que um galão de etanol con- tém menos energia que um galão de gasolina, FFVs tipicamente circula cerca de 20 a 30% menos milhas por galão quando abastecido com E85. Os pacotes de conversão estão dis- poníveis para converter um veículo convencional a um FFV que inclui tipicamente um dispo- sitivo eletrônico para aumentar o volume de combustível injetado por ciclo (devido ao conte- údo mais baixo de energia de etanol) e, em alguns casos, um tratamento químico protege o motor de corrosão. Mais de 4 milhões de veículos de combustível flexível são atualmente operados nas estradas nos Estados Unidos, embora um estudante 2002 descobrisse que menos de 1% do combustível consumido por estes veículos serem E*%.

O butanol possui diversas vantagens sobre o etanol para combustível. Enquanto este pode ser feito dos mesmos mantimentos como etanol, ao contrário de etanol, é compa- tível com gasolina e petrodiesel em qualquer razão. O butanol pode também ser utilizado como um combustível puro na existência de carros sem modificações e tem sido proposto como um combustível a jato pelo Grupo do Sr. Richard Branson em linhas aéreas virgens. Ao contrário de etanol, o butanol não absorve água e pode então ser armazenado e distribu- ído na infra-estrutura petroquímica existente. Devido ao seu maior conteúdo de energia, a economia do combustível (milhas por galão) é melhor que aquela do etanol. Também, mistu- ras butanol-gasolina têm pressão de vapor menor que misturas etanol-gasolina, que é im- portante na redução de emissões de hidrocarbonetos evaporativos. Estas propriedades for- necem o potencial para o butanol ser utilizado definitivamente da mesma maneira como ga- solina, sem modificação do veículo e sem o peso em consumidores reabastecer mais fre- quentemente.

O n-butanol pode ser produzido utilizando espécie de Clostridium que produzem na- turalmente através de um percurso que leva de butiril-CoA a n-butanol. Uma desvantagem da espécie Clostridium é que a produção ocorre em um processo de duas etapas que envol- vem uma fase de crescimento produzindo ácido seguido por uma fase de produção de sol- vente. Também, grandes quantidades de bioprodutos, tais como hidrogênio, etanol, e aceto- 5 na são produzidos neste processo, assim limitando o rendimento estequiométrico de n- butanol para aproximadamente 0,6 mol de n-butanol por mol de glicose consumida. Adicio- nalmente, a espécie Clostridium perde sua habilidade para produzir solventes sob condições de culturas contínuas (Cornilot et al., J. Bacteriol. 179: 5442-5447, 1997). O percurso de Clostridium mostrando a conversão de glicose a ácidos e solventes em C. acetobutilicum, 10 incluindo o caminho para produzir n-butanol de acetil-CoA, é mostrado na Figura 1.

Sumário da invenção

Em uma modalidade, há fornecido uma levedura metabolicamente projetada capaz de metabolizar uma fonte de carbono para produzir n-butanol, pelo menos um percurso con- figurado para produzir uma quantidade aumentada de acetil-CoA citosólico relativo à outra 15 quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por uma levedura tipo selvagem, e pelo me- nos um gene anormal para codificar e expressar pelo menos uma enzima para um percurso metabólico capaz de utilizar NADH para converter acetil-CoA ao n-butanol.

Em outra modalidade, há fornecido um método para produzir n-butanol, o método compreendendo (a) fornecer levedura metabolicamente projetada capaz de metabolizar uma 20 fonte de carbono para produzir n-butanol, pelo menos um percurso configurado para produ- zir uma quantidade aumentada de acetil-CoA citosólico relativo à outra quantidade de acetil- CoA citosólico produzido por uma levedura tipo selvagem, e pelo menos um gene anormal para codificar e expressar pelo menos uma enzima para um percurso metabólico capaz de utilizar NADH para converter acetil-CoA ao n-butanol; e (b) cultivar a levedura metabolica- 25 mente projetada por um período de tempo e sob condições para produzir o n-butanol.

Em ainda outra modalidade, há fornecido um método para produzir n-butanol, utili- zando levedura, o método compreendendo (a) projetar metabolicamente a levedura para aumentar a produção de acetil-CoA citosólica; (b) projetar metabolicamente a levedura para expressar um percurso metabólico que converte uma fonte de carbono a n-butanol, em que 30 o percurso exige pelo menos uma enzima não-nativa da levedura, em que as etapas (a) e (b) podem ser desempenhadas na ordem; e (c) cultivar a levedura por um período de tempo de sob condições para produzir uma quantidade recuperável de n-butanol.

Em ainda outra modalidade, há fornecido um método para produzir n-butanol, utili- zando levedura, o método compreendendo (a) cultivar uma levedura metabolicamente proje- tada por um período de tempo e sob condições para produzir uma biomassa da célula de levedura sem ativar a produção de n-butanol; e (b) alterar as condições de cultura para outro período de tempo e sob condições para produzir uma quantidade recuperável de n-butanol. Em outra modalidade, há fornecido uma levedura metabolicamente projetada capaz de metabolizar uma fonte de carbono e produzir uma quantidade aumentada de acetil-CoA relativo à quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por uma levedura tipo selvagem.

Em ainda outra modalidade, há fornecido um método para aumentar a atividade metabólica da levedura, o método compreendendo produzir uma quantidade aumentada de acetil-CoA citosólico da levedura relativo à quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por uma levedura tipo selvagem.

Em ainda outra modalidade, há fornecido uma levedura metabolicamente projetada possuindo pelo menos um percurso configurado para produzir uma quantidade aumentada de acetil-CoA citosólico relativo à outra quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por uma levedura tipo selvagem.

Outras modalidades são também descritas.

Breve Descrição das Figuras

Modalidades ilustrativas da invenção são ilustradas nas figuras, nas quais:

A Figura 1 ilustra os percursos metabólicos envolvidos na conversão de glicose, pentose, e granulose a ácidos e solventes em Clostridium acetobutylicum. Hexoses (por exemplo, glicose) e pentoses são convertidas a piruvato, ATP e NADH. Subsequentemente, piruvato é descarboxilado oxidativamente a acetil-CoA por um piruvato-ferredoxina oxidore- dutase. A redução equivalente gerada nesta etapa é convertida a hidrogênio por uma hidro- genase somente de ferro. Acetil-CoA é o ponto filial intermediário, conduzindo à produção de ácidos orgânicos (acetato e butirato) e solventes (acetona, butanol e etanol).

A Figura 2 ilustra um percurso químico para produzir butanol em leveduras.

A Figura 3 ilustra percursos utilizados por Sacchromyces cerevisiae para gerar ace-

til-CoA.

As Figuras 4 e 5 ilustram vários plasmídeos exemplares que podem ser utilizados para expressar várias enzimas de acordo com a presente descrição.

A Figura 4 ilustra um plasmídeo exemplar que pode ser utilizado para expressar vá- rias enzimas de acordo com a presente descrição como descrito na Tabela 1.

A Figura 5 ilustra um plasmídeo exemplar que pode ser utilizado para expressar vá- rias enzimas de acordo com a presente descrição como descrito na Tabela 2.

A Figura 6 ilustra geograficamente a produção de n-butanol em tempo excessivo por Gevo 1099 e Gevo 1103 como comparada ao Vetor que somente isola o controle, Gevo 1110 e Gevo 1111, como segue:

{"·”*$“*·'} Gevo 1099;

(—**—) Gevc 1103;

( } Gevo 1110;

Gevo 1111

A Figura 7 ilustra o plasmídeo pGV1090 contendo genes bcd, etfb, etfa de C. ace- tobutilicum inseridos nos sítios EcoRI e BamHl e a jusante de um promotor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de origem de pBR322 e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 8 ilustra o plasmídeo pGV1095 para expressão de butiraldeído desidroge- nase (bdhB) de C. acetobutilicum inseridos nos sítios EcoRI e BamHI e fluxo a jusante de um promotor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de origem de CoIEI e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 9 ilustra o plasmídeo para expressão de crotonase (CRT) de C. acetobuti- licum inserido nos sítios EcoRI e SamHI e fluxo a jusante de um promotor de Iambda de fa- go modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de ori- gem de pBR322 e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 10 ilustra o plasmídeo pGV1037 para expressão de hidroxibutiril-CoA de- sidrogenase (hbd) de C. acetobutilicum inseridos nos sítios EcoRi e BamHi e fluxo a jusante de um promotor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Pl-I3c)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de origem de CoIEI e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 11 ilustra o plasmídeo pGV1031 para expressão de tiolase (tal) de C. ace- tobutilicum inseridos nos sítios EcoRi e BamHi e fluxo a jusante de um gene Laços. O plas- mídeo também realiza uma replicação do gene de origem de pBR322 e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 12 ilustra o plasmídeo pGV1049 para expressão de crotonase (CRT) de

Clostridium beijerinckii inserido nos sítios EcoRi e BamHi e fluxo a jusante de um promotor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de origem e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 13 ilustra o plasmídeo pGV1050 para a expressão de hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd) de C. beijerinckii inserido nos sítios EcoRi e BamHi e fluxo a jusante de um promotor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replicação do gene de origem e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 14 ilustra o plasmídeo pGV1091 para a expressão de álcool desidrogena- se (adhA) de C. beijerinckii inserido nos sítios Hindlll e BamHi e fluxo a jusante de um pro- motor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma repli- cação do gene de origem e um gene resistente a cloramfenicol.

A Figura 15 ilustra o plasmídeo pGV1096 para a expressão de álcool desidrogena- se (aldh) de C. beijerinckii inserido nos sítios EeoRi e BamHi e fluxo a jusante de um promo- tor de Iambda de fago modificado LacO-1 (Puac)- O plasmídeo também realiza uma replíca- ção do gene de origem e um gene resistente a cloramfenicol.

Descrição Detalhada

Os microorganismos de levedura recombinantes são descritos que são projetados para converter uma fonte de carbono em n-butanol com alto rendimento. Em particular, os microorganismos de levedura recombinantes são descritos que são capazes de metabolizar uma fonte de carbono para produção de n-butanol em um rendimento de pelo menos 5% de teórico, e, em alguns casos, um rendimento de mais de 50% de teórico. Como utilizado aqui, o termo “rendimento” refere-se ao rendimento molar. Por exemplo, o rendimento iguala 100% quando um mol de glicose é convertido a um mol de n-butanol. Em particular, o termo “rendimento” é definido como o mol do produto obtido por mol de nanômero da fonte de car- bono e pode ser expresso como por cento. A menos que caso contrário notado, o rendimen- to é expresso como uma porcentagem do rendimento teórico. O “Rendimento Teórico” é definido como os mois máximos do produto que podem ser gerados por um mol dado do substrato como ditado através de estequiometria do percurso metabólico utilizado para fazer o produto. Por exemplo, o rendimento teórico para uma conversão típica de glicose a n- butanol é 100%. Como tal, um rendimento de n-butanol proveniente da glicose de 95% seria ser expresso como 95% de teórico ou 95% de rendimento teórico.

Os microorganismos aqui descritos são projetados, utilizando técnicas de engenha- ria genética, para prover microorganismos que utilizam enzimas anormais expressadas para produzir n-butanol em alto rendimento. O rendimento de butanol é dependente da conversão de alto rendimento de uma fonte de carbono a acetil-CoA, e a conversão de alto rendimento subseqüente de acetil-CoA a butanol. A invenção refere-se à combinação destes dois as- pectos resultando em um microorganismo que produz n-butanol em um alto rendimento.

Como utilizado aqui, o termo “microorganismo” inclui espécies microbiais procarióti- cos e eucarióticos da Bactéria Domains e Eukaryote, o último incluindo levedura e filamen- tous fungi, protozoa, algae, ou Protista maior. Os termos “célula”, “células microbiais”, e “mi- cróbios” são utilizados permutavelmente com o termo microorganismo. Em uma modalidade preferida, o microorganismo é uma levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Kluyveromyce lactis) ou E. coli.

“Levedura”, refere-se a um domínio de organismos eucarióticos, colocados filogene- ticamente no reino fungi, sob o fila Ascomiceta e Basidiomicota. Aproximadamente 1500 espécies de leveduras estão descritas até o momento. Leveduras são primariamente micro- organismos unicelulares que reproduzem primariamente através de germinação assexuada mesmo se algumas leveduras multicelulares e aquelas que reproduzem através de ramifica- ção binária forem descritas. A maioria das espécies é classificada como leveduras aeróbias, porém facultativas e anaeróbias são também bem-conhecidas. Com relação à fisiologia fer- mentativa da levedura, as leveduras são categorizadas em dois grupos - Crabtree - positivo e Crabtree - negativo.

Resumidamente, o efeito de Crabtree é definido como a inibição do consumo de o- xigênio por um microorganismo quando cultivado sob condições aeróbicas devido à presen- ça de uma alta concentração de glicose (por exemplo, 50 gramas de glicose/L). desse mo- do, uma célula de levedura possuindo um fenótipo de Crabtree-positivo continua a fermentar sem dizer respeito à disponibilidade de oxigênio devido à presença de glicose, enquanto uma célula de levedura possuindo um fenótipo de Crabtree negativo não exibe inibição me- diada de glicose de consumo de oxigênio. Exemplos, de células de levedura tipicamente possuindo um fenótipo de Crabtree-positivo inclui, sem limitação, células de levedura de gênero Saccharomyces, ZygoSaccharomyces, Torulaspora e Dekkera., Exemplos, de célu- las de levedura tipicamente possuindo um fenótipo de Crabtree-negativo inclui, sem limita- ção, células de levedura de gênero Kluyveromyces Pichis, Hansenula e Candida.

Certos aspectos detalhados e modalidades da invenção estão ilustrados abaixo, seguindo uma definição de certos termos utilizados na aplicação. O termo “fonte de carbo- no” geralmente refere-se a um substrato ou composto adequado para ser utilizado como uma fonte de carbono para crescimento da célula de levedura. As fontes de carbono podem estar em várias formas, incluindo, mas não limitados a polímeros tais como xilan e pectina, carboidratos, ácidos, alcoóis, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos, etc. Tais fontes de carbono mais especificamente incluem, por exemplo, vários monossacarídeos tal como gli- cose e frutose, oligossacarídeos tais como Iactose ou sucrose, polissacarídeos, material celulósico, ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactose, acetato, etanol, ou misturas dos mesmos e misturas não-purificadas de mantimentos renováveis, tais como soro do queijo permeável, licor de “comsteep”, melado do açúcar da beterraba, e malte da cevada.

Fontes de carbono que servem como materiais de partida adequáveis para a pro- dução de produtos de n-butanol incluem, mas não estão limitadas a, biomassa hidrolisada, glicose, amido, celulose, hemicelulose, xilose, lignina, dextrose, frutose, galactose, milho, farinha de milho liqüefeita, licor íngreme do milho (um subproduto do processo de trituração molhada do milho que contêm nutrientes Iixiviados fora do milho durante imersão), melado, lignocelulose, e maltose. Organismos fotossintéticos podem adicionalmente produzir uma fonte de carbono como um produto de fotossíntese. Em uma modalidade preferida, fontes de carbono podem ser selecionadas de biomassa hidrolisada e glicose. A glicose, dextrose, e amido podem ser provenientes de uma fonte endógena ou exógena.

Deve ser notado que outras fontes de carbono mais acessíveis e/ou de menor custo podem ser substituídas por glicose com modificações relativamente menores para microor- ganismos hospedeiros. Por exemplo, em certas modalidades, o uso de outros substratos renováveis e economicamente praticáveis pode ser preferido. Este inclui: desperdício agrí- cola, materiais de empacotamento baseado em amido, fibras de milho hidrolisadas, melado de soja, fruta processando desperdício industrial, e soro do leite permeado, etc.

Açúcares de cinco carbonos são somente utilizados como fontes de carbono com espécies de microorganismos que sejam capazes de processar estes açúcares, por exem- plo, E. coli B. Em algumas modalidades, glicerol, um carboidrato de três carbonos, pode ser utilizado como uma fonte de carbono para as biotransformações. Em outras modalidades, glicerina, ou glicerol impuro obtidos pela hidrólise de triglicerídeos a partir da gordura e óleos de plantas e animais, podem ser utilizados como uma fonte de carbono, enquanto que quaisquer impurezas não afetam contrariamente microorganismos hospedeiros.

O termo “enzima”, como utilizado, aqui se refere a qualquer substância que catalisa ou promove uma ou mais reações químicas ou bioquímicas, que usualmente inclui enzimas totalmente ou parcialmente compostas de um polipeptídio, mas pode incluir enzimas com- postas de diferentes moléculas incluindo polinucleotídeos.

O termo “polinucleotídeo” é utilizado aqui permutavelmente com o termo “ácido nu- cléico” e se refere a um polímero orgânico composto de dois ou mais monômeros incluindo nucleotídeos, nucleosídeos ou análogos do mesmo, incluindo, mas não limitado a, ácido desoxirribonucléico (DNA) nativo ou desnaturado, sense ou anti-sense de qualquer compri- mento e, onde apropriado, ácido ribonucléico (RNA) nativo ou desnaturado, sense ou anti- sense de qualquer comprimento, incluindo siRNA. O termo “nucleotídeos” se refere a qual- quer de diversos compostos que consistem de um açúcar da ribose ou desoxirribose unido a uma base purina ou uma pirimidina e a um grupo fosfato, e que são as unidades estruturais básicas de ácidos nucléicos. O termo “nucleosídeo” se refere a um composto (como guano- sina ou adenosina) que consiste em uma base purina ou pirimidina combinada com ribose ou desoxirribose é encontrada especialmente em ácidos nucléicos. O termo “nucleotídeo análogo” ou “nucleosídeo análogo” se refere, respectivamente, a um nucleotídeo ou nucleo- sídeo no qual um ou mais átomos individuais têm sido recolocados com um átomo diferente ou com um grupo funcional diferente. Do mesmo modo, o termo polinucleotídeo inclui ácidos nucléicos de qualquer comprimento, DNA, RNA, análogos e fragmentos do mesmo. Um po- linucleotídeo de três ou mais nucleotídeos é também chamado oligômero nucleotídico ou oligonucleotídeo.

O termo “proteína” ou “polipeptídio” como utilizado aqui indica um polímero compos- to de dois ou mais monômeros amino acídicos e/ou análogos dos mesmos. Como utilizado aqui, o termo “aminoácido” ou “monômeros amino acídicos” se referem a quaisquer aminoá- cidos natural e/ou sintético incluindo glicina e ambos os isômeros D ou L. o termo “aminoá- cido análogo” se refere a um aminoácido no qual um ou mais átomos individuais têm sido recolocados, seja com um átomo diferente, ou com um grupo funcional diferente. Do mesmo modo, o termo polipeptídio inclui polímeros amino acídicos de qualquer comprimento inclu- indo proteínas de comprimento total, e peptídeos bem com como análogos e fragmentos do mesmo. Um polipeptídio de três ou mais aminoácidos é também chamado um oligômero de proteína ou oligopeptídio. O termo “anormal” ou “exógeno” como utilizado aqui com referência às moléculas e em particular enzimas e polinucleotídeos, indica moléculas que são expressas em um orga- nismo, outras que o organismo do qual eles originaram ou encontraram na natureza, inde- pendentemente do nível de expressão que pode ser menor, igual ou maior que o nível de expressão da molécula no microorganismo nativo.

Por outro lado, o termo “nativo” ou “endógeno” como utilizado aqui com referência às moléculas, e em particular enzimas e polinucleotídeos, indica moléculas que são expres- sas no organismo no qual eles originaram ou são encontrados na natureza, independente- mente do nível de expressão que pode ser menor, igual ou maior que o nível de expressão da molécula no microorganismo nativo.

Em certas modalidades, o microorganismo não projetado, nativo, é incapaz de con- verter uma fonte de carbono a n-butanol, ou um ou mais do(s) intermediário(s) metabólicos dos mesmos, devido a, por exemplo, tal hospedeiro tipo selvagem carece de uma ou mais enzimas requeridas em um percurso de produção de n-butanol.

Em certas modalidades, o microorganismo não projetado, nativo, é capaz de so- mente converter quantidades pequenas de uma fonte de carbono a n-butanol, a um rendi- mento de menos de 0,1% de teórico.

Por exemplo, microorganismos tais como E. coli ou Saccharomyces sp. Geralmente não possuem um percurso metabólico para converter açúcares tais como glicose em n- butanol, mas é possível transferir um percurso produzindo n-butanol a partir de uma espécie produzindo n-butanol, (por exemplo, Clostridium) em um hospedeiro anormal eucariótico, tal como E. coli ou Saceharomyces sp., e utilizar o microorganismo recombinante resultante para produzir n-butanol.

Os Microorganismos, em geral, são apropriáveis como hospedeiros se eles possuí- rem propriedades inerentes tais como resistência ao solvente que permitirá a eles metaboli- zar uma fonte de carbono em ambientes contendo solvente.

Os termos “hospedeiro”, “células hospedeiras” e “células hospedeiras recombinan- tes” são utilizados permutavelmente aqui e se referem não somente à célula do indivíduo particular mas também à prole ou prole potencial de tal célula. Devido a certas modificações poderem ocorrer em gerações que sucedem devido à mutação ou influências ambientais, ta como a prole pode não ser de fato, idêntica à célula mãe, mas estão ainda incluídas dentro do escopo do termo como utilizado aqui.

Os Hospedeiros úteis para produção de n-butanol podem ser tanto microorganismo eucariótico ou procariótico. Uma célula de levedura é o hospedeiro preferido tal como, mas não limitado a, Saccharomyces cerevisiae ou Kluyveromyces laetis. Em certas modalidades, outros microorganismos hospedeiros de levedura apropriados incluem, mas não estão limi- tados às espécies Pichia, Yarrowia, Aspergillus, Kluyveromyees, Paehysolen, Rhodotorula, ZygoSaccharomyces, Galactomyces, SchizoSaccharomyces, Penicillium, Torulaspora, De- baryomyces, Williopsis, Dekkera, Kloeckera, Metschrtikowia e Candida.

Em particular, os microorganismos recombinantes aqui descritos são projetados pa- ra ativar, e em particular expressam enzimas anormais que pode ser utilizadas na produção de n-butanol. Em particular, em certas modalidades, os microorganismos recombinantes são projetados para ativar enzimas anormais que catalisam a conversão de acetil-CoA a n- butanol.

Os termos “ativado” ou “de ativação” como utilizados aqui com referência a uma molécula biologicamente ativa, tal como uma enzima, indica qualquer modificação no geno- ma e/ou proteoma de um microorganismo que aumenta a atividade biológica da molécula biologicamente ativa no microorganismo. Ativações moleculares incluem, mas não estão limitadas a, modificações que resultam na conversão da molécula de uma forma biologica- mente inativa a uma forma biologicamente ativa e de uma forma biologicamente ativa para uma forma biologicamente mais ativa, e modificações que resultam na expressão da molé- cula biologicamente ativa em um microorganismo em que a molécula biologicamente ativa não foi previamente expressada. Por exemplo, a ativação de uma molécula biologicamente ativa pode ser desempenhada expressando uma codificação de polinucleotídeo anormal ou nativo para a molécula biologicamente ativa no microorganismo, expressando uma codifica- ção de polinucleotídeo anormal ou nativo para uma enzima envolvida no percurso para a síntese da molécula ativa biológica no microorganismo, expressando uma molécula anormal ou nativa que aumenta a expressão da molécula biologicamente ativa no microorganismo.

Uma seqüência de gene ou DNA é “anormal” a um microorganismo se este não for parte do genoma daquele microorganismo como normalmente existe, isto é, ele não é natu- ralmente parte do genoma da versão tipo selvagem do microorganismo. Por meio de exem- plo, e sem limitação, para S. cerevisiae, um DNA codificando qualquer um do seguinte é considerado ser anormal. A proteína ou enzima de Escherichia coli, proteínas ou enzimas de quaisquer outros microorganismos outros que não S. cerevisiae, seqüências de controle translacional e não-translacional, e um mutante ou de outro modo proteína de S. cerevisiae ou RNA modificada, se o mutante surgir ou não pela seleção ou for projetado em S. cerevi- siae. Além disso, construções que possuem uma proteína de S. cerevisiae tipo selvagem sob o controle translacional e/ou transcricional de um elemento regulatório anormal (promo- tor induzível, melhoria, etc.) é também considerado ser DNA anormal.

A metabolização de uma fonte de carbono é dita ser "equilibrado", quando o NADH produzido durante as reações de oxidação da fonte de carbono igual ao NADH utilizado para converter acetil-CoA a metabolização dos produtos finais. Somente sobe estas condições todo o NADH é reciclado. Sem reciclagem, o raio NADH / NAD+ se torna desequilibrado (ou seja, aumenta), o qual pode levar o organismo a morrer, em última instância, a menos que uma série de reações químicas metabólicas alternadas esteja disponível para manter um raio NADH / NAD+.

Em certas modalidades, o rendimento de n-butanol é mais elevado se o microrga- nismo não utilizar respiração aeróbia ou anaeróbia uma vez que o carbono for perdido na forma de dióxido de carbono em tais casos.

Em certas modalidades, o microorganismo produz n-butanol fermentativamente sob condições anaeróbicas para que o carbono não seja perdido na forma de dióxido de carbo- no.

O termo “respiração aeróbica” refere-se a uma via respiratória na qual o oxigênio é o aceptor de elétron final e a energia é tipicamente produzida na forma de uma molécula ATP. O termo “via respiratória aeróbica” é utilizada permutavelmente com a expressão “me- tabolismo aeróbico”, “metabolismo oxidativo” ou “respiração celular”.

Por outro lado, o termo “respiração anaeróbica” refere-se a uma via respiratória na qual o oxigênio não é o aceptor de elétron final e a energia é tipicamente produzida na forma de uma molécula ATP. Isto inclui uma via respiratória na qual uma outra molécula orgânica ou inorgânica que não oxigênio, (por exemplo, nitrato, fumarato, dimetilsulfoxido, compostos de enxofre tais como, sulfato, e óxidos metálicos) seja o aceptor de elétron final. A expres- são “via respiratória anaeróbica” é utilizada aqui permutavelmente com a expressão “meta- bolismo anaeróbico” e “respiração anaeróbica”.

“Respiração anaeróbica” deve ser distinguida de “fermentação”. Na “fermentação”, NADH doa seus elétrons a uma molécula produzida pela mesma via metabólica que produ- ziu os elétrons realizados em NADH. Por exemplo, em uma das séries de reações químicas fermentativas do E. coli, o NADH gerado através da glicólise transfere seus elétrons para piruvato, rendendo lactato.

Um microorganismo operando sob condições fermentativas só pode metabolizar uma fonte de carbono, se a fermentação for "equilibrada". A fermentação é dito ser "equili- brada", quando o NADH produzido durante as reações de oxidação da fonte de carbono é igual ao NADH utilizado para converter acetil-CoA à fermentação dos produtos finais. So- mente sob estas condições todo o NADH é reciclado. Sem reciclagem, o raio NADH / NAD+ se torna desequilibrado o que leva o organismo a morrer, em última instância, a menos que séries de reações químicas metabólicas estejam disponíveis para manter um equilíbrio do raio NADH / NAD+. Uma prova escrita de fermentação é dito ser "equilibrada", quando os hidrogênios produzidos durante as oxidações são iguais a hidrogênios transferidos para a fermentação dos produtos finais. Somente sob estas condições é todo o NADH e reduziu ferredoxina reciclada para formas oxidadas. É importante saber se uma fermentação é equi- librada, porque, se não for, então a reação global escrita está incorreta.

Condições anaeróbicas são preferidas para um alto rendimento de n-butanol produ- zindo microorganismos. A Figura 2 ilustra uma série de reações químicas em levedura que converte uma fonte de carbono de n-butanol, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Este percurso pode ser considerado como tendo duas partes distintas, que incluem (1) conversão de uma fonte de carbono para acetil-CoA, e (2) conversão de acetil-CoA a n-butanol. Devido à compartimentação das reações metabólicas em leveduras (e outros eucarióticos) e para assegurar a geração de acetil-CoA adequada a partir da glicose para conduzir a segunda parte do percurso, a produção de acetil-CoA no citosol é necessária e, portanto, aumentou em certas variantes projetadas descritas aqui divulgadas.

Relevante à parte (1) da conversão de uma fonte de carbono para butanol, um mi- croorganismo da levedura pode ser projetado para elevar o fluxo de piruvato a acetil-CoA no citosol.

Conforme mostrado na figura 3, S. cerevisiae gera acetil-CoA na mitocôndria e no citosol. Uma vez que a conversão de acetil-CoA a n-butanol participa no citosol, a geração de acetil-CoA no citosol é aumentada na celular projetada. Opcionalmente, a geração de acetil-CoA no mitocôndrio pode ser reduzida ou reprimida.

Em uma modalidade, o acetil-CoA pode ser gerado a partir de piruvato pelo aumen- to do fluxo através da "passagem secundária de desidrogenase piruvato" citosólica (Prank et al.(1996). Levedura 12 (16): 1607), conforme ilustrado na figura 3, Etapas 1 a 3. Para au- mentar o fluxo por essa rota, uma ou mais das enzimas de piruvato descarboxilase (PDC), aldeído desidrogenase (ALD) e acetil-CoA sintase (ACS), pode ser superexpressada.

Esta manipulação de aumentar a atividade ou o fluxo da rota da "passagem secun- dária de PDH" pode resultar na obtenção de um rendimento e butanol de mais de 5% do máximo teórico.

Uma vez que esta rota da produção de acetil-CoA gera acetaldeído como um inter- mediário, é preferível minimizar o desvio de acetaldehye em percursos distantes da síntese de acetil-CoA, principalmente, a redução adicional do acetaldeído a etanol pela atividade das enzimas de álcool desidrogenase (ADH). Portanto, reduzir ou eliminar a atividade de ADH pode aumentar a geração de acetil-CoA através da série de reações químicas na pas- sagem secundária de desidrogenase de piruvato.

Como um exemplo, o genoma da levedura Crabtree positivo do Saccharomyces ce- revisiae contém 7 ADH genes conhecidos. Destes, ADH1 é a fonte predominante de ativida- de ADH citosólica, e células suprimidas por ADHI não são capazes de crescer anaerobica- mente (Drewke et al., (1990). J. Bacteriology 172 (7): 3909) Deste modo, ADH1 pode ser preferencialmente suprimido para minimizar a conversão de acetaldeído a etanol. No entan- to, outras isoformas ADH podem catalisar a redução de acetaldeído a etanol, e é contem- plada a sua redução ou supressão também. Esta manipulação de diminuir o acetaldeído convertido para o etanol, independen- temente ou em combinação com o acima descrito aumento do fluxo da "passagem secundá- ria de PDH" pode resultar na obtenção de um rendimento de butanol de mais de 10% do máximo teórico.

Além disso, piruvato desidrogenase catalisa a conversão direta de piruvato a acetil- CoA e CO2, enquanto reduz NAD+ para NADH. Assim, em determinadas modalidades, um piruvato desidrogenase é superexpressado no citosol da levedura. Alternativamente, o piru- vato é convertido em formiato e acetil-CoA, e o formiato resultante é ainda metabolizado para CO2 pela atividade de formiato desidrogenase, que também reduz NAD+ para NADH.

Uma vez que a produção das rotas de acetil-CoA acima-mencionadas utiliza piruva- to como um substrato, é preferível minimizar o desvio de piruvato em outros percursos me- tabólicos. A atividade do Piruvato descarboxilase (PDC) representa uma importante rota citoplasmática do metabolismo de piruvato. Portanto, reduzir ou eliminar as atividades de PDC pode aumentar ainda a geração de acetil-CoA pelas rotas acima-mencionadas

A manipulação dos percursos metabólicos para converter piruvato a acetil-CoA, em combinação com a eliminação da atividade de PDC (eliminando, assim, a rota de "passa- gem secundária de PDH") pode alcançar um rendimento de butanol de mais de 50% do má- ximo teórico. Essa melhora é o resultado de três importantes manipulações dos percursos metabólicos nativos das células de levedura: (1) eliminar a perda de carbono através da produção de etanol; (2) eliminar uma atividade energeticamente dispendiosa da sintetase de acetil-CoA nas células; e (3) equilibrando a produção e o consumo de co-fatores (por exem- plo, NAD+ / NADH) para todo o percurso envolvido na conversão de glicose para butanol (4 NADH produzidos a partir de glicose para acetil-CoA e 4 NADH consumidos através do ace- til-CoA para a conversão do butanol). As últimas duas manipulações irão contribuir princi- palmente para o aumento do rendimento elevando a capacidade metabólica global de célu- las hospedeiras de levedura, facilitando assim a função do percurso do butanol tornando ATP, disponível para processos biossintéticos e reduzir o desequilíbrio do raio NAD+ / NADH na célula.

Relevante à parte (2) de converter uma fonte de carbono para butanol, uma levedu- ra pode ser projetada para converter acetil-CoA para butanol.

Em uma modalidade ilustrada, acetil-CoA é convertido para acetoacetil-CoA pela acetil-CoA-acetiltransferase, acetoacetil-CoA é convertido para hidroxibutiril-CoA por hidro- xibutiril-CoA desidrogenase, hidroxibutiril-CoA é convertido para crotonil-CoA por crotonase, crotonil-CoA é convertido para butiril-CoA por butiril-CoA desidrogenase (bcd). Bcd exige a presença e a atividade de proteínas de transferência de elétrons (etfA e etfB), a fim de aco- plar a redução de crotonil-CoA para a oxidação do NADH. Butiril-CoA é então convertido para butiraldeído e butiraldeído é convertido para butanol por butiraldeído desidrogenase / butanol desidrogenase. As enzimas podem ser de C. acetobutylicum.

Um exemplo da segunda parte do percurso para a conversão de acetil-CoA a n- butanol utilizando uma série de reações químicas anormais expressas com os genes de bactérias solventogenic, por exemplo, de espécie Clostridium, é descrita no Pedido de Pa- tente U.S. N0 de série 11/949,724, depositado em 3 de dezembro de 2007, que é incorpora- do neste documento por referência.

Em algumas modalidades, o microorganismo recombinante pode expressar um ou mais genes anormais que codificam para as enzimas que conferem a capacidade de produ- ção de n-butanol. Por exemplo, microrganismos recombinantes podem expressar genes anormais que codificam um ou mais de um piruvato desidrogenase (PDH) anaerobicamente ativo, Piruvato Formiato Iiase (PFI), formiato desidrogenase dependente de NADH (FDH)1 acetil-CoA-acetiltransferase (tiolase), hidroxibutiril-CoA desidrogenase, crotonase, butiril- CoA desidrogenase, desidrogenase butiraldeído, n-butanol desidrogenase, butiraldeído / n- butanol desidrogenase bifuncional. Essas seqüências de DNA anormais são preferencial- mente obtidas a partir de um microorganismo anormal (tais como Clostridium acetobutylicum ou Clostridium beijerinckii), e um ou mais destes genes anormais podem ser introduzidos em um hospedeiro adequado utilizando convencionalmente técnicas de biologia molecular. Es- tas seqüências de DNA anormais permitem que microorganismo recombinante produza n- butanol, pelo menos para produção de n-butanol ou o(s) metabolismo(s) intermediário(s) do mesmo em uma quantidade maior que o produzido pelo microrganismo de tipo selvagem homólogo.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito expressa uma Tiolase anormal ou acetil-CoA-acetiltransferase, como uma codificada por um gene thl de um Clostridium.

Tiolase (E.C. 2.3.1.19) ou acetil-CoA acetiltransferase, é uma enzima que catalisa a

condensação de um grupo acetil para uma molécula acetil-CoA. A enzima é, em C. aceto- butylicum, codificada pelo gene thl (GenBank U08465 adesão, proteína AAA82724.1 ID), que foi superexpressada, entre outras enzimas, em E. coli sob o seu promotor nativo para a produção de acetona (Bermejo et al., Appl. Environ. Mirobiol. 64:1079-1085, 1998). Enzimas 30 homólogas foram também identificadas, e podem ser identificados realizando uma pesquisa BLAST contra a seqüência da proteína acima. Estes homólogos também podem servir como tiolases adequadas em um percurso de n-butanol expressa anomalamente. Somente para citar algumas, estas enzimas homólogas incluem, mas não estão limitados a, aquelas de C. acetobutylicum sp. (por exemplo, a proteína AAC26026.1 ID), C. pasteurianum (por exem- 35 plo, a proteína ABA18857.1 ID), C. beijerinckii sp. (por exemplo, a proteína ID EAP59904.1 ou EAP59331.1), Clostridium perfringens sp. (por exemplo, a proteína ID ABG86544.1, ABG83108.1), Clostridium difficile sp. (por exemplo, a proteína ID CAJ67900.1 ou ΖΡ_01231975.1), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (por exemplo, a proteína CAB07500.1 ID), Thermoanaerobactertengcongensis (por exemplo, AAM23825.1), Car- boxydothermus hydrogenoformans (por exemplo, a proteína ABB13995.1 ID), Desulfotoma- culum reducens Ml -1 (por exemplo, a proteína EAR45123.1 ID), Candida tropicalis (por e- 5 xemplo, a proteína ID BAA02716.1 ou BAA02715.1), Saccharomyces cerevisiae (por exem- plo, a proteína ID AAA62378.1 ou CAA30788.1), Bacillus sp., Megasphaera elsdenii, e Butr- yivibrio fibrisolvens. Além disso, o endógeno S. cerevisiae tiolase poderia também ser ativo em um percurso de n-butanol anomalamente expressas (ScERGIO).

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% 10 seqüência de identidade, ou, pelo menos, cerca de 65%, 70%, 80% ou 90% seqüência ho- móloga, conforme calculado pelo NCBI1S BLAST, são tiolase homóloga adequada que po- dem ser utilizados em microorganismos recombinantes da presente invenção. Tais homólo- gos incluem, mas não estão limitados a, Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00909576.1 ou ZP_00909989.1), Clostridium acetobutylicum ATCC 824 15 (NP_149242.1), Clostridium tetani E88 (NP_781017.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP 563111.1), Clostridium perfringens SM101 (YP_699470.1), Clostridium pasteurianum (ABA18857.1), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (CAB04793.1), Clostridium difficile QCD-32g58 (ZP_01231975.1), e Clostridium difficile 630 (CAJ67900. 1).

Em certas modalidades, microrganismos recombinantes da presente invenção ex- pressam uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase anormal, tal como uma codificada por um gene hbd de um Clostridium.

O 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (BHBD) é uma enzima que catalisa a conver- são de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA. Existem diferentes variantes desta enzima que produzem o (S) ou o (R) do isômero 3 -hidroxibutiril-CoA. Enzimas homólogas podem 25 ser facilmente identificadas por um versado na técnica, por exemplo, realizando uma pes- quisa BLAST contra o acima-mencionado C. acetobutylicum BHBD. Todas estas enzimas homólogas poderiam servir como um BHBD em um percurso do n-butanol expresso de for- ma anormal. Estas enzimas homólogas incluem, mas não estão limitadas a: Clostridium kluyveri, que expressa duas formas distintas desta enzima (Miller et al., J. Bacteriol. 138:99- 30 104, 1979), e Butyrivibrio fibrisolvens, que contém um gene bhbd que é organizado dentro do mesmo Iocus do resto do seu percurso de butirato (Asanuma et al. Current Microbiology 51 :91-94, 2005; Asanuma et al. Current Microbiology 47:203-207, 2003). Um gene que codi- fica para uma cadeia curta acil-CoA desidrogenase (SCAD) foi clonado a partir de Megas- phaera elsdenii e expressos em E. coli. A Atividade in vitro pode ser determinada (Becker et 35 al., Bioquímica 32:10736-10742, 1993). Outros homólogos foram identificados em outras espécies de Clostridium como o C. Kluyveri (Hillmer et al., FEBS Lett. 21 :351-354, 1972; Madan et al. Eur. J. Biochem. 32:51-56, 1973), C. beijerinckii, C. thermosaccharolyticum, C. tetani.

Em certas modalidades, onde um BHBD é expresso, pode ser benéfico selecionar uma enzima do mesmo organismo thiolase a montante ou crotonase a jusante originários. Isso pode evitar crises de interações proteína-proteína potenciais entre proteínas adjacentes 5 na série de reações químicas, quando as enzimas de diferentes organismos são expressas.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito expressa um crotonase anormal, tal como um codificado por um gene crt de um Clostridium.

Crotonases ou enoil-CoA hidratases são enzimas que catalisam a hidratação rever- sível de substratos cis e trans enoil-CoA para o correspondente derivado de hidroxiacil β- CoA. Em C. acetobutylicum, esta etapa do metabolismo é catalisada por butanoato EC 4.2.1.55, codificada pelo gene crt (proteína GenBank adesão AAA95967, Kanehisa, Novartis Found Symp. 247:91-101, 2002; discussão 01-3, 19 -28, 244-52). O crotonase (CRT) de C. acetobutylicum foi purificado à homogeneidade e caracterizado (Waterson et al., J. Biol. Chem. 247:5266-5271, 1972). Ele se comporta como uma proteína homogênea em ambos os estados nativo e desnaturado. A enzima parece funcionar como um tetrâmero com peso molecular de uma subunidade de 28,2 kDa e 261 resíduos (Waterson et al. relata uma mas- sa molecular de 40 kDa e um comprimento de 370 resíduos). A enzima purificada perdeu atividade quando armazenada em soluções tampão a 4o C ou quando congelados (Water- son et al., J. Biol. Chem. 247:5266-5271, 1972). O pH ótimo para a enzima é pH 8,4 (S- chomburg et al., Nucleic Acids Res. 32: D431-433, 2004). Ao contrário dos mamíferos croto- nases que têm uma ampla especificidade de substrato, a enzima bacteriana hidrata apenas crotonil-CoA e hexenoil-CoA. Os valores de Vmax e Km de 6,5 x 106 mol por minuto por mol e 3 x 10'5 M foram obtidos para crotonil-CoA. A enzima é inibida pelas concentrações de cro- tonil-CoA mais elevadas do que 7 x 105 M (Waterson et al. J. Biol. Chem. 247:5252-5257, 1972; Waterson et al., J. Biol. Chem. 247:5258-5265, 1972).

As estruturas de muitas das famílias crotonase de enzimas têm sido resolvidos (Engel et al., J. Mol. Biol. 275:847-859, 1998). O gene Crt é altamente expresso em E. coli e exibe uma atividade específica maior do que em C. acetobutylicum (187,5 U/mg de mais de 128,6 U/mg) (Boynton et al., J. Bacteriol. 178:3015-3024, 1996 ). Uma série de diferentes 30 homólogos de crotonase é codificada em eucarióticos e procarióticos que funcionam como parte do metabolismo do butanoato, síntese de ácidos graxos, /?-oxidação e outros percur- sos relacionados (Kanehisa, Novartis Found Symp. 247:91-101, 2002; discussão 01 -3, 19- 28, 244-52; Schomburg et al., Nucleic Acids Res. 32: D431-433, 2003). Algumas dessas enzimas têm sido bem-estudadas. Enoil-CoA hidratase proveniente de fígado bovino é ex- 35 tremamente bem-estudado e pelo todo caracterizado (Waterson et al., J. Biol. Chem. 247:5252-5257, 1972). Um alinhamento CIustaIW de 20 mais orthologs próximos de croto- nase é gerado a partir de bactérias. Os homólogos variam em seqüência de identidade 40 a 85%.

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou 70% da seqüência de identidade, ou, pelo menos, cerca de 55%, 65%, 75% ou 85% seqüência homóloga, conforme calculado pelo NCBI's BLAST, são homólogos Crt adequáveis que po- 5 dem ser utilizados em microorganismos recombinantes da presente invenção. Tais homólo- gos incluem, mas não estão limitados a, Clostridium tetani E88 (NP_782956.1), Clostridium perfringens SM101 (YP_699562.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563217.1), Clostridi- um beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00909698.1 ou ZP_00910124.1), Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei str. Goettingen (YP_754604.1), Desulfotomaculum reducens IA-1 10 (ZP_01147473.1 ou ZP_01149651.1), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (CAB07495.1), e Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901 (YP_360429.1).

Estudos em Clostridia demonstram que o gene crt que codifica para crotonase é codificado como parte da maior BCS operon. No entanto, os estudos sobre B. fibriosolvens, um butirato produzindo uma bactéria do rúmen, mostra um arranjo estritamente diferente. Enquanto o Tipo I B. fibriosolvens tem os genes thl, crt, hbd, bcd, etfA e etfB agrupados e organizados como parte de um operon, as espécies do Tipo Il têm um cluster semelhante, mas falta o gene crt (Asanuma et ai, Curr. Microbiol. 51 :91-94, 2005; Asanuma et al., Curr. Microbiol. 47:203-207, 2003). Uma vez que a proteína está bem-expressada em E. coli e pelo todo caracterizada, a enzima C. acetobutylicum é a para a enzima preferida para o per- curso do n-butanol expresso de forma anormal. Outros possíveis alvos são genes homólo- gos de Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii (Q7P3U9-Q7P3U9_FUSNV), Clostridium difficile (P45361-CRT-CLODI), Clostridium pasteurianum (P81357-CRT_CLOPA) e Brucella melitensis (Q8YDG2-Q8YDG2_BRUME). [0091] Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito manifesta um butiril-CoA desidrogenase anormal e, se necessá- rio, as proteínas correspondentes da transferência de elétrons, tais como codificadas pelos genes bcd, etfA, e etfB de um Clostridium.

O acetobutylicum C. butiril-CoA desidrogenase (bcd) é uma enzima que catalisa a redução da dupla ligação carbono-carbono em crotonil-CoA para render butiril-CoA. Esta redução está associada à oxidação do NADH. No entanto, a enzima exige duas proteínas de transferência de elétrons etfA e etfB (Bennett et al. Ferns Microbiology Reviews 17:241-249, 1995).

O gene Clostridium acetobutylicum ATCC 824 que codifica as enzimas beta- hidroxibutiril-coenzima A (CoA) desidrogenase, crotonase e butiril-CoA desidrogenase estão agrupadas no BCS operón, cujo número adesão GenBank é U17110.

A seqüência de proteína de butiril-CoA desidrogenase (bcd) (No. de adesão

GENBANK AAA95968.1) é dado em SEQ ID No: 3.

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% da seqüência de identidade, ou, pelo menos, cerca de 70%, 80%, 85% ou 90% da seqüên- cia homóloga, conforme calculado pelo NCBI's BLAST, são homólogos Bcd adequáveis que podem ser utilizados em microorganismos recombinantes da presente invenção. Tais homó- logos incluem, mas não estão limitados a, Clostridium tetani E88 (NP_782955.1 ou 5 NP 781376.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563216.1), Clostridium beijerinckii (AF494018_2), Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00910125.1 ou ZP_00909697.1), e Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (CAB07496.1), Thermoanaerobacter teng- congensis MB4 (NP_622217.1).

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou 70% 10 da seqüência de identidade, ou, pelo menos, cerca de 60%, 70%, 80% ou 90% da seqüên- cia homóloga, conforme calculado pelo NCBI1S BLAST, são homólogos Hbd adequáveis que podem ser utilizados no microorganismo recombinante aqui descritos. Tais homólogos in- cluem, mas não estão limitados a, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (NP_349314.1), Clostridium tetani E88 (NP 782952.1), Clostridium perfringens SM101 (YP_699558.1), Clos- 15 tridium perfringens str. 13 (NP_563213.1), Clostridium saccharobutylicum (AAA23208.1), Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00910128.1), Clostridium beijerinckii (AF494018_5), Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 (NP_622220.1), Thermoanaero- bacterium thermosaccharolyticum (CAB04792.1), e Alkaliphilus metalliredigenes QYMF (ZP_00802337.1).

A Km de Bcd para butiril-CoA é 5. C. acetobutylicum bcd e os genes que codificam

as respectivas ETFs tem sido clonados em um vetor aleatório de E co//-acetobutylicum C. A atividade elevada de Bcd foi detectada em C. acetobutylicum ATCC 824 transformada com este plasmídeo (Boynton et al., Journal of Bacteriology 178:3015-3024, 1996). A km do C. acetobutylicum P262 Bcd para butiril-CoA é de aproximadamente 6 μΜ (DiezGonzaIez et al. 25 Current Microbiology 34:162-166, 1997). Homólogos de Bcd e os respectivos ETFs foram identificados na produção de butirato de Megasphaera elsdenii (Williamson et al. Biochemi- cal Journal 218:521-529, 1984), Peptostreptococcus elsdenii (Engel et al. Biochemical Jour- nal 125:879, 1971 ), Syntrophospora bryanti (Dong et al., Antonie van Leeuwenhoek Interna- tional Journal of General and Molecular Microbiology 67:345-350, 1995), e Treponema 30 phagedemes (George et al., Journal of Bacteriology 152:1049-1059, 1982) anaeróbios. A estrutura da M. elsdenii Bcd foi resolvido (Djordjevic et al., Biochemistry 34:2163-2171, 1995). Uma pesquisa BLAST de C. acetobutilicum ATCC 824 Bcd identificou uma grande quantidade de seqüências homólogas de uma ampla variedade de espécies, algumas dos homólogos estão listados acima. Qualquer um dos genes que codificam esses homólogos 35 pode ser utilizado para a presente invenção. Note-se que a expressão questões, questões de transferência de elétrons, ou ambas as questões, podem surgir quando de forma anormal expressar esses genes em um microrganismo (tal como o E. coli), mas não em outro. Além disso, uma enzima homóloga pode ter expressão e/ou a questão de transferência de elé- trons em um determinado microrganismo, mas outras enzimas homólogas não podem. A disponibilidade de genes diferentes, em grande medida equivalente fornece mais opções de projeto quando projetando o microorganismo recombinante.

5 Um promissor bcd que já foi clonado e expresso em E. coli é de Megasphaera els-

denii, e a atividade in vitro da enzima expressa poderia ser determinada (Becker et al., Bio- química 32:10736-10742, 1993). 0'Neill et al. relatou a clonagem e expressão anormal em E. coli do gene etfA e eftB e caracterização funcional das proteínas codificadas de Megas- phaera elsdenii (0'Neill et al., J. Biol. Chem. 273:21015-21024, 1998). A atividade foi medida 10 com O ensaio ETF que acopla a oxidação NADH para a redução de crotonil-CoA via Bcd. A atividade d ETF recombinante no ensaio FEF com Bcd é semelhante ao da enzima nativa como relatado por Whitfield e Mayhew. Portanto, utilizar a Megasphaera elsdenii Bcd e as suas proteínas ETF fornece uma solução para sintetizar butiril-CoA. O km da M. elsdenii Bcd foi medido como 5 μΜ quando expresso de forma recombinante, e 14 μΜ quando expresso 15 no hospedeiro nativo (Duplessis et al. 37:10469-77 Bioquímica, 1998). M. elsdenii Bcd pare- ce ser inibida por acetoacetato em concentrações extremamente baixas (K, - de 0,1 M) (Vanberkel et al. Eur. J. Biochem. 178:197-207, 1988). Um gene cluster contendo thl, crt, hbd, bcd, etfA, e etfB foi identificado em dois butiratos produzindo espécies de Butyrivibrio fibrisolvens. A similaridade da seqüência de aminoácidos destas proteínas é alto, em com- 20 paração com Clostridium acetobutylicum (Asanuma et al. Current Microbiology 51 :91-94, 2005; Asanuma et al. Current Microbiology 47:203-207, 2003). Nos sistemas de mamíferos, uma enzima similar, envolvida na oxidação de ácidos graxos de cadeia curta é encontrada nas mitocôndrias.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito expressa uma "trans-2-enoil-CoA redutase" ou "TER" anormal.

Trans-2-enoil-CoA redutase ou TER é uma proteína que é capaz de catalisar a con- versão de crotonil-CoA para butiril-CoA. Em certas modalidades, o microorganismo recom- binante expressa um TER que catalisa a mesma reação que bcd / EtfA / EtfB de Clostridia e outras espécies bacterianas. TER mitocondrial de E. gracilis tem sido descrita, e muitas pro- 30 teínas TER e proteínas com atividade TER derivada de um número de espécies foram iden- tificadas formando uma família de proteína TER (Pat. Appl. U.S. 2007/0022497 para Cirpus et al.; Hoffmeister et al., J. Biol. Chem., 280:4329-4338, 2005, ambas as quais são incorpo- radas na íntegra por referência neste documento). A cDNA truncado do gene E. gracilis foi funcionalmente expressado em E. coli. Este cDNA ou os genes dos homólogos de outros 35 microorganismos podem ser expressos em conjunto com o percurso de n-butanol genes THL, crt, adhE2, e hbd para produzir n-butanol em E. coli, S. cerevisiae ou outros hospedei- ros. Proteínas TER também podem ser identificadas por métodos de bioinformática ge- ralmente bem-conhecidos, tal como BLAST. Exemplos de proteínas TER incluem, mas não estão limitados a, capítulos de espécies, tais como: Euglena spp. incluindo, mas não se limi- tando a, E. gracilis, Aeromonas spp. incluindo, mas não limitados, a A. hydrophila, Psychro- 5 monas spp. incluindo, mas não se limitando a, p. ingrahamii, Photobacterium spp. incluindo, mas não limitados, a P. profundum, Vibrio spp. incluindo, mas não limitados, a V angustum, V. cholerae, V alginolyticus, V parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fischeri, V splendidus, Shewanella spp. incluindo, mas não se limitando a, S. amazonensis, S. woodyi, S. frigidima- rina, S. paeleana, S. baltica, S. denitrificans, Oceanospirillum spp. Xanthomonas spp. inclu- 10 indo, mas não se limitando a, X oryzae, X campestris, Chromohalobacter spp. incluindo, mas não limitados, a C. salexigens, Idiomarina spp. incluindo, mas não limitados, a I. baltica, Pseudoalteromonas spp. incluindo, mas não se limitando a, P. atlantica, Alteromonas spp. Saccharophagus spp. incluindo, mas não se limitando a, S. degradans, S. marinho proteo- bacterium gamma, S. alpha proteobacterium, Pseudomonas spp. incluindo, mas não se Iimi- 15 tando a, P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, Burkholderia spp. incluindo, mas não se limitando a, B. phytofirmans, B. cenoespéciecia, B. espéciecia, B. ambifaria, B. vietnamen- sis, B. multivorans, B. dolosa, Methylbacillus spp. incluindo, mas não se limitando a, M. fla- geliatus, Stenotrophomonas spp. incluindo, mas não se limitando a, S. maltophilia, Congre- gibacter spp. incluindo, mas não se limitando a, C. litoralis, Serratia spp. incluindo, mas não 20 se limitando a, S. proteamaculans, Marinomonas spp. Xytella spp. incluindo, mas não se limitando a, X fastidiosa, Reinekea spp. Colwellia spp. incluindo, mas não se limitando a, C. psychrerythraea, Yersinia spp. incluindo, mas não se limitando a, Y. pestis, Y. pseudotuber- culosis, Methylobacillus spp. incluindo, mas não se limitando a, M flageliatus, Cytophaga spp. incluindo, mas não se limitando a, C. hutchinsonii, Flavobacterium spp. incluindo, mas 25 não se limitando a, F. johnsoniae, Microscilla spp. incluindo, mas não se limitando a, M ma- rina, Polaribacter spp. incluindo, mas não se limitando a, p. irgensii, Clostridium spp. incluin- do, mas não se limitando a, C. acetobutylicum, C. beijerenckii, C. cellulolyticum, Coxiella spp. incluindo, mas não se limitando a, C. burnetii.

Além do exposto, os termos "trans-2-enoil-CoA redutase" ou "TER" referem-se a 30 proteínas que são capazes de catalisar a conversão de crotonil-CoA para butiril-CoA e que partilham, pelo menos, cerca de 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seqüência de identidade ou, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de similaridade da se- qüência, conforme calculado pelo NCBI BLAST, utilizando parâmetros padrão, para um ou 35 por ambos os E. gracilis TER truncados ou a totalidade do comprimento de A. hydrophila TER.

Conforme utilizado aqui, "seqüência de identidade" refere-se à ocorrência de exa- tamente o mesmo nucleotídeo ou aminoácido na mesma posição em seqüências alinhadas. "Seqüência de similaridade" leva jogos aproximados em conta, e só faz sentido quando tais substituições são pontuadas de acordo com um certo grau de "diferença" ou "semelhança" com substituições conservadoras ou muito prováveis atribuídas a pontuações mais favorá- veis que os não-conservadores ou improváveis.

Outra vantagem da utilização do TER, ao invés de bcd / EtfA / EtfB ser aquele TER é ativo como um monômero e nem a expressão da proteína, nem a própria enzima é sensí- vel ao oxigênio.

Conforme utilizado aqui, "trans-2-enoil-CoA redutase (TER) homólogo" refere-se a uma polipeptídios de enzima homóloga de outros organismos, por exemplo, pertencente ao filo Euglena ou Aeromonas, que têm as mesmas características essenciais do TER como acima definido, mas partilha menos que 40% da seqüência de identidade e 50% da seqüên- cia de similaridade padrão conforme discutido acima. Mutações engloba substituições, a- créscimos, supressões, inversões ou inserções de um ou mais resíduos de aminoácidos. Isto permite que a expressão da enzima durante uma fase aeróbia cresça e a fase de ex- pressão do processo do n-butanol, que poderia potencialmente permitir para um ou mais processos eficientes de produção de biocombustível.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito manifesta um butiraldeído desidrogenase / n-butanol desidrogenase anormais, tal como codificadas pelos genes bdhA / bdhB, aad, ou adhE2 de uma Clostridium.

O butiraldeído desidrogenase (BYDH) é uma enzima que catalisa a redução depen- dente de NADH de butiril-CoA para butiraldeído. Butiraldeído é ainda reduzido a n-butanol por um n-butanol desidrogenase (BDH). Esta redução é também acompanhada pela oxida- ção de NADH. Clostridium acetobutylicum contém genes de várias enzimas que têm sido mostrados para converter butiril-CoA a n-butanol.

Uma destas enzimas é codificada por aad (Nair et al., J. Bacteriol. 176:871 - 885, 1994). Este gene é referido como adhE em espécie de C. acetobutylicum DSM 792. A enzi- ma faz parte do operon sol e que codifica para uma BYDH / BDH bifuncional (Fischer et al., Journal of Bacteriology 17'5 :6959-6969, 1993; Nair et ai, J. Bacteriol. 176:871 - 885, 1994).

O produto do gene aad foi funcionalmente expressado em E. coli. No entanto, em condições aeróbias, a atividade resultante manteve-se muito baixa, indicando sensibilidade ao oxigênio. Com um superior a 100 vezes maior em comparação à atividade para butiralde- ído acetaldeído, o principal papel da Aad está na formação de n-butanol em vez de etanol (Hair et al., Journal of Bacteriology 176:5843-5846, 1994).

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 50%, 55%, 60% ou 65% da seqüên- cia de identidade, ou, pelo menos, cerca de 70%, 75% ou 80% da seqüência homóloga, conforme calculado pelo NCBI BLASTs, são homólogos adequáveis que podem ser utiliza- dos nos microorganismos recombinantes aqui descritos. Tais homólogos incluem (sem limi- tação): Clostridium tetani E88 (NP_781989.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563447.1), Clostridium perfringens ATCC 13124 (YP_697219.1), Clostridium perfrin- gens SM101 (YP_699787.1), Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00910108.1), Clostri- 5 dium acetobutylicum ATCC 824 (NP_149199.1), Clostridium difficile 630 (CAJ69859.1), Clostridium difficile QCD-32g58 (ZP_01229976.1), e Clostridium thermocellum ATCC 27405 (ZP_00504828.1).

Dois n-butanol desidrogenases dependentes de NADH adicionais de (BDH I, Il BDH) têm sido purificados, e seus genes (bdhA, bdhB) clonados. A adesão GenBank para BDH I é AAA23206.1, e a seqüência de proteínas é dada em SEQ ID NO: 10.

A adesão GenBank para BDH Il é AAA23207.1, e a seqüência de proteínas é dada em SEQ ID NO: 11.

Estes genes são adjacentes no cromossomo, mas são transcritas pelos seus pró- prios promotores (Walter et al., Gene 134:107-111, 1993). BDH utiliza NADPH como co- fator, enquanto BDH Il utiliza NADH. No entanto, é notado que a relativa preferência do co- fator é dependente de pH. A atividade de BDH I foi observada em E. coli expressando bdhA Iisados depois de um plasmídeo (Petersen et al., Journal of Bacteriology 173:1831 - 1834, 1991). BDH Il foi relatado ter uma atividade 46 vezes maior com butiraldeído do que com acetaldeído e é 50 vezes menos ativo na direção inversa. BDH I é apenas cerca de duas vezes mais ativos com butiraldeído do que com acetaldeído (Welch et al., Archives of Bio- chemistry and Biophysics 273:309-318, 1989). Assim, em uma modalidade, BDH Il ou um homólogo do BDH Il é utilizado em um percurso de n-butanol expresso de forma anormal. Além disso, estas enzimas são mais ativas sob um pH relativamente baixo de 5,5, traço no qual deve ser levado em consideração quando na escolha de um hospedeiro e/ou condições de processo apropriados.

Enquanto os genes acima-mencionados são transcritos em condições solventoge- nic, um outro gene, adhE2 está transcrito sob condições alcoologênicas (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830, 2002, adesão GenBank No. AF321779). Essas condições estão pre- sentes no pH relativamente neutro. A enzima tem sido superexpressada em culturas anae- 30 róbicas de E. coli e com altas atividades de BYDH e BDH dependentes de NADH. Em certas modalidades, esta enzima é a enzima preferida. A seqüência de proteína desta enzima (a- desão GenBank No. AAK09379.1) é listada como SEQ ID NO: 1.

Homólogos partilhando, pelo menos, cerca de 50%, 55%, 60% ou 65% da seqüên- cia de identidade, ou, pelo menos, cerca de 70%, 75% ou 80% da seqüência homóloga, conforme calculado pelo NCBI BLASTs, são homólogos adequáveis que podem ser utiliza- dos nos microorganismos recombinantes aqui descritos. Tais homólogos incluem, mas não estão limitados a, Clostridium perfringens SM101 (YP_699787.1), Clostridium perfringens str. 13 (ΝΡ_563447.1), Clostridium perfringens ATCC 13124 (ΥΡ_697219.1), Clostridium tetani Ε88 (ΝΡ_781989.1), Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ΖΡ_00910108.1), Clostridi- um difficile QCD-32g58 (ΖΡ_01229976.1), Clostridium difficile 630 (CAJ69859.1), Clostridi- um acetobutylicum ATCC 824 (NP_149325.1), e Clostridium thermocellum ATCC 27405 (ZP_00504828.1).

Em certas modalidades, quaisquer enzimas homólogas que são pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 99% idênticas, ou partilham, pelo menos, cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% da seqüência homóloga (semelhante) a quaisquer dos polipeptídios acima pode ser usado no lugar desses polipeptídios tipo selvagem. Estas enzimas que partilham a seqüência de identidade ou de similaridade necessária podem ser enzimas tipo selvagem a partir de um organismo diferente, ou podem ser enzimas recombinantes artificiais.

Em certas modalidades, quaisquer genes que codificam para as enzimas com a mesma atividade como quaisquer das enzimas acima podem ser utilizadas no lugar dos ge- nes que codificam as enzimas acima. Estas enzimas podem ser de tipo selvagem enzimas provenientes de um organismo diferente, ou podem ser enzimas artificiais, recombinantes ou projetadas.

Além disso, devido à degeneração inerente do código genético, outras seqüências de ácidos nucléicos que codificam substancialmente o mesmo ou uma seqüência de amino- ácidos funcionalmente equivalente também podem ser utilizadas para clonar e expressar o polinucleotídeo codificando tais enzimas. Como será entendido por aqueles versados na técnica, tal enzima pode ser vantajosa para modificar uma seqüência de codificação para melhorar a sua expressão em um determinado hospedeiro. Os códons que são utilizados com mais frequência em uma espécie são chamados códons ótimos, e os que não são utili- zados muitas vezes são classificados como códons raros ou de baixa utilização. Os códons podem ser substituídos para refletir a o uso preferido do códon do hospedeiro, um processo por vezes denominado "otimização do códon", ou "controle para indução de espécies de códons". A metodologia para otimizar uma seqüência nucleotídica de expressão em uma planta é fornecida, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.015.891, e as referências aí citadas.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito tem uma ou mais seqüências de DNA anormais de um solventogenic Clostridia, tais como Clostridium acetobutylicum ou Clostridium beijerinckii. Um Clostridium acetobutylicum exemplar é espé- cie ATCC824, e um beijerinckii Clostridium exemplar é a espécie NCIMB 8052.

A expressão dos genes pode ser obtida por meios convencionais de biologia mole- cular. Por exemplo, os genes anormais podem estar sob o controle de um promotor induzí- vel ou um promotor constitutivo. Os genes anormais podem ser integrados em um cromos- somo do microorganismo hospedeiro, ou existem como um elemento genético extra- cro- mossômicos que pode ser repercutido estável ("herdado") para a célula filha. Tais elementos genéticos extra-cromossômicos (como plasmídeos, BAC1 YAC1 etc) podem também conter seleção de marcadores que garantam a presença de tais elementos genéticos nas células filhas.

Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito também po- de produzir um ou mais intermediários metabólicos do percurso que produz n-butanol, tal como acetoacetiI-CoA, hidroxibutiril-CoA, crotonil-CoA, butiril-CoA, ou butiraldeído, e/ou seus derivados, como o butirato.

Em algumas modalidades, os microrganismos recombinantes aqui descritos proje- tados para ativar uma ou mais das enzimas anormais acima-mencionados para produzir n- butanol, produção de n-butanol através de um percurso anormal.

Conforme utilizado aqui, o termo "percurso" refere-se a um processo biológico, in- cluindo uma ou mais reações químicas controladas enzimaticamente pelo qual um substrato é convertido em um produto. Do mesmo modo, um percurso para a conversão da fonte de carbono em n-butanol é um processo biológico que inclui uma ou mais reações controladas 15 enzimaticamente pela qual a fonte de carbono é convertida em n-butanol. Um "Percurso anormal" refere-se a um percurso em que, pelo menos, uma das, pelo menos, uma ou mais reações químicas é catalisada por pelo menos uma enzima anormal. Por outro lado, um "percurso nativo" refere-se a um percurso onde a uma ou mais reações químicas é catalisa- da por uma enzima nativa.

Em certas modalidades, os microorganismos recombinantes aqui descritos são pro-

jetados para ativar um n-butanol produzindo uma série de reações químicas anormais (aqui também indicado como percurso do n-butanol), que compreende: (1) Conversão de 2 acetil- CoA para AcetoacetiI-CoA, (2) Conversão de Acetoacetil CoA para Hidroxibutiril-CoA, (3) Conversão de Hidroxibutiril-CoA para Crotonil-CoA, (4) Conversão da Crotonil CoA para 25 butiril-CoA, (5) Conversão de butiraldeído a n-butanol, (ver a ilustração exemplar da figura 2).

A conversão de 2 acetil-CoA para AcetoacetiI-CoA pode ser desempenhada por ex- pressar um gene nativo ou anormal codificando para um acetil-CoA-acetil transferase (tiola- se) ou Thi no microorganismo recombinante. Tiolases exemplares apropriados no microor- 30 ganismo recombinante aqui descrito são codificados por thl de Clostridium acetobutylicum e, em especial a partir de espécie ATCC824 ou um gene codificando uma enzima homóloga de C. pasteurianum, C. beijerinckii, em especial a partir da espécie NCIMB 8052 ou espécie BA101, Candida tropicalis, Bacillus spp. Megasphaera elsdenii, ou Butyrivibrio fibrisolvens, ou um E. coli tiolase selecionados de fadA ou atoB.

A conversão de Acetoacetil CoA para Hidroxibutiril-CoA pode ser desempenhada

por expressar um gene nativo ou anormal codificando para hidroxibutiril-CoA desidrogenase Hbd no microorganismo recombinante. Hbd exemplar adequado no microorganismo recom- binante aqui descrito são codificados por hbd de Clostridium acetobutylicum e, em especial a partir da espécie ATCC824, ou um gene codificando uma enzima homóloga de Clostridium kluyveri, Clostridium beijerinckii e, em especial a partir da espécie NCIMB 8052 ou espécie BA101, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium tetani, Butyrivibrio fibrisolvens, Me- gasphaera elsdenii, ou E. coli (fadB).

A conversão de Hidroxibutiril-CoA para Crotonil-CoA pode ser desempenhada por expressar um gene nativo ou anormal codificando para uma crotonase ou Crt no microorga- nismo recombinante. Crt exemplar apropriado no microorganismo recombinante aqui descri- to são codificados por crt de Clostridium acetobutylicum e, em especial a partir da espécie 10 ATCC824, ou um gene codificando uma enzima homóloga de β. fibriosolvens, Fusobacteri- um nucleatum subsp. Vincentii, Clostridium difficile, Clostridium pasteurianum, ou Brucella abortus.

A conversão de Crotonil CoA para butiril-CoA pode ser desempenhada por expres- sar um gene nativo ou anormal codificando para uma butiril-CoA desidrogenase no microor- 15 ganismo recombinante. Butiril-CoA desidrogenases exemplar adequado no microorganismo recombinante aqui descrito são codificados por bcd / etfA / etfB de Clostridium acetobutyli- cum e, em especial a partir da espécie ATCC824, ou um gene codificando uma enzima ho- móloga de Megasphaera elsdenii, Peptostreptococcus elsdenii, Syntrophospora bryanti, Treponema phagedemes , Butyrivibrio fibrisolvens, ou uma mitocôndria de mamífero Bcd 20 homólogo.

A conversão de butiraldeído a n-butanol pode ser desempenhada por expressar um gene nativo ou anormal codificando para uma butiraldeído desidrogenase ou um n-butanol desidrogenase no microorganismo recombinante. Butiraldeído desidrogenase / n-butanol desidrogenase exemplares adequados no microorganismo recombinante aqui descrito são 25 codificados por bdhA, bdhB, aad, ou adhE2 a partir de Clostridium acetobutylicum e, em especial a partir da espécie ATCC824, ou um gene codificando ADH-1, ADH-2, ou ADH-3 a partir de Clostridium beijerinckii, em especial a partir da espécie NCIMB 8052 ou espécie BA101.

Em certas modalidades, as enzimas da série de reações químicas metabólica de 30 acetil-CoA a n-butanol são: (i) tiolase (Thl), (ii) hidroxibutiril-CoA desidrogenase (Hbd), (iii) crotonase (Crt), (iv) pelo menos uma de álcool desidrogenase (AdhE2), ou n-butanol desi- drogenase (Aad) ou butiraldeído desidrogenase (Aid), juntamente com um monofunctional n- butanol desidrogenase (BdhA / BdhB), e (v) trans-2-enoil-CoA redutase (TER) (Figura 2). Em certas modalidades, o Thi, Hbd, Crt, AdhE2, Aid, BdhA / BdhB e Aad são de Clostridium. 35 Em certas modalidades, o Clostridium é um C. acetobutylicum. Em certas modalidades, o TER é de Euglena gracilis ou de Aeromonas hydrophila.

Em certas modalidades, um ou mais genes anormais codificam uma ou mais de a- cetil-CoA-acetiltransferase (tiolase), hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), crotonase (crt) e álcool desidrogenase (adhE2), butiril-CoA desidrogenase (bcd), butiraldeído desidrogenase (bdhA / bdhB) I butanol desidrogenase (aad), e trans-2-enoil-CoA redutase (TER).

Por exemplo, a acetil-CoA-acetiltransferase (tiolase) pode ser de thl Clostridium a- cetobutylicum, ou uma enzima homóloga de C. pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Can- dida tropicalis, Bacillus sp., Megasphaera elsdenii, ou Butryivibrio fibrisolvens, ou uma E. coli tiolase selecionados a partir de fadA ou atoB.

A hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser hbd de C. acetobutylicum, ou uma en- zima homóloga de Clostridium kluyveri, Clostridium beijerinckii, Clostridium thermosaccha- rolyticum, Clostridium tetani, Butyrivibrio fibrisolvens, Megasphaera elsdenii, ou Escherichia coli (fadB).

A crotonase pode ser crt de Clostridium acetobutylicum, ou uma enzima homóloga de β. fibqosolvens, Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii, Clostridium difficile, Clostridi- um pasteurianum, ou Brucella abortus.

A butiril-CoA desidrogenase pode ser bcd / etfA / etfB de Clostridium acetobutyli-

cum, ou uma enzima homóloga de Megasphaera elsdenii, Peptostreptococcus elsdenii, Syn- trophospora bryanti, Treponema phagedemes, Butyrivibrio fibrisolvens, ou um homólogo eucariótico mitocondrial bcd.

A butiraldeído desidrogenase / butanol desidrogenase pode ser bdhA, bdhB, aad, ou adhE2 de Clostridium acetobutylicum, ou ADH-1, ADH-2, ou ADH-3 de Clostridium beije- rinckii.

A enzima trans-2-enoil-CoA redutase (TER), pode ser proveniente de um Euglena gracilis ou um Aeromonas hydrophila.

A uma ou mais sequência(s) de DNA anormal pode(m) ser proveniente(s) de um 25 solventogenic Clostridium selecionada(s) a partir de Clostridium acetobutylicum ou Clostridi- um beijerinckii, ou a partir de Clostridium difficile, Clostridium pasteurianum, Clostridium kluyveri, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium tetani, Candida tropicalis, Bacillus sp., Brucella abortus, Megasphaera elsdenii, Butryivibrio fibrisolvens, Fusobacterium nuclea- tum subsp. Vincentii, Peptostreptococcus elsdenii, Syntrophospora bryanti, Treponema pha- 30 gedemes, ou E. coli.

Em certas modalidades, o Clostridium acetobutylicum é espécie ATCC824, e o Clostridium beijerinckii é espécie NCIMB 8052 ou espécie BA101. Em certas modalidades, homólogos partilhando, pelo menos, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% da seqüência de identidade, ou, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 35 90% da seqüência de identidade (como calculado pelo NCBI BLAST, utilizando parâmetros predefinidos) são apropriados para a presente invenção.

Parte (1): Projetando a conversão de piruvato a acetil-CoA Como descrito acima, a conversão de piruvato a acetil-CoA pode ocorrer em uma célula projetada por duas linhas gerais: (A) a rota da "passagem secundária PDH" tal como acima definida ou (B) a conversão direta de piruvato a acetil-CoA no citosol pelo PDH ou pelo PFL.

(A) Geração de acetil-CoA através da rota de "passagem secundária PDH"

Relativas à rota (A), gerando acetil CoA a partir de piruvato, a geração do percurso de acetil-CoA citosólica é catalisada por três enzimas como mostrado na figura 3, etapas 1, 2 e 3. Um percurso mais eficiente para a geração de acetil-CoA é alcançado através do au- mento da atividade dessas enzimas que são Iimitantes em taxa. Por exemplo, em Saccha- 10 romyces cerevisiae, se a atividade ALD estiver limitando em um percurso, a superexpressão de ALD6 irá, assim, aumentar o fluxo geral através do percurso. A formação elevada de ace- til-CoA no citosol é alcançada através de um dos seguintes mecanismos ou uma combina- ção dos mesmos:

Em uma modalidade, o acetil-CoA elevado pode ser gerado pela superexpressão de um gene piruvato descarboxilase (por exemplo, S. cerevisiae PDC1, PDC5 e/ou PDC6\ Etapa 1).

Em outra modalidade, o acetil-CoA elevado pode ser gerado pela superexpressão de um gene acetaldeído desidrogenase (por exemplo, S. cerevisiae ALD6\ Etapa 2).

Em outra modalidade, o acetil-CoA elevado pode ser produzido pela superexpres- são de um gene acetil-CoA sintase (por exemplo, S. cerevisiae ACS1 ou ACS2 ou ambos; Etapa 3).

Em uma modalidade diferente, a superexpressão simultânea de ambos os ALD e ACS (S. cerevisiae ALD6\ Etapa 2), pode gerar um acetil-CoA elevado (Etapas 2 e 3).

Em outra modalidade, a superexpressão simultânea dos genes PDC, ALD, e ACS podem gerar aumento da produção de acetil-CoA (Etapas 1 a 3).

Para aumentar adicionalmente a produção de acetil-CoA, o principal percurso de produção de etanol citosólico em levedura pode ser reduzido ou eliminado. Em Crabtree positivo, S. cerevisiae, isto é alcançado através da supressão do ADHI que é a fonte predo- minante de atividade ADH citosólica. Células suprimidas por ADH1 são incapazes de cres- 30 cer de forma anaeróbia (Drewke et al., (1990). J. Bacteriology 172 (7): 3909), e, portanto, podem ser preferencialmente suprimidas para minimizar a conversão de acetaldeído a eta- nol. A eliminação deste percurso seletivamente conduz acetaldeído em direção ao acetato e, posteriormente, à produção de acetil-CoA (Figura 3, Etapa 5). Portanto, a superexpressão dos genes descrita acima pode ser realizada em uma célula possuindo atividade ADH redu- 35 zida ou eliminada

Do mesmo modo, a atividade ADH citosólica pode ser reduzida ou eliminada em uma levedura Crabtree negativa, tal como Kluyveromyces Iactis pela supressão do ADHI ou ADHII para aumentar o fluxo de piruvato a acetil-CoA através da rota da "passagem secun- dária PDH". Por isso, neste organismo, semelhante ao que foi proposto a S. cerevisiae aci- ma, o fluxo através da "passagem secundária PDH" poderia ser aumentada pelo excesso de expressão de KIALD6, KIACS1 ou KIACS2 isoladamente ou em combinação.

(B) Geração direta de acetil-CoA a partir de piruvato

Relativas à rota (B) de geração de acetil CoA a partir de piruvato, a produção de acetil-CoA pode ser aumentada pela superexpressão dos genes que formam uma completa complexa PDH. Por exemplo, os genes superexpressados podem ser provenientes de E. coli (aceE, aceF, e IpdA), Zymomonas mobilis (pdhAct, pdhAfi, pdhB, e Ipd), S. aureus (p- dhA, pdhB, PDHC1 e Ipd), Bacillus subtilis , Corynebacterium glutamicum, ou Pseudomonas aeruginosa (Etapa 4).

A enzima piruvato desidrogenase complexo catalisa a conversão de piruvato a ace- til-CoA. Em S. cerevisiae, este complexo está localizado no espaço interno da membrana mitocondrial. Consequentemente, outro método para a obtenção de níveis mais elevados de acetil-CoA no citoplasma de S. cerevisiae é projetar uma célula para superexpressar um complexo de piruvato desidrogenase eucariótico ou procariótico que possa funcionar no ci- toplasma (Etapa 4). Em certas modalidades, o microorganismo recombinante aqui descrito inclui uma piruvato desidrogenase (PDH) ativa, sob condições anaeróbicas ou microaeróbi- cas. A piruvato desidrogenase ou formiato desidrogenase dependente de NADH pode ser anormal ao microorganismo recombinante, em que o código da seqüência que codifica estas enzimas é anormal, ou a região reguladora transcricional é anormal (incluindo artificiais), ou os polipeptídios codificados compreendem trocas de seqüência que tornem a enzima resis- tente à inibição da realimentação por certos intermediários ou substratos metabólicos.

Até há pouco tempo, era amplamente aceito que Pdh não funcionasse em condi- ções anaeróbicas, mas diversos registros recentes têm demonstrado que este não é o caso (de Graef, M. et al, 1999, Journal of Bacteriology, 181, 2351 - 57; Vernuri, GN et al, 2002, Applied and Environmental Microbiology, 68, 1715-27). Além disso, outros microrganismos tais como Enterococcus faecalis apresentam alta atividade in vivo do complexo Pdh, mesmo sob condições anaeróbicas, forneceu que as condições do crescimento foram tais que o raio de NADH / NAD+ em estado-estacionário foi suficientemente baixo (Snoep, JL et al, 1991, Ferns Microbiology Letters, 81, 63-66). Ao invés de oxigênio, que regula a expressão e a função de Pdh, tem sido demonstrado que Pdh é regulamentada pelo raio NADH / NAD+ (de Graef, M. et al, 1999, Journal of Bacteriology, 181, 2351-57. Se o percurso de n-butanol ex- presso em uma célula hospedeira consome NADH rápido o suficiente para manter um baixo nível de NADH / NAD+ dentro da célula, uma Pdh endógena ou anormal expressa pode permanecer ativa e prover NADH suficiente para equilibrar o percurso.

Estas enzimas Pdh podem equilibrar o percurso de n-butanol em um microorganis- mo recombinante aqui descrito.

A expressão de uma Pdh que é funcional sob condições anaeróbias é esperada pa- ra aumentar os mois de NADH obtido por mol de glicose. Kim et al. descreve um PDH que torna disponível em E. coli até quatro mois de NADH por mol de glicose consumida (Kim, Y.

et al. (2007). Appl. Environm. Microbiol., 73, 1766-1771). Células de levedura também po- dem ser projetadas para expressar Pdh complexa a partir de diversas fontes bacterianas. Por exemplo, Pdh de Enterococcus faecalis é semelhante ao Pdh de E. coli, mas é desati- vados a níveis muito menores de NADH / NAD+. Além disso, alguns organismos, tais como Bacillus subtilis e quase todas as espécies de bactérias do ácido láctico utilizam um Pdh no metabolismo anaeróbio. A expressão de um percurso da produção de n-butanol em um mi- croorganismo expressando uma Pdh que é anaerobicamente ativa é esperada para resultar em rendimentos de n-butanol superiores a 1,4% se o percurso de produção de n-butanol puder competir com percursos fermentativos endógenos.

Alternativamente, o acetil-CoA pode ser produzido no citosol por superexpressar duas enzimas bacterianas, uma piruvato formiato Iiase (por exemplo, E. coli pfIB) e uma formiato desidrogenase (por exemplo, Candida boidinii fdhl). Usando este percurso, piruva- to é convertido em acetil-CoA e formiato. O formiato desidrogenase então catalisa a conver- são dependente de NADH de formiato para dióxido de carbono. O resultado líquido destas reações é o mesmo que se piruvato fosse convertido em acetil-CoA pelo complexo de piru- vato desidrogenase:

Piruvato + NAD+ acetil-CoA + NADH + CO2.

Formiato desidrogenase dependente de NADH (FDH; CE 1.2.1.2) catalisa a oxida- ção de Formiato para CO2 e simultaneamente a redução de NAD+ para NADH. Fdh pode ser utilizado em conformidade com a presente invenção para aumentar a disponibilidade intra- celular de NADH no interior do microorganismo hospedeiro e pode ser utilizado para equili- brar ao percurso de produção de n-butanol no que diz respeito ao NADH. Em particular, uma Fdh dependente de NADH pode ser biologicamente ativada e em particular superexpressa- da no microrganismo hospedeiro. Na presença deste percurso de formiato desidrogenase recentemente introduzido, um mol de NADH será formado quando um mol de formiato for convertido em dióxido de carbono. Em certas modalidades, no microorganismo nativo um formiato desidrogenase converte formiato a CO2 e H2 sem envolvimento de co-fator.

Além disso, qualquer dos genes que codificam enzimas estrangeiras (ou quaisquer outros mencionados neste documento (ou qualquer dos elementos reguladores que contro- lam ou modulam a expressão do mesmo) pode estar sujeito à evolução dirigida utilizando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Tal ação permite que aqueles versa- dos na técnica otimizem as enzimas para expressão e atividade na levedura.

Além disso, genes de piruvato descarboxilase, acetil-CoA sintetase, e acetaldeído desidrogenase de outras espécies fúngicas e bacterianas podem ser expressos para a mo- dulação deste percurso. Uma variedade de organismos poderiam servir como fontes para estas enzimas, incluindo mas não limitados a, Saccharomyces sp., Incluindo S. cerevisiae mutantes e S. uvarum, Kluyveromyces, incluindo K. thermotolerans, K. lactis, e K. marxia- nus, Pichia , Hansenula, H. polymorpha incluindo, Candidia, Trichosporon, Yamadazyma, incluindo stipitis Y., Torulaspora pretoriensis, Schizosaccharomyce pombe, Cryptoeoceus sp., Aspergillus sp., Neurospora sp. ou Ustilago sp. Exemplos de piruvato descarboxilase úteis são aqueles provenientes de Saccharomyees bayanus (1 PYD), Candida glabrata, K. Iaetis (KIPDC1), ou Aspergillus nidulans (PDcA) e acetil-CoA sytetase de Candida albieans, Neurospora crassa, A. nidulans, ou K . Iactis (ACS1), e acetaldeído desidrogenase de As- pergillus niger (ALDDH), C. albieans, Cryptococcus neoformans (alddh). Fontes de enzimas procarióticas que são úteis incluem, mas não estão limitadas a, E. eoli, Z. mobilis, Bacillus sp., Clostridium sp., Pseudomonas sp., Lactococcus sp., Enterobacter sp. e Salmonella sp. A melhoria adicional deste percurso pode ser obtida através do projeto destas enzimas para a atividade elevada por mutagênese dirigida por sítio e outros métodos de evolução (que incluem técnicas conhecidas para aqueles versados na técnica).

Procariotas tais como, mas não limitados a, E. eoli, Z. mobilis, Staphylococcus au- reus, Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebaeterium sp., Pseudomonas sp., Laetococeus sp., Enterobaeter sp., E Salmonella sp., podem servir como fontes para este complexo de enzi- ma. Por exemplo, complexos de piruvato desidrogenase proveniente de E. eoli (aceE, aceF, e IpdA), Z mobilis (pdhAalfa, pdhAbeta, pdhB, e lpd), S. aureus (pdhA, pdhB, PdhC, e P- dhC), Bacillus subtilis, Corynebaeterium glutamieum, e Pseudomonas aeruginosa, podem ser utilizados para esta finalidade.

Métodos para crescimento e manuseio de levedura são bem conhecidos na técnica. Métodos para superexpressar, expressar em vários níveis inferiores, reprimir expressão e suprimir genes em células de levedura são conhecidos na técnica e qualquer método está previsto para o uso para construir as espécies de leveduras do presente.

Qualquer método pode ser utilizado para introduzir uma molécula exógena de ácido nucléico em levedura e muitos desses tais métodos são bem conhecidos por aqueles versa- dos na técnica. Por exemplo, a transformação, eletroporação, conjugação, e fusão de proto- plastos são métodos comuns para a introdução de ácido nucléico em células de levedura. Ver, por exemplo, Ito et al., J. Bacterol. 153:163-168 (1983); Durrens et al., Curr. Genet. 18:7-12 (1990) e Becker e Guarente, Methods in Enzymology 194:182-187 (1991).

Em uma modalidade, a integração de um gene de interesse em um fragmento de DNA ou gene - alvo ocorre de acordo com o princípio da recombinação homóloga. De acor- do com esta modalidade, uma fita de integração contendo um módulo compreendendo pelo menos um gene marcador de levedura, com ou sem o gene a ser integrado (módulo inter- no), é ladeado em ambos os lados por fragmentos de DNA homólogos aos das extremida- des do sítio de integração direcionada (seqüências de recombinação genética). Depois de transformar a levedura com a casa fita por métodos adequados, uma recombinação homó- loga entre as seqüências de recombinação genética pode resultar na substituição do módulo interno na região cromossômica entre os dois sítios do genoma correspondente à seqüência de recombinação genética da fita de integração.

Em uma modalidade, para supressão de genes, a fita integração pode incluir um marcador apropriado da seleção de levedura ladeado pela seqüência de recombinação ge- nética. Em uma modalidade, para a integração de um gene anormal no cromossomo da le- vedura, a fita de integração inclui o gene anormal sob o controle de um promotor e finaliza- dor adequados, juntamente com o marcador selecionável ladeado pela seqüência de re- combinação genética. Em uma modalidade, o gene anormal compreende um gene nativo desejado apropriado para aumentar o número de cópias de um gene nativo. O gene marca- dor de seleção pode ser qualquer gene marcador utilizado na levedura, incluindo, mas não limitados a, genes URA3 proveniente de S. cerevisiae ou um gene homólogo, ou gene resis- tente à higromicina para complementação auxotrófica ou a seleção baseada na resistência a antibióticos das células transformadas, respectivamente, A seqüência de recombinação ge- nética pode ser escolhida à vontade, dependendo do local de integração adequado para a aplicação desejada.

Além disso, em uma modalidade, certos genes marcadores introduzidos são remo- vidos do genoma utilizando técnicas bem-conhecidas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, a perda do marcador URA3 pode ser obtida por plaqueamento URA3 contendo células em FOA (ácido 5-fluoro-orotico), contendo meios e seleção para colônias resistentes a FOA (Boeke, J. et al, 1984, Mol. Gen. Genet, 197, 345-47).

A molécula exógena de ácido nucléico contida dentro de uma célula de levedura da invenção pode ser mantida dentro dessa célula, sob qualquer forma. Por exemplo, molécu- las exógenas de ácidos nucléicos podem ser integradas no genoma da célula ou mantidas em um estado epissomal que pode de forma estável ser passado em ("herdado") para a célula filha. Tais elementos genéticos extra-cromossômicos (tais como plasmídeos, etc) po- dem adicionalmente conter marcadores de seleção que garantam a presença de tais ele- mentos genéticos nas células filhas. Além disso, as células de levedura podem ser transfor- madas de forma estável ou transitória. Além disso, as células de levedura descritas neste documento podem conter uma única cópia, ou múltiplas cópias, de uma molécula exógena de ácido nucléico particular, como descrito acima.

Métodos para expressar um polipeptídio de uma molécula exógena de ácido nucléi- co são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Esses métodos incluem, sem limi- tação, a construção de um ácido nucléico tal que um elemento regulador promove a expres- são de uma seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídio desejado. Normalmente, elementos reguladores são seqüências de DNA que regulam a expressão de outras se- qüências de DNA, em nível de transcrição. Assim, elementos reguladores incluem, sem limi- tação, promotores, realçadores, e coisas similares. Por exemplo, os genes exógenos podem estar sob o controle de um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Além disso, os métodos para expressar um polipeptídio a partir de uma molécula de ácido nucléico exóge- no em levedura são bem-conhecidos aos versados na técnica. Por exemplo, construtos de ácidos nucléicos que são capazes de expressar polipeptídios exógenos dentro Kluyveromy- ces (ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos 4,859,596 e 4,943,529, cada uma das quais é incorpo- rada por referência neste documento, na sua totalidade) e Saccharomyces (ver, por exem- plo, Gelissen et al., Gene 190 (1): 87 - 97 (1997)) são bem-conhecidos. Em outra modalida- de, elementos anormais de controle podem ser usados para ativar ou reprimir expressão de genes endógenos. Além disso, quando a expressão está a ser reprimida ou eliminada, o gene para a enzima relevante, proteínas ou RNA pode ser eliminada por técnicas de su- pressão conhecidas.

Tal como descrito aqui, levedura no escopo da descrição pode ser identificada por técnicas específicas de seleção para a enzima particular que está sendo expressa, superex- pressada ou reprimida. Métodos para identificar as espécies com o fenótipo desejado são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, técnicas de hibridização de ácidos nucléicos e PCR tal como a análise do Norte e do Sul, alterou as capacidades de crescimento em um determinado substrato ou na presença de um determinado substrato, um composto químico, um agente de seleção e similares. Em alguns casos, técnicas imunohistoquímica e bioquímica podem ser utilizadas para determinar se uma célula contém um ácido nucléico específico, detectando a expressão do polipeptídio codificado. Por exemplo, um anticorpo possuindo especificidade para uma enzima codifica- da pode ser utilizado para determinar se uma célula de levedura particular contém ou não enzimas codificadas. Além disso, técnicas bioquímicas podem ser utilizadas para determinar se uma célula contém uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídio enzimáti- co através da detecção de um produto produzido, como resultado da expressão do polipep- tídio enzimático. Por exemplo, transformar uma célula com um vetor de codificação acetil- CoA sintetase e detectar aumento nas concentrações de acetil-CoA citosólico indica que o vetor está tanto presente e que o produto do gene está ativo. Métodos para detectar ativida- des enzimáticas específicas ou a presença de determinados produtos são bem-conhecidos para aqueles versados na técnica. Por exemplo, a presença de acetil-CoA pode ser deter- minada conforme descrito por Dalluge et al., Anal. Bioanal. Chem. 374 (5):835-840 (2002).

Células de levedura da presente invenção têm reduzida atividade enzimática, tal como atividade reduzida de álcool desidrogenase. O termo "reduzido", como é utilizado aqui com respeito a uma célula e a uma atividade enzimática especial se refere a um nível de atividade enzimática menor do que o medido em uma célula de levedura comparável à mesma espécie. Assim, células de levedura com falta da atividade de álcool desidrogenase são consideradas ter reduzida atividade de álcool desidrogenase, uma vez que a maioria, se não todas, as espécies de levedura comparáveis têm pelo menos alguma atividade de álcool desidrogenase. Tais atividades enzimáticas reduzidas podem ser o resultado de uma con- centração menor das enzimas, menor atividade específica de uma enzima, ou uma combi- nação dos mesmos. Muitos diferentes métodos podem ser utilizados para fazer que levedu- ras tenham a atividade enzimática reduzida. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser projetada para ter uma perturbada enzima de codificação Iocus utilizando mutagênese co- mum ou tecnologia "knock-out". Ver, por exemplo, Methods in Yeast Genetics (edição 1997), Adams, Gottschling, Kaiser, e caules, Cold Spring Harbor Press (1998).

Alternativamente, tecnologia anti-sense pode ser utilizada para reduzir a atividade enzimática. Por exemplo, a levedura pode ser projetada para conter um cDNA que codifica uma molécula anti-sense que evita que uma enzima seja feita. O termo "molécula anti- sense", como utilizado neste documento engloba qualquer molécula de ácido nucléico que contenha seqüências que correspondem ao cabo de codificação de um polipeptídio endóge- no. Uma molécula anti-sense pode também ter divisão de seqüências (por exemplo, se- qüências reguladoras). Assim, moléculas anti-sense podem ser oligonucleotídeos ribozimas ou anti-sense. Uma ribozima pode ter qualquer estrutura geral, incluindo, sem limitação, es- truturas de grampo para cabelo, cabeça do martelo, ou "axhead", desde a molécula racha RNA.

Levedura possuindo uma atividade enzimática reduzida pode ser identificada por meio de qualquer método. Por exemplo, levedura possuindo atividade reduzida de álcool desidrogenase pode ser facilmente identificada utilizando métodos comuns, por exemplo, medindo formação de etanol, através de cromatografia gasosa.

Em uma modalidade, n-butanol pode ser produzido a partir de uma das espécies metabolicamente projetadas da presente descrição utilizando um processo de duas etapas. Uma vez que níveis elevados de butanol (por exemplo, 1,5% na média e isto geralmente varia por leveduras e espécies) podem ser tóxicos para as células, uma estratégia para ob- ter uma grande quantidade de n-butanol é fazer crescer uma espécie capaz de produzir n- butanol sob condições em que nenhum butanol, ou apenas uma quantidade insignificante, não-tóxica de butanol, é produzido. Esta etapa permite a acumulação de uma grande quan- tidade de células viáveis, ou seja, uma quantidade significativa de biomassa, que pode en- tão ser deslocado para condições de crescimento sob as quais o n-butanol é produzido. Es- sa estratégia permite que uma grande quantidade de n-butanol a ser produzida antes que problemas de toxicidade se tornem significativos e o crescimento celular lento. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em condições aeróbias (na qual a produção de n-butanol é suprimida ou ausente) e então deslocadas para condições anaeróbias ou microaeróbicas para a produção de n-butanol (por exemplo, pela ativação dos percursos metabólicos ade- quados que foram projetados para a espécie em conformidade com a presente invenção). Alternativamente, a expressão das enzimas relevantes pode ser induzível sob controle, por exemplo, promotores sensíveis térmicos ou outra etapa sensíveis térmicos (como a termo- estabilidade da própria enzima), dessa forma a primeira etapa ocorre com o(s) percurso(s) relevante ou enzimas desligadas (isto é, inativa), indução ocorre (por exemplo, deslocamen- to da temperatura), e n-butanol é produzido. Métodos para tornar induzíveis genes sujeitos a controle são bem-conhecidos. Enzimas termoestáveis são conhecidas ou podem ser sele- cionados através de métodos conhecidos na técnica. Como em outros processos da descri- ção, uma vez que o n-butanol é produzido, ele pode ser recuperado em conformidade com uma modalidade.

Processos de recuperação de n-butanol a partir de microorganismos, incluindo as leveduras são descritos no Pedido Provisório U.S. No. de Serial 11/949,724, depositado em 3 de dezembro de 2007, o qual é incorporado neste documento por referência.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que diversas omissões, adições e alterações podem ser feitas à invenção descrita acima sem afastar do escopo da invenção, e todas essas modificações e alterações destinam-se a cair no escopo da invenção, tal co- mo definido pelas reivindicações em anexo. Todas as referências, patentes, pedidos de pa- tentes, ou outros documentos citados são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

A tabela 1 lista um conjunto de genes que são descritos nos Exemplos 1 a 38. São dados os primers relevantes (direto e reverso) que podem ser utilizados para ampliar cada gene, bem como a seqüência de cada primer. Genes são listados de acordo com as con- venções apropriadas de nomenclatura para cada espécie; certos genes como listado são precedidos por duas letras, representando a primeira letra do gênero e espécies de origem para um dado gene. Para certos nomes de genes, o sufixo "-co" é anexado para indicar que um gene sintético otimizado pelo códon foi construído utilizando uso de códon preferido para a bactéria E. coli, ou a levedura de S. cerevisiae, como indicado no texto. Tabela 1

Gene Gene SEQ ID NO: Nome do Primer izlRlcn P S '·■ ID Seqüência Primer Cb-hbd 155 Gevo-311 42 GAGGTTGTCGACATGAAAAAGATTTTTGTACTTGGAG Gevo-175 43 AATTG GATC CTTATTTAGAATAATCATAG AATCCT Cb-crt 156 Gevo-312 44 GTTCTTGTCGACATGGAATTAAAAAATGTTATT CTTG Gevo-171 45 AATTG GATC CTTATTTATTTTG AAAATTCTTTTCTG C Cb-bcd 157 Gevo-313 46 CAAGAGGTCGACATGAATTTCCAATTAACTAGAGAAC Gevo-314 47 GCGTCCGGATCCCT ATCTT AAAATGCTTCCTGCG Cb-etfA 158 Gevo-315 48 CGGAAAGTCGACATGAATATAGCAGATTACAAAGGC Gevo-173 49 AATTGGATCCTTATTCAGCGCTCTTTATTTCTTTA Cb-etfB 159 Gevo-316 50 CAAAATGTCGACATGAATATAGTAGTTTGTGTAAAAC Gevo-317 51 TAATTTGGATCCTTAGATGTAGTGTTTTTCTTTTAAT Cb- adhA 160 Gevo-319 52 GAACCAGTCGACATGGCACGTTTTACTTTACCAAG Gevo-177 53 AATTGGATCCTTACAAATTAACTTTAGTTCCATAG Cb-aldh 161 Gevo-318 54 TCCATAGTCGACATGAATAAAGACACACTAATACCT Gevo-249 55 AATTGGATCCTTAGCCGGCAAGTACACATCTTCTTTGTC T Ca-thl 162 Gevo-308 56 GATCGAGTCGACATGAAAGAAGTTGTAATAGCT AG Gevo-309 57 GTT ATAG G ATCCCTAG CACTTTTCTAG CAAT ATTG Ca-hbd 163 Gevo-281 58 GTGGATGTCGACATGAAAAAGGTATGTGTTATAGGTG Gevo-161 59 AATTGGATCCTTAI I I IGAATAATCGTAGAAACCT Ca-crt 164 Gevo-282 60 TCCTACGTCGACATGGAACTAAACAATGTCATCCT Gevo-283 61 TAACTTGGATCCCTATCTATTTTTGAAGCCTTCAAT Ca-bcd 165 Gevo-284 62 CAAGAGGTCGACATGGATTTTAATTTAACAAGAGAAC Gevo-285 63 CAATAAGGATCCTTATCTAAAAATTTTTCCTGAAATAAC Ca-etfA 166 Gevo-286 64 CGGGAAGTCGACATGAATAAAGCAGATTACAAGGG C Gevo-287 65 GTTCAAGGATCCTTAATTATTAGCAGCTTTAACTTG Ca-etfB 167 Gevo-288 66 CAAAATTGTCGACATGAATATAGTTGTTTGTTTAAAAC Gevo-289 67 GTmAGGATCCTTAAATATAGTGTTCTTCTTTTAATTTT Gene Gene SEQ ID NO: Nome do Primer SEQ ID NO: Seqüência Primer G Ca- adhE2 168 Gevo-292 68 CAAGAAGTCGACATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAAC Gevo-293 69 ICCIAI GCGGCCGC I IAAAAIGAI I I IAIAIAGATATCC T Ca-aad 169 Gevo-290 70 AGGAAAGTCGACATGAAAGTCACAACAGTAAAGGA Gevo-291 71 Al I IAAGCGGCCGCI IAAUGI IGI I I I I IAAAACAATTT A Ca- bdhA 170 Gevo-294 72 CATAACGTCGACATGCTAAG I I I IGATTATTCAATAC Gevo-247 73 AAI IGGAICCI IAAIAAGAI Illl IAAAIAICICAA Ca- bdhB 171 Gevo-295 74 CATAACGTCGACATGGTTGATTTCGAATATTCAATAC Gevo-159 75 AATTGGATCCTTACACAGAI IIII IGAATAI I IGTA Ca-thl- CO 1 Gevo-310 76 GATCGAGAATTCATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAG Gevo-309 77 Gl IAIAGGAICCCIAGCACI I I ICIAGCAAIAI IG Ca-hbd- CO 2 Gevo-296 78 CGGATAGTCGACATGAAAAAGGTATGTGTTATAGGC Gevo-297 79 TCCCAAGGATCCTTATTTTGAATAATCGTAGAAACCCT Ca-crt- CO 3 Gevo-282 80 TCCTACGTCGACATGGAACTAAACAATGTCATCCT Gevo-283 81 IAACI IGGAICCCIAICIAI I I I IGAAGCCI ICAAI Ca-bcd- CO 4 Gevo-284 82 CAAGAGGTCGACATGGATTTTAATTTAACAAGAGAAC Gevo-298 83 GTAAAGGGATCCTTAACTAAAAATTnTTTCCTGAAATG Ca-eftA- CO 5 Gevo-286 84 CGGGAAGTCGACATGAATAAAGCAGATTACAAGGGC Gevo-299 85 GTTCAAGGATCCTTAATTATTAGeAGCTTTAACCTG Ca-eftB- CO 6 Gevo-288 86 CAAAATTGTCGACATGAATATAGTTGTTTGTTTAAAAC Gevo-300 87 GACTTTGGATCCTTAAATATAGTGTTCTTCTTTCAG Ca- adhE2- CO 7 Gevo-292 88 CAAGAAGTCGACATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAAC Gevo-301 89 Al I I lCGGAICCI IAAAAIGAI I I IAIAIAGAIAICI I I I A Me-bcd- CO 8 Gevo-302 90 CTTATAGTCGACATGGAI I I IAACTTAACAGATATTC Gevo-303 91 CCGCCAGGATCCTTAACGTAACAGAGCACCGCCGGT Me-eftA- CO 9 Gevo-304 92 CGGAAAGTCGACATGGATTTAGCAGAATACAAAGGC Gevo-305 93 CTTTGTGGATCCTTATGCAATGCCTTTCTGTTTC Me-eftB- CO 10 Gevo-306 94 C AAACTGAATTC ATGG AAATATTG GTATGTGTCAAAC Gevo-307 95 ACCAACGGATCCTTAAATGATTTTCTGGGCAACCA ERG10 154 Gevo-273 96 GTTACAGTCGACATGTCTCAGAACGTTT ACATTG Gevo-274 97 GATAACGGATCCTCATATCTTTTCAATGACAATAG IpdA 20 Gevo-610 119 ttttGTCGACACTAGTatgagtactgaaatcaaaactcaggtcgtg Gevo-611 120 ttttCTCGAGttacttcttcttcgctttcgggttcgg Gene Gene SEQ ID NO: Nome do Primer SEQ ID NO: Seqüência Primer aceE 21 Gevo-606 116 ttttGTCGACACT AGTatgtcagaacgtttcccaaatgacgtgg Gevo-607 117 ttttCTCGAGttacgccagacgcgggttaactttatctg aceF 22 Gevo-653 136 ttttGTCGACACTAGTatggctatcgaaatcaaagtaccggacatcggg Gevo-609 118 ttttCTCGAGttaeatcaccagacggcgaatgtcagaeag PDA1 23 Gevo-660 143 ttttCTCGAGactagtATGgcaaetttaaaaacaaetgataagaagg Gevo-661 144 ttttagatetTTAATCCCTAGAGGCAAAACCTTGC PDB1 24 Gevo-662 145 ttttCTCGAGactagtATGgcggaagaattggaccgtgatgatg Gevo-663 146 tttGGATCCTTATTCAATTGACAAGACTTCTTTGACAG PDX1 25 Gevo-664 147 TtttCTCGAGactagtATGttacttgctgtaaagacattttcaatgcc Gevo-665 148 ttttggateeTCAAAATGATTCTAACTCCCTTACGTAATC LAT1 26 Gevo-656 139 ttttCTCGAGgctagcATGGCATCGTACCCAGAGCACACCAT TATTGG Gevo-657 140 ttttGGATCCTCACAATAGCATTTCCAAAGGATTTTCAAT LPD1 27 Gevo-658 141 ttttCTCGAGactagtATGGTCATCATCGGTGGTGGCCCTGC TGG Gevo-659 142 ttttGGATCCTCAACAATGAATAGCTTTATCATAGG PDC1 28 Gevo-639 129 ttttctegagaetagtATGTCTGAAATTACTTTGGG Gevo-640 130 ttttggatecTTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAG CUP1 prom 178 Gevo-637 127 ttttGAGCTCgccgateccattaccgaeatttggg Gevo-638 128 aaaGTCGACaecgatatacctgtatgtgtcaccaccaatgtatctataagtate eatGCTAGCCCTAGGtttatgtgatgattgattgattgattg PfIA 36 PfIA forw 98 cattgaattcatgtcagttattggtegcatteac PfIA Rev 99 cattgtcgaettagaacattaccttatgacegtactg PfIB 37 PflB forw 100 cattgaattcatgtccgagcttaatgaaaagttagcc PfIB Rev 101 cattgtcgaettaeatagattgagtgaaggtacgag Cb- FDH1 38 fdhl forw 102 cattgaattcatgaagategttttagtcttatatggtge fdhl rev 103 cattgtcgacttatttettatcgtgtttaccgtaage KIALD6 39 KIALD6 rig ht3 104 gttaggatecttaatccaacttgatcctgacggecttg KIALD6 Lef t5 105 ceaagtcgacatgtcctctacaattgctgagaaattgaaccte KlACS 1 40 KIACS1 Ri ght3 106 gttagcggccgcttataatttcacggaatcgatcaagtge KlACS 1 Lef t5 107 ccaagctagcatgtctcctgctgttgataccgcttce KIACS 2 41 KIACS2 rig ht3 108 ggttggatccttatttettctgctgactgaaaaattgattttctactge KIACS2 Lef t5 109 ccaagaattcatgtcgtcggataaattgcataagg ACS1 30 Gevo-479 112 catgccgfcgacatgtcgccctctgccgtac Gevo-480 113 gattaagcggccgcttacaacttgaccgaateaattag ACS 2 31 Gevo-483 114 gatgaagfcgacatgaeaatcaaggaaeataaagtag Gevo-484 115 gttaaaggafccttatttetttttttgagagaaaaattg ALD6 29 Gevo-643 133 ceaagfcgacatgactaagctacaetttgacac Gevo-644 134 gteggtaagagtgttgctgtggactcg Ca-ter 179 Gevo-345 183 atgtttgtegaeatgatagtaaaageaaagtttgta Gevo-346 184 cttaatgcggecgcttaaggttctaattttcttaataatte Ah-ter 180 Gevo-343 185 Gcttgagtegacatgatcattaaacegaaagttcg Gene Gene SEQ ID NO: Nome do Primer SEQ ID NO: Seqüência Primer Gevo-344 186 atttaaggatcctcacagttcgacaacatcaaattta Eg-ter 181 Gevo-347 187 catcacgtcgacatggccatgttcaccactac Gevo-348 188 ctcqcqggatccttactgctgagctgcgctc Sc-ccr 182 Gevo-341 189 gtcttagtcgacatg accgtgaaagacattctg Gevo-342 190 attqqcq qatcctcacacattacg q aaacgg tta

A tabela 2 lista um conjunto de construtos de plasmídeo e suas características rele- vantes, como descritos nos exemplos. Incluídos na tabela estão os nomes dos plasmídeos relevantes (pGV); o atual marcador prototrófico, útil para seleção e manutenção do plasmí- deo em uma espécie auxotrófica; uma seqüência promotora (a partir da região dada do gene S. cerevisiae)·, o gene sob controle do promotor acima-mencionado; combinações promotor

+ gene; se presente.

Tabela 2: Sumário de características relevantes de plasmídeos nos Exemplos.

Nome Marcador Promotor 1 GENE Promotor 2 GENE prototrófico 1 2 pGV1099 HIS3 TEFl (AU1 tag) pGVHOO TRPl TEFl (HAtag) pGVllOl LEU2 TEFl (AU1 tag) pGV1102 URA3 TEFl (HAtag) pGV1103 HIS3 TDH3 (iriyc tag) pGV1104 TRPl TDH3 (myc tag) pGV1105 LEU2 TDH3 (myc tag) pGV1106 URA3 TDH3 (myc tag) pGV1208 TRPl TEFl Ca-hbd-co pGV1209 LEU2 TEFl Ca-crt-co pGV1213 URA3 TEFl Ca-adhE2-co pGV1214 HIS3 TD H3 Me-bcd-co pGV1217 TRPl TEFl Ca-hbd-co TDH 3 Ca-eftA-co pGV1218 LE U2 TEFl Ca-crt-co TDH3 Ca-eftB-co pGV1219 HIS3 TEFl ScE RG10 TDH3 Me-bcd-co pGV1220 HIS3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Ca-bcd-co pGV1221 TRPl TEFl Ca-hbd-co TDH3 Me-eftA-co pGV1222 LEU2 TEFl Ca-crt-co TDH3 Me-eftB-co pGV1223 HIS3 TEFl ScERG 10 TDH3 Ca-bcd-co pGV1224 HIS3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Me-bcd-co pGV1225 HIS3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Ca-ter pGV1226 H1S3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Ah-ter Nome Marcador prototrófico Promotor 1 GENE 1 Promotor 2 GENE 2 pGV1227 HIS3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Eg-ter PGV1228 HIS3 TEFl Ca-thl-co TDH3 Sc-ccr PGV1262 LEU2 TEFl ScACSl pGV1263 URA3 TEFl ScACS2 pGV1319 URA3 TDH3 Ca-AdhE2_co TEFl ACSl pGV1320 URA3 TDH3 Ca-AdhE2_co TEFl ACS2 PGV1321 LEU2 TDH3 ALD6 PGV1326 LEU2 TEFl ALD6 PGV1334 HIS3 TDH3 IpdA pGV1339 LEU2 TEFl Ca_Crt_co TDH3 ALD6 pGV1379 HIS3 TD H3 aceE pGV1380 HIS3 TDH3 aceF pGV1381 HIS3 TDH3 LATI pGV1383 HIS3 TDH3 PDAl pGV1384 HIS3 TDH3 PDBl pGV1385 HIS3 TDH3 PDXl PGV1388 URA3 CUPl n/a pGV1389 URA3 TDH3 PDCl pGV1399 LEU2 TEFl Ca-hbd-co TDH3 ALD6 pGV1414 URA3 MET3 n/a PGV1428 HIS3 TDH3 n/a pGV1429 TRPl TDH3 n/a pGV1430 LEU2 TDH3 n/a PGV1483 URA3 MEt3 n/a pGV1603 TRPl TDH3 aceE pGV1604 LEU2 TDH3 aceF pGV1605 URA3 TEFl adhE2 TDH3 PDCl 1102Fdhl URA3 TEFl Cb-FDHl 1103PflA HIS3 TDH3 PfIA 1104PÍIB TRPl TDH3 PfIB 1208_PflA TRPl TEFl Ca_hbd_co TDH3 pflA 1208KI HIS3 TEFl Ca_hbd_co 1208KIALD6 HIS3 TEFl Ca_hbd_co TDH3 KIALD6 1208KIPÍIA HIS3 TEFl Ca_hbd_co TDH3 pflA 1208KIPÍIA TRPl TEFl Ca_Crt_co TDH3 pflB 1208-lpdA TRPl TEFl thl TDH3 -IpdA 1209_PflB LEU2 TEFl Ca_Crt_co TDH3 PfIB 1209-aceE LEU2 TEFl crt TDH3 aceE 1209KI TRPl TEFl Ca_Crt_co Nome Marcador prototrófico Promotor 1 GENE 1 Promotor 2 GENE 2 1209klACSl LE U2 TEFl Ca_Crt_co TDH3 KIACSl 1209klACS2 LEU2 TEFl Ca_Crt_co TDH3 KIACS2 1213_Fdhl URA3 TDH3 Ca_AdhE2_co TEFl Cb-FDHl 1213-aceF- URA3 TEFl adhE2 TDH3 aceF 1213KI URA3 TDH3 Ca_AdhE2_co 1213 Kl PfIA LEU2 TEFl Ca thl co TDH3 Cb-FDHl 1227KI LEU2 TEFl Ca_thl_co TDH3 Eg-TER-co 1388-PDC1 URA3 CUPl PDCl 1428_PflA HIS3 TDH3 PftA 1428ALD6 HIS3 TDH3 KtALDS 1428-IpdA H1S3 TDH3 IpdA 1429_PflB TRPl TDH3 PflB 1429-aceE TRPl TDH3 aceE 1429ACS1 TRPl TDH3 KIACSl 1430_Fdhl LEU2 TDH3 Cb-FDHl 1430-aceF LEU2 TDH3 aceF 1431ACS2 URA3 TDH3 KIACS2 pGV1103- Ipdl HIS3 TDH3 LPDl

A tabela 3 descreve o butanol produzido em uma levedura S. cerevisiae (espécie W303a) conduzindo vários plasmídeos, pelo presente expressando um conjunto de genes introduzidos, que estão listados. Tabela 3: Produção de butanol por através de Saccharomyces cerevisiae transfor-

mantes.

Nome Isolado Combinação de plasmídeo Genes Introduzidos Quantidade de Bu- tanol 72 hpi (μΜ) Gevo 1094; Gevol 095 pGV1208; pGV1209; PGV1225; PGV1213 Ca-hbd-co; Ca-Crt-co; Ca-thl-co+Ca-ter; Ca- adhE2-co 129; 145 Gevo 1096; Gevol 097 pGV1208; PGV1209; PGV1226; PGV1213 Ca-hbd; Ca-Crt; Ca-thi- co+Ah-ter; Ca-adhE2- CO 207;216 Gevo 1098; Gevol 099 pGV1208; pGV1209; pGV1227; PGV1213 Ca-hbd; Ca-Crt; Ca-thl- co+Eg-ter; Ca-adhE2- CO 251; 313 Gevo 1100, Gevol 101 pGV1208; PGV1209; Ca-hbd; Ca-Crt; Ca-thl- co+Sc-ter; Ca-adhE2- 109; 109 Nome isolado Combinação de plasmídeo Genes Introduzidos Quantidade de Bu- tanol 72 hpi (μΜ) pGV1228; PGV1213 CO Gevo 1102, Gevol 103 PGV1217 PGV1218 PGV1220 PGV1213 Ca-hbd-co+ Ca-etfa- co; Ca-Crt-co+Ca-etfb- co; Ca-thl-co+Ca-bcd- co; Ca-adhE2-co 317; 332 Gevo 1104, Gevol 105 pGV1217 PGV1218 pGV1223 PGV1213 Ca-hbd-co+ Ca-etfa- co; Ca-Crt-co+Ca-etfb- co; ERG10+Ca-bcd- co; Ca-adhE2-co 172;269 Gevo 1106, Gevol 107 pGV1221 PGV1222 pGV1224 PGV1213 Ca-hbd-co+ Ca-etfa- co; Ca-Crt-co+Ca-etfb- co; Ca-thl-co+Me-bcd- co; Ca-adhE2-co 125; 115 Gevo 1108, Gevol 109 pGV1221 pGV1222 pGV1219 PGV1213 Ca-hbd-co+ Ca-etfa- co; Ca-Crt-co+Ca-etfb- co; ERG10+Me-bcd- co; Ca-adhE2-co 101; 124 Gevo 1110, Gevol 111 pGV1099 pGV1100 pGV1101 pGV1106 N/A 0; 12

Todos os procedimentos de clonagem e combinação de gene foram inicialmente realizados em E. coli utilizando métodos estabelecidos (Miller, JH1 1992, Sambrook1 J. et. Al1 2001).

Um conjunto de vetores útil para a expressão em uma levedura, S. cerevisiae, foi

descrito anteriormente (Mumberg, D., et al. (1995) Gene 156:119-122; Sikorski & Heiter (1989) Genetics 122: 19-27). Em particular, essas publicações descrevem um conjunto de marcadores selecionáveis (HIS3, LEU2, TRPI, URA3) e replicação de origens S. cerevisiae que também são usadas em muitos dos vetores listados na Tabela 2. Exemplo 1. Construção de Plasmídeo para expressão de genes do percurso de bu-

tanol na levedura S. cerevisiae.

O gene S. cerevisiae tiolase, ERG10, foi clonado por PCR de DNA genômico da espécie S. cerevisiae W303a, utilizando primers que introduziram um Sal \ local imediata- mente a montante do códon de partida e um BamH \ local imediatamente após o códon pa- rar. Este produto da PCR foi digerido com Sal / e BamH \ e clonado no mesmo em locais de pUC19 (Yanisch-Perron, C, Vieira, J., 1985, Gene, 33, 103-19) para gerar pGV1120.

Os plasmídeos pGV1031, pGV1037, pGV1094, e pGV1095 foram utilizados como modelos para amplificação de PCR do gene C. acetobutylicum (Ca)-Ca-THL, Ca-hbd, Ca- crt, e Ca-bdhB, respectivamente. pGV1090 foi utilizado como modelo para a amplificação de PCR de Ca-bcd, Ca-etfA, e Ca-etfB. O DNA genômico de Clostridium ATCC 824 foi utilizado para amplificar Ca-bdhA. Fragmentos amplificados foram digeridos com Sal / e BamH \ e clonado no mesmo local de pUC19. Estes esquemas de plasmídeos gerados, pGV1121, pGV1122, pGV1123, pGV1124, pGV1125, pGV1126, pGV1127, pGV1128, que contêm os genes, Ca-thl, Ca-hbd, Ca-crt, Ca-bcd, Ca-etfA, Ca-etfB, Ca-bdhA, e Ca-bdhB, respectiva- mente.

O gene Clostridium beijerinckii (Cb), Cb-hbd, Cb-crt, Cb-bcd, Cb-etfA, Cb-etfB, Cb- aldh e Cb-Adha foram amplificados por PCR utilizando primers projetados para introduzir um Sal/ local apenas a montante do início e uma BamH \ local apenas a jusante do códon parar. Os plasmídeos pGV1050, pGV1049, pGV1096 e pGV1091 foram utilizados como modelos para a amplificação de PCR de Cb-hbd, Cb-crt, Cb-aldh, e Cb-Adha, respectivamente. O DNA genômico de Clostridium beijerinckii ATCC 51743 foi utilizado como modelo para Cb- bcd, Cb-etfA e Cb-etfB. Os fragmentos PCR amplificados foram digeridos com Sal \ e Bamhh e clonados nos mesmos locais de pUC19. Este procedimento gerou plasmídeos pGV1129, pGV1130, pGV1131, pGV1132, pGV1133, pGV1134, e pGV1135, que contêm os genes Cb- hbd, Cb-crt, Cb-bcd, Cb-etfA, Cb-etfB, Cb-aldh, e Cb -Adha, respectivamente.

Os gentes C. acetobutylicum e Meghasphaera elsdenii (Me)-genes que foram otimi- zados pelo códon (co-) para a expressão em E. coli também foram clonados. Estes genes incluem Ca-thl-co, Ca-hbd-co, Ca-crt-co, Ca-bcd-co, Ca-etfA-co, Ca-etfB-co, Ca-adhE2-co, co-Me-bcd, Me-etfA-co, e Me-etfB-co. Estes genes, exceto para o Ca-thl-co e co-Me-etfB foram amplificados utilizando primers destinados a introduzir um Sal/ local apenas a montan- te do códon de partida e um BamHI local apenas a jusante do códon de parada. No caso do Ca-THL-Me-etfB e co-co, primers foram designados para introduzir um local EcoRI apenas a montante do códon de partida e um BamHI local apenas a jusante do códon de parada. Os produtos resultantes da PCR foram digeridos utilizando as enzimas restrição apropriadas (Sal/ e BamHI ou EcoRI e BamHI) e clonados no mesmo local de pUC19 para gerar plasmí- deos pGV1197, pGV1198, pGV1199, pGV1200, pGV1201, pGV1202, pGV1203, pGV1205, pGV1206, que contêm os genes, Ca-thl-co, Ca-hbd-co, Ca-crt-co, Ca-bcd-co, Ca-etfA-co, Ca-etfB-co, Ca-adhE2-co, Me-etfA-co, e co-Me-etfB, respectivamente. O gene Me-bcd-co foi clonado em pGV1103 diretamente como um fragmento SaII-BamHI para gerar pGV1214.

Os genes acima foram clonados em vetores de expressão alta cópia de levedura, pGV1099, pGV1100, pGV1101, pGV1102, pGV1103, pGV1104, pGV1105 e pGV1106. As propriedades dos vetores utilizados para a clonagem de gene e construtos de plasmídeos resultantes são descritos na Tabela 2.

Os genes tiolase, ERG10 e Ca-thl foram liberados a partir de pGV1120 e pGV1121 utilizando Sal / e BamHI e clonados em pGV1099 (transportando um marcador HIS3) para gerar pGV1138 e pGV1139, respectivamente. O gene tiolase otimizado pelo códon, Ca-thl- co foi removido de pGV1197 e clonado em pGV1099 utilizando EcoRI e SamHI para gerar pGV1207. Assim, estes genes são clonados em moldura (in-frame) com duas cópias da eti- queta AU1 (SEQ ID NO: 172) e expresso utilizando a região promotora do S. cerevisiae TEF1 (SEQ ID NO: 175). O gene hidroxibutiril-CoA-desidrogenase, Ca-hbd (de pGV1122), Cb-hbd (de pGV1129) e Ca-hbd-co (de pGV1198) foram clonados em pGV1100 (conduz o marcador LEU2), utilizando Sal / e SamHI para gerar pGV1140, pGV1141, e pGV1208, res- pectivamente. Isso resulta em sendo estes genes clonados em moldura com uma etiqueta HA (SEQ ID NO: 173) e expressa utilizando o promotor TEF1. O gene crotonase, Ca-crt (de pGV1123), Cb-crt (de pGV1130), Ca-crt-co (de pGV1199) foram clonados em pGV1101 (conduz o marcador TRP1), utilizando Sal / e SamHI para gerar pGV1142, pGV1143, e pGV1209, respectivamente. Assim, estes genes são clonados em moldura com duas cópias da etiqueta AU1 e expressados utilizando os promotores TEF1. A butiril-CoA desidrogenase e os respectivos genes de transferência de elétrons et-

fA e etfB foram clonados por trás de uma etiqueta myc (SEQ ID NO: 174) expressa utilizan- do a região promotora TDH3 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 176). Os genes Ca-bcd (de pGV1124), Cb-bcd (de pGV1131), Ca-bcd-co (de pGV1200) e Me-bcd-co foram clonados em pGV1103 (conduz o marcador HIS3) para gerar pGV1144, pGV1145, pGV1210, e pGV1214. Os genes Ca-etfA (de pGV1125), Ca-etfB (de pGV1126), Cb-etfA (de pGV1132), Cb-etfB (de pGV1133), Ca-etfB-co (de pGV1202) e Me-etfA-co ( a partir de pGV1205) foram clonados em pGV1104 (conduz o marcador LEU2) para gerar pGV1146, pGV1147, pGV1148, pGV1149, pGV1212, e pGV1215, respectivamente. O Ca-etfA-co (de pGV1201) e Me-etfB-co (de pGV1206) foram clonados em pGV1104 (conduz o marcador TRP1) para gerar pGV1211 e pGV1216, respectivamente.

O gene para um aldeído desidrogenase, Cb-aldh (de pGV1134), foi clonado em pGV1102 (conduz o marcador URA3) para gerar pGV1150. O gene Cb-aldh é colocado na moldura com a etiqueta HA (SEQ ID NO: 173) expressa utilizando o promotor TEF1. O alde- ído / álcool desidrogenases bi-funcional, Ca-aad, Ca-adhE2, e Ca-adhE2-co, e os alcoóis desidrogenases específicos, Ca-bdhA, Ca-bdhB, e Cb-Adha foram clonados por trás de uma etiqueta myc expressado sob o controle do promotor TDH3. Ca-aad e Ca-adhE2 foram am- plificados por PCR utilizando primers designados a introduzir um Sal / local apenas a mon- tante do códon de partida e um Not \ local apenas a jusante do códon de parada. O plasmí- deo, pGV1089, foi utilizado como um modelo para o Ca-DAA, e do C. acetobutylicum DNA genômico foi usado como um modelo para o Ca-adhE2. Estes produtos PCR foram clona- dos em pGV1106 (conduz o marcador URA3), utilizando Sal / e Not \ para gerar pGV1136 (Ca-daa) e pGV1137 (Ca-adhE2). O códon otimizado Ca-adhE2-co (de pGV1203) foi clona- do em pGV1106 utilizando Sal / e BamHI para gerar pGV1213. O álcool desidrogenases, Ca-bdhA (de pGV1127), Ca-bdhB (de pGV1128) e Cb-Adha (a partir de pGV1135), foram clonados em pGV1106 usando Sal I e BamHI para gerar pGV1151, pGV1152, e pGV1153, respectivamente.

Portanto, os genes de expressão de levedura acima descritos para butiril-CoA desi- drogenase, a transferência de elétrons da proteína A, a transferência de elétrons da proteína B, e o álcool desidrogenase específico, foram combinadas com o promotor TEF1 conduzin- do tiolase, hidroxibutiril-CoA desidrogenase, crotonase, ou o aldeído desidrogenase, na for- ma por pares como resumidos na Tabela 2 acima.

Para este efeito, os fragmentos EcolCRI para Xho\ de pGV1144 (promotor TDH3 e

Ca-bcd) e de pGV1145 (promotor TDH3 e Cb-bcd) foram clonados no Not \ (preenchido com Klenow) para Xho \ local de pGV1138 para gerar pGV1167 (ERG10 +Ca-bcd) e pGV1168 (ERG10 + Cb-bcd), respectivamente. Estes mesmos fragmentos EcolCRI para Xho \ foram também clonados similarmente em pGV1139 para gerar pGV1169 (Ca-thl + Ca-bcd) e pGV1170 (Ca-thl + Cb-bcd), respectivamente. Utilizando a mesma estratégia, a EcolCRI para fragmentos Xho \ de pGV1146 (promotor TDH3 e Ca-etfA), pGV1148 (promotor TDH3 e Ca-etfB), pGV1147 (promotor TDH3 e Cb-etfA), e pGV1149 (promotor TDH3 e Cb-etfB) foram clonados em Not \ (preenchido com Klenow) para Xho \ local de pGV1140, pGV1141, pGV1142, pGV1143 para gerar pGV1171 (Ca-hbd + Ca-etfA), pGV1172 (Ca-crt +Ca-etfB), pGV1173 (Cb-hbd + Cb-etfA), e pGV1174 (Cb-crt + CB-etfB), respectivamente. O aldeído desidrogenases e o álcool desidrogenase foram combinados de modo similar clonando a EcolCRI para fragmentos Xhol de pGV1151 (promotor TDH3 e Ca-bdhA), pGV1152 (promo- tor TDH3 e Ca-bdhB) e pGV1153 (promotor TDH3 e Cb-Adha) na (preenchido com Klenow) para Xhol local de pGV1150 para gerar pGV1175 (Cb-aldh + Ca-bdhA), pGV1176 (Cb-aldh + Ca-bdhB), e pGV1177 (Cb-aldh + Cb-Adha), respectivamente.

No caso de genes otimizada por códon, o EcolCRI para fragmentos Xho\ de pGV1210 (promotor TDH3 e Ca-bcd-co), pGV1211 (promotor TDH3 e Ca-etfA-co), pGV1212 (Promotor TDH3 e Ca -etfB-co) foram clonados na BamH \ (preenchido com Klenow) para Xho \ local de pGV1207, pGV1208, e pGV1209, respectivamente, para gerar pGV1220 (Ca- thl-co-Ca + bcd-co), pGV1217 (Ca -Ca + hbd-co-co-etfA), e pGV1218 (Ca-crt-co + Ca-etfB- co). O EcolCRI para fragmentos Xho \ de pGV1214 (Promotor TDH3 e Me-bcd-co), pGV1215 (Promotor TDH3 e Me-etfA-co), pGV1216 (Promotor TDH3 e co-Me-etfB) também foram clonados para o mesmo conjunto de vetores, respectivamente, para gerar pGV1224 (Ca-thl-co + Me-bcd-co), pGV1221 (Ca-hbd-co- + Me-etfA-co), e pGV1222 (Ca-crt-co + Me- etfB-co). Além disso, o EcolCRI para fragmentos Xho\ de pGV1210 (Promotor TDH3 e Ca- bcd-co) e de pGV1214 (Promotor TDH3 e Me-bcd-co) foram clonados na SamHI (preenchi- do com Klenow) para Xho \ local de pGV1138 para gerar pGV1223 (ERG10 + Ca-bcd-co) e PGV1219 (ERG10 + Me-bcd-co).

Além dos referidos percursos, constructos foram gerados que utilizam alternativas ao complexo bcdletfA / etfB, a saber, trans-enoil redutase e crotonil-CoA redutase. Genes trans-enoil redutase de C. aetobutylicum (Ca-ter), Aeromonas hydrophila (Ah-ter), e Euglena gracilis (Eg-ter) e o crotonil-CoA redutase de Streptomyces collinus (SC-ccr) foram clonados. Ca-ter foi amplificados por PCR a partir do DNA genômico de C. acetobutylicum utilizando primers designados para introduzir um Sal \ local imediatamente a montante do códon de partida e um Not \ local apenas a jusante do códon de parada. Ah-ter, Eg-ter, e SC-ccr foram amplificados por PCR a partir de pGV1114, pGV1115, e pGV1166, respectivamente, utili- zando primers designados para introduzir um Sal\ local imediatamente a montante do códon de partida um BamHW local apenas a jusante do códon de parada. As seqüências para estes três genes foram otimizadas pelo códon para expressão em E. coli. Também, a seqüência Eg-ter codifica para uma proteína que está faltando à região N-terminal, que podem estar envolvidos na localização mitocondrial. Os respectivos produtos PCR foram clonados em pGV1103 utilizando enzimas de restrição adequadas para gerar pGV1155 (Ca-ter), pGV1156 (Ah-ter), pGV1157 (Eg-ter) e pGV1158 (SC-ccr).

Para o uso em expressar o percurso de butanol em levedura, estas alternativas pa- ra o complexos bcd / etfA / etfB foram cada um combinado com um gene tiolase em um plasmídeo. Os genes Ca-ter, Ah-ter, Eg-ter e Sc-ccr foram combinados com o gene Ca-thl- co clonando a EcolCRI para fragmento Xho \ de pGV1155, pGV1156, pGV1157 e pGV1158 em SamHI (preenchido com Klenow) para Xho \ local de pGV1207 para gerar pGV1225 (Ca- thl-co + Ca-ter), pGV1226 (Ca-thl-co + Ah-ter), pGV1227 (Ca-thl-co + Eg-ter) e pGV1228 (Ca-thl-co + SC-ccr), respectivamente.

Exemplo 2. Extrato de Levedura / Análise Ocidental do Borrão Para a análise da expressão protéica, os extratos brutos da proteína da levedura fo-

ram feitos por um rápido protocolo de precipitação TCA. Um equivalente OD6OO de células foram coletados e tratados com 200 μΐ de NaOH/7.4% 2-mercaptoetanol 1,85N no gelo du- rante 10 min. 200 //L de TCA 50% foi adicionado e as amostras incubadas em gelo por um acréscimo de 10 min. As proteínas precipitadas foram coletadas por centrifugação a 25.000 rcf durante 2 minutos e lavados com 1 mL de acetona em gelo frio. As proteínas foram no- vamente coletadas por centrifugação a 25,000 rcf por 2 min. O pellet foi então ressuspenso em amostra tampão de SDS e fervida (99° C) por 10 min. As amostras foram centrifugadas a um máximo em uma microcentrífuga por 30 segundos para remover matéria insolúvel.

Amostras foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para nitrocelulose. Foi fei- ta a análise ocidental utilizando o TMB Western Blot Kit (KPL). Anticorpos HA.11, myc (9E10), e AU1 foram obtidos a partir de Covance. Os ocidentais foram desempenhados con- forme descrito pelo fabricante, exceto que quando o anticorpo myc foi utilizado, o detector da solução em bloco foi utilizado em 0.3x a 0.5x suplementados com 1% do detector de pó no bloco. A expressão de todos os genes descritos no Exemplo 1, foi verificada utilizando este método.

Exemplo 3. Transformações em Levedura.

Foram feitas transformações de Saccharomyces cerevisiae (W303a) utilizando mé- todo de acetato de lítio (Gietz, RDaRAW1 2002, Methods in Enzymology, 350, 87-96). Re- sumidamente, 1 mL de uma cultura de levedura tratada durante a noite (overnight) foi diluída em 50 mL de meio fresco YPD e incubados em um agitador a 30° C por 5 a 6 horas. As cé- lulas foram coletadas, lavadas com 50 mL de água esterilizada, e lavadas com 25 ml de á- gua estéril. As células foram ressuspensas utilizando 1 ml de acetato de lítio 100 mM e transferido para um tubo de microcentrífuga. As células foram peletizadas por centrifugação durante 10 s. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 4x o vo- lume de acetato de lítio 100 mM. 15 //L de células foram adicionados à mistura de DNA (72 /vL de PEG 50%, 10 μΙ de acetato de lítio 1 M, 3 //L 10mg/ml de DNA desnaturado do es- perma do salmão, 2 μΐ_ de cada um do DNA do plasmídeo desejado e água estéril a um vo- lume total de 100 μί). As amostras foram incubadas a 30° C por 30 min e chocado ao calor a 42° C por 22 min. As células foram então coletadas por centrifugação durante 10 s, res- suspensas em 100 μί em médio SOS (Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., 1989), e cha- peada nas chapas de seleção SC apropriadas (C Kaiser, M., S . Mitchel e A, 1994) - sem uracil, triptofano, Ieucina ou histidina.

Exemplo 4. Produção de n-butanol.

Transformantes (Tabela 1 acima) expressando diferentes combinações de enzimas relacionadas à proposta do percurso de produção de butanol foram avaliados para produção de n-butanol. Pré-culturas dos isolados foram preparadas pela inoculação de algumas colô- nias de placas SC ágar em 3 ml de SC médio (C Kaiser, M., S. e Mitchel, A, 1994), que foi agitada sob condições aeróbias durante 16 horas a 30°C a 250 rpm. As células resultantes foram peletizadas a 4000xg por 5 minutos e ressuspensas em 500 μ\ de SC médio. O cres- cimento celular foi avaliado pela absorbância a 600nm com diluições adequadas. Para cada isolado testado, células produzindo 15 OD foram injetadas (200 μΙ) em tubos BALCH anae- róbio contendo 5 ml de SC médio anaeróbio, previamente saturada com gás N2 para remo- ver oxigênio dissolvido. Os tubos foram incubados a 30° C com agitação a 250 rpm para impedir a fixação da célula.

Os tubos foram amostrados 10, 26, 44 e 70 horas após a inoculação através da re- moção de 500 μ\ da cultura com uma seringa esterilizada. Posteriormente, 250 μ\ de 40% em solução glicosada foram injetados em cada tubo para manter o carbono adequado no meio de cultura. Em cada momento, as amostras foram centrifugadas para peletizar as célu- las e o sobrenadante foi imediatamente congelado até que todas as amostras fossem cole- tadas.

A produção de N-butanol pelo transformantes foi determinada através da análise por cromatografia gasosa (GC). Todas as amostras congeladas foram descongeladas em temperatura ambiente e 400 μΙ de cada amostra com 80 μΙ de Pentanol 10mM adicionado como um controle interno foi filtrada através de um filtro de 0,2 μηι. 200 μΙ do filtrado resul- tante foi colocado em frascos GC e submetidos à análise GC.

Amostras foram executadas em uma cromatografia gasosa de Série Il Plus com um detector de ionização por chama (FID), equipado com um sistema automático HP-7673. Os analitos foram identificados com base em tempos de retenção de padrões autênticos e quantificados utilizando curvas de calibração de ponto 5. Todas as amostras foram injetadas em um volume de 1/vL. A análise direta do produto n-butanol foi realizada em uma coluna capilar DB-FFAP (30 m de comprimento, 0,32 mm ID, espessura da película de 0,25 //m) ligado ao detector FID. O programa de temperatura para separar o produto do álcool foi inje- tar a 225° C1 detector a 225° C, forno a 50°C por 0 minutos, em seguida, gradiente de Q°CI minuto a 80°C, gradiente de 13°C / minuto a 170°C, gradiente de 50°C / minuto a 220°C, então 220°C por 3 minutos.

Para avaliação da produção de butanol, dois independentes transformantes de ca- da combinação de plasmídeo foram testados. Os resultados são resumidos na Tabela 3 a- cima. Os dois números Gevo em "Nome Isolado" referem-se aos dois transformantes inde- pendentes avaliados para cada combinação do plasmídeo.

A quantidade de butanol produzida ao longo do tempo por dois dos melhores produ- tores, transformantes Gevol099 e Gevol 102, relativa ao isolados transformados apenas com os vetores vazios, Gevol 110 e Gevo1111 são mostrados a seguir (Figura 6). Ge- vo1099 e Gevol 102 exibiram um aumento na produção de butanol ao longo do tempo com concentração crescente do butanol de 123//M a 313//M e de 57/yM a 317/vM, respectivamen- te, de 24 a 72 horas após a inoculação.

Exemplo 5. Clonagem e Expressão de subunidades de E. coli de Piruvato Desidro- genase em Saccharomyces cerevisiae.

O objetivo deste exemplo é o de descrever como clonar genes aceE, aceF, e IpdA provenientes de E. coli, que juntos compreendem as três subunidades da enzima piruvato desidrogenase (PDH), como encontrado em E coli. Os três genes foram amplificados a par- tir de DNA genômico utilizando PCR. Este exemplo ilustra também a forma como os produ- tos protéicos destes três genes foram expressos em um organismo hospedeiro, Saceha- romyces cerevisiae.

O gene IpdA proveniente de E. coli foi amplificado por PCR utilizando o DNA genô-

mico de E coli como um modelo. Para amplificar especificamente IpdA, os primers Gevo- 610 e Gevo-611 foram utilizados; outros reagentes PCR foram fornecidos nos kits do fabri- cante, por exemplo, Kod Hot Start Polimerase (Novagen, Inc., catalog # 71086-5), e utiliza- dos de acordo para o protocolo do fabricante. Os primers diretos e reversos incorporaram nucleotídeos codificando locais de restrição de endonuclease Sall e Xhol restrição endonu- clease sites, respectivamente. O produto PCR resultante digerido com Sall e Xhol e clonado em pGV1103, rendendo pGV1334. O DNA IpdA inserido foi sequenciado na sua totalidade. Os genes aceE e aceF provenientes de E. coli foram inseridos no pGV1334 utili- zando uma abordagem semelhante à descrita acima. O gene aceE foi amplificado a partir do DNA genômico de E. coli utilizando dos primers Gevo-606 e Gevo-607, digerido com Sa/\ + Xhol e clonado no vetor pGV1334 cortado com Sal\ + Xhol, rendendo pGV1379. O aceE inserido foi sequenciado na sua totalidade. Para obter um plasmídeo com um marcador pro- totrófico diferente selecionável apropriado para expressão S. cerevisiae, o aceE inserido foi clonado fora do pGV1379 como fragmento Sa/\ + Xho\ e clonado em Sa/\ + Xho\ cortado pGV1104 produzindo pGV1603.

O gene aceF foi amplificado a partir do DNA genômico de E. coli utilizando os pri- mers Gevo-653 e Gevo-609. O produto resultante de 1,9 kb foi digerido com Sa/\ + Xho\ e clonado no vetor pGV1334, cortado com as mesmas enzimas, produzindo pGV1380. O aceF inserido foi sequenciado na sua totalidade. Para obter um plasmídeo com um marcador dife- rente selecionável para expressão S. cerevisiae adequada, o aceF inserido foi clonado a fora de pGV1380 e clonado em pGV1105, produzindo pGV1604. Para expressar estas proteínas em S. cerevisiae, a espécie S. cerevisiae Gevol 187

(CEN. PK) foi transformado com qualquer combinação de pGV1334, pGV1603, e pGV1604, e transformantes selecionados em meios de abandono adequados, como descrito no Exem- plo 3. Como um controle, as células foram transformadas com os vetores vazios correspon- dentes - pGV1103, pGV1104, e pGV1105, respectivamente. Culturas cultivadas a partir de transformantes foram analisadas para expressão LpdA, AceE, ou AceF através da prepara- ção de extratos brutos de proteína da levedura e analisando-os pelo Western blotting (base- ado na detecção do epítopo Myc presente em cada proteína), conforme descrito no Exemplo 2.

Exemplo 6. Clonagem de subunidades de S. cerevisiae PDH a partir do DNA ge- nômico, modificado para remover seqüências direcionadas endógenas mitocondriais, e sua expressão em células de S. cerevisiae.

Na maioria dos eucariotas, o complexo piruvato desidrogenase (PDH) está localiza- do no interior da mitocôndria. As várias proteínas compreendendo PDH são direcionadas para ingressar a mitocôndria, em virtude do seu teor, em sua região N-terminal, em torno de 20 a 40 aminoácidos comumente conhecidos como uma seqüência direcionada mitocondri- al. A presença de tal seqüência pode ser determinada experimentalmente ou computacio- nalmente (por exemplo, o programa MitoProt: http://mips.qsf.de/cqi- bin/proi/medqen/mitofilter). O sucesso da importação mitocondrial da proteína é seguido por clivagem proteolítica específica e da remoção da seqüência direcionada, resultando em uma de "clivados" importados. É bem-conhecido que a remoção de tal seqüência a partir de uma proteína por alteração genética da sua seqüência de codificação faz com que as proteínas se tornem incapazes de transitar na mitocôndria. Dessa forma, uma estratégia atraente para redirecionar uma proteína normalmente mitocondrial para o citosol envolve apenas a ex- pressão que parte do gene que codifica a parte "clivada" proteína restante após importação mitocondrial e posterior clivagem de protease.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a clonagem de vários dos genes com- preendendo o complexo piruvato desidrogenase de S. cerevisiae e, a expressão e a detec- ção desses genes em uma cultura de células de S. cerevisiae.

Muitos dos genes que codificam subunidades da PDH foram clonados por PCR1 uti- lizando essencialmente o procedimento descrito no Exemplo 5, exceto o modelo do DNA genômico de S. cerevisiae. O gene S. cerevisiae a ser amplificado e os primers correspon- dentes que foram utilizados estão apresentados na Tabela 1.

Para gerar genes que codificam proteínas previstas para serem localizadas no cito- sol, o primeiro primer listado em cada par de primers (listado na Tabela 1) foi designado pa- ra amplificar uma região de cada gene a jusante da parte prevista para codificar a seqüência mitocondrial direcionada. Os produtos PCR resultantes foram clonados no vetor pGV1103 utilizando locais únicos de restrição enzimática codificados nos primers utilizados para am- plificar cada gene, rendendo os plasmídeos listados na Tabela 2. Cada inserção foi sequen- ciada na sua totalidade. Para testar a expressão de cada gene, a espécie S. cerevisiae Ge- vo1187 (CEN. PK) foi transformada individualmente com cada um dos pGV1381, pGV1383, pGV1384, ou pGV1385, seguindo basicamente o procedimento descrito no Exemplo 3, e selecionando colônias HIS+ em meio de abandono SC-his definido. A expressão protéica foi testada por preparação de Iisado e Western blotting (para detectar a etiqueta Myc presente em cada proteína), conforme descrito (Exemplo 2).

Exemplo 7. Profético. Clonagem e expressão de subunidade de S. cerevisiae LPD1 e sua expressão em células de S. cerevisiae. Este Exemplo profético descreve como clonar o gene LPD1 a partir do DNA genô-

mico de S. cerevisiae por PCR1 e como detectar a expressão de LPD1 em uma célula hos- pedeira em S. cerevisiae.

A leitura aberta de Lpdl faltando aqueles nucleotídeos previstos para codificar a seqüência mitocondrial direcionada são amplificadas utilizando os primers Gevo-658 mais o Gevo-659 em uma reação de PCR, essencialmente, como descrito no Exemplo 5. Um pro- duto de 1.5kb é digerido com Xho\ + BamHI e clonado em pGV1103 cortado com a mesma enzima de restrição. O clone resultante, pGV1103-lpd1, é transformado em Gevol 187 e colônias resultantes são selecionadas por prototrofia HIS+, essencialmente, como descrito no Exemplo 3. Uma cultura de células contendo pGV1103-lpd1 é cultivada e a expressão LPD1 é detectada através da colheita de células seguida pelo Western blotting (para a eti- queta Myc presentes na proteína) essencialmente como descrito no Exemplo 2.

Exemplo 8. Profético. Clonagem de subunidades PDH de E. coli e sua expressão em Κ. Iactis

Algumas leveduras, especialmente aquelas conhecidas como "Crabtree negativas", oferecem vantagens distintas como uma produção de hospedeiro. Diferentemente espécies Crabtree-positivos isolados (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), que fermentam o excesso de glicose para etanol em condições aeróbias, espécies Crabtree-negativa isola- das, tais como as aquelas do gênero Kluyveromyces, irão ao invés de metabolizar glicose através do ciclo TCA produzir biomassa. Consequentemente, leveduras de Crabtree- negativos são tolerantes de inativação (durante o crescimento aeróbico) da assim chamada rota de passagem secundária PDH de dissimilação de glicose, que pode ocorrer, por exem- pio, pela supressão do gene KIPDC1.

O Exemplo profético seguinte descreve como clonar os genes que codificam as três subunidades de E. coli em vetores PDH adequados para a expressão da levedura Kluyve- romyces lactis, e também como detectar a expressão desses genes.

O gene de E. coli IpdA, aceE, e aceF são amplificados por PCR, como descrito no Exemplo 5. Os produtos PCR resultantes são digeridos com Sal\ + Xho\ e clonado no vetor pGV1428, pGV1429, e pGV1430, respectivamente, de cada corte Sal\ +XhoV Estas etapas produzem os plasmídeos pGV1428-lpdA, pGV1429-aceE, e pGV1430-aceF. Cada inserção é sequenciada em sua espécie entiretyA de K. Iactis (por exemplo, Gevol 287) é transfor- mada com uma ou qualquer combinação destes plasmídeos de acordo com métodos co- nhecidos (por exemplo, Kooistra R, Hooykaas PJ, Steensma HY. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92), e colônias resultantes são selecionadas por prototrofias adequadas. Culturas culti- vadas a partir de transformantes são testados para expressão LpdA, AceE, ou AceF utili- zando extratos brutos de proteínas da levedura e análise ocidental do borrão (com base na detecção do epítopo Myc presente em cada proteína), conforme descrito no Exemplo 2. Exemplo 9. Profético. Medição de atividade PDH nas células superexpressando su-

bunidades PDH.

O objetivo deste exemplo é o de descrever como a atividade PDH pode ser medida por meio de um ensaio in vitro.

Um método para quantificar a atividade PDH em uma célula de Iisado é descrito na literatura: (Wenzel TJ, et al. (1992). Eur J Biochem 209 (2) :697-705). Este método utiliza um Iisado derivado de uma fração celular enriquecida em mitocôndrias. Uma modalidade dife- rente deste método utiliza, como uma fonte de PDH, Iisados de células obtidas a partir de células inteiras. Tais Iisados são preparados conforme descrito anteriormente (Exemplo 2). Outra modalidade do presente método ensaio utiliza um Iisado de célula derivado de uma fração celular altamente enriquecido para proteína citosólica (não-mitocondrial). Este fracio- namento bioquímico irá reduzir a contribuição de PDH mitocondrial endógeno no ensaio. Métodos para preparar tais Iisados enriquecidos estão disponíveis comercialmente e bem- conhecidos àqueles versados na técnica; (ex. Mitochondrial / cytosol Fractionation Kit, Bio- Vision, Inc., Mountain View, CA).

Em outra modalidade, a atividade PDH é imunopurificada de células, em virtude da presença de uma etiqueta de epítopo Myc codificado em uma ou mais da expressão plasmi- dial. Métodos para imunopurificar proteínas epítopes marcadas são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica (por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) CSHL Press). O PDH imunopurificada complexo é, portanto, distinto dos complexos endógenos e serve como fonte de atividade no referido ensaio PDH in vitro.

Exemplo 10. Profético. Medição do acetil-CoA intracelular elevado em células su- perexpressando PDH.

O objetivo deste exemplo é o de descrever como níveis intracelulares de acetil- CoA, um produto de PDH, podem ser medidos em uma população de células de levedura cultivadas.

Para medir acetil-CoA intracelular, aqueles transformantes de leveduras que reali- zam combinações de plasmídeo apropriado necessárias para expressar o conjunto completo de genes PDH (por exemplo, pGV1334, pGV1603, e pGV1604) serão avaliados por níveis de acetil-CoA celulares, em comparação com o transformantes que controlam apenas vetor (por exemplo, pGV1103, pGV1104, e pGV1105). Células de leveduras são cultivadas à satu- ração em meio de abandono definido adequado (por exemplo, SC-His1-Leu1-Trp) no agitar de frascos. A densidade óptica (OD6OO) da cultura é determinada e células peletizadas por centrifugação a 2800xg por 5 minutos. As células são Iisadas utilizando um glóbulo batedor e os Iisados são utilizados para determinação da proteína e análise para determinação de acetil-CoA com métodos estabelecidos (Zhang et al, Conexão de PropioniI-CoA Metabolis- mo para Polyketide biosynthesis em Aspergillus nidulans. Genetics, 168:785 — 794). Exemplo 11. Profético. A co-expressão de genes de subunidades PDH de E. coli e

um percurso da produção de butanol em S. cerevisiae.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a forma como os genes que codificam subunidades PDH de E. coli serão co-expressadas com os genes que compreendem um percurso da produção de butanol, no Saccharomyces cerevisiae hospedeiro. Co-expressar PDH com um percurso da produção de butanol irá aumentar o rendimento do butanol produ- zido em relação a apenas expressar o percurso de butanol sem o PDH funcional expresso de forma anormal no citosol.

O genes clonados IpdA, e aceE e aceF (ver Exemplo 5), são subclonados em plasmídeos dos genesdo percurso de butanol, especificamente pGV1208, pGV1209 e pGV1213 (Tabela 2). Para fazer isso, pGV1334, pGV1603 e pGV1604 são cada digeridos com as enzimas de restrição EcolCRI mais Xhol, e a inserção resultante liberada é ligada em pGV1208, pGV1209 e pGV1213 que é digerido com SamHI, a protuberância preenchida por Klenow DNA polimerase, e então digeridos com Xho\, utilizando todos os métodos da biologia molecular padrão (Sambrook, J. Fritsch1 EF1 Maniatis1 T., 1989). Estas etapas pro- duzem pGV1208-lpdA, pGV1209-aceE e pGV1213-aceF, respectivamente. Os plasmídeos resultantes são transformados, juntamente com pGV1227 em Gevo 1187 e selecionado para protrotofia HIS1 LEU, TRP e URA, todos essencialmente como descrito no Exemplo 3. Espé- cies transformadas com os plasmideos parentais pGV1208 mais pGV1209 mais pVG1213 mais pGV1227 são utilizados como controles, para avaliar os efeitos da co-expressão PDH na produção de butanol. A produção de butanol é desempenhada conforme descrito no E- xemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 12. Profético. Geração de uma forma de PDH que é funcional em condi- ções anaeróbicas, ou em condições de excesso de NADH.

O objetivo deste exemplo é o de descrever o isolamento de uma forma mutante do PDH1 que é ativo por via anaeróbia, ou seja, é ativo na presença de um raio elevado [NADH]/[NAD+] relativo ao raio presente durante o crescimento aeróbia normal. Essa forma de um mutante PDH é desejável na medida em que pode permitir a atividade enzimática PDH continuada mesmo sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas.

Métodos para identificar e obter versões alteradas de PDH que permitem atividade microaeróbica ou anaeróbia foram descritos anteriormente: (Kim, Y. et al. (2007). Appl. Envi- ronm. Microbiol., 73, 1766-1771; Pedido de Patente U.S. N0 11/949,724, que é incorporado na íntegra aqui).

Exemplo 13. Profético. A co-expressão de genes de subunidade PDH E. coli e um percurso da produção de butanol em uma espécie S. cerevisiae com atividade reduzida ou ausente de piruvato descarboxilase.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a forma como os genes que codificam subunidades PDH E. coli são co-expresssados com genes compreendendo um percurso da produção de butanol, em uma espécie Saccharomyces cerevisiae com atividade reduzida ou ausente de piruvato descarboxilase (PDC). Ambos os PDC e PDH utilizam e, portanto, com- petem para recursos disponíveis de piruvato. Considerando que o produto de PDH, acetil- CoA, pode ser diretamente utilizado pelo percurso do butanol, o produto do PDC, acetaldeí- do, ainda pode ser reduzido a etanol (através de álcool desidrogenase), um produto lateral indesejável da fermentação do butanol, ou pode ser convertido em acetil-CoA através da ação concertada de acetaldeído desidrogenase acrescido de acetil-CoA sintetase. Assim, reduzir ou eliminar a atividade PDC irá aumentar o rendimento do butanol a partir de piruva- to em uma célula também superexpressando PDH funcional no citosol.

Geração de uma espécie de pdc- de S. cerevisiae.

Espécies de S. cerevisiae com atividade PDC reduzida ou ausente são descritas na literatura (por exemplo, Flikweert, MT, et al., (1996). Levedura 15; 12 (3) :247-57; Flikweert MT, et al., (1999). FEMS Microbiol Lett. 1; 174 (1) :73-9; van Maris AJ1 et al., (2004) Appl Environ Microbiol. 70 (1): 159-66. e são bem-conhecidas aos versados na técnica. Em uma modalidade, uma espécie de S. cerevisiae carecendo de toda a atividade PDC tem o genóti- po pdclA pdc5A pdc6A. Tais espécies carecem de atividade PDC detectável e são incapa- zes de crescer em glicose como única fonte de carbono, mas pode viver, quando o meio é suplementado com etanol ou acetato como uma fonte alternativa de carbono. Em outra mo- dalidade, um derivado desta espécie tem evoluído paraa crescer em glicose, uma fonte de carbono conveniente e comumente utilizada. Uma terceira modalidade de uma espécie com muita atividade PDC reduzida é uma espécie do respectivo genótipo pdc2A, também descri- ta na literatura (Flikweert MT, et al., (1999). Biotechnol Bioeng. 66 (1) :42-50). Quaisquer dessas espécies podem servir como um hospedeiro útil para a expressão de um percuroso de PDH mais butanol. Se necessário, qualquer espécie mutante de pdc- será projetada, por meio de padrão de biologia molecular e técnicas genéticas de levedura, para que disponibili- zem esses marcadores auxotróficos tais que os plasmídeos pGV1208-lpdA, pGV1209-aceE, e pGV1213-aceF pode ser selecionada e mantida estável dentro de uma célula hospedeira. Essa projeção genética terá lugar por causa da ruptura do gene endógeno relevante através da fita de rompimento baseado em URA3, com posterior remoção do marcador URA3 pela seleção FOA.

Produção do Butanol em uma espécie pdc- superexpressando PDH. Os genes clonados IpdA, aceE e aceF (ver Exemplo 5), estão subclonados em ge-

nes de plasmídeos no percurso do butanol, especificamente pGV1208, pGV1209 e pGV1213 (Tabela 2), essencialmente como descritas no Exemplo 11.

O conjunto de plasmídeos pGV1208-lpdA mais pGV1209-aceE mais pGV1213- aceF mais pGV1227, ou o conjunto pGV1208 mais pGV1209 mais pGV1213 mais pGV1227 como um controle, são transformados em espécie mutante de levedura pdc- e colônias culti- vadas resultantes em de cultura líquida. A produção de butanol é desempenhada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimentode n-butanol esperado é superior a 50%.

É provável que espécies com atividade PDC diminuída ou ausência de irá apresen- tar um defeito de crescimento acentuado, e, portanto, pode ter de ser complementado com uma fonte adicional de carbono (por exemplo, acetato ou etanol). Uma vez que o defeito no crescimento do pdc- S. cerevisiae resulta de sua falta de recursos citoplasmáticos do acetil- CoA, espera-se que o sucesso da expressão PDH no citosol gere acetil-CoA suficiente para salvar este defeito no crescimento. Essa recuperação do crescimento pode servir como uma leitura útil in vivo da atividade PDH no citosol. Exemplo 14 (profético). Expressão de PFL (Piruvato Formiato liase) e FDH1 (For-

miato dehydrogenase) em Saccharomyces cerevisiae.

Clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato liase inativo) e pflA (ativação enzimáti- ca de Piruvato Formiato liase).

Para a clonagem de Escherichia coli pflB e pflA, os genes são amplificados utilizan- do DNA genômico de E. coli e primers pflB_forw, PflB_rev e PflA_forw, PflA_rev, respecti- vamente. Para a clonagem do gene de Candida boidinii FDH1 (CB-FDHI), DNA genômico de Canida boidinii é utilizado com primers fdh_forw e fdh_rev. Utilizando os locais de restrição, SalV e EcoRI incorporados nos primers de amplificação genes direto e reverso, respectiva- mente, o DNA é ligado para Sal/e EcoR\ pGV1103 digerida, pGV1104 e pGV1102 yielding pGV1103pflA, pGV1104pflB e pGV1002fdh1. As proteínas expressas a partir de plasmídeos resultante são marcadas com etiquetas myc, myc e HA, respectivamente. Os plasmídeos resultantes (pGV1103pflA, pGV1104pflB e pGV1002fdh1) e vetores

(pGV1103, pGV1104and pGV1102) são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1187, como indicado por exemplo 3 para produzir PflA, PFIB, Fdhl expressando (PFL+) e controlar transformantes (PFL-). Ambos os conjuntos de transformantes são esco- lhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e URA. A trasformantes resultantes são avaliados pela expressão PflA, PFIB e Cb-Fdhl uti-

lizando extrato bruto de proteína de levedura e pela análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí- nas são avaliados por níveis celulares de acetil-CoA, em comparação com o vetor que con- trola apenas transformantes. Para isso, as células de PFL + e PFL são cultivadas em meio SC-ura, his, trp em formato de frasco de agitação. A densidade óptica (OD6OO) da cultura determinada e células peletizadas por centrifugação a 2800 xrcf por 5 minutos. As células são Iisadas utilizando um glóbulo batedor e os Iisados são utilizados para determinação de proteínas e análise para determinação de acetil-CoA com métodos estabelecidos (Zhang et al, Connection de PropionyI-CoA Metabolism to Polyketide Biosynthesis em Aspergillus nidu- lans. Genetics, 168:785 - 794). As quantidades de Acetil-CoA são avaliadas por mg de pro- teína total celular.

Para avaliar o efeito da expressão PflA, PFIB Fdhl na produção de n-butanol, pflA, pflB e Cb-FDHI são subclonados genes do percurso do butanol contendo pGV1208, pGV1209 e pGV1213 (Tabela 1). Para isso, pGV1103pflA, pGV1104pflB e pGV1002fdh1 são digeridos com enzimas de restrição EcolCRI + Xhole ligados em pGV1208, pGV1209 e pGV1213 digeridos com SamHI (e, posteriormente, terminada às cegas com Klenow Fill-in) + Xhol utilizando métodos padrão da biologia molecular (Sambrook, J. Fritsch, EF, Maniatis, T., 1989) para produzir pGV1208PflA, pGV1209PflB e pGV1213Fdh1. Os plasmídeos resul- tantes, juntamente com pGV1227 são transformados em Gevo 1187 e selecionados por pro- totrofia HIS, Leu, Trp e Ura. Gevol 110 e Gevol 111 são utilizados como controles isolados (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimen- to esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 15. (Profético). Expressão PfIA, PFIB Fdhl em Saccharomyce cerevisiae com atividade reduzida ou ausente de piruvato descarboxilase

A clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato Iiase inativos) e pflA (ativação enzi- mática de Piruvato Formiato liase) e Cb-FDHI é feito conforme descrito no Exemplo 14.

Os plasmídeos resultantes (pGV1103pflA, pGV1104pflB e pGV1002fdh1) e vetores (pGV1103, pGV1104 e pGV1102) são utilizados para transformar espécies de Ievedrua de S. cerevisiae (genótipo pertinente: ura3, trpl, his3, Ieu2, pdcl, pdc5, pdc6) como indicado pelo exemplo 3 para render PfIA1 PFIB, Cb-FDM expressando (PFL+) e transformantes de controle (PFL-). Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e URA.

Os transformantes resultantes serão avaliados por expressão PfIA1 PFIB e Fdh 1 uti- lizando extrato bruto de proteínas da levedura e por análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transformantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí- nas são avaliados por níveis celulares de acetil-CoA, em comparação com os transforman- tes que controlam apenas os vetores como descrito no Exemplo 14.

Para avaliar o efeito de expressar PfIA1 FDM PFIB na produção de n-butanol, pGV1208PflA1 pGV1209PflB e pGV1213Fdh1 juntamente com pGV1227 transformam-se em S. cerevisiae (ΜΑΤ A1 ura3, trpl, his3, Ieu2, pdcl, pdc5, pdc6 ) e selecionado por proto- trofia HIS1 Leu1 Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utilizados como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito em Exemplo 4. O rendimento de n- butanol esperado é superior a 50%.

Exemplo 16. (Profético) Expressão PFI e Fdh 1 em Saccharomyces cerevisiae com atividade ADH1 reduzida ou ausente

Clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato liase inativo) e pflA (ativação enzimáti- ca de Piruvato Formiato liase)

A clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato liase inativo) e pflA (ativação enzimá- tica de Piruvato Formiato liase) e Cb-FDHI é feito conforme descrito no Exemplo 14.

Os plasmídeos resultantes (pGV1103pflA, pGV1104pflB e pGV1002fdh1) e vetores (pGV1103, pGV1104 e pGV1102) são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1253 (adhIA), conforme descrito no Exemplo 3 para produzir PfIA1 PFIB1 Fdhl ex- pressando (PFL+) e transformantes de controle (PFL-). Ambos os conjuntos de transforman- tes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e LJRA.

Os transformantes resultantes serão avaliados para expressão PfIA1 PFIB e Fdhl utilizando extrato bruto proteínas da levedura e pela análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 2. Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí- nas são avaliados por níveis celulares de acetil-CoA, em comparação com os transforman- tes que controlam apenas vetores como descrito no Exemplo 14.

Para avaliar o efeito da superexpressão PfIA1 PFIB e Fdhl na produção de n- butanol, pGV1208PflA, pGV1209PflB e pGV1213Fdh1 juntamente com pGV1227 são trans- formados em Gevo 1253 e selecionado por protorofia His, Leu, Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utilizados como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é maior do que 10%.

Exemplo 17. Clonagem de genes PDC1 de S. cerevisiae, e sua superexpressão em S. cerevisiae.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a clonagem de um gene que codifica pi- ruvato descarboxilase sob o controle de um promotor constitutivamente ativo, e para des- crever a expressão de tal gene, em uma célula hospedeira de S. cerevisiae.

O PDC1 ORF completo foi amplificado a partir do DNA genômico de S. cerevisiae utilizando primers Gevo-639 mais Gevo-640, em uma reação de PCR1 que foi realizada es- sencialmente como descrito (Exemplo 5). O produto resultante de 1.7kb foi digerido com Xhol + SamHI e ligado ao vetor pGV1106, que foi cortado SaA + SamHV produzindo pGV1389 (ver Tabela 2). A inserção foi sequenciada na sua totalidade.

Para superexpressar Pdcl em S. cerevisiae, a espécie S. cerevisiae Gevol 187 (CEN.PK) foi transformado com pGV1389, e transformantes selecionados em meio de a- bandono SC-ura, como descrito no Exemplo 3. Culturas cultivadas a partir de transforman- tes foram analisadas por expressão pdcl utilizando extrato bruto de proteínas da levedura e por análise ocidental do borrão (com base na detecção do epítopo Myc presente na proteína recombinante expressa), conforme descrito no Exemplo 2. Exemplo 18. Clonagem para permitir expressões induzíveis de um gene de piruvato

descarboxilase.

A expressão constitutiva de um gene, por exemplo, piruvato descarboxilase, pode ser indesejável em certos pontos durante um crescimento da cultura, ou podem exercer uma pressão inesperada metabólica ou seletiva sobre aquelas células superexpressas. Assim, existe a necessidade de empregar um sistema de expressão gênica regulada, em que um gene de interesse pode ser expresso principalmente em um momento ótimo para maximizar o crescimento da cultura, bem como o desempenho em uma fermentação posterior.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a clonagem de um gene que codifica a enzima piruvato descarboxilase sob o controle de um promotor regulado induzivelmente, e para descrever a expressão de tal gene, tais em uma célula hospedeira S. cerevisiae.

O PDC1 ORF presente em pGV1389 (ver Exemplo 19) foi liberado como um frag- mento Xbal + BamH e clonado no vetor pGV1414 que tinha sido digerido Ανή\ + SamHI, produzindo vectores pGV1483. O vector pGV1483 (Tabela 2), desse modo, caracteriza o gene promotor MET3 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 177) conduzindo a expressão do gene PDC1. O promotor MET3 é transcricionalmente mudo na presença de metionina, mas torna- se ativo quando os níveis de metionina caem abaixo de um determinado limite. O plasmídeo pGV1483 é transformado em Gevo 1187 e transformantes resultantes são identificados pela seleção em meios SC-ura, tal como descrito no Exemplo 3. Culturas de Gevo 1187 transpor- tando pGV1483 são cultivados e testados pela expressão PDC1 essencialmente como des- crito no Exemplo 2.

Em outra modalidade deste exemplo, o gene PDC1 é expresso sob o controle do gene promotor CUP1 induzíveis por cobre de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 178). Primeiro, o gene promotor CUP1 foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de S. cerevisiae utilizando primers em uma reação essencialmente como descrito em (Exemplo 5). O produto PCR foi digerido Sacl + Sa/I e inserido em pGV1106 que foi cortado Sac/ + Sal, produzindo pGV1388. A seqüência promotora inserida CUP1 foi sequenciada na sua totalidade. Em seguida, um fragmento Xba\ + BamH contendo o gene PDC1 proveniente de pGV1389 é inserido no AvrlI + SamHI digerido pGV1388, produzindo pGV1388-PDC1. O Plasmídeo pGV1388-PDC1 é transformado em Gevo 1187, conforme descrito no Exemplo 3, e trans- formantes são identificados no meio SC-ura definido carente de cobre. Culturas de células transformadas são cultivadas em meio SC-ura sem suplementação de cobre até atingirem um OD6OO de > 0,5, momento em que o sulfato de cobre é adicionado a uma concentração final de 0,5 mM. As culturas são cultivadas por mais 24 h a 48 h, conforme o desejado, e depois testadas para a expressão de Pdcl por análise ocidental do borrão, essencialmente como descrito (Exemplo 2).

Exemplo 19. Profético. Um ensaio in vitro para medir a atividade PDC produzida em uma cultura de células de levedura superexpressando uma enzima de piruvato descarboxi- lase.

O objetivo deste exemplo é o de descrever um ensaio in vitro útil para determinar o total da atividade de piruvato descarboxilase presente em uma célula, e em particular a par- tir de uma população de células superexpressando uma enzima PDC. Ensaios para medir a atividade de PDC a partir de Iisados celulares totais foram

descritas e são bem-conhecidos para aqueles versados na técnica (Maitra PK Lobo & Z. 1971. J Biol Chem. 25, 246 (2) :475-88. ; Schmitt HD & Zimmermann FK. 1982. J bactéria. 151 (3): 1146-52; Eberhardt et al„ (1999) Eur. J. Biochem. 262 (1) ,191-201).

Em outra modalidade deste exemplo, a atividade PDC gerada pela expressão do PDC, tal como descrito nos exemplos 17 e 18 é medida pela primeira imuno precipitação PDC, utilizando um anticorpo específico dirigido contra PDC, ou utilizando um anticorpo diri- gido contra o epitopo de etiqueta Myc, que está presente no PDC superexpressado (mas não endógeno), como expressado nos Exemplos RF20 e RF21. Métodos para immuno pre- cipitatar especialmente proteínas presentes em uma mistura complexa são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies: A Labora- tory Manual, CSHL Press). O PDC immuno precipitatado complexos então servem como fonte de material para ser analisado utilizando os ensaios acima referidos. Este método permite, assim, a dosagem específica de PDC anormais, superexpressados.

Exemplo 20. Profético. Aumento da produtividade do butanol resultante da super- expressão de PDC em S. cerevisiae, que também tem um percurso funcional na produção do butanol.

O objetivo deste exemplo é para ilustrar a forma como a superexpressão de PDC aumenta a produtividade de butanol em uma cultura de Saccharomyces cerevisiae expres- sando também um percurso de produção do butanol.

A espécie de S. cerevisiae superexpressando um gene PDC tem sido descrito ante- riormente (van Hoek et al., (1998). Appl Environ Microbiol. 64 (6) :2133-40). Estas experiên- cias revelaram que (1) níveis de PDC endógeno em S. cerevisiae, embora compreendendo até 3,4.% do total de proteínas celulares, pode ser ainda aumentada pela presença de uma construção de superexpressão; e (2) a capacidade fermentativa (a taxa máxima específica de produção de etanol), de culturas superexpressando PDC em altas taxas de crescimento foi um aumentada em relação à espécies de controle. Estes resultados sugerem que a su- perexpressão de PDC, sob determinadas condições de crescimento, elevem o fluxo através de um percurso anormal produção de butanol fornecido.

Para superexpressar um gene PDC na presença de um percurso de butanol, o ge- ne PDC1 excisado a partir de pGV1389 por digestão com Spel, o corte da protuberância do DNA é preenchido com fragmento de DNA polimerase Klenow, e em seguida, o vetor digeri- do com Xho\. O fragmento é inserido no pGV1213 que é digerido com SamHI, o corte termi- na preenchido com enzima Klenow e, em seguida, digerido com Xhol, produzindo plásmido pGV1605. O plasmídeo pGV1605 ou pGV1057 (Mumberg, D., et al. (1995) Gene 156:119- 122) é transformado em Gevo 1187, juntamente com plasmídeos pGV1208, pGV1209, e pGV1213, essencialmente como descrito (Exemplo 3), e selecionado por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Fermentações são realizadas para produzir butanol, que é medido conforme descrito (Exemplo 4). A inclusão de pGV1605 resulta em maior produtividade de butanol (quantidade de butanol produzido por unidade de tempo) que faz a inclusão de pGV1057 com plasmídeos pGV1208, pGV1209, e pGV1213 nas fermentações acima-referidas. O n- butanol rendimento esperado é superior a 5%.

Exemplo 21. Profético. Aumento da produtividade de butanol resultante da super- expressão PDC em uma célula S. cerevisiae que tem atividade reduzida de álcool desidro- genase, e que contém também um percurso de produção funcional de butanol. O objetivo deste exemplo é demonstrar como a produtividade elevada do butanol é obtida superexpressando um gene PDC na presença de um percurso de produção do buta- nol, em uma espécie de levedura deficiente em atividade de álcool desidrogenase (ADH).

Acetaldeído gerado a partir de piruvato pelo PDC tem dois destinos principais: ele ainda pode ser metabolizado a acetil-CoA pela ação de acetaldeído desidrogenase e acetil- CoA sintetase, em que pode, então, ser um substrato útil para um percurso sintético do bu- tanol, ou, ele ainda pode ser metabolizado por um processo redutor para o etanol, pela ação de uma enzima de álcool desidrogenase (ADH). Portanto, diminuir ou eliminar ADHs, espe- cialmente aquelas enzimas (ADH) com uma preferência para acetaldeído, reduziria ou elimi- naria esta indesejável rota de dissimilação de acetaldeído e aumentaria recursos de acetil- CoA disponíveis a um percurso de butanol.

Os plasmídeos pGV1208, pGV1209, pGV1213, e pGV1605 são simultaneamente co-transformados em espécie Gevo 1187, que tem o genótipo pertinente ADH1+, ou em es- pécie Gevol266, que tem o genótipo adhIA relevante. Colônias transformadas são selecio- nadas por prototrofia His, Leu, Trp e Ura, essencialmente, como descrito no Exemplo 3. Fermentações são realizadas para produzir butanol, que é medido conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%. A espécie Gevol266 (adhiA) apresenta uma melhora de rendimento de butanol sobre uma fermentação paralela realizada em espécie Gevo 1187 (ADHI+).

Exemplo 22. Profético. Aumento do rendimento de butanol resultante de superex- pressão PDC em uma célula K.lactis com atividade reduzida de álcool desidrogenase e ex- pressando um percurso funcional produção de butanol.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a produção de butanol em uma espécie K Iactis com atividade ADH grandemente reduzida ou ausente. Prevê-se que a expressão de um percuroso de butanol em tal espécie produzirá significativamente maiores rendimen- tos de butanol por entrada de glicose do que a expressão de um percurso de butanol em uma espécie com atividade ADH.

Geração de uma espécie Kluyveromyces Iactis com reduzida atividade de álcool desidrogenase.

Métodos para transformar células de e romper genes em Kluyveromyces Iactis - ou seja, para substituir uma moldura de leitura aberta funcional com um marcador selecionável, seguido pela remoção posterior do marcador - foram descritos anteriormente (R Kooistra, Hooykaas PJ, Steensma HY. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92). Kluyveromyces Iaetis tem quatro genes que codificam enzimas ADH, dois dos quais, KIAD1 e KIADH2, estão localiza- das ao citoplasma. Um mutante derivado do K. Iaetis em que todos os quatro genes foram suprimidos (chamado K Iaetis ADH°) tem sido descrito na literatura (Saliola, M., et al., (1994) Yeast 10 (9); 1133-40), bem como as condições de cultura necessárias para crescer idealmente esta espécie . Uma versão alternativa desta abordagem emprega utilizar um marcador conferindo resistência ao fármaco G418/geneticin, por exemplo, conforme previsto pelo gene kan. Essa abordagem é útil na medida em que deixa o marcador URA3 disponível para utilização como um marcador selecionável em subsequentes transformações.

Expressão de um percurso de expressão do butanol em uma espécie adhO de K.

lactis.

O plasmídeos pGV1208, pGV1209, pGV1213, e pGV1605 são simultaneamente co- transformados em espécie Gevo 1287, que é ADH+, ou em uma espécie adhO. Colônias transformadas são selecionadas por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Fermentações são reali- zadas para produzir butanol, que é medido conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%. A espécie Gevol 287 produz significativamente mais butanol do que a fermentação paralela realizada em outra espécie adhO isogénica.

Exemplo 23. (Profético). Superexpressão ALD6 em Saccharomyces cerevisiae.

Para clonar o gene ALD6 de S. cerevisiae, um método de fusão de duas etapas PCR foi empregado que eliminou uma restrição enzimática internA Sa/I do local para facilitar manipulações posteriores de biologia molecular. Dois produtos PCR de sobreposição que abrange a seqüência de gene ALD6 de S. cerevisiae foram gerados usando pares de pri- mers Gevo-643 & Gevo-644 e Gevo-645 & Gevo-646 com DNA genômico de S. cerevisiae conforme o modelo. O fragmento de PCR resultante foi digerido com Sal\ + SamHI e ligado em forma semelhante restrição digeridos pGV1105 e pGV1101 para produzir pGV1321 e pGV1326. Posteriormente, ALD6 foi subclonado pela digestão dos pGV1321 e pGV1326 com EcoICRI + Xhol e ligação em SamHI (e, posteriormente, terminada às cegas por Klenow preenchido) + Xhol digerido pGV1209 e pGV1208 para produzir pGV1339 e pGV1399, res- pectivamente.

Os plasmídeos resultantes (pGV1339 e pGV1399) e vetores (pGV1105 e pGV1101)

são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1187 como descrito no Exemplo 3 para produzir ALD6 superexpressando ("Ald6+"), ou transformantes de controle, respecti- vamente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por pro- totrofia TRP e LEU em médio de abandono adequado. Os transformantes resultantes são avaliados por expressão Ald6 utilizando extrato

bruto de proteínas da levedura e análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar proteínas Ald6 são avaliados para o aumento da atividade de acetaldeído desidrogenase, em comparação com os transformantes que controlam apenas vetores. Para isso, Ald6+ e células de controle são cultivadas em médio abandono apropriado ao agitar frascos. A densidade óptica (OD6OO) da cultura é determinada e células peletizadas por centrifugação a 2800xg durante 5 minutos. As células são Iisadas utilizando um glóbulo batedor e os Iisados são utilizados para deter- minação da proteína e de análise para atividade de aldeído desidrogenase utilizando méto- dos estabelecidos (por exemplo, Van Urk et al, Biochim. Biophys. Acta1 191: 769).

Para avaliar o efeito da superexpressão de Ald6 na produção de n-butanol, pGV1339 é transformada em Gevo 1187, juntamente com pGV1208, pGV1227 e pGV1213 e selecionadas por prototrofia His1 Leu, Trp e Ura. Gevo 1110e 1111 são utilizados como con- trole isolado (Tabela 1). A produção de butanol é desempenhada conforme descrito no E- xemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%.

Exemplo 24. (Profético). Superexpressão de Ald6 em um Saccharomyces cerevisi- ae sem atividade de álcool desidrogenase I (adhIA).

Clonagem de gene ALD6 é realizada conforme descrito no Exemplo 23.

Os plasmídeos resultantes (pGV1339 e pGV1399) e vetores (pGV1100 e pGV1101) são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1253, como indicado pelo e- xemplo 3 para o rendimento de superexpressão Ald6+ e transformantes de controle, respec- tivamente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos em meio adequado de abandono.

Os transformantes resultantes serão avaliados por expressão Ald6 utilizando extra- to bruto de proteínas da levedura e análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exem- plo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar proteínas Ald6 serão

avaliadas quanto ao aumento da atividade do acetaldeído desidrogenase como descrito no Exemplo 23.

Para avaliar a conseqüência da superexpressão de produção de n-butanol, pGV1339 será transformada em Gevo 1253, juntamente com pGV1209, pGV1227 e pGV1213 e selecionadas por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utiliza- dos como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 25. (Profético). Superexpressão de um gene acetil-CoA sintetase em Sac- charomyces cerevisiae.

O objetivo deste exemplo é o de descrever a clonagem de um gene que codifica a

atividade acefyl-CoA sintetase, bem como a expressão de tal gene em uma célula hospedei- ra de S. cerevisiae. Especificamente, por um ou ambos os genes S. cerevisiae ACS1 ou ACS2 codificam a atividade de acetil-CoA sintetase.

Para a clonagem de genes ACS1 e ACS2, DNA genômico de S. cerevisiae foi utili- zado como modelo com Primers Gevo-479 & Gevo-480 (ACS1) e Gevo-483 & Gevo-484 (ACS2), cada conjunto contendo locais de restrição Saii e BamHl na nos primers diretos e reversos, respectivamente. O fragmento da PCR resultante foi digerido com Sal + BamHI e ligado em restrição similar digeridos pGV1101 e pGV1102 para produzir pGV1262 e pGV1263. Posteriormente, ACS1 e ACS2 foram subclonados pela digestão dos pGV1262 e com pGV1263 EcoICR + Xhol e ligação em BamHI (e, posteriormente, terminado às cegas com Klenow preenchido) + Xhol digerido pGV1213 para produzir pGV1319 e pGV1320 .

Os plasmídeos resultantes, pGV1262 e pGV1263, e vetores pGV1101 e pGV1102

são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1187 como descrito no Exemplo 3 para produzir superexpressão ACS1+, ACS2+ e transformantes de controle, respectiva- mente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por proto- trofia LEU, URA. Os transformantes são avaliados por expressão Acsl ou Acs2 usando ex- tratos brutos de proteína da levedura e por análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estas transformantes de leveduras verificadas para expressar proteínas Acsl ou Acs2 são avaliados para o aumento da atividade de acetil-CoA sintetase, em comparação com os transformantes que controlam apenas vetores. Para isso, ACS1+ ou ACS2+ e célu- Ias de controle são cultivadas em meio SC - LEU, URA em formato de frasco de agitação. A densidade óptica (OD6OO) da cultura determinada e células peletizadas por centrifugação a 2800 χ RCF por 5 minutos. As células são Iisadas utilizando um glóbulo batedor e os Iisados são utilizados para determinação da proteína e para análise da atividade de acetil-CoA sin- tetase utilizando métodos estabelecidos (Van Urk et al, Biochim. Biophys. Acta, 191: 769). Para avaliação do efeito da superexpressão Acsl ou Acs2 na produção n-butanol,

pGV1319 e 1320 vai ser transformado em Gevo 1187, juntamente com pGV1208, pGV1209 e pGV1227 e selecionadas por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utili- zados como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descri- to no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%. Exemplo 26. (Profético). Superexpressão de um acetil-CoA sintetase em célula de

Saccharomyces cerevisiae sem atividade de álcool desidrogenase I (adhIA).

Clonagem de genes ACS1 e ACS2 de S. cerevisiae são como descritas no Exem- plo 25.

Os plasmídeos resultantes, pGV1262 e pGV1263, e vetores pGV1101 e pGV1102 são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1253, como indicado pelo e- xemplo 3 para o rendimento de superexpressão ACS1+, ACS2+ e transformantes de contro- le, respectivamente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de sele- ção por prototrofia LEU, URA. Os transformantes são avaliados por expressão ACSI ou Acs2 utilizando extratos brutos das proteínas da levedura e análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 25.

Estes transformantes de leveduras verificados para expressar proteínas Acsl ou Acs2 proteínas são avaliados para o aumento da atividade do acetil-CoA sintetase descrito no Exemplo 26.

Para avaliação do efeito da superexpressão Acsl ou Acs2 na produção do butanol, pGV1319 e 1320 vão ser transformados em Gevo 1253, juntamente com pGV1208, pGV1209 e pGV1227 e selecionadas por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utilizados como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%.

Exemplo 27. (Profético). Superexpressão ALD6, ACS1 e ACS2 em Saccharomyces cerevisiae.

Os genes ALD6, ACS1 e ACS2 são clonados como descrito acima, nos exemplos

23 e 25.

Os plasmideos resultantes pGV1321 e pGV1262 ou pGV1263 e vetores pGV1105 e pGV1102 são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1187, tal como indi- cado pelo Exemplo 3 para produzir superexpressão ALD6+, ACS1+, ALD6+ ACS2+ e con- trole de transformantes, respectivamente. Ambos os conjuntos de transformantes são esco- Ihidos através de seleção por prototrofia LEU e URA.

Transformantes ALD6+ ACS1+ e ALD6+ ACS2+ são avaliados para o aumento da atividade de acetil-CoA sintetase, em comparação com transformantes que controlam ape- nas o vector. Para isso, ALD6+ ACS1+, ALD6+ ACS2+ e células de controle são cultivadas em meio SC - LEU, URA em formato de frasco de agitação e avaliada conforme descrito no Exemplo 25.

Avaliar o efeito da superexpressão de Ald6 mais Acsl ou Acs2 resulta em maior produção de butanol, Gevo 1187 é transformado com pGV1208, pGV1339, pGV1227 e pGV1319 ou 1320 e selecionado por prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Gevo 1110 e 1111 são utilizados como controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é avaliada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%.

Exemplo 28. (Profético). Superexpressão ALD6 mais ACS1 ou ACS2 em Saeeha- romyees cerevisiae sem atividade de álcool desidrogenase I (adhlA).

Os Genes ALD6, ACS1 e ACS2 são clonados como descrito nos exemplos 23 e 25.

Os plasmideos resultantes pGV1321 e pGV1262 ou pGV1263 e vetores pGV1105 e pGV1102 são utilizados para transformar a espécie de levedura Gevo 1253 (ÍADH1), como indicado pelo exemplo 3 para produzir superexpressão ALD6+ ACS1+ ou espécies ALD6+ ACS2+ ou controle de transformantes, respectivamente. Ambos os conjuntos de transfor- mantes são escolhidos através de seleção por prototrofia LEU e URA.

Os transformantes ALD6+ ACS1+ ou ALD6+ ACS2+ são avaliados para o aumento da atividade de acetil-CoA sintetase, em comparação com transformantes que controlam apenas os vectores. Para isso, ALD6+ ACS1+ ou ALD6+ ACS2+ e células de controla são cultivadas em médio SC - LEU, URA em formato de frasco de agitação e avaliadas confor- me descrito no Exemplo 25.

Para avaliar o efeito da superexpressão SALD6 e ACS1 ou ACS2 na produção de butanol, Gevo 1253 é transformado com pGV1208, pGV1339, pGV1227 e pGV1319 ou 1320 e selecionado por o prototrofia His1 LEU, TRP e URA. Gevo 1110 e 1111 são utilizados co- mo controle isolado (Tabela 1). A produção de butanol é realizada conforme descrito no E- xemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 29. (Profético). Clonagem de um percurso do butanol em vetores de ex- pressão em uma levedura do gênero Kluyveromyces.

Para clonar os genes do percurso do butanol em vetores adequáveis de expressão para a espécie Kluyveromyces lactis, hbd, Crt1 Thi + TER são liberadas a partir de pGV1208, pGV1209 e pGV1227 por digestão com a restrição Sacl e NoA digere e clonado de forma similar em pGV1428, 1429 e 1430 digerido para produzir pGV1208KI, pGV1209KI e pGV1227KI. Para clonar ADHE2 em Kluyveromyces lactis, pGV1213 é digerida com Mlul e Sacl e ligado para similarmente pGV1431 digerido para produzir pGV1213KI. Os plasmídeos resultantes pGV1208KI, pGV1209KI, pGV1227KI e pGV1213KI são transformados em K lactis (espécie Gevo 1287; genótipo relevante: MATa1 trpl, his3, Ieu2, ura3) e transforman- tes são selecionados por prototrofia TRP1 SUA, LEU e URA (Kooistra R, Hooykaas PJ, Ste- ensma ORQUÊ. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92). A produção de butanol é realizada con- forme descrito no Exemplo 4. Exemplo 30. (Profético). Expressão de Piruvato formiato Iyase e Formiate desidro-

genase I em Kluyveromyces lactis.

Clonagem de E. colipflB (Piruvato Formiato Iiase inactivos) e pflA (ativação enzimá- tica de Piruvato Formiato liase)

Para a clonagem de Escherichia coli pflB e pflA, os genes são amplificados utilizan- do DNA genômico de E. coli e primers pflB_forw, PflB_rev e PflA_forw, PflA_rev, respecti- vamente. Para a clonagem do gene FDH1 de Candida boidinii, DNA genômico de Canida boidinii é utilizado como um modelo em uma reação de PCR com primers fdh_forw e f- dh_rev. Utilizando os locais de restrição, Sal e EcoRI incorporados nos primers de amplifi- cação direto e reverso, respectivamente, o DNA amplificado está ligado no Sal e EcoRI dige- rido pGV1428, pGV1429 e pGV1430 produzindo pGV1428pflA, pGV1429pflB e pGV1430fdh1. As proteínas expressas a partir dos plasmídeos resultantes são direcionadas com etiquetas myc para os estudos de expressão protéica.

Os plasmídeos resultantes (pGV1428pflA, pGV1429pflB e pGV1430fdh1) e vetores (pGV1428, pGV1429 e pGV1430) são utilizados para transformar a espécie da levedura K. lactis (Gevo 1287; relevant genotype: MatA, trpl, his3, Ieu2 e ura3) por conhecidos métodos (R Kooistra, Hooykaas PJ, Steensma ORQUÊ. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92) para rendi- mento PflA, PFIB, Cb-Fdhl expressando (PFL +) e controle de transformantes (PFL-). Am- bos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e LEU.

Os transformantes resultantes são avaliados para expressão PfIA1 PfIB e Pfhl utili- zando extrato bruto de proteínas da levedura e por análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí- nas são avaliadas por níveis celulares do acetil-CoA, em comparação com os transforman- tes que controlam apenas vetores. Para isso, células o PFL+ e PFL- são cultivadas em mé- dio SC-LEU, HIS, TRP em formato de frasco de agitação. A densidade óptica (OD6OO) da cultura determinada e células peletizadas por centrifugação a 2800 xrcf por 5 minutos. As células são Usadas utilizando um glóbulo batedor e os Iisados são utilizados para determina- ção de proteínas e análise para determinação do acetil-CoA com métodos estabelecidos (Zhang et al, Connection de Propioniy-CoA Metabolism to Polyketide biosynthesis em As- pergillus nidulans.Genet\cs, 168:785 - 794). Quantidades de Acetil-CoA são avaliadas por mg de proteína total celular.

Para avaliar o efeito da expressão da PfIA1 PFIB e Fdhl na produção de butanol, o pflA, pflB e Cb-FDHI são subclonados em genes do percurso do butanol contendo pGV1208KI, pGV1209KI, pGV1227KI e pGV1213KI (Tabela 1). Para isso, pGV1428pflA, pGV1429pflB e pGV1002fdh1 são digeridas com enzimas de restrição EcolCRI + Xhol e ligados em pGV1208KI, pGV1209KI e pGV1213KI digerido com BamHI (e, posteriormente, terminado às cegas com Klenow preenchido) + Xhol utilizando métodos padrão de biologia molecular (Sambrook, J. Fritsch, EF, Maniatis, T., 1989) para produzir pGV1208KIPflA, pGV1209KIPflB e pGV1213KIFdh1. Os plasmídeos resultantes, juntamente com pGV1227KI são transformados em uma espécie de K. Iactis (MATa, pdcl, trpl, his3, Ieu2 ura3) e sele- cionado por prototrofia His1 Leu, Trp e Ura. Transformantes de Kluyveromyces Iactis abri- gando pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 31. (Profético). Expressão de Piruvato Formiato Iiase e Formate desidro- genase I em Kluyveromyces Iaetis carente de atividade de piruvato descarboxilase.

Clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato Iiase inativo) e pflA (ativação enzimáti- ca de Piruvato Formiato liase) Cb-FDHI são como descritos no Exemplo 30.

Os plasmídeos resultantes (pGV1428pflA, pGV1429pflB e pGV1430fdh1) e vetores (pGV1428, pGV1429 e pGV1430) são utilizados para transformar a espécie da levedura K. Iaetis (MatA, PDD, trpl, his3, Ieu2 e ura3) por métodos conhecidos (Kooistra R , Hooykaas PJ, Steensma HY. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92) para produzir PflA, PFIB, Cb-Fdhl ex- pressando (PFL+) e controle de transformantes (PFL-). Ambos os conjuntos de transforman- tes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e LEU.

Os transformantes resultantes são avaliados para expressão PfIA1 PFIB e Cb-Fdhl utilizando extratos brutos de proteínas da levedura e por análise ocidental do borrão, tal co- mo descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí-

nas são avaliadas para níveis celulares de acetil-CoA, em comparação com os transforman- tes que controlam apenas vetores. Para isso, células PFL+ e PFL- são cultivadas em médio SC-LEU1 HIS1 TRP formato de frasco para agitação e avaliada conforme descrito no Exem- plo 30.

Para avaliar o modo como a expressão de PfIA1 PFIB e Fdhl resulta em maior pro-

dução de butanol, pGV1208KIPfIA1 pGV1209KIPflB e pGV1213KIFdh1 juntamente com pGV1227KI são transformados em K, Iactis (ΜΑΤ uma, pdclA, trpl, his3, Ieu2, ura3) e sele- cionados por prototrofia His1 Leu, Trp e Ura. Transformantes Kluyveromyces Iactis abrigando pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n- butanol é superior a 50%.

Exemplo 32. (Profético). Expressão de PIF (Piruvato Formiato liase) e Fdhl (Forma- te dehydrogenase I) em um Kluyveromyces Iactis desprovido de atividade de Adhl.

Clonagem de E. coli pflB (Piruvato Formiato liase inativo), pflA (ativação enzimática Piruvato Formiato liase) e Cb-FDHI são descritas no Exemplo 30.

Os plasmídeos resultantes (pGV1428pflA, pGV1429pflB e pGV1430fdh1) e vetores (pGV1428, pGV1429 e pGV1430) são utilizados para transformar a espécie de levedura K. Iaetis (ΜΑΤ uma, trpl, his3, Ieu2, ura3) por métodos conhecidos (Kooistra R, Hooykaas PJ, Steensma HY. (2004) Yeast. 15, 21 (9) :781-92) para rendimento PflA, PfIBI Fdhl expres- sando (EcPFL +) e controle de transformantes (EcPFL-). Ambos os conjuntos de transfor- mantes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS1 TRP e LEU.

Os transformantes resultantes são avaliados para expressão PflA, PFIB e Fdhl uti- lizando extrato bruto de proteínas da levedura e por análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar todas as três proteí-

nas são avaliados por níveis celulares de acetil-CoA, em comparação com os transforman- tes que controlam apenas vetores. Para isso, células EcPFL+ e EcPFL- são cultivadas em médio SC-LEU, SUA, TRP em formato de frasco agitação e avaliada conforme descrito no Exemplo 30.

Para avaliar o modo como a expressão de PflA, PFIB e Fdhl resulta em maior pro-

dução de butanol, pGV1208KIPflA, pGV1209KIPflB e pGV1213KIFdh1 juntamente com pGV1227KI são transformados em K. Iaetis (MATa, adhIA, trpl, his3, Ieu2, ura3) e selecio- nados prototrofia His, Leu, Trp e Ura. Transformantes de Kluyveromyces Iactis abrigando pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n- butanol é superior a 20%.

Exemplo 33. (Profético). Superexpressão de KIALD6 em Kluyveromyces lactis.

Para clonar KIALD6, o DNA genômico de Kluyveromyces lactis é utilizado como um modelo em uma reação de PCR com primers KIALD6_left5 e KIALD6_right3 (ver Tabela 1), que é montado, de qualquer forma, conforme descrito no Exemplo 5. Os primers amima- mencionados contêm locais de restrição Sall e BamHI1 respectivamente, e os fragmentos resultantes da PCR são digeridos com Sal\ + BamHI\ e ligado de forma semelhante à restri- ção digerida pGV1428 para produzir pGV1428KLALD6. Posteriormente, KIALD6 é subclo- nado pela digestão dos pGV1428ALD6 com EcolCRI + Xhol e ligação em BamHI (e, poste- riormente, terminado às cegas por Klenow preenchido) + Xhol-digerida pGV1208KI para produzir pGV1208KIALD6. O plasmídeo resultante, pGV1428ALD6KI, e vetor, pGV1428 são utilizados para

transformar a espécie da levedura K lactis (MATa, trpl, his3, Ieu2, ura3) por métodos co- nhecidos (R Kooistra, Hooykaas PJ, Steensma HY. (2004) Yeast. 15, 21 (9) -.781-92) para produzir superexpressão KIALD6+ e KIALD6- e controle de transformantes, respectivamen- te. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS.

Os transformantes resultantes, KIALD6+ e-KIALD6 são avaliados para expressão KIAId6 utilizando extratos brutos de proteínas da levedura e por análise ocidental do borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Aqueles transfromantes K. lactis verificados para superexpressar proteínas KIAId6 são avaliados para o aumento da atividade de acetaldeído desidrogenase, em comparação com transformantes que controlam apenas vetores. Para isso, células KIALD6+ e KIALD6- são cultivadas em médio SC - SUA em formato de frasco para agitação e avaliada conforme

descrito no Exemplo 23.

Para avaliar a forma como a superexpressão de KIALD6 resulta em maior produção de butanol, pGV1208KIALD6 é transformado em K. lactis (MATa, trpl, his3, Ieu2, ura3), jun- tamente com pGV1209KI, pGV1227KI e pGV1213KI e selecionados por prototrofia His, LEU, TRP URA e transformantes decorrentes de K lactis transformados com pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de buta- nol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é su- perior a 5%.

Exemplo 34. (Profético). Superexpressão de um aldeído desidrogenase em Kluyve- romyces lactis desprovida de atividade Adh 1. Clonagem de gene Kluyveromyces KIALD6 é descrita no Exemplo 33.

O plasmídeo resultante, pGV1428ALD6, e o vetor, pGV1428 são utilizados para transformar a espécie de levedura K. Iactis (MATa, adhIA, trpl, his3, Ieu2, ura3) por méto- dos conhecidos (R Kooistra, Hooykaas PJ1 Steensma HY. (2004 ) Yeast. 15, 21 (9):781-92) para produzir superexpressão de KIALD6+ e KIALD6- e controle de transformantes, respec- tivamente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por prototrofia HIS.

Os transformantes resultantes - são avaliados pela expressão KIAId6 utilizando ex- tratos brutos de proteínas da levedura e por análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Aqueles transfromantes K. Iactis verificados para expressar proteínas KIAId6 são avaliados para o aumento da atividade de acetaldeído desidrogenase como descrito no E- xemplo 30.

Para avaliar a forma como a superexpressão de KIAId6 resulta em maior produção de butanol, pGV1208KIALD6 é transformado em K Iactis (MATa, adhlA, trpl, his3, Ieu2, ura3), juntamente com pGV1209KI, pGV1227KI e pGV1213KI e selecionados por prototrofia His, LEU, TRP e URA. Transformantes decorrentes de K. Iactis transformado com pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. Produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Exemplo 35. (Profético). Superexpressão de um gene acetil-CoA sintetase da leve- dura Kluyveromyces Iaetis.

Dois genes parálagos, KIACS1 e KIACS2, codificam a atividade de acetil-CoA no genoma da levedura Kluyveromyces laetis. Para clonar KIACS1 e KIACS2, o DNA genômico Kluyveromyces laetis é utilizado como modelo com primers KIACS1 Jeft5 & KIACS2_Right3 (ACS1) e KIACS2_Left5 & KIACS2_Right3 (ACS2) (ver tabela 1), contendo locais de restri- ção Notl & Sall e Sall & BamHI nos primers diretos e reversos, respectivamente. Os frag- mentos PCR resultantes são digerido com as enzimas apropriadas e ligado de forma seme- lhante restrição digerida pGV1429 e pGV1431 para render pGV1429ACS1 e pGV1431ACS2. Posteriormente, KIACS1 e KIACS2 são subclonados pela digestão dos pGV1429ACS1 e pGV1431 ACS2 com Sall & Notl e ligação de forma similar digerido PGV1209KI e pGV1213KI para produzir pGV1209KIACS1 e pGVKIACS2.

Os plasmídeos resultantes, pGV1429ACS1 e pGV1431ACS2 e vetores vazios pGV1429 e pGV1431 são utilizados para transformar K laetis (MATa, trpl, his3, Ieu2, ura3) por métodos conhecidos para produzir proteínas KIACS1+, KIACS2+ e KIACS- sobre- expressando transformantes de controle, respectivamente. Ambos os conjuntos de trans- formantes são escolhidos através de seleção por prototrofia TRP, UfRA. O transformantes são avaliados para expressão KIAcsi e KIAcs2 utilizando extratos brutos de proteínas da levedura e por análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar proteínas KIAcsI e KIAcs2 são avaliados para o aumento da atividade de acetil-CoA sintetase, em comparação com os transformantes que controlam apenas vetores. Para isso, células KIACS1+, KIACS2+ e KIACS- são cultivadas em médio SC-TRP1 URA em formato de frasco para agi- tação e avaliada conforme descrito no Exemplo 25.

Para avaliar a forma como a superexpressão de KIACS1 e KIACS2 resulta em mai- or produção de butanol, pGV1209KIACS1 e pGV1209KIACS2 transformam-se em espécie Gevo em 1287, juntamente com pGV1208KI e pGV1227KI, e as células transformadas são selecionadas por prototrofia His1 Leu, Trp e Ura. Transformantes resultantes de um K. Iactis (MATa, trpl, his3, Ieu2, ura3) transformada com pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%.

Exemplo 36. (Profético). Superexpressão de um gene acetil-CoA sintetase em uma levedura Kluyveromyces Iactis desprovida de atividade Adhl.

Clonagem de genes KIACSI e KIACS2 de Kluyveromyces Iaetis é descrito no E- xemplo 35.

Os plasmídeos resultantes, pGV1429ACS1 e pGV1431ACS2 e vetores vazios pGV1429 e pGV1431 são utilizados para transformar K Iaetis (MATa, adhIA, trpl, his3, I- eu2, ura3) por métodos conhecidos para produzir superexpressão KIACS1+ e KIACS2+ e transformantes de controle, respectivamente . Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por prototrofia TRP e URA. O transformantes são avaliados para KIAcsI e expressão KIAcs2 utilizando extratos brutos de proteínas da levedura e por análise ocidental de borrão, tal como descrito no Exemplo 2.

Estes transfromantes de leveduras verificados para expressar proteínas KIAcsI e KIAcs2 são avaliados para o aumento da atividade de acetil-CoA sintetase descrita no E- xemplo 25.

Para avaliar a forma como a sobre-expressão de KIACS1 e KIACS2 resulta em maior produção de butanol, pGV1209KIACS1 e pGV1209KIACS2 são transformados em K. Iactis (MatA, adhl, trpl, his3, Ieu2 e ura3), juntamente com pGV1208KI e pGV1227KI. A pro- dução de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n- butanol é superior a 10%.

Exemplo 37. (Profética). KIALD6 e KIACS1 ou KIACS2 sobre-expressão em Kluyve- romyces lactis.

Os genes KIALD6, KIACS1 e KIACS2 são clonados como descrito acima, nos e- xemplos 33 e 35. Os plasmideos resultantes pGV1428ALD6 e pGV1429ACS1 ou pGV1430ACS2 e vetores pGV1428 e pGV1429 ou pGV1430 são utilizados para transformar K. Iactis (MATa, trpl, his3, Ieu2, ura3) por métodos conhecidos para produzir superexpressão de KIALD6+ KIACS1+, KIALD6+ e KIACS2+ e KIALD-KIACS-, e transformantes de controle, respectiva- mente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção por proto- trofia His1 TRP1 LEU1 respectivamente.

Os transformantes KIALD6+KIACS1 + e KIALD6+KIACS2 são avaliados para o au- mento da atividade de acetil-CoA sintetase, em comparação com os transformantes que controlam apenas vetores (ALD-ACS-). Para isso, células KIALD6+KIACS1, KIALD6+KIACS2+ e KIALD-KIACS- são cultivadas em meios SC - HIS1 TRP HIS1LEU, res- pectivamente, em formato de frasco para agitação e avaliada conforme descrito no Exemplo 25.

Para avaliar a forma como a superexpressão de KIAId6 e KIAcsI ou KIAcs2 resulta em maior produção de butanol, K Iactis (MATa, trpl, his3, Ieu2 ura3) é transformada com pGV1208KIALD6, pGV1209KIACS1 ou pGV1209KIACS2, pGV1227KI, pGV1213KI e sele- cionadas por prototrofia HIS, LEU, TRP e URA. Os transformantes resultantes de K. Iactis (MATa, trpl, his3, Ieu2 ura3) transformados com pGV1428, pGV1429, pGV1430 e pGV1431 são utilizados como controle isolado. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 5%. Exemplo 38. (Profético). Superexpressão de KIALD6, KlACS1 e KIACS2 em Kluy-

veromyces Iactis desprovida de atividade de KIAdhI (KladhA).

Os genes KIALD6, KIACS1 e KIACS2 são clonados como descrito nos exemplos 33

e 35.

Os plasmidios resultantes de pGV1428ALD6 e pGV1429ACS1 ou pGV1430ACS2 e vetores pGV1428 e pGV1429 ou pGV1430 são utilizados para transformar K Iaetis (MATa, KIadhIA trpl, his3, Ieu2 ura3) por métodos conhecidos para produzir superexpressão de KIALD6+KIACS1+, KIALD6+KIACS2+ e KIALD-KIACS-, e transformantes de controle, res- pectivamente. Ambos os conjuntos de transformantes são escolhidos através de seleção de por HIS, e prototrofia SUA TRP1 LEU, respectivamente. Os transformantes, KIALD6+KIACS1 + e KIALD6+KIACS2+ são avaliados por níveis

celulares de acetil CoA conforme descrito no Exemplo 14.

Para avaliar se a superexpressão de KIAId6 e KIAcsI ou KIAcs2 resulta ou não em maior produção de butanol, K Iaetis (MATa, Kladh1Atrp1, his3, Ieu2 ura3) é transformada com pGV1208KIALD6, pGV1209KIACS1 ou pGV1209KIACS2, pGV1227KI, pGV1213KI. A produção de butanol é realizada conforme descrito no Exemplo 4. O rendimento esperado de n-butanol é superior a 10%.

Claims (64)

1. Levedura metabolicamente projetada capaz de metabolizar a fonte de carbono a fim de produzir n-butanol, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um percurso configurado para produzir uma quantidade elevada de acetil-CoA citosólico relativo à outra quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por levedura do tipo selvagem, e pelo menos um gene anormal para codificar e expressar pelo menos uma enzima para um percurso me- tabólico capaz de utilizar NADH para converter acetil-CoA em n-butanol.

2. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um gene anormal sozinho codifica e expressa pelo menos uma enzima para o percurso metabólico capaz de utilizar NADH para conveter acetil-CoA em n-butanol.

3. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um gene anormal em combinação com pelo menos um gene de levedura nativa codifica e expressa pelo menos uma enzima para o percurso metabólico capaz de utilizar NADH para conveter acetil-CoA em n-butanol.

4. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato descarboxilase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

5. Levedura, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que piruvato descarboxilase é codificada pelo gene PDCIde S. cerevisiae.

6. Levedura, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que piruvato descarboxilase é codificado por pelo menos um dos genes PDC1, PDC5 e PDC6 de S. cerevisiae,.

7. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa um aldeído desidrogenase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

8. Levedura, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o aldeído desidrogenase é codificado pelo gene ALD6 de S. cerevisiae.

9. Levedura, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o aldeído desidrogenase é codificado pelo gene ALD6 de K. /actis.

10. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa acetil-CoA sintetase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

11. Levedura, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes ACS1 de S. cerevisi- ae e S. cerevisiae ACS2.

12. Levedura, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes ACS1 de K. Iactis e ACS2 de Κ. Iactis.

13. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa ambas desigrogenase de aldeído e sintetase de acetil-CoA para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

14. Levedura, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o aldeído desidrogenase é codificado por gene ALD6 de S. cerevisiae e o acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes ACS1 de S. cerevisiae e ACS2 de S.cerevisiae.

15. Levedura, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o aldeído desidrogenase é codificadao por gene ALD6 de K. Iactis e o acetil-CoA sinte- tase é codificado por pelo menos um dos genes ACS1 de K. Iactis e ACS2 de K. lactis.

16. Levedura, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato descarboxilase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico

17. Levedura, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a piruvato descarboxilase é codificada por pelo menos um de PDC1, PDC5 e PDC6, o aldeído desidrogenase é codificado pelo gene ALD6 de S. cerevisiae e acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes ACS1 de S. cerevisiae e ACS2 de S. cerevisiae.

18. Levedura, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a descarboxilase de piruvato é codificada por K. Iactis PDC1, o aldeído desidrogenase é codificada pelo gene K. Iactis ALD6 e a sintetase de acetil-CoA é codificada por pelo um dos genes K. Iactis ACS1 e K. Iactis ACS2.

19. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa desidrogenase de piruvato par eleva a produção de acetil- CoA citosólico.

20. Levedura, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa desidrogenase de piruvato codificada pelos genes E. coli aceE, aceF, IpdA eleva a produção de acetil-CoA citosólico.

21. Levedura, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de 30 que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

22. Levedura, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa desidrogenase de piruvato codificada pelos genes S. cerevi- siae PDA1, PDB1, PDX1, LAT1, LPD1 com sinal de segmentação mitocondrial N-terminal suprimido de forma a elevar a produção de acetl-CoA cistosólico.

23. Levedura, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

24. Levedura, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura de S. cerevisiae é do (1) genótipo pdc2 0 ou (2) genótipo pdcl 0, genótipo pdcõ 0 e genótipo pdc6 0.

25. Levedura, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura K. Iactis é do genótipo pdcl 0.

26. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa ambas piruvato formiato Iiase e formiato desidrogenase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

27. Levedura, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato formiato Iiase codificado pelos genes E. coli pfiA e E. coli pfiB e em combinação com o gene C. boidini FDH1 de forma a elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

28. Levedura, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

29. Levedura, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae do (1) genótipo pdc2 0 ou (2) genótipo pdcl 0, genótipo pdcõ 0 e genótipo pdc6 0.

30. Levedura, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é K. Iactis do genótipo pdcl 0.

31. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um gene anormal foi submetido a evolução molecular para melhorar a ativi- dade enzimática da proteína assim codificada.

32. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um álcool desidrogenase codificado por gene adicional é desativado de forma que que a atividade do álcool desidrogenase é reduzido o suficiente para elevar a produção de acetil-CoA citosólico relativo à produção do tipo selvagem.

33. Levedura, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae e o álcool desidrogenase é codificada por ADH1.

34. Levedura, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é K. Iactis e o álcool desidrogenase é codificado por ADH1.

35. Levedura, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae e o álcool desidrogenase é codificado por ADH1, ADH2, ADH3 e ADH4.

36. Levedura, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é K. Iactis e o álcool desidrogenase é codificado por ADH1, ADH2, ADH3 e ADH4.

37. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é uma espécie de um dos gêneros Saccharomyces, Dekera, Pichia, Hanse- nula, Yarrowia, Aspergillus, Kluyveromyces, Pachysolen, Schizosaccharomyces, Candida, Trichosporon, Yamadezyma, Toluraspora e Cryptococcus.

38. Levedura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o percurso fornece produção e consumo de NADH balanceados quando metabolizando fonte de carbono para produzir n-butanol.

39. Método de produzir n-butanol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen- de: (a) fornecimento de levedura metabolicamente projetada capaz de metabolizar fon- te de carbono a fim de produzir n-butanol, pelo menos um percurso configurado para produ- zir uma quantidade elevada de acetil-CoA citosólico relativo a outra quantidade de acetil- CoA citosólico produzido por levedura do tipo selvagem, e pelo menos um gene anormal para codificar e expressar pelo menos uma enzima para um percurso metabólico capaz de utilizar NADH para converter acetil-CoA em n-butanol. (b) cultura de levedura metabolicamente projetada por determinado período de tempo e sob condições de produzir n-butanol.

40. Método de produzir n-butanol utilizando levedura, que compreende: (a) Projeção metabólica de levedura para elevar produção de acetil-CoA citosólico. (b) Projeção metabólica de levedura para expressar percurso metabólico que con- verta fonte de carbono em n-butanol, CARACTERIZADA pelo fato de que o percurso exige pelo menos uma enzima nativa da levedura, onde as etapas (a) e (b) podem ser executadas em qualquer ordem; e (c) cultura de levedura por determinado período de tempo e sob condições de pro- duzir quantidade recuperável de n-butanol

41. Método de produzir n-butanol utilizando levedura, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) cultura de levedura metabolicamente projetada por determinado de período de tempo e sob condições de produzir biomassa de células de levedura sem ativar a produção de n-butanol; e (b) alteração das condições de cultura por determinado período de tempo e sob condições de produzir quantidade recuperável de n-butanol.

42. Levedura metabolicamente projetada, CARACTERIZADA pelo fato de ser ca- paz de metabolizar fonte de carbono e produzir quantidade elevada de acetil-CoA relativo à quantidade de acetl-CoA citosólico produzido por levedura tipo selvagem.

43. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato descarboxilase, aldeído desidrogenase e acetil-CoA sintetase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

44. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que o piruvato descarboxilase é codificado por pelo menos um gene S. cerevisiae PDC1, PDC5 e PDC6, o aldeído desidrogenase é codificado por S. cerevisiae ALD6 e o acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes S. cerevisiae ACS1 e S. cerevisiae ACS2.

45. Levedura, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADA pelo fato de que o álcool desidrogenase é desativado pela eliminação do gene S. cerevisiae ADH1.

46. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é do gênero Kluyveromyces, a piruvato descarboxilase é codificada pelo ge- ne K. Iactis KIPDC1, o aldeído desidrogenase é codificado pelo gene K. Iactis KIALD6 e a acetil-CoA sintetase é codificado por pelo menos um dos genes K. Iactis KIACS1 e KIACS2.

47. Levedura, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o álcool desidrogenase é desativado pela eliminação do gene K. Iactis ADH1.

48. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato desidrogenase para elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

49. Levedura, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato desidrogenase codificada por gene E. coli aceE, ge- ne E. coli aceF, gene E. coli IpdA de forma a elevar a produção de acetil-CoA cistosólico.

50. Levedura, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

51. Levedura, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae do (1) genótipo pdc2 0 ou (2) genótipo pdcl 0, genótipo pdc5 e genótipo pdc6 0.

52. Levedura, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é K. Iactis do genótipo pdcl 0.

53. Levedura, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato desidrogenase codificada pelos genes S. cerevisiae PDA1, PDB1, PDX1, LAT1, LPD1 com sinal de segmentação mitocondrial N-terminal supri- mido de forma a elevar a produção de acetl-CoA cistosólico.

54. Levedura, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

55. Levedura, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae do (1) genótipo pdc2 0 ou (2) genótipo pdcl 0, genótipo pdc5 0 e genótipo pdc6 0.

56. Levedura, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é K. Iactis do genótipo pdcl 0.

57. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa ambas piruvato formiato Iiase e formiato desidrogenase de forma a elevar a produção de acetil-CoA citosólico.

58. Levedura, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura superexpressa piruvato formiato Iiase codificada pelos genes E. coli pfiA, pfiB e em combinação com o gene C. boidini FDH1 de forma a elevar a produção de acetil- CoA citosólico.

59. Levedura, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade PDC é reduzida ou eliminada.

60. Levedura, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é S. cerevisiae do (1) genótipo pdc2 0 ou (2) genótipo pdcl 0, genótipo pdc5 0 e genótipo pdc6 0.

61. Levedura, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADA pelo fato de que a levedura é K. Iactis do genótipo pdcl 0.

62. Levedura, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um gene foi submetido à evolução molecular para melhorar a atividade en- zimática de uma proteína assim codificada.

63. Método de elevar a atividade metabólica da levedura, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende produzir quantidade elevada de acetil-CoA citosólico da levedura relativa à outra quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por levedura tipo selvagem.

64. Levedura metabolicamente projetada, CARACTERIZADA pelo fato de que ten- do pelo menos um percurso configurado para produzir quantidade elevada de acetil-CoA citosólico relativa à outra quantidade de acetil-CoA citosólico produzido por levedura tipo selvagem