KR20120088753A - 아닐린의 제조를 위한 미생물 - Google Patents

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Abstract

아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 아닐린 경로는 (1) 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 또는 (2) 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다. 아닐린의 제조 방법은 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 상기 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함한다.

Description

아닐린의 제조를 위한 미생물{MICROORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF ANILINE}
본 발명은 일반적으로 유기체의 인실리코(in silico) 설계 및 유기체의 유전자조작, 보다 특히는 아닐린 생합성 능력을 갖는 유기체에 관한 것이다.
아닐린은 화학식 C6H7N을 갖는 화합물이며, 많은 복잡한 화학물질에 전구체이다. 아닐린은 통상적으로 벤젠으로부터 2 단계로 산업적으로 생성된다. 먼저, 벤젠을 50 내지 60 ℃에서 질산 및 황산의 농축 혼합물을 이용하여 니트로화시켜 니트로벤젠을 생성한다. 두 번째 단계에서, 니트로벤전을 전형적으로 600 ℃에서 니켈 촉매의 존재하에 수소화시켜 아닐린을 수득한다. 대안적 방법으로, 아닐린을 미국 특허 제 3,965,182 호에 기술된 바와 같이 페놀 및 암모니아로부터 제조한다. 페놀은 큐멘 공정으로부터 유도된다.
아닐린의 주된 용도는 폴리우레탄의 제조이다. 아닐린은 또한 염료의 생성에서도 가치를 갖는다. 염료에 전구체로서의 용도 이외에, 아닐린은 파라세타몰(아세타미노펜, 타이레놀(Tylenol))과 같은 많은 약물의 제조를 위한 출발-생성물이다. 현재, 아닐린에 대한 최대 시장은 메틸렌 다이페닐 다이이소시아네이트(MDI)의 제조로서, 아닐린의 약 85%가 상기 시장에 제공된다. 다른 용도로는 고무 가공 화학물질(9%), 제초제(2%), 및 염료 및 안료(2%)가 포함된다.
중합시, 아닐린은, 예를 들면, 바이오센서와 같은 나노-규모 장치에서 반도체 전극 가교로서 사용하기 위한 한 유형의 나노와이어로 사용될 수 있다. 상기 폴리아닐린 나노와이어는 특정 반도체 성질을 달성하기 위해 도핑될 수 있다.
또한 덜 에너지- 및 자본-집약적 공정을 이용하면서, 석유계 공급원료를 재생가능한 원료로 대체시키는 대안적 방법에 의해 아닐린의 제조 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 본 발명은 상기 필요를 만족시키며, 또한 관련된 이점을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 태양들은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체에 관한 것이다. 아닐린 경로는 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 태양들은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를, 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법에 관한 것이다. 아닐린 경로는 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 태양들은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체에 관한 것이다. 상기 아닐린 경로는 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 태양들은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를, 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 아닐린 경로는 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다.
도 1은 코리스메이트로의 대사 경로를 나타낸 것이다. E4P는 에리트로스-4-포스페이트이고, PEP는 포스포엔올피루베이트이며, DAHP는 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로손산-7-포스페이트이다.
도 2는 아닐린의 생성을 위한 대사 경로를 나타낸 것이다. E4P는 에리트로스-4-포스페이트이고, PEP는 포스포엔올피루베이트이며, DAHP는 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로손산-7-포스페이트이다.
본 발명은 부분적으로, 아닐린의 생성을 위한 생합성 경로에 관여하는 세포 및 미생물 유기체의 설계 및 생성에 관한 것이다. 다중 경로를 통해, 중심 대사 전구체인 에리트로스-4-포스페이트(E4P) 및 포스포엔올피루베이트(PEP)로부터 아닐린을 생성하기에 유용한 효소가 도 2에 기술되어 있다. 상기 유기체는 재생가능한 공급원료를 이용하여 석유계 아닐린 생성에 대안을 제공할 수 있다. 탄소 공급원으로서 글루코스로부터 아닐린의 최대 이론적 수율은 하기 반응식 1을 기준으로 0.857 몰/글루코스 몰이다.
[반응식 1]
7 C6H12O6 + 6 NH3 → 6 C6H5NH2 + 6 CO2 + 30 H2O
상기 경로를 미생물내에 조작처리하는 것은 일련의 효소를 암호화하는 적절한 조합의 유전자를 본원에 기술된 생산 숙주내에 클로닝하고, 발효 조건을 최적화하고, 발효후 생성물 생산을 분석하는 것을 포함한다. 아닐린의 생산을 위한 생산 숙주를 조작처리하기 위해, 하나 이상의 외인성 DNA 서열(들)이 미생물에서 발현될 수 있다. 또한, 미생물은 기능적으로 파괴되거나 결실되거나 과발현된 외인성 유전자(들)을 가질 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 상기 아닐린 경로는, 도 2에 도시된 바와 같이, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 상기 아닐린 경로는, 도 2에 도시된 바와 같이, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법을 제공한다. 상기 경로는, 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안, 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 아닐린 경로는 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다. 다른 태양에서, 아닐린 경로는 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-천연"은 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물과 관련하여 사용될 때, 상기 미생물 유기체가, 언급된 종의 야생형 균주를 포함하여, 언급된 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변이를 갖는 것을 의미하는 것이다. 유전자 변이는, 예를 들면, 대사성 폴리펩티드를 암호화하는 발현가능한 핵산을 도입하는 변형, 다른 핵산 부가, 핵산 결실 및/또는 미생물 유기체의 유전 물질의 기타 기능적 파괴를 포함한다. 상기 변형은, 예를 들면, 언급된 종에 대해 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 폴리펩티드 둘 다에 대한 암호화 영역 및 그의 작용성 단편을 포함한다. 추가의 변형은, 예를 들면, 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변화시키는 비-암호화 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사성 폴리펩티드로는 아닐린 생합성 경로 내의 효소 또는 단백질이 포함된다.
대사 변형은 그의 천연 상태로부터 변화되는 생화학 반응을 말한다. 그러므로, 비-천연 미생물은 대사성 폴리펩티드 또는 그의 작용성 단편을 암호화하는 핵산에 대한 유전자 변형을 가질 수 있다. 예시적인 대사 변형이 본원에 개시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 미생물 유기체와 관련하여 사용될 때, 언급된 미생물 유기체가 천연에서 발견될 때 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 유기체를 의미하는 것이다. 상기 용어는 그의 천연적 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 상기 용어는 또한 미생물 유기체가 비-천연 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 그러므로, 분리된 미생물 유기체는 천연에서 발견될 때 또는 비-천연 환경에서 성장하거나 보관되거나 존재할 때 다른 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 분리된 미생물 유기체의 특정 예로는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물, 및 비-천연 배지에서 배양된 미생물이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미생물의", "미생물 유기체" 또는 "미생물"은 고세균, 세균 또는 진핵생물의 영역내에 포함되는 현미경적 세포로서 존재하는 임의의 유기체를 의미하는 것이다. 그러므로, 상기 용어는 현미경적 크기를 갖는 원핵 또는 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함하는 것이며, 모든 종의 세균, 고세균 및 진정세균, 및 효모 및 진균류와 같은 진핵 미생물을 포함한다. 상기 용어는 또한 생화학 물질의 생산을 위해 배양될 수 있는 임의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 혐기성"은 배양 또는 성장 조건과 관련하여 사용될 때, 산소량이 액체 배지중 용존 산소에 대해 약 10% 미만의 포화도인 것을 의미하는 것이다. 상기 용어는 또한 약 1% 미만의 산소 대기하에 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀폐 챔버를 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "외인성"은 언급된 분자 또는 언급된 활성이 숙주 미생물 유기체내에 도입되는 것을 의미하는 것이다. 상기 분자는, 예를 들면, 숙주 염색체 내에 통합됨으로써 또는 플라스미드와 같은 비-염색체 유전 물질로서, 숙주 유전 물질내에 암호화 핵산의 도입에 의해 도입될 수 있다. 그러므로, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때, 미생물 유기체내에 발현가능한 형태의 암호화 핵산의 도입을 말한다. 생합성 활성과 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 숙주 표준 유기체내에 도입되는 활성을 말한다. 공급원은, 예를 들면, 숙주 미생물 유기체내에 도입후 언급된 활성을 발현하는 동종 또는 이종 암호화 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "외인성"은 숙주에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 말한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 용어는 미생물 유기체내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 말한다. 용어 "이종"은 언급된 종이 아닌 다른 공급원으로부터 유래된 분자 또는 활성을 말하는 반면, "동종"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 말한다. 따라서, 본 발명의 암호화 핵산의 외인성 발현은 이종 또는 동종 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 사용할 수 있다.
하나보다 많은 외인성 핵산이 미생물 유기체에 포함되는 경우 하나보다 많은 외인성 핵산은 상기에서 논의한 바와 같이, 언급된 암호화 핵산 또는 생합성 활성을 말하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 개시된 바와 같이, 상기 하나보다 많은 외인성 핵산은 숙주 미생물 유기체내에 별도의 핵산 분자 상에, 다시스트론성(polycistron) 핵산 분자 상에, 또는 이들의 조합으로 도입될 수 있으며, 여전히 하나보다 많은 외인성 핵산으로 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이, 미생물 유기체는 목적하는 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 2개 이상의 외인성 핵산을 발현시키도록 조작처리될 수 있다. 목적 활성을 암호화하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물 유기체내에 도입되는 경우, 상기 2개의 외인성 핵산은 단일 핵산으로, 예를 들면, 단일 플라스미드 상에, 별도의 플라스미드 상에 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체내에 통합될 수 있으며, 여전히 2개의 외인성 핵산으로 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 2개보다 많은 외인성 핵산이 임의의 바람직한 조합으로, 예를 들면, 단일 플라스미드 상에, 별도의 플라스미드 상에서 숙주 유기체내에 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체내에 도입될 수 있으며, 여전히 2개 이상의 외인성 핵산으로, 예를 들면, 3개의 외인성 핵산으로 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 언급된 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 암호화 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 말하며, 숙주 유기체내에 도입된 별개 핵산의 수를 말하는 것이 아니다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 변이의 소실 없이 5 세대 이상동안 배양될 수 있는 미생물을 말하는 안정한 유전자 변이를 함유할 수 있다. 일반적으로, 안정한 유전자 변이는 10 세대 이상 지속되는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25 세대 이상 지속되며, 보다 특히, 안정한 유전자 변형은 무기한을 포함하여 50 세대 이상 이어진다.
당해 분야에 숙련된 자라면 본원에 예시된 대사 변형을 포함하여 유전자 변이가 대장균(E. coli)과 같은 적합한 숙주 유기체 및 그의 상응하는 대사 반응 또는 목적하는 대사 경로를 위한 유전자와 같은 목적 유전 물질에 적합한 공급원 유기체와 관련하여 기술됨을 이해할 것이다. 그러나, 매우 다양한 유기체의 완전한 게놈 서열분석 및 유전체학 분야에서의 높은 기술 수준을 고려할 때, 당해 분야에 숙련된 자라면 본원에 제공된 교지내용 및 지침을 필수적으로 모든 다른 유기체에 용이하게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본원에 예시된 대장균 대사 변이는, 언급된 종과 다른 종으로부터의 동일하거나 유사한 암호화 핵산을 혼입함으로써 다른 종에 용이하게 적용될 수 있다. 상기 유전자 변이는, 예를 들면, 일반적으로, 종 동족체의 유전자 변이, 및 특히, 이종상동체(ortholog), 상동체(paralog) 또는 비-이종상동성 유전자 변위를 포함한다.
이종상동체는 수직적 혈통에 의해 연관되고, 상이한 유기체에서 실질적으로 동일하거나 일치하는 기능을 담당하는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들면, 마우스 에폭시드 하이드롤라제 및 인간 에폭시드 하이드롤라제는 에폭시드의 가수분해의 생물학적 기능에 대해 이종상동체로 간주될 수 있다. 유전자는, 예를 들면, 이들이 상동성임을 나타내기에 충분한 수준의 서열 유사성을 공유하는 경우 수직적 혈통에 의해 연관되거나, 또는 공통 선조로부터의 진화에 의해 연관된다. 유전자는 또한, 이들이 1차 서열 유사성이 식별될 수 없을 정도로 공통 선조로부터 진화된 것을 나타내기에 충분한 수준의 3차원 구조를 공유하지만 반드시 서열 유사성을 갖는 것은 아닌 경우, 이종상동체로 간주될 수 있다. 이종상동성인 유전자는 약 25 내지 100% 아미노산 서열 동일성의 서열 유사성을 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 암호화하는 유전자도 또한, 그의 3차원 구조가 또한 유사성을 나타내는 경우 수직적 혈통에 의해 발생된 것으로 간주될 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성인자 및 엘라스타제를 포함하여 세린 프로테아제 부류 효소의 구성원은 공통 선조로부터의 수직적 혈통에 의해 발생된 것으로 간주된다.
이종상동체는, 예를 들면, 진화를 통해 구조 또는 전체 활성에서 나뉘어진 유전자 또는 그의 암호화된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들면, 하나의 종이 2개의 기능을 나타내는 유전자 산물을 암호화하는 경우 및 상기 기능이 제 2의 종에서 별개의 유전자로 분리된 경우, 상기 3개의 유전자 및 그의 상응하는 산물들은 이종상동체인 것으로 간주된다. 생화학 생성물의 제조에 있어, 당해 분야에 숙련된 자는 도입되거나 파괴될 대사 활성을 갖는 이종상동성 유전자가 비-천연 미생물의 제조를 위해 선택되어야 함을 이해할 것이다. 분리가능한 활성을 나타내는 이종상동체의 예는 별개의 활성이 2개 이상의 종 사이에서 또는 단일 종안에서 별개의 유전자 산물로 분리된 경우이다. 특정 예는 세린 프로테아제 활성의 두 유형인 엘라스타제 단백질분해 및 플라스미노겐 단백질분해의 플라스미노겐 활성인자와 엘라스타제로서 별개 분자로의 분리이다. 두 번째 예는 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 초파리(Drosophila) DNA 폴리머라제 III 활성의 분리이다. 첫번째 종으로부터의 DNA 폴리머라제는 두번째 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 둘 다에 이종상동체인 것으로 간주될 수 있으며 그 반대도 가능하다.
대조적으로, 상동체는, 예를 들면, 복제후 진화적 분기에 의해 연관된 동족체이며, 유사하거나 공통되지만 동일하지는 않은 기능을 갖는다. 상동체는, 예를 들면, 동일 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래할 수 있다. 예를 들면, 마이크로솜 에폭시드 하이드롤라제(에폭시드 하이드롤라제 I) 및 가용성 에폭시드 하이드롤라제(에폭시드 하이드롤라제 II)는 상동체인 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는 이들이 별개의 반응을 촉진하고 동일 종에서 별개의 기능을 갖는, 공통 선조로부터 공-진화된 2개의 별개의 효소를 나타내기 때문이다. 상동체는 서로 상당한 서열 유사성을 갖는 동일 종으로부터의 단백질로서, 이들이 상동성이거나 공통 선조로부터의 공-진화를 통해 연관됨을 시사한다. 유사 단백질 부류의 군은 HipA 동족체, 루시퍼라제 유전자, 펩티다제 등을 포함한다.
비-이종상동성 유전자 변위는 상이한 종에서의 언급된 유전자 기능을 대체할 수 있는 한 종으로부터의 비-이종상동성 유전자이다. 대체는, 예를 들면, 상이한 종에서의 언급된 기능에 비해 원래의 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로 비-이종상동성 유전자 변위는 언급된 기능을 암호화하는 알고있는 유전자에 구조적으로 관련되는 것으로 식별가능할 것이지만, 그럼에도 불구하고 구조적으로 덜 관련되지만 기능적으로 유사한 유전자 및 그의 상응하는 유전자 산물은 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 상기 용어의 의미내에 포함된다. 기능적 유사성은, 예를 들면, 대체되고자 하는 기능을 암호화하는 유전자에 비해 비-이종상동성 유전자 산물의 활성 부위 또는 결합 영역에서 적어도 일부의 구조적 유사성을 필요로 한다. 그러므로, 비-이종상동성 유전자는, 예를 들면, 상동체 또는 비관련 유전자를 포함한다.
그러므로, 아닐린 생합성 능력을 갖는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 동정하고 제조하는데 있어서, 당해 분야에 숙련된 자라면 본원에 제공된 교지내용 및 지침을 특정 종에 적용하여 대사 변형의 확인이 이종상동체의 확인 및 혼입 또는 불활성화를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 상동체 및/또는 비-이종상동성 유전자 변위가 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉진하는 효소를 암호화하는 언급된 미생물에 존재하는 정도로, 당해 분야에 숙련된 자라면 또한 상기 진화적으로 연관된 유전자들을 이용할 수 있다.
이종상동체, 상동체 및 비-이종상동성 유전자 변위는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 두 폴리펩티드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 조사는 비교 서열간의 서열 동일성 및 유사성을 나타낼 것이다. 상기 유사성을 기초로, 당해 분야에 숙련된 자라면 단백질이 공통 선조로부터 진화를 통해 연관되는 것을 나타낼 만큼 유사성이 충분히 높은지 여부를 결정할 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 알고리즘, 예를 들면, Align, BLAST, Clustal W 및 기타 알고리즘은 그대로의 서열 유사성 또는 동일성을 비교 및 결정하며, 또한 중량 또는 스코어에 할당될 수 있는 서열에 틈(gap)의 존재 또는 의미를 결정한다. 상기 알고리즘은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 뉴클레오티드 서열 유사성 또는 동일성을 측정하는데에도 유사하게 적용될 수 있다. 연관성을 결정하기에 충분한 유사성을 위한 매개변수는 통계적 유사성, 또는 랜덤 폴리펩티드 중 유사한 매치(match)를 발견할 기회 및 측정된 매치의 유의성을 산출하기 위한 공지된 방법을 기준으로 산정된다. 2개 이상의 서열의 컴퓨터 비교는, 바람직한 경우, 또한 당해 분야에 숙련된 자에 의해 가시적으로 최적화될 수 있다. 연관된 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들면, 25 내지 100% 서열 동일성을 가질 것으로 예상할 수 있다. 연관되지 않는 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스가 검색되는 경우(약 5%), 우연히 일어날 것으로 예상되는 바와 필수적으로 같은 동일성을 가질 수 있다. 5 내지 24%의 서열 동일성은 비교된 서열이 연관된다고 결론내리기에 충분한 상동성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 데이터 세트의 크기를 고려하여 상기 매치의 유의성을 결정하기 위한 또 다른 통계적 분석을 수행하여 상기 서열들의 연관성을 측정할 수 있다.
예를 들면, BLAST 알고리즘을 사용하여 2개 이상의 서열의 연관성을 측정하기 위한 예시적인 매개변수는 하기에 나타낸 바와 같을 수 있다. 간략하게, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행될 수 있다: 행렬: 0 BLOSUM62; 갭(gap) 개방: 11; 갭 연장:1; x_드롭오프(dropoff): 50; 예상값(expect): 10.0; 워드사이즈: 3; 필터: 온. 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수를 사용하여 수행할 수 있다.: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 개방: 5; 갭 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상값: 10.0; 워드사이즈: 11; 필터: 오프. 당해 분야에 숙련된 자라면, 예를 들면, 비교의 엄격성을 증가 또는 감소시키기 위해 상기 매개변수에 변형이 수행될 수 있으며 2개 이상의 서열의 연관성을 결정할 수 있음을 인지할 것이다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 아닐린 경로는 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 DAHP 신타제를 추가로 포함할 수 있으며, 또 다른 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 또한 3-데하이드로퀴네이트 신타제를 포함할 수 있다.
일부 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 한편, 다른 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함한다. 예를 들면, 일부 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다.
일부 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 4개의 외인성 핵산을 갖는 비-천연 미생물 유기체는 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화할 수 있다. 비-천연 미생물 유기체에 외인성일 수 있는 DAHP 신타제는, 예를 들면, 유전자의 추가 복사체의 삽입에 의해서 및/또는 외인성 조절 유전자의 사용 및 방향족 아미노산에 의한 피드백 조절 제거를 통해 과발현될 수 있다.
또 다른 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 5개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 5개의 외인성 핵산을 갖는 비-천연 미생물 유기체는 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화할 수 있다. 비-천연 미생물 유기체에 외인성일 수 있는 3-데하이드로퀴네이트 신타제는 또한, 예를 들면, 유전자의 추가 복사체의 삽입에 의해서 및/또는 외인성 조절 유전자의 사용을 통해 과발현될 수 있다.
또한, 일부 태양에서 외인성일 수 있는, 코리스메이트를 생성하는 경로에 존재하는 다른 효소들 중 임의의 하나 이상이 코리스메이트의 생성을 증가시키기 위해 과발현될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제(EC 4.2.1.10), 시키메이트 데하이드로게나제(1.1.1.25), 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제(1.1.1.282), 시키메이트 키나제(2.7.1.71), 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제(2.5.1.19) 및 코리스메이트 신타제(4.2.3.5)를 포함한다. 이들 효소는 원핵생물 및 대부분의 진핵생물에서 DAHP로부터 코리스메이트를 제조하기 위한 경로를 구성한다. 3-데하이드로퀴네이트의 생성을 위한 대안적 경로(3-데하이드로퀴네이트로부터 코리스메이트까지의 단계는 고세균을 포함하여 모든 유기체에서 동일하다)는 하기의 효소 단계를 포함한다: 트리오스포스페이트 이소머라제, 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제, 2-아미노-3,7-다이데옥시-D-트레오-헵트-6-울로소네이트 신타제 및 데하이드로퀴네이트 신타제.
일부 태양에서, 전술한 비-천연 미생물 유기체는 이종 핵산인 하나 이상의 외인성 핵산을 가질 수 있다. 또한, 전술한 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지중에 제공될 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명은 또한 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 아닐린 경로는 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다. 상기 비-천연 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 DAHP 신타제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 또한 3-데하이드로퀴네이트 신타제를 포함할 수 있다.
일부 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함한다. 예를 들면, 상기 2개의 외인성 핵산은 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 3개의 외인성 핵산은 DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 4개의 외인성 핵산은 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 태양에서 외인성일 수 있는, 코리스메이트를 생성하는 경로에 존재하는 다른 효소들 중 임의의 하나 이상이 코리스메이트의 생성을 증가시키기 위해 과발현될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제, 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제를 포함한다.
일부 태양에서, 전술한 상기 비-천연 미생물 유기체는 이종 핵산인 하나 이상의 외인성 핵산을 가질 수 있다. 일부 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지중에 제공될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 비-천연 미생물 유기체는, 코리스메이트를 4-아미노-4-데옥시코리스메이트로, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트를 p-아미노벤조에이트로, 및 p-아미노벤조에이트를 아닐린으로 전환시키는 것으로 이루어진 군에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 비-천연 미생물 유기체는, 코리스메이트를 안트라닐레이트로 및 안트라닐레이트를 아닐린으로 전환시키는 것으로 이루어진 군에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 이들이 단지 예시적인 것이며, 목적 생성물을 생성하기에 적합하고 그에 적절한 활성이 기질의 생성물로의 전환에 이용가능한 본원에 개시된 임의의 기질-생성물 쌍은 본원의 교지내용을 근거로 당해 분야에 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 도 1에 도시된 바와 같은 아닐린 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
본원에서 아닐린 경로를 함유하는 미생물 유기체로서 일반적으로 기술되었지만, 본 발명은 또한 아닐린 경로의 중간체를 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이, 아닐린 경로는 도 1에 예시되어 있다. 그러므로, 아닐린을 생성하는 아닐린 경로를 함유하는 미생물 유기체 이외에, 본 발명은 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 아닐린 경로 중간체, 예를 들면, DAHP, 코리스메이트, 안트라닐레이트, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트 또는 p-아미노벤조에이트를 생성한다.
실시예에 기술되고 도면에 예시된 바와 같이, 도 1의 경로를 포함하여, 본원에 개시된 경로 중 임의의 경로는 기술된 바와 같은 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 생성하는 비-천연 미생물 유기체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 개시된 바와 같이, 중간체를 생성하는 상기 미생물 유기체는 목적 생성물을 생성하는 하위 경로 효소를 발현하는 또 다른 미생물 유기체와 함께 사용될 수 있다. 그러나, 아닐린 경로 중간체를 생성하는 비-천연 미생물 유기체는 목적 생성물로서 중간체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 본원에서 일반적으로 대사 반응, 반응물 또는 그의 생성물과 관련하여, 또는 특별히, 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉진하는 효소, 또는 이들과 관련된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자와 관련하여 기술된다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 당해 분야에 숙련된 자는 반응에 대한 언급이 또한 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급으로 여겨짐을 이해할 것이다. 유사하게, 본원에 달리 언급되지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 대한 언급은 또한 반응을 나타내며, 임의의 상기 대사 구성요소에 대한 언급은 또한 언급된 반응, 반응물 또는 생성물을 촉진하는 효소 또는 이들에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 나타낸다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 유전체학의 공지된 분야를 고려할 때, 유전자 또는 암호화 핵산에 대한 본원의 언급은 또한 상응하는 암호화된 효소 및 상기 효소가 촉진하는 반응, 또는 상기 반응과 관련된 단백질 및 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급으로 여겨진다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 아닐린 경로의 제 1 단계는 1 분자의 E4P와 1 분자의 PEP를 결합시켜 중간체 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로손산 7-포스포네이트(DAHP)를 생성하는 알돌-형 축합이다. 상기 효소는 DAHP 신타제, 또는 동등하게 2-데하이드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌라제로 지칭된다. 상기 반응(EC #2.5.1.54)은 시키메이트 경로에서 첫번째 개입 단계이며, 세균, 진균류 및 식물에서 방향족 아미노산, 폴레이트, 퀴논 및 기타 2차 대사물의 생합성에 필요하다. DAHP 신타제는 AroAI 및 AroAII 부류로 분류되었다[Wu et al., J. Biol. Chem. 281:4042-4048 (2006)]. 전자의 부류는 주로 미생물 단백질로 이루어지는 반면, 후자는 주로 식물 단백질로 이루어진다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 상기 기능은 3개의 유전자: aroFGH에 의해 촉진된다. 이들 각각은 이소자임을 암호화하며, 상이한 방향족 아미노산에 의해 피드백 조절된다. 대조적으로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 같은 일부 다른 유기체는 이작용성 효소이다. aroA 유전자는 DAHP 신타제 활성을 암호화하며 aroQ 유전자는 바실러스 서브틸리스에서 코리스메이트 뮤타제 활성을 암호화한다. 그러나, 이들 활성은 부위 절단(domain truncation)에 의해 분리될 수 있다[Wu et al., J. Biol. Chem. 281:4042-4048 (2006)]. 바실러스 서브틸리스 효소는 하위 중간체인 코리스메이트 및 프레파네이트에 민감하다. 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터의 DAHP 신타제는 페닐알라닌 및 티로신 둘 다에 민감한 피드백이다[Wu et al., J. Biol. Chem. 278:27525-27531 (2003)].
상기 효소들은 금속효소이며, 그의 조절 메카니즘은 당해 분야에 숙련된 자에게 숙지되어 있다. 대장균 및 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) DAHP 신타제의 결정 구조는 해석되었으며, (β/α)8 장벽으로 이루어진 구조를 나타낸다. 그러나, 조절 영역을 갖지 않으며 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus) 및 노스톡 속(Nostoc sp .)과 같은 유기체에 속하는 여러 미생물이 있다. 예시적인 유전자는 하기 표 1에 요약되어 있다.
유전자 GI 번호 유전자 은행 ID 유기체
aroF 16130522 NP_417092.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
aroG 16128722 NP_415275.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
aroH 16129660 NP_416219.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
aroA 16080027 NP_390853.1 바실러스 서브틸리스
aroA 34396967 AAQ66031.1 포르피로모나스 진지발리스 W83
Aro4 6319726 NP_009808.1 사카로마이세스 세레비지에
aroG 1168513 P44303.1 헤모필러스 인플루엔자( Haemophilus influenza )
aroF 16765985 NP_461600.1 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella typhimurium )
aroG 21903376 P35170.2 코리네박테리움 글루타미쿰
PF1690 18893851 AAL81814.1 피로코커스 푸리오서스
alr3050 17132144 BAB74749 노스톡 속
코리스메이트는 그람-양성균, 그람-음성균 및 고세균에서 방향족 아미노산 생합성을 위한 공지된 중간체이다. 상기 코리스메이트는 또한 일부 미생물에서 폴산, 유비퀴논, 메나퀴논 및 엔테로콜레인의 생성을 위한 전구체이다. DAHP는 3-데하이드로퀴네이트로 전환될 수 있으며, 이어서 공지된 다단계를 통해 코리스메이트로 전환될 수 있다. 대장균에서, DAHP는 3-데하이드로퀴네이트 신타제에 의해 3-데하이드로퀴네이트로 전환될 수 있다. 대장균에서 상기 신타제는 산화, β-제거반응, 분자내 알돌 축합 및 환원반응을 촉진하는 것으로 이해된다[Frost et al., Biochemistry 23:4470-4475 (1984); Maitra et al., J. Biol. Chem. 253:5426-5430 (1978)]. 상기 효소는 촉매량의 NAD+ 및 Co2 +를 필요로 한다[Maitra et al., J. Biol. Chem. 253:5426-5430 (1978)]. 코리스메이트의 생성에 유용한 효소로는, 예를 들면, 전술한 바와 같은 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제, 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제가 포함된다.
코리스메이트의 4-아미노-4-데옥시코리스메이트로의 전환은 코리스메이트 L-글루타민 아미노트랜스퍼라제로도 지칭되는 아미노데옥시코리스메이트 신타제(EC# 2.6.1.85)에 의해 달성될 수 있다. 대장균에서, 상기 기능은 두개의 유전자 pabA 및 pabB에 의해 촉진된다. pabA 폴리펩티드는 활성을 위해 pabB와 1:1 복합체를 필요로 하는 조건적 글루타미나제이다. pabB 효소는 상기 반응에 의해 방출된 발생기 암모니아를 사용하여 코리스메이트를 4-아미노-4-데옥시코리스메이트로 전환시킨다(Mg2 +의 존재하에). pabB 반응은 완전히 가역적이다. pabA의 부재하에, pabB는 상당히 감소된 속도로 NH3를 이용한다[Roux and Walsh, Biochemistry 32:3763-3768 (1993); Roux and Walsh, Biochemistry 31:6904-6910 (1992)].
pabA 및 pabB에 의해 형성된 유사한 효소 복합체는 스트렙토마이세스 베네주엘라( Streptomyces venezuelae)에서 코리스메이트의 4-아미노-4-데옥시코리스메이트로의 전환을 촉진한다[Brown et al., Microbiology 142(pt 6);1345-1355 (1996)]. 상기 유기체는 한 세트 이상의 pabAB 유전자를 갖는 것으로 알려져 있다[Chang et al., Microbiology 147:2113-2126 (2001)]. 전술한 기능을 갖는 유전자는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 및 솔라넘 라이코페르시쿰(Solanum lycopersicum)에서도 또한 확인되었다. 대장균의 PabA 및 PabB 유전자의 단백질 서열을 이용하여 아라비돕시스 탈리아나에서 아미노데옥시코리스메이트 신타제(ADCS)를 암호화하는 cDNA를 분리하였다[Basset et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1496-1501 (2004)]. 상기 효소는 대장균에서 재조합적으로 발현되어 4-아미노-4-데옥시코리스메이트의 생성을 나타내었다. p-아미노벤조에이트 또는 폴레이트 어느 것에 대해서도 상기 효소의 피드백 억제는 보고된 바가 없다. 유전자 은행 ID와 함께 상응하는 유전자들이 하기 표 2에 열거되어 있다.
pabAB 710438 AAB30312.1 스트렙토마이세스 베네주엘라
pabA 16131239 NP_417819.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
pabB 16129766 NP_416326.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
pabA 152972254 YP_001337400.1 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)
pabB 152970875 YP_001335984.1 클렙시엘라 뉴모니에
pabA 118467576 YP_884448.1 마이코박테리움 스메그마티스
(Mycobacterium smegmatis)
pabB 118473035 YP_889684.1 마이코박테리움 스메그마티스
여러 유기체에서, 아미노데옥시코리스메이트 리아제(EC# 4.1.3.38)를 암호화하는 유전자는 전형적으로 pabB 및 pabA와 커플링되어 피루베이트 분자의 방출과 함께 아미노데옥시코리스메이트의 p-아미노벤조에이트로의 전환을 촉진한다. 대장균[Green et al., J. Bacteriol. 174:5317-5323 (1992); Green and Nichols, J. Biol. Chem. 266:12971-12975 (1991)] 및 스트렙토마이세스 베네주엘라 둘 다에서, pabC가 상기 반응을 촉진한다. 최근에, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트 리아제는 2개 이상의 스트렙토마이세스 종, 즉 FR-008 및 그리세우스(griseus)에서 기능적으로 특성화되었다[Zhang et a., Microbiology 155:2450-2459 (2009)]. 아미노데옥시코리스메이트 신타제 및 아미노데옥시코리스메이트 리아제는 전형적으로 대부분의 유기체에서 폴레이트 생합성의 일부이며 코리스메이트의 파라-아미노벤조에이트로의 전환을 촉진한다. 아미노데옥시코리스메이트 리아제는 피리독살-포스페이트 의존성 단백질이다. 추정상의 효소는 아비돕시스 탈리아나[Basset et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1496-1501 (2004)] 및 바실러스 서브틸리스[Schadt et al., J. Am. Chem. Soc. 131:3481-3493 (2009)]에서 폴레이트 오페론의 일부로서 확인되었다. 일부 예시적인 유전자를 하기 표 3에 나타내었다.
pabC 16129059 NP_415614.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
pabC 16077144 NP_387957.1 바실러스 서브틸리스
pabC 29828105 NP_822739.1 스트렙토마이세스 아버미틸리스
( Streptomyces avermitilis)
pabC -1 224831591 AAQ82550.2 스트렙토마이세스 속 FR -008
pabC -2 219879202 ACL50980.1 스트렙토마이세스 속 FR -008
체계명 코리스메이트 피루베이트-리아제(아미노-수용; 안트라닐레이트-생성) 또는 동의어 글루타민 아미노트랜스퍼라제로도 알려진 안트라닐레이트 신타제(EC: 4.1.3.27)는 코리스메이트로부터의 트립토판 합성 경로에서 첫번째 단계이다. 안트라닐레이트의 생성은 글루타민으로부터 아민 기의 전이 및 글루타메이트의 생성 유도에 의해 달성된다. 피루베이트는 또한 반응시에도 방출된다. 대장균에서, 상기 반응은 TrpD의 두 단량체 및 TrpE의 두 단량체로 이루어진 4량체성 효소 복합체에 의해 촉진된다. TrpE는 단독으로, 아미노 공여체로서 글루타메이트보다 황산암모늄을 사용하여 상기 반응의 대안적 반응을 수행할 수 있다[Ito et al., Acta. Pathol. Jpn. 19:55-67 (1969)]. 그러나, TrpD는 TrpE 단독에 비해 글루타민에 대한 TrpE의 친화도를 증가시킨다. 상기 효소는 트립토판에 의해 피드백 조절된다. 상기 피드백 조절은 또한 초고온성(hyperthermophilic) 설폴로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 효소 복합체에 대해 관찰되었다. 상기 유기체로부터의 상기 효소 복합체는 대장균에서 발현되었다[Tutino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:306-310 (1997)]. 안트라닐레이트 신타제에 의해 촉진된 반응의 열역학은 살모넬라 타이피뮤리움에서 설명되었다[Byrnes et al., Biophys. Chme. 84:45-64 (2000)]. 효소 복합체의 서브유닛(subunit)도 또한 터모토가 마리티마(Thermotoga maritima)에서 설명되었다[Kim et al., J. Mol. Biol. 231:960-981 (1993)]. 상기 유전자들의 요약을 하기 표 4에 나타내었다.
TrpD 16129224 NP_415779.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
TrpE 16129225 NP_415780.1 에스케리키아 콜라이 K12 MG1655
TrpE 15897780 NP_342385.1 설폴로버스 솔파타리쿠스
TrpGD 15897781 NP_342386.1 설폴로버스 솔파타리쿠스
trpD 16765068 NP_460683.1 살모넬리 타이피뮤리움
trpE 16765067 NP_460682.1 살모넬리 타이피뮤리움
trpE 15642916 NP_227957.1 터모토가 마리티마
trpGD 15649215 NP_227956.1 터모토가 마리티마
p-아미노벤조에이트 및 안트라닐레이트의 탈카복실화는 아미노벤조에이트 카복실리아제에 의해 촉진될 수 있다[McCullough et al., J. Am. Chme. Soc. 79:628-630 (1957)]. 대장균 0111:B4로부터 수득된 무세포 효소가 상기 분자 둘 다를 탈카복실화시킬 수 있는 것으로 나타났다. 상기 효소의 활성은 피리독살 포스페이트 및 철(III)에 의존성인 것으로 밝혀졌다. 마이코박테리움의 일부 추출물에서 p-아미노벤조에이트의 아닐린으로의 전환이 기술되었다[Sloane et al., J. Biol. Chem. 193:453-458 (1951)]. 아닐린을 혐기적으로 분해시킬 수 있는 새로운 균주가 확인되었다[Kahng et al., FEMS Microbiol. Lett. 190:215-221 (2000); Schnell et al., Arch. Microbiol. 152:556-563 (1989)]. 이들 균주는 먼저 아닐린을 4-아미노벤조에이트로 카복실화시킨다. 균주 데설포박테리움 아닐리니(Desulfobacterium anilini)에서, 아닐린 분해 속도는 배지중 CO2의 존재에 의존한다. 혐기성 탈질소 조건하에 균주 HY99의 아닐린 배양물 상등액의 GC 분석 결과 4-아미노벤조에이트의 존재를 나타내었다[Kahng et al., FEMS Microbiol. Lett. 190:215-221 (2000)].
방향족 화합물, 주로 하이드록실 방향족 화합물의 탈카복실화에 관해 많은 다른 연구들이 수행되었다. 예를 들면, 4-하이드록시벤조에이트 데카복실라제가 통성혐기성 세균인 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae)로부터 확인되었다[Matsui et al., Arch. Microbiol. 186:21-29 (2006)]. 상응하는 유전자를 서열분석하였다. 상기 효소는 여러 기질에 대한 활성에 대해 시험하였으며 4-하이드록시벤조산 및 4-아미노벤조산 둘 다에 의해 유도되는 것으로 나타났다. p-하이드록시 벤조에이트로부터 CO2를 제거할 수 있는 또 다른 데카복실라제가 클로스트리듐 테로마세티쿰(Clostridium theromaceticum)에서 보고되었다[Hsu et al., J. Bacteriol. 172:5901-5907 (1990)]. 상기 효소는 광범위한 기질 특이성을 가지며, 메타-위치에 다양한 작용기 치환체를 갖는 p-하이드록시 벤조에이트에 작용할 수 있다. 이들로는 하이드록실, 클로로, 플루오로 및 메톡시기가 포함된다. 상기 효소는 글루코스 또는 다른 외부 에너지 공급원에 의해 억제되지 않았다. 클렙시엘라 에어로겐스(Klebsiella aerogens)도 또한 파라-하이드록시 벤조에이트, 2,5-다이하이드록시벤조에이트, 3,4-다이하이드록시벤조에이트 및 3,4,5-트라이하이드록시벤조에이트의 비-산화성 탈카복실화를 수행할 수 있는 것으로 보고되었다[Grant et al., Antonie Van Leeuwenhoek 35:325-343 (1969)]. 가역적 4-하이드록시벤조에이트 데카복실라제는 클로스트리듐 하이드록시벤조이쿰(Clostridium hydroxybenzoicum)(현재 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스(Sedimentibacter hydroxybenzoicus)로 불림)으로부터 정제되었다. 상기 효소는 3개의 클러스터(clustered) 유전자, shdB , C 및 D에 의해 암호화된다. 상기 효소는 4-하이드록시벤조에이트 및 3,4-다이하이드록시벤조에이트 둘 다에 작용할 수 있다. 효소 활성은 금속 이온 또는 다른 보조인자에 의해 영향받지 않았다[He et al., Eur J. Biochem. 229:77-82 (1995)]. 바실러스 서브틸리스는 최근에 하이드록시아릴산 데카복실라제 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 세 유전자 shdB , C 및 D는 대장균에 클로닝되었으며, 4-하이드록시벤조에이트 및 바닐레이트에 대해 활성을 나타내었다[Lupa et al., Can. J. Microbiol. 54:75-81 (2008)]. 이들 데카복실라제는 여러 다른 유기체에서 보고되었으며[Lupa et al., Genomics 86:342-351 (2005)], 이들 중 일부에 대한 유전자 후보가 하기 표 5에 열거되어 있다.
shdB 67462197 AAY67850.1 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스
shdC 5739200 AAD50377.1 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스
shdD 67462198 AAY67851.1 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스
110331749 BAE97712.1 엔테로박터 클로아케
bsdB 13124411 P94404.1 바실러스 서브틸리스
bsdC 6686207 P94405.1 바실러스 서브틸리스
bsdD 239977069 C0H3U9.1 바실러스 서브틸리스
STM292 16766227 NP_461842.1 살모넬라 타이피뮤리움 LT2
STM2922 16766228 NP_461843.1 살모넬라 타이피뮤리움 LT2
STM2923 16766229 NP_461844.1 살모넬라 타이피뮤리움 LT2
kpdB 206580833 YP_002236894.1 클렙시엘라 뉴모니에 342
kpdC 206576360 YP_002236895.1 클렙시엘라 뉴모니에 342
kpdD 206579343 YP_002236896.1 클렙시엘라 뉴모니에 342
pad1 15832847 NP_311620.1 에스케리키아 콜라이 O157
yclC 15832846 NP_311619.1 에스케리키아 콜라이 O157
yclD 15832845 NP_311618.1 에스케리키아 콜라이 O157
본 발명의 다양한 태양의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형도 또한 본원의 정의 내에 포함되는 것으로 이해된다. 따라서, 하기의 예들은 본 발명을 예시하는 것이며 제한하는 것이 아니다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 아닐린 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 암호화하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써 제조될 수 있다. 생합성을 위해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 아닐린 생합성 경로의 일부 또는 전부에 대한 핵산이 발현될 수 있다. 예를 들면, 선택된 숙주가 목적하는 생합성 경로를 위한 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결여된 경우, 결여 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 발현가능한 핵산을 후속 외인성 발현을 위해 숙주내에 도입한다. 또는, 선택된 숙주가 일부 경로 유전자의 외인성 발현을 나타내지만, 다른 유전자는 결여된 경우, 아닐린 생합성을 달성하기 위해 결여 효소(들) 또는 단백질(들)을 위해 암호화 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 생합성 경로를 얻기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 제조될 수 있거나, 또는 목적하는 생합성 경로는, 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 함께, 아닐린과 같은 목적 생성물을 생성하는 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 수득될 수 있다.
숙주 미생물 유기체는, 예를 들면, 세균, 효모, 진균류 또는 발효 공정에 적용가능한 임의의 다양한 다른 미생물로부터 선택될 수 있으며, 이들 중에서 비-천연 미생물 유기체가 생성될 수 있다. 예시적인 세균으로는 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 언에어로바이오스피릴럼 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum), 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜로(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택된 종이 포함된다. 예시적인 효모 또는 진균류로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르지아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 오리재(Rhizopus orizae) 등으로부터 선택된 종들이 포함된다. 대장균은 유전 공학에 적합한 잘 특성화된 미생물 유기체이므로 특히 유용한 숙주 미생물이다. 다른 특히 유용한 숙주 유기체로는 사카로마이세스 세레비지에와 같은 효모가 포함된다. 목적 생성물을 생성하기 위한 대사 및/또는 유전자 변형을 도입하기 위해 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체를 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 아닐린 생합성 경로 구성요소에 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 외인적으로 발현되는 아닐린 경로-암호화 핵산, 및 하나 이상의 아닐린 생합성 경로에 대한 모든 암호화 핵산을 포함한다. 예를 들면, 아닐린 생합성은 상응하는 암호화 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결여된 숙주에서 확립될 수 있다. 아닐린 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결여된 숙주에서, 경로의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있지만, 경로의 모든 효소 또는 단백질은 숙주가 하나 이상의 경로 효소 또는 단백질을 함유할 경우에조차 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 또는 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제와 같은, 아닐린 생성을 위한 경로의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있다.
본원에 제공된 교지내용 및 지침을 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자라면 발현가능한 형태로 도입하기 위한 암호화 핵산의 수가 적어도 선택된 숙주 미생물 유기체의 아닐린 경로 결여에 필적할 것임을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 본원에 개시된 아닐린 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 전부까지를 가질 수 있다. 일부 태양에서, 비-천연 미생물 유기체는 또한 아닐린 생합성을 촉진하거나 최적화하거나, 또는 숙주 미생물 유기체상에 다른 유용한 기능을 제공하는 다른 유전자 변형을 포함할 수 있다. 하나의 상기 다른 기능은, 예를 들면, 코리스메이트, 안트라닐레이트, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트 및 p-아미노벤조에이트와 같은 하나 이상의 아닐린 경로 전구체의 합성의 증대를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는, 천연적으로 생성된 분자로서, 또는 목적하는 전구체의 신생 생성 또는 숙주 미생물 유기체에 의해 천연적으로 생성된 전구체의 증가된 생성을 제공하는 조작처리된 생성물로서, 아닐린 경로의 전구체를 생성하도록 선택된다. 예를 들면, 코리스메이트는 대장균과 같은 숙주 유기체에서 천연적으로 생성된다. 숙주 유기체는 본원에 개시된 바와 같이 전구체의 생성을 증가시키도록 조작처리될 수 있다. 또한, 목적하는 전구체를 생성하도록 조작처리된 미생물 유기체는 숙주 유기체로 사용될 수 있으며, 또한 아닐린 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 조작처리될 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 아닐린을 합성하는 효소적 능력을 갖는 숙주로부터 생성된다. 상기 특정 태양에서, 예를 들면, 아닐린 경로 반응을 아닐린 생성으로 유도하도록 아닐린 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적은, 예를 들면, 하나 이상의 전술한 아닐린 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 아닐린 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과발현은, 예를 들면, 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 일어날 수 있다. 그러므로, 천연 유기체는, 예를 들면, 아닐린 생합성 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 전부의 과발현을 통해 아닐린을 생성하는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체가 되도록 용이하게 생성될 수 있다. 또한, 비-천연 유기체는, 아닐린 생합성 경로의 효소 활성의 증가를 야기하는 외인성 유전자의 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.
특히 유용한 태양에서, 암호화 핵산의 외인성 발현을 이용한다. 외인성 발현은 숙주에게 발현 및/또는 조절 요소들을 요구에 따라 변형시키는 능력 및 사용자에 의해 조절되는 목적하는 발현 수준을 달성하기 위한 용도를 제공한다. 그러나, 외인성 발현은 또한 음성 조절 작동인자의 제거 또는 유도성 프로모터 또는 기타 조절 요소에 연결될 때 유전자의 프로모터의 도입을 제거하는 것과 같은 다른 태양에 사용될 수 있다. 따라서, 천연 유도성 프로모터를 갖는 외인성 유전자는 적절한 유도제를 제공함으로써 상향조절될 수 있거나, 또는 외인성 유전자의 조절 영역은 유도성 조절 요소를 혼입함으로써 목적하는 시간에 외인성 유전자의 증가된 발현을 조절할 수 있도록 조작처리될 수 있다. 마찬가지로, 유도성 프로모터는 비-천연 미생물 유기체내에 도입된 외인성 유전자에 대한 조절 요소로서 포함될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 임의의 하나 이상의 외인성 핵산이 미생물 유기체에 도입되어 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 핵산은, 예를 들면, 미생물 유기체상에 아닐린 생합성 경로를 부여하기 위해 도입될 수 있다. 또는, 암호화 핵산은 아닐린 생합성 능력을 제공하기 위해 필요한 반응의 일부를 촉진하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체를 생성하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 아닐린 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는, 아미노데옥시코리스메이트 신타제와 아미노데옥시코리스메이트 리아제, 또는 아미노데옥시코리스메이트 리아제와 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 또는 아미노데옥시코리스메이트와 4-아미노벤조에이트 카복실리아제 등의 조합과 같이, 목적 효소 또는 단백질을 암호화하는 2개 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 2개 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적 생성물의 생성을 제공하는 한, 생합성 경로의 3개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합이 바람직한 대로 본 발명의 비-쳔연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적 생성물의 생성을 제공하는 한, 본원에 개시된 바와 같은 생합성 경로의 효소 또는 단백질의 4개 이상의 임의의 조합이 바람직한 대로 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 아닐린의 생합성 이외에, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법은 또한 서로와 및 다른 미생물 유기체 및 다른 경로에 의해 생성물 생합성을 달성하기 위해 당해 분야에 공지된 방법과 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 아닐린 생산자를 사용하는 것 이외에 아닐린을 생성하기 위한 하나의 대안은 아닐린 경로 중간체를 아닐린으로 전환시킬 수 있는 또 다른 미생물 유기체의 첨가를 통해서이다. 한 상기 절차는, 예를 들면, 아닐린 경로 중간체를 생성하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 이어서, 아닐린 경로 중간체를 아닐린으로 전환시키는 제 2의 미생물 유기체를 위한 기질로 아닐린 경로 중간체가 사용될 수 있다. 아닐린 경로 중간체는 제 2의 유기체의 또 다른 배양물에 직접 첨가될 수 있거나, 또는 아닐린 경로 중간체 생산자의 원래 배양물은, 예를 들면, 세포 분리에 의해 상기 미생물 유기체를 고갈시킨 다음, 발효액에 제 2 유기체를 연속하여 첨가하는 것을 이용하여 중간체 정제 단계없이 최종 생성물을 생성할 수 있다.
다른 태양으로, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법은, 예를 들면, 아닐린의 생합성을 달성하기 위한 매우 다양한 부경로로 조합될 수 있다. 상기 태양들에서, 본 발명의 목적 생성물을 위한 생합성 경로는 상이한 미생물 유기체들로 구분될 수 있으며, 상이한 미생물 유기체들은 공-배양되어 최종 생성물을 생성할 수 있다. 상기 생합성 방법에서, 한 미생물 유기체의 생성물은 최종 생성물이 합성될 때까지 제 2 미생물 유기체에 기질이다. 예를 들면, 아닐린의 생합성은, 한 경로 중간체를 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로 전환시키기 위한 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 제조함으로써 수행될 수 있다. 또는, 아닐린은 또한 동일한 용기에서 두 유기체를 사용하여 공-배양 또는 공-발효를 통해 미생물 유기체로부터 생합성적으로 생성될 수 있으며, 여기서 첫 번째 미생물 유기체는 아닐린 중간체를 생성하고, 제 2의 미생물 유기체는 중간체를 아닐린으로 전환시킨다.
본원에 제공된 교지내용 및 지침을 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자라면 다른 미생물 유기체와, 부경로를 갖는 다른 비-천연 미생물 유기체의 공-배양과 함께, 및 아닐린을 생성하기 위한 당해 분야에 공지된 다른 화학적 및/또는 생화학적 절차의 조합과 함께 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법에 대해 매우 다양한 조합 및 순열이 존재함을 이해할 것이다.
아닐린 경로 효소 또는 단백질에 대한 암호화 핵산의 공급원은, 예를 들면, 암호화된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉진할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 상기 종은 고세균 및 진정세균을 포함한 세균, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한 진핵생물을 포함하여(이로 한정되지 않는다) 원핵 및 진핵 유기체 둘 다를 포함한다. 상기 공급원에 예시적인 종으로는, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이, 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스 및 바실러스 서브틸리스, 및 본원에 개시되거나 또는 상응하는 유전자에 대한 공급 유기체로서 이용가능한 다른 예시적인 종들이 포함된다. 그러나, 395개 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균류, 식물 및 포유동물 게놈을 포함하여, 현재 550개 종 이상에 대해 이용가능한 완전 게놈 서열을 사용하여(NCBI와 같은 공용 데이터베이스 상에서 이용가능한 상기 종들 중 절반 이상을 사용하여), 예를 들면, 알고 있는 유전자의 동족체, 이종상동체, 상동체 및 비-이종상동성 유전자 변위를 포함하여 관련되거나 또는 별개의 종들에서 하나 이상의 유전자에 대한 필수 아닐린 생합성 활성을 암호화하는 유전자의 확인, 및 유기체들 간의 유전자 변이의 상호교환은 당해 분야에서 통상적이며 공지되어 있다. 따라서, 대장균과 같은 특정 유기체와 관련하여 본원에 기술된 아닐린의 생합성을 가능케하는 대사 변이는 원핵 및 진핵 유기체 모두 포함하여 다른 미생물들에 용이하게 적용될 수 있다. 본원에 제공된 교지내용 및 지침을 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자라면 한 유기체에서 예시된 대사 변이가 다른 유기체에도 동일하게 적용될 수 있음을 인지할 것이다.
대안적 아닐린 생합성 경로가 비관련 종들에 존재하는 경우와 같은 일부 경우에서, 예를 들면, 언급된 반응을 대체할 유사하지만 동일하지는 않은 대사 반응을 촉진하는 비관련 종으로부터의 상동체 또는 상동체들의 외인성 발현에 의해, 아닐린 생합성이 숙주 종에 제공될 수 있다. 대사 네트워크중 특정 차이가 상이한 유기체들 간에 존재하기 때문에, 당해 분야에 숙련된 자라면 상이한 유기체들간에 실제 유전자 이용이 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제공된 교지내용 및 지침을 고려할 때, 당해 분야에 숙련된 자라면 또한 본 발명의 교지내용 및 방법이 아닐린을 합성할 해당 종에서 미생물 유기체를 제조하기 위해 본원에 예시된 변이와 유사한 대사 변이를 이용하는 모든 미생물 유기체에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
비-천연 아닐린-생성 숙주의 발현 수준을 구성하고 시험하는 방법은, 예를 들면, 당해 분야에 공지된 재조합체 및 검출 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에서 찾을 수 있다.
아닐린의 생성을 위한 경로에 포함된 외인성 핵산 서열은, 접합, 전기천공, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염 및 초음파 형질전환을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포내에 안정하게 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 대장균 또는 다른 원핵 세포에서의 외인성 발현을 위해, 진핵세포 핵산의 유전자 또는 cDNA 중 일부 핵산 서열은 N-말단 미토콘드리아와 같은 표적화 신호 또는 경우에 따라 원핵성 숙주 세포내에 형질전환되기 전에 제거될 수 있는 다른 표적화 신호를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 미토콘드리아 리더 서열의 제거는 대장균에서 증가된 발현을 유도할 수 있다[Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)]. 효모 또는 다른 진핵 세포에서의 외인성 발현을 위해, 유전자는 리더 서열의 부가없이 세포기질에서 발현될 수 있거나, 또는 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호와 같은 적합한 표적화 서열의 부가에 의해 미토콘드리온 또는 다른 세포소기관에 대해 표적화되거나 또는 분비를 위해 표적화될 수 있다. 따라서, 표적화 서열을 제거하거나 포함시키기 위한 핵산 서열에 대한 적절한 변형이 바람직한 성질을 제공하기 위해 외인성 핵산 서열내에 혼입될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 유전자는 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 코돈 최적화되어 단백질의 최적화된 발현을 달성할 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은 숙주 유기체에서 작용성인 발현 조절 서열과 작용가능하게 연결된 본원에 예시된 바와 같은 하나 이상의 아닐린 생합성 경로 암호화 핵산을 포함하도록 제작될 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에 사용하기 위해 적용가능한 발현 벡터는, 예를 들면, 숙주 염색체내에 안정한 통합을 위해 작용가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함하여, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자 및 적절한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항생물질 또는 독소, 보체 영양요구성 결핍에 대한 내성을 제공하거나 또는 배양 배지에 존재하지 않는 부족한 영양소를 공급하는 선택성 마커 유전자가 또한 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 분야에 공지되어 있는 구성성 및 유도성 프로모터, 전사 증폭인자, 전사 종결인자 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 외인성 암호화 핵산이 공-발현되어야 하는 경우, 두 핵산 모두, 예를 들면, 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 발현 벡터의 경우, 암호화 핵산은 하나의 공통 발현 조절 서열에 작용가능하게 연결되거나, 또는 상이한 발현 조절 서열, 예를 들면, 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성성 프로모터에 연결될 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 포함되는 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들면, 핵산 분석, 예를 들어, 노던 블롯(Northern blot) 또는 mRNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현을 위한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 그의 상응하는 유전자 산물의 발현을 검사하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 분야에 숙련된 자는 외인성 핵산이 목적 생성물을 생성하기에 충분한 양으로 발현됨을 이해하며, 당해 분야에 공지되고 본원에 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 충분한 발현을 수득하도록 발현 수준이 최적화될 수 있음을 또한 이해할 것이다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산이 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법을 제공한다. 상기 아닐린 경로는 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 경로는 또한 DAHP 신타제를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 경로는 또한 3-데하이드로퀴네이트 신타제를 포함한다. 아닐린의 제조 방법은 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 또한, 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지에서 배양될 수 있다.
본 발명의 방법은 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 갖는 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 3개의 외인성 핵산은 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화할 수 있다. 일부 태양에서, 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 4개의 외인성 핵산은 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화할 수 있다.
또 다른 태양에서, 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 5개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 5개의 외인성 핵산은 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화할 수 있다.
전술한 배양 미생물 중 임의의 미생물은 이종 핵산인 하나 이상의 외인성 핵산을 가질 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명은 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산이 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 상기 아닐린 경로는 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 유기체는 또한 DAHP 신타제를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 유기체는 또한 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 배양된 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지에서 배양된다.
일부 태양에서, 상기 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 2개의 외인성 핵산은 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 3개의 외인성 핵산은 DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화한다. 또 다른 태양에서, 배양된 미생물 유기체는 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 4개의 외인성 핵산은 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화한다. 임의의 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산으로 제공될 수 있다.
아닐린의 생성에 대해 시험하기에 적합한 정제 및/또는 분석은 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 삼중 배양물과 같은 적합한 복제물을 시험될 각각의 조작처리된 균주에 대해 성장시킬 수 있다. 예를 들면, 조작처리된 생성 숙주에서의 생성물 및 부산물 생성을 모니터할 수 있다. 최종 생성물 및 중간체, 및 기타 유기 화합물들은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(가스 크로마토그래피-질량 분광분석) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광분석)와 같은 방법 또는 당해 분야에 공지된 통상의 절차를 사용하는 기타 적당한 분석 방법에 의해 분석될 수 있다. 발효액에서 생성물의 방출은 또한 배양 상등액을 사용하여 시험할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스는, 예를 들면, 글루코스 및 알콜용 굴절률 검출기 및 유기산용 UV 검출기[Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)]를 사용하여 HPLC에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 기타 적합한 분석 및 검출 방법에 의해 정량화할 수 있다. 외인성 DNA 서열로부터 개별적 효소 또는 단백질 활성도 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다[McCullough et al., J. Am. Chem. Soc. 79:628-630 (1957)].
아닐린은 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 배양물중 다른 성분들로부터 분리될 수 있다. 상기 분리 방법으로는, 예를 들면, 추출 절차, 및 연속 액체-액체 추출, 투과증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 및 한외여과를 포함한 방법들이 포함된다. 상기 방법들은 모두 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 기술된 임의의 비-천연 미생물 유기체는 본 발명의 생합성 생성물을 생성 및/또는 분비하도록 배양될 수 있다. 예를 들면, 아닐린 생산자를 아닐린의 생합성 생성을 위해 배양할 수 있다.
아닐린의 생성을 위해, 재조합 균주를 탄소 공급원 및 기타 필수 영양소를 갖는 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 감소시키기 위해 발효조에서 혐기성 조건을 유지하는 것이 매우 바람직하다. 상기 조건은, 예를 들면, 먼저 배지를 질소로 스파징한 후 플라스크를 격막 및 크림프-캡으로 밀봉함으로써 달성할 수 있다. 성장이 혐기적으로 관찰되지 않은 균주의 경우, 제한된 통기를 위해 격막에 작은 구멍을 천공함으로써 미세호기성 조건을 적용할 수 있다. 예시적인 혐기성 조건은 앞에서 기술하였으며 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적인 호기성 및 혐기성 조건은, 예를 들면, 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 특허출원 제 11/891,602 호에 기술되어 있다. 발효는 본원에 개시된 바와 같이 배치식(batch), 유가식(fed-batch), 또는 연속 방식으로 수행할 수 있다.
경우에 따라, 배지의 pH는 바람직한 pH에서 배양 배지를 유지시키기 위해 필요한 대로, NaOH와 같은 염기 또는 기타 염기, 또는 산의 첨가에 의해, 목적하는 pH, 특히 약 7의 pH와 같은 중성 pH에서 유지될 수 있다. 성장률은 분광광도계(600 nm)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정할 수 있으며, 글루코스 흡수율은 시간당 탄소 공급원 고갈을 모니터함으로서 측정할 수 있다.
성장 배지는, 예를 들면, 비-천연 미생물에 탄소 공급원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 상기 공급원으로는, 예를 들면, 글루코스, 자일로스, 아리비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 슈크로스 및 전분과 같은 당이 포함된다. 탄수화물의 다른 공급원으로는, 예를 들면, 재생가능한 공급원료 및 바이오매스가 포함된다. 본 발명의 방법에 공급원료로 사용될 수 있는 바이오매스의 예시적 유형으로는 셀룰로스 바이오매스, 헤미셀룰로스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부가 포함된다. 상기 바이오매스 공급원료는, 예를 들면, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 및 전분과 같은 탄소 공급원으로 유용한 탄수화물 기질을 함유한다. 본원에 제공된 교지내용 및 지침을 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자라면 상기 예시된 것 이외에 다른 재생가능한 공급원료 및 바이오매스는 또한 아닐린을 생성하기 위한 본 발명의 미생물 유기체를 배양하기 위해 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
상기 예시된 것과 같은 재생가능한 공급원료 이외에, 본 발명의 아닐린 미생물 유기체는 또한 그의 탄소 공급원으로서 합성가스 상에서의 성장을 위해 변형될 수 있다. 상기 특정 태양에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소가 아닐린 생성 유기체에서 발현되어 합성가스 또는 기타 가스상 탄소 공급원의 사용을 위한 대사 경로를 제공한다.
합성가스 또는 생산자 가스로도 알려진 합성 가스는 석탄, 및 농작물 및 잔류물을 포함하여 바이오매스 물질과 같은 탄소상 물질의 가스화의 주 생성물이다. 합성가스는 주로 H2 및 CO의 혼합물이며, 석탄, 석유, 천연 가스, 바이오매스 및 폐 유기 물질을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 임의의 유기 공급원료의 가스화로부터 수득될 수 있다. 가스화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비 하에서 수행된다. 주로 H2 및 CO이지만, 합성가스는 또한 CO2 및 기타 가스를 소량으로 포함할 수 있다. 따라서, 합성 가스는 CO, 및 추가로 CO2와 같은 가스상 탄소의 비용 효과적 공급원을 제공한다.
우드-정달(Wood-Ljungdahl) 경로는 CO 및 H2의 아세틸-CoA 및 아세테이트와 같은 기타 생성물로의 전환을 촉진한다. CO 및 합성가스를 이용할 수 있는 유기체는 또한 일반적으로 우드-정달 경로에 포함되는 동일한 기본 세트의 효소 및 형질전환을 통해 CO2 및 CO2/H2 혼합물을 이용하는 능력을 갖는다. 미생물에 의한 CO2의 아세테이트로의 H2-의존성 전환은, CO가 또한 동일 유기체에 의해 사용될 수 있으며 동일 경로가 포함된 것이 밝혀지기 훨씬 이전에 인지되었다. 많은 아세토겐이 CO2의 존재하에서 성장하며 수소가 존재하여 필요한 환원 당량을 공급하는 한 아세테이트와 같은 화합물을 생성하는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 문헌 [Drake, Acetogenesis, pp. 3-60, Chapman and Hall, New York (1994)] 참조). 이것은 하기 반응식으로 요약될 수 있다:
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + nPi → CH3COOH + 2H2O + n ATP
따라서, 우드-정달 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 아세틸-CoA 및 기타 목적 생성물의 생성을 위해 CO2 및 H2 혼합물을 또한 이용할 수 있다.
우드-정달 경로는 당해 분야에 공지되어 있으며, 2개의 분지: (1) 메틸 분지 및 (2) 카보닐 분지로 분리될 수 있는 12개의 반응으로 이루어진다. 메틸 분지는 합성가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트(메틸-THF)로 전환시키는 반면, 카보닐 분지는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 메틸 분지에서의 반응은 하기 효소 또는 단백질에 의해 순서에 따라 촉진된다: 페레독신 옥시도리덕타제, 포메이트 데하이드로게나제, 포밀테트라하이드로폴레이트 신테타제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드라타제, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제. 카보닐 분지에서의 반응은 하기 효소 또는 단백질에 의해 순서에 따라 촉진된다: 메틸테트라하이드로폴레이트:코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라제(예를 들면, AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 결합 단백질(예를 들면, AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타제, 일산화탄소 데하이드로게나제 및 니켈-단백질 결합 단백질(예를 들면, CooC). 아닐린 경로를 생성하기 위해 충분한 수의 암호화 핵산을 도입하기 위해 본원에 제공된 교지내용 및 지침에 따라서, 당해 분야에 숙련된 자라면 적어도 숙주 유기체에 부재하는 우드-정달 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 것과 관련하여 동일한 공학적 설계를 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 변형된 유기체가 완전한 우드-정달 경로를 함유하도록 본 발명의 미생물 유기체중에 하나 이상의 암호화 핵산의 도입은 합성가스 활용 능력을 제공할 것이다.
따라서, 본원에 제공된 교지내용 및 지침에 따라서, 당해 분야에 숙련된 자라면 탄수화물과 같은 탄소 공급원상에서 성장할 때 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비-천연 미생물 유기체가 생성될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 화합물은, 예를 들면, 아닐린 및 아닐린 경로중 임의의 중간 대사물을 포함한다. 필요한 모든 것은, 예를 들면, 아닐린 생합성 경로의 일부 또는 전부의 혼입을 포함하여, 목적 화합물 또는 중간체의 생합성을 달성하기 위한 하나 이상의 필요한 효소 또는 단백질 활성에서 조작처리하는 것이다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원상에서 성장할 때 아닐린을 생성하고/하거나 분비하고, 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원상에서 성장할 때 아닐린 경로에 나타낸 임의의 중간 대사물을 생성하고/하거나 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 아닐린 생성 미생물 유기체는 중간체, 예를 들면, 코리스메이트, 안트라닐레이트, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트 또는 p-아미노벤조에이트로부터 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 본원에 예시된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 아닐린 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 외인적으로 발현하도록 제조된다. 본 발명의 미생물 유기체는 아닐린을 생성하기에 충분한 조건하에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에 제공된 교지내용 및 지침에 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 약 0.1 내지 200 mM 이상의 세포내 농도를 제공하는 아닐린의 생합성을 달성할 수 있다. 일반적으로, 아닐린의 세포내 농도는 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM 이상을 포함하여, 약 3 내지 150 mM, 특히 약 5 내지 125 mM, 보다 특히 약 8 내지 100 mM이다. 각각의 상기 예시적 범위 사이 및 그 이상의 세포내 농도도 또한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 달성될 수 있다.
일부 태양에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 성장 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건은 앞에서 기술하였으며 당해 분야에 공지되어 있다. 발효 공정에 예시적인 혐기성 조건은 본원에 기술되어 있으며, 예를 들면, 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공개공보 제 2009/0047719 호에 기술되어 있다. 임의의 상기 조건을 상기 비-천연 미생물 유기체에 사용할 수 있을 뿐 아니라 당해 분야에 공지된 다른 혐기성 조건도 사용할 수 있다. 상기 혐기성 조건하에서, 아닐린 생산자는 5 내지 10 mM 이상의 세포내 농도 및 본원에 예시된 모든 다른 농도로 아닐린을 합성할 수 있다. 상기 설명이 세포내 농도를 언급하고 있긴 하지만, 아닐린 생성 미생물 유기체는 아닐린을 세포내로 생성하고/하거나 생성물을 배양 배지내에 분비할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 개시된 배양 및 발효 조건 이외에, 아닐린의 생합성을 달성하기 위한 성장 조건은 배양 조건에 삼투보호제(osmoprotectant)의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 삼투보호제의 존재하에서 본원에 기술된 바와 같이 유지, 배양 또는 발효될 수 있다. 간략하게, 삼투보호제는 삼투물질로서 작용하며 본원에 기술된 바와 같은 미생물 유기체가 삼투 스트레스를 견디는 것을 돕는 화합물을 말한다. 삼투보호제로는 베타인, 아미노산 및 당 트레할로스가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 물질의 비제한 예는 글라이신 베타인, 프랄린 베타인, 다이메틸테틴, 다이메틸설포니오프로프리오네이트, 3-다이메틸설포니오-2-메틸프로프리오네이트, 페페콜산, 다이메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이다. 한 태양에서, 삼투보호제는 글라이신 베타인이다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게는 본원에 기술된 미생물 유기체를 삼투 스트레스로부터 보호하기에 적합한 삼투보호제의 양 및 유형이 사용되는 미생물 유기체에 딸라 달라질 것임이 이해될 것이다. 배양 조건중 삼투보호제의 양은, 예를 들면, 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 이하 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.
배양 조건은, 예를 들면, 액체 배양 절차 및 발효 및 다른 대규모 배양 절차를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 생합성 생성물의 특히 유용한 수율은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건하에서 수득될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 아닐린의 생합성을 달성하기 위한 한 예시적 성장 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 특정 태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건하에서 유지, 배양 또는 발효될 수 있다. 간략하게, 혐기성 조건은 산소가 결여된 환경을 말한다. 실질적으로 혐기성 조건은, 예를 들면, 배지중 용존 산소 농도가 포화도의 0 내지 10%로 유지되는 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 1% 미만의 산소 대기하에 유지되는 밀폐 챔버 내에서 액체 배지 중에서 또는 고체 아가상에서 세포를 성장 또는 휴지시키는 것을 포함한다. 산소의 퍼센트는, 예를 들면, 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 기타 적당한 비-산소 가스 또는 가스들을 스파징함으로써 유지될 수 있다.
본원에 기술된 배양 조건은 아닐린의 제조를 위해 연속적으로 확장되고 증대될 수 있다. 예시적인 증대 절차는, 예를 들면, 유가식 발효 및 배치 분리; 유가식 발효 및 연속 분리 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이들 공정은 모두 당해 분야에 공지되어 있다. 발효 절차는 상업적 양의 아닐린의 생합성 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 및 비-연속 배양 절차와 마찬가지로, 아닐린의 연속 및/또는 거의-연속 생성은 증식기에서 성장을 지속 및/또는 거의 지속하기에 충분한 영양소 및 배지에서 본 발명의 비-천연 아닐린 생성 유기체를 배양하는 것을 포함할 것이다. 상기 조건하에서의 연속 배양은, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 이상 동안 성장을 포함할 수 있다. 또한, 연속 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5 주 이상 및 수개월까지의 보다 긴 기간을 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 유기체는 특정 용도에 적합한 경우 수시간동안 배양할 수 있다. 연속 및/또는 거의-연속 배양 조건은 또한 상기 예시적 기간 사이의 모든 시간 간격을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 미생물 유기체를 배양하는 시간은 바람직한 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생성하기에 충분한 시간동안인 것으로 이해된다.
발효 절차는 당해 분야에 공지되어 있다. 간략하게, 아닐린의 생합성 생성을 위한 발효는, 예를 들면, 유가식 발효 및 배치 분리; 유가식 발효 및 연속 분리 또는 연속 발효 및 연속 분리에 사용될 수 있다. 배치 및 연속 발효 절차의 예는 당해 분야에 공지되어 있다.
상당량의 아닐린의 연속 생성을 위한 본 발명의 아닐린 생산자를 사용하는 상기 발효 절차 이외에, 아닐린 생산자는 또한, 예를 들면, 생성물을 다른 화합물로 전환시키기 위한 화학 합성 절차에 동시에 적용될 수 있거나, 또는 경우에 따라, 생성물을 발효 배양물로부터 분리하고 계속해서 화학 전환에 적용하여 생성물을 다른 화합물로 전환시킬 수 있다.
일부 태양에서, 아닐린의 제조 방법은 발효액으로부터 아닐린을 단리하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 표준 추출, 증류, 염 결정화 기술, 및 이들 기술과 전술한 것들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 아닐린과 같은 염기성 생성물의 경우, 염 결정화는 브론스테드(Bronsted) 또는 루이스(Lewis) 산의 산염의 생성을 포함할 수 있다. 예시적인 산염으로는, 제한하지 않고, 아세테이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 카보네이트, 바이설페이트, 설페이트, 클로라이드, 브로마이드, 벤젠 설포네이트, 메틸 설포네이트, 포스페이트, 바이포스페이트, 락테이트, 말리에이트, 말레이트, 말로네이트, 푸마레이트, 락테이트, 타르타레이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루큐로네이트, 글루코네이트 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 사카레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 토실레이트 및 트라이플루오로아세테이트 염이 포함된다.
보다 우수한 생산자를 제조하기 위해, 대사 모델링을 이용하여 성장 조건을 최적화할 수 있다. 모델링은 또한 경로의 이용을 추가로 최적화하는 유전자 결손(gene knockout)을 설계하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공개공보 US 2002/0012939 호, US 2003/0224363 호, US 2004/0029149 호, US 2004/0072723 호, US 2003/0059792 호, US 2002/0168654 호 및 US 2004/0009466 호 및 미국 특허 제 7,127,379 호 참조). 모델링 분석은 대사를 아닐린의 보다 효과적인 생성으로 유도하는 세포 성장에 대한 영향의 확실한 예상을 가능케 한다.
목적 생성물의 생합성을 유리하게 하는 대사 변이를 확인하고 설계하기 위한 하나의 컴퓨터적 방법은 옵트녹(OptKnock) 컴퓨터 프레임워크이다[Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)]. 옵트녹은 표적 생성물을 과잉생성하는 유전적으로 안정한 미생물을 제공하는 유전자 결실 또는 파괴 수단을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 특히, 상기 프레임워크는 목적하는 생화학 물질이 세포 성장의 필수 부산물이 되도록 하는 유전자 조작을 제시하기 위해 미생물의 완전한 대사적 및/또는 생화학적 네트워크를 조사한다. 생화학적 생산을 전략적으로 배치된 유전자 결실 또는 다른 기능성 유전자 파괴를 통해 세포 성장과 연결시킴으로써, 생물반응기에서 장시간 후에 조작처리된 균주상에 부과된 성장 선택 압력이 강제적 성장-연결된 생화학적 생산의 결과로서 성능의 개선을 유도한다. 최종적으로, 유전자 결실이 구성되는 경우, 옵트녹에 의해 선택된 유전자가 게놈으로부터 완전히 제거되기 때문에, 설계된 균주가 그의 야생형 상태로 되돌아갈 가능성은 미미하다. 그러므로, 상기 컴퓨터에 의한 방법은 목적 생성물의 생합성을 유도하는 대안적 경로를 확인하기 위해 사용되거나, 또는 목적 생성물의 생합성의 추가의 최적화를 위해 비-천연 미생물 유기체와 관련되어 사용될 수 있다.
간략하게, 옵트녹은 세포 대사를 모델링하기 위한 컴퓨터적 방법 및 시스템을 말하기 위해 본원에 사용된 용어이다. 옵트녹 프로그램은 특정 제약조건을 플럭스 밸런스 분석(flux balance analysis, FBA) 모델 내에 혼입시키는 모델 및 방법의 프레임워크에 관한 것이다. 상기 제약조건은, 예를 들면, 정성적 동역학적 정보, 정량적 조절 정보 및/또는 DNA 미세배열 실험 데이터를 포함한다. 옵트녹은 또한, 예를 들면, 플럭스 밸런스 모델을 통해 유도된 플럭스 경계를 강화하고 이어서 유전자 부가 또는 결실의 존재하에 대사 네트워크의 성능 한계를 조사함으로써 다양한 대사 문제에 대한 해결책을 추정한다. 옵트녹 컴퓨터적 프레임워크는 대사 네트워크의 성능 한계의 효과적 확인을 가능케하고 야기된 혼합-정수 선형 프로그래밍 문제를 해결하기 위한 방법을 제공하는 모델 공식의 구성을 가능하게 한다. 본원에서 옵트녹으로 언급된 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은, 예를 들면, 2002년 1월 10일자로 출원된 미국 공개공보 제 2002/0168654 호, 2002년 1월 10일자로 출원된 국제 특허 PCT/US02/00660 호 및 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공개공보 제 2009/0047719 호에 기술되어 있다.
생성물의 생합성적 생산을 유리하게 하는 대사 변이를 확인하고 설계하기 위한 또 다른 컴퓨터적 방법은 심페니(SimPheny, 등록상표)로 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 상기 컴퓨터적 방법 및 시스템은, 예를 들면, 2002년 1월 14일자로 출원된 미국 공개공보 제 2003/0233218 호 및 2003년 1월 13일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US03/18838 호에 기술되어 있다. 심페니(등록상표)는 네트워크 모델을 인실리코로 제작하고, 시스템내 화학 반응의 임의의 및 모든 가능한 작용기를 포함하는 해결 공간을 정의하기 위한 생물학적 시스템의 화학 반응을 통한 질량, 에너지 또는 전하의 플럭스를 시뮬레이션함으로써 생물학적 시스템에 일련의 허용된 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템이다. 해결 공간이 포함된 반응의 알고 있는 화학량론 뿐 아니라 반응을 통한 최대 플럭스와 관련된 반응 열역학 및 용량 제한과 같은 제약조건에 의해 규정되기 때문에 상기 접근방법은 제약조건-기반 모델링으로 지칭된다. 상기 제약조건에 의해 규정된 공간은 생물학적 시스템 또는 그의 생화학적 성분의 표현형 능력 및 양태를 결정하기 위해 탐색될 수 있다.
상기 컴퓨터적 접근방법은, 생물학적 시스템이 유연하고 많은 상이한 벙법으로 동일한 결과에 이를 수 있기 때문에 생물학적 사실과 일치한다. 생물학적 시스템은 모든 살아있는 시스템이 직면해야 하는 근본적인 제약에 의해 제한된 진화적 메카니즘을 통해 설계된다. 그러므로, 제약조건-기반 모델링 방법은 이러한 일반적인 사실을 포함한다. 또한, 제약의 강화를 통해 네트워크 모델에 추가의 제한을 계속적으로 부과하는 능력은 해결 공간의 크기의 감소를 야기함으로써, 그에 의해 생리학적 성능 또는 표현형이 예상될 수 있는 정확성이 향상된다.
본원에 제공된 교지내용 및 지침에 따라서, 당해 분야에 숙련된 자는 숙주 미생물 유기체에서 목적 화합물의 생합성을 설계하고 실행하기 위한 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위한 다양한 컴퓨터 프레임워크를 적용할 수 있을 것이다. 상기 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은, 예를 들면, 상기에서 심페니(등록상표) 및 옵트녹으로 예시된 컴퓨터 시스템을 포함한다. 본 발명의 예시를 위해, 일부 방법을 모델링 및 시뮬레이션을 위한 옵트녹 컴퓨터 프레임워크와 관련하여 본원에 기술하였다. 당해 분야에 숙련된 자라면 당해 분야에 공지된 임의의 상기 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 컴퓨터 프레임워크 및 방법에 옵트녹을 사용하여 대사 변이의 확인, 설계 및 실행을 적용하는 방법을 인지할 것이다.
전술한 방법은 파괴될 한 세트의 대사 반응을 제공할 것이다. 상기 세트내의 각 반응의 제거 또는 대사 변형은 유기체의 성장 단계동안 필수 생성물로서 목적 생성물을 제공할 수 있다. 반응들은 공지되어 있기 때문에, 바이레벨(bilevel) 옵트녹 문제에 대한 해결은 또한 상기 반응들의 세트내의 각 반응을 촉진하는 하나 이상의 효소를 암호화하는 관련 유전자 또는 유전자들을 제공할 것이다. 한 세트의 반응 및 각 반응에 관여하는 효소를 암호화하는 그의 상응하는 유전자들의 확인은 일반적으로 효소와 암호화 유전자 사이에 관계를 갖는 반응 데이터베이스와 반응의 상호관계를 통해 달성된 자동화 공정이다.
일단 확인되면, 목적 생성물의 생산을 달성하기 위해 파괴되어야 하는 반응 세트는 그 세트 내의 각 대사 반응을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 기능적 파괴에 의해 표적 세포 또는 유기체에서 실행된다. 반응 세트의 기능적 파괴를 달성하기 위한 특히 유용한 한가지 수단은 각 암호화 유전자의 결실에 의한 것이다. 그러나, 일부 경우에서, 예를 들면, 프로모터 또는 조절 인자를 위한 시스 결합 부위와 같은 조절 영역의 돌연변이, 결실을 포함하여 기타 유전자 이상에 의해, 또는 많은 위치중 임의 위치에서 암호화 서열의 절단(truncation)에 의해 반응을 파괴하는 것이 유리할 수 있다. 유전자 세트의 전체보다 적은 결실을 야기하는 상기 후자의 이상은, 예를 들면, 생성물의 커플링의 신속한 평가가 요구되는 경우 또는 유전자 복귀가 일어날 가능성이 적은 경우에 유용할 수 있다.
파괴될 반응의 추가 세트, 또는 목적 생성물의 성장-연결된 생합성을 포함하여 생합성을 야기할 수 있는 대사 변형을 초래하는 전술한 바이레벨 옵트녹 문제에 대한 추가의 생산적 해결책을 확인하기 위해, 정수 삭제로 지칭되는 최적화 방법이 실행될 수 있다. 상기 방법은 각 반복시 정수 삭제로 지칭되는 추가 제약의 혼입에 의해 상기 예시된 옵트녹 문제를 반복적으로 해결함으로써 진행된다. 정수 삭제 제약은 해결 절차가 필수적으로 생성물 생합성을 성장과 연결시키는 임의의 사전 반복에서 확인된 반응의 정확히 동일한 세트를 선택하는 것을 효과적으로 방지한다. 예를 들면, 이전에 확인된 성장-연결된 대사 변형이 파괴를 위한 반응 1, 2 및 3을 명시한 경우, 이어지는 제약이 후속 해결책에서 동일 반응이 동시에 고려되는 것을 방지한다. 정수 삭제 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797 (2001)]에서 찾을 수 있다. 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위한 옵트녹 컴퓨터 프레임워크와 함께 그의 사용과 관련하여 본원에 기술된 모든 방법들의 경우에서와 같이, 반복 컴퓨터 분석에서 불필요한 중복을 감소시키는 정수 삭제 방법은 또한, 예를 들면, 심페니(등록상표)를 포함하여 당해 분야에 공지된 다른 컴퓨터 프레임워크를 사용하여 적용될 수 있다.
본원에 예시된 방법들은 표적 생화학 생성물의 생산을 확인된 유전자 변이를 갖도록 조작처리된 세포 또는 유기체의 성장과 필수적으로 연결시키는 것을 포함하여, 생합성적으로 목적 생성물을 생성하는 세포 및 유기체의 제조를 가능케 한다. 그러므로, 본원에 기술된 컴퓨터적 방법은 옵트녹 또는 심페니(등록상표)로부터 선택된 인실리코 방법에 의해 확인되는 대사 변형의 확인 및 실행을 가능케 한다. 대사 변형의 세트는, 예를 들면, 하나 이상의 생합성 경로 효소의 부가 및/또는, 예를 들면, 유전자 결실에 의한 파괴를 포함하여 하나 이상의 대사 반응의 기능적 파괴를 포함할 수 있다.
상기에서 논의한 바와 같이, 옵트녹 방법은, 장기간의 성장 선택에 적용되는 경우 돌연변이 미생물 네트워크가 그의 컴퓨터로 예상된 최대-성장 표현형쪽으로 진화될 수 있다는 전제하에 개발되었다. 즉, 상기 접근방법은 선택 압력하에서 자가-최적화되는 유기체의 능력에 영향을 준다. 옵트녹 프레임워크는 네트워크 화학량론을 기준으로 생합성 생산과 세포 성장을 연결시키는 유전자 결실 조합의 완전한 열거를 가능하게 한다. 최적 유전자/반응 결손의 확인은 야기된 네트워크에 대한 최적 성장 해결책이 해당 생화학물질을 과잉생성하도록 활성 반응의 세트를 선택하는 바이레벨 최적화 문제의 해결을 요한다.
대장균 대사의 인실리코 화학량론적 모델은, 앞에서 예시되고, 예를 들면, 미국 특허 공개공보 US 2002/0012939 호, US 2003/0224363 호, US 2004/0029149 호, US 2004/0072723 호, US 2003/0059792 호, US 2002/0168654 호 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호에 기술된 바와 같은 대사 경로를 위한 필수 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 옵트녹 수학적 프레임워크는 목적 생성물의 성장-연결 생산을 초래하는 유전자 결실을 정확히 찾아내기 위해 적용될 수 있다. 또한, 바이레벨 옵트녹 문제의 해결은 한 세트의 결실만을 제공한다. 모든 의미있는 해결, 즉, 성장-연결된 생성물 생성을 초래하는 결손의 모든 세트를 열거하기 위해, 정수 삭제로 지칭되는 최적화 기술을 실행할 수 있다. 이것은, 상기에서 논의한 바와 같이, 각각의 반복시 정수 삭제로서 지칭된 추가 제약의 혼입에 의해 옵트녹 문제를 반복적으로 해결하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 아닐린 경로의 목적 활성을 암호화하는 핵산을 숙주 유기체내에 도입할 수 있다. 일부 경우에서, 아닐린 생산을 증가시키기 위해 아닐린 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이를 암호화 핵산 분자내에 도입시킬 수 있다. 또한, 최적화 방법은 효소 또는 단백질의 활성을 증가시키고/시키거나 억제 활성을 감소, 예를 들면, 음성 조절인자의 활성을 감소시키기 위해 적용될 수 있다.
한가지 상기 최적화 방법은 방향성 진화이다. 방향성 진화는 효소의 성질을 개선하고/하거나 변이시키기 위해 특정 유전자를 표적으로 한 돌연변이의 도입을 포함하는 강력한 접근방법이다. 개선되고/되거나 변이된 효소는 많은 효소 변이체(예를 들면, >104)의 자동 스크리닝을 가능케 하는 민감한 고속 처리량 스크리닝 분석법의 개발 및 실행을 통해 확인될 수 있다. 반복 순환의 돌연변이유발 및 스크리닝은 전형적으로 최적화된 성질을 갖는 효소를 수득하기 위해 수행된다. 돌연변이유발을 위한 유전자의 영역을 확인하는 것을 촉진할 수 있는 컴퓨터 알고리즘도 또한 개발되었으며, 생성되고 스크리닝될 필요가 있는 효소 변이체의 수를 상당히 감소시킬 수 있다. 다양한 변이체 라이브러리에서 효과적일 많은 방향성 진화 기술이 개발되었으며(개관을 위해, 문헌 [Hibbert et al., Biomol. Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde., Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries, pp.717-742, Patel(ed.), CRC Press, (2007); Otten and Quax, Biomol. Eng 22:11-19 (2005); and Sen et al., Appl Biochem. Biotechnol 143:212-223 (2007)]을 참조하시오), 상기 방법들은 많은 효소 부류에 걸쳐 광범위한 성질의 개선에 성공적으로 적용되었다. 방향성 진화 기술에 의해 개선되고/되거나 변이된 효소 특성으로는, 예를 들면, 다음이 포함된다: 비-천연 기질의 전환을 위해, 선택성/특이성; 견실 고온 가공을 위해, 온도 안정성; 낮거나 높은 pH 조건하에서 생체공정을 위해, pH 안정성; 높은 생성물 역가가 달성될 수 있도록, 기질 또는 생성물 내성; 기질 결합을 확장시켜 비-천연 기질을 포함하도록, 결합도(Km); 생성물, 기질 또는 핵심 중간체에 의한 저해를 배제하도록, 억제율(Ki); 효소 반응 속도를 증가시켜 목적 플럭스를 달성하도록, 활성(kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 플럭스를 증가시키도록, 발현 수준; 호기성 조건하에서 공기 민감성 효소의 작업을 위해, 산소 안정성; 및 산소의 부재하에 호기성 효소의 작업을 위해, 혐기 활성.
특정 효소의 목적하는 성질을 표적화하기 위해 유전자의 돌연변이유발 및 변이를 위해 많은 예시적 방법들이 개발되었다. 상기 방법들은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들중 임의의 방법을 사용하여 아닐린 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변이시키고/시키거나 최적화시킬 수 있다. 상기 방법으로는 다음이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다: PCT 반응에서 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시킴으로써 무작위 점 돌연변이를 도입시키는 EpPCR[Pritchard et al., J. Theor. Biol. 234:497-509 (2005)]; 전체 원형 플라스미드를 주형으로 사용하고 마지막 2개 뉴클레오티드 상에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 갖는 불규칙 6-량체를 사용하여 플라스미드를 증폭시킨 후 플라스미드가 순차 반복으로 재순환되는 세포내로 형질전환시키는 것을 제외하고 epPCR과 유사한 유발 회전 환 증폭(Error-prone Rolling Circle Amplification, epRCA)[Fujii et al., Nucl. Acids Res 32:e145 (2004); and Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)]; 전형적으로 DnaseI 또는 EndoV와 같은 뉴클레아제로 2개 이상의 변이 유전자를 절단시켜 DNA 폴리머라제의 존재하에서 어닐링 및 연장 사이클에 의해 재조립되어 키메라 유전자의 라이브러리를 생성하는 불규칙 단편들의 풀을 생성하는 것을 수반하는 DNA 또는 가계 재편성(Family Shuffling)[Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994); and Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)]; 주형 프라이밍 후 변성 및 매우 단기간(5초 정도)의 어닐링/연장하에 2 단계 PCR의 반복 사이클을 포함하는 시차적 연장(Staggered Extension, StEP)[Zhao et al., Nat. Biotechnol 16:258-261 (1998)]; 무작위 서열 프라이머를 사용하여 주형의 상이한 절편들에 상보성인 많은 짧은 DNA 단편들을 생성하는 무작위 프라이밍 재조합(Random Priming Recombination, RPR)[Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998)].
또 다른 방법으로는 다음이 포함된다: 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 미스매치 복구에 의해 복구된 헤테로듀플렉스를 형성하는 헤테로듀플렉스 재조합(Heteroduplex Recombination)[Volkov et al., Nucleic Acids Res 27:e18 (1999); and Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)]; DnaseI 단편화 및 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 크기 분류를 이용하는 과도성 주형상의 무작위 키메라생성(Random Chimeragenesis on Transient Templates, RACHITT)[Coco et al., Nat. Biotechnol 19:354-359 (2001)]; 주형의 풀로 사용되는 단일방향성 ssDNA 단편의 존재하에 프라이머로부터 가닥을 단일방향성으로 성장시키는 주형 스위칭을 포함하는 절두형 주형상의 재조합 연장(Recombined Extension on Truncated templates, RETT)[Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-120 (2003)]; 변성 프라이머를 사용하여 분자간 재조합을 조절하는 변성 올리고뉴클레오티드 유전자 재편성(Degenerate Oligonucleotide Gene Shuffling, DOGS)[Bergquist and Gibbs, Methods Mol. Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol. Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)]; 해당 유전자 또는 유전자 단편의 1개의 염기쌍 결실을 갖는 조합 라이브러리를 제공하는 하이브리드 효소의 제조를 위한 점증적 절두(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes, ITCHY)[Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999); Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209 (1999)]; 포스포티오에이트 dNTP를 이용하여 절두체를 형성하는 것을 제외하고 ITCHY와 유사한 하이브리드 효소의 제조를 위한 티오-점증적 절두(Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes, THIO-ITCHY)[Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)]; 유전자를 재조합하기 위한 두 방법, ITCHY 및 DNA 재편성을 결합시킨 SCRATCHY[Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253 (2001)]; 돌연변이가 epPCR 후에 이용가능한 활성을 유지하는 것에 대한 스크리닝/선택에 의해 이루어지는 무작위 드리프트 돌연변이유발(Random Drift Mutagenesis, RNDM)[Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72 (2005)]; 포스포티오에이트 뉴클레오티드의 무작위 혼입 및 절단을 이용하여 불규칙한 길이의 단편의 풀을 생성하고, 상기 풀을 이노신과 같은 "보편적" 염기의 존재하에 연장되기 위한 주형으로 사용하며, 이노신-함유 보체의 복제가 무작위 염기 혼입을 제공하여 결과적으로 돌연변이유발을 일으키는 무작위 돌연변이 방법인 서열 포화 돌연변이유발(Sequence Saturation Mutagenesis, SeSaM)[Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); and Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)]; "표적에서의 모든 유전자 다양성"을 암호화하도록 설계된 중복 올리고뉴클레오티드를 사용하며, 재편성된 자손에 매우 고도의 다양성을 허용하는 합성 재편성(Synthetic Shuffling)[Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002)]; dUTP 혼입 후 우라실 DNA 글리코실라제 및 이어서 피페리딘에 의한 처리의 조합을 이용하여 종료점 DNA 단편화를 수행하는 뉴클레오티드 교환 및 삭제 기술(Nucleotide Exchange and Excision Technology) NexT[Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:e117 (2005)].
다른 방법으로는 다음이 포함된다: 링커를 사용하여 2개의 멀리 관련되거나 또는 관련되지 않은 유전자간의 융합을 촉진하고, 두 유전자 사이에 일련의 키메라를 생성하여, 단일-교차 하이브리드의 라이브러리를 제공하는 서열 상동성-의존성 단백질 재조합(Sequence Homology-Independent Protein Recombination, SHIPREC)[Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)]; 출발 물질이 삽입물을 갖는 초나선 이중가닥 DNA(dsDNA) 플라스미드 및 돌연변이의 바람직한 부위에서 변성되는 2개의 프라이머를 포함하는 유전자 부위 포화 돌연변이유발(Gene Site Saturation Mutagenesis(등록상표), GSSM(등록상표))[Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)]; 제한된 영역들을 많은 가능한 아미노산 서열 변이로 대체하기 위해 짧은 올리고뉴클레오티드 카세트의 사용을 포함하는 조합 카세트 돌연변이유발(Combinatorial Cassette Mutagenesis, CCM)[Reidhaar-Olson et al., Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); and Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57 (1988)]; 본질적으로 CCM과 유사하며, 열점 및 열 영역을 확인하기 위해 높은 돌연변이율에서 epPCR을 사용하고 이어서 단백질 서열 공간의 한정된 영역을 포함하기 위해 CMCM에 의해 연장시키는 조합 다중 카세트 돌연변이유발(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis, CMCM)[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)]; 조건적 ts 돌연변이유발 플라스미드가, 선택시에 무작위 및 천연 돌연변이 빈도에서 20- 내지 4000-배의 증가를 허용하고 선택이 필요하지 않은 경우 결실 돌연변이의 축적을 차단하기 위해, DNA 폴리머라제 III의 돌연변이체 서브유닛을 암호화하는 mutD5 유전자를 사용하는 돌연변이유발 균주 기술(Mutator Strains technique)[Selifonova et al., Appl Envrion Microbiol 67:3645-3649 (2001)]; Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)].
또 다른 예시적 방법으로는 다음이 포함된다: 선택된 아미노산들의 조합 돌연변이를 평가하고 최적화하는 다차원 돌연변이유발 방법인 룩-스루 돌연변이유발(Look-Through Mutagenesis, LTM)[Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005)]; 동시에 다중 유전자에 적용될 수 있거나 또는 단일 유전자의 키메라(다중 돌연변이)의 거대 라이브러리를 제작하는데 적용될 수 있는 DNA 재편성 방법인 유전자 재조립(Gene Reassembly)(베레늄 코포레이션(Verenium Corporation)에 의해 공급되는 튜나블 진리어셈블리(Tunable GeneReassembly, 등록상표)(TGM, 등록상표); 특정한 접힘을 갖는 구조적으로 정의된 단백질 주쇄를 고정시키고 접힘 및 전체 단백질 에너지학을 안정화시킬 수 있는 아미노산 치환을 위한 서열 공간을 탐색하는 최적화 알고리즘이며, 일반적으로 공지된 3차원 구조를 갖는 단백질에 가장 효과적으로 작용하는 인실리코 단백질 설계 자동화(in Silico Protein Design Automation, PDA)[Hayes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931 (2002)]; 및, 효소 개선을 위해 적당한 부위를 선택하기 위한 구조/기능에 대한 지식을 이용하고, 스트레이타진 퀵 체인지(Stratagene QuickChange)(스트레이타진; 캘리포니아주 산디에고)과 같은 돌연변이유발 방법을 사용하여 선택된 부위에서 포화 돌연변이유발을 수행하고, 목적하는 성질에 대해 스크리닝/선별하고, 개선된 클론(들)을 사용하여 또 다른 부위에서 다시 시작하여 목적하는 활성이 달성될 때까지 반복을 계속하는 것을 포함하는 반복 포화 돌연변이유발(Iterative Saturation Mutagenesis, ISM)[Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); and Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006)].
돌연변이유발을 위한 임의의 전술한 방법들은 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 또한, 방향성 진화 방법의 어느 하나 또는 조합을 본원에 기술된 바와 같이 적응 진화 기술과 함께 사용할 수 있다.
실시예 I
전구체로서 p- 아미노벤조에이트를 사용한 아닐린 생합성
본 실시예는 전구체로서 코리스메이트를 사용하여 아닐린을 생성할 수 있는 미생물 유기체의 제조를 기술한다.
에스케리키아 콜라이를 도 2에 나타낸 바와 같이 효소 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 사용하는 경로를 조작처리하기 위한 표적 유기체로서 사용한다. 대장균은 아닐린을 생성할 수 있는 비-천연 미생물을 제조하기 위한 우수한 숙주를 제공한다. 대장균은 유전적 조작에 잘 순응하며, 혐기성 또는 미세호기성 조건하에서 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산 및 숙신산과 같은 다양한 생성물을 효과적으로 생성할 수 있는 것으로 알려져 있다.
아닐린을 생성하도록 조작처리된 대장균 균주를 생성하기 위해, 전술한 바와 같이, 개시된 경로에 사용된 효소를 암호화하는 핵산을 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 대장균에서 바람직한 정도로 발현시킨다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999); Roberts et al., Arch. Microbiol. 117:99-108 (1989)] 참조).
대장균에서의 천연 효소를 변형시키거나 또는 이종 효소를 도입하여 상당량의 p-아미노벤조에이트를 생성할 수 있다. 또한, 세디멘티박터 하이드록시벤조이쿠스로부터의 shdB , C 및 D와 같은 적절한 유전자를 도입함으로써 4-아미노벤조에이트 카복실리아제 활성을 균주에 혼입시킬 수 있다. 상기 유전자를 PA1/lacO 프로모터하에서 pZE13 벡터(익스프레시스(Expressys), 독일 루엘츠하임 소재) 내에 클로닝시킨다. 상기 플라스미드를 p-아미노벤조에이트를 생성하는 재조합 대장균 균주내에 형질전환시켜 상기 대사물로부터 아닐린 합성에 필요한 단백질 및 효소를 발현시킨다.
생성된 유전자 조작된 유기체를 당해 분야에 공지된 절차에 따라서 글루코스 함유 배지에서 배양한다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)] 참조). 경로 유전자의 발현은, 예를 들면, 노던 블롯, mRNA의 PCR 증폭, 면역블롯팅을 포함하여, 폴리펩티드 발현 또는 효소 활성을 측정하기 위한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 발현된 효소의 효소 활성은 개별 활성에 특이적인 분석을 이용하여 확인한다. 아닐린을 생성하는 조작처리된 대장균 균주의 능력은 HPLC, 가스 크로마토그래피-질량 분광분석(GCMS) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)을 사용하여 확인한다.
기능적 아닐린 합성 경로를 갖도록 조작처리된 미생물 균주는 또한 경로의 효과적 사용을 위한 최적화에 의해 증대된다. 간략하게, 조작처리된 균주는 임의의 외인성 유전자가 속도 제한 수준으로 발현되는지 여부를 측정하기 위해 평가된다. 발현은, 예를 들면, 추가 유전자 복사체 수의 도입에 의해 경로를 통한 플럭스를 제한할 수 있는 낮은 수준으로 발현된 임의의 효소에 대해 증가된다.
보다 우수한 생산자를 제조하기 위해, 대사 모델링을 이용하여 성장 조건을 최적화한다. 모델링은 또한 경로의 활용을 추가로 최적화시키는 유전자 결손을 설계하는데에도 사용된다(예를 들면, 미국 특허 공개공보 US 2002/0012939 호, US 2003/0224363 호, US 2004/0029149 호, US 2004/0072723 호, US 2003/0059792 호, US 2002/0168654 호 및 US 2004/0009466 호 및 미국 특허 제 7,127,379 호 참조). 모델링 분석은 대사를 아닐린의 보다 효과적인 생성으로 유도하는 세포 성장에 대한 효과의 확실한 예상을 가능케 한다. 한 모델링 방법은 바이레벨 최적화 접근방법인 옵트녹[Burgard et al., Biotechnol. Bioengineer. 84:647-657 (2003)]으로, 이것은 총괄적으로 아닐린의 보다 우수한 생성을 야기하는 유전자 결손을 선택하기 위해 적용된다. 적응 진화도 또한, 예를 들면, 중간체, 코리스메이트 또는 생성물인 아닐린의 보다 우수한 생산자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 적응 진화는 성장 및 생성 특성 둘 다를 개선하기 위해 수행된다[Fong and Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058 (2004); Alper et al., Science 314:1565-1568 (2006)]. 결과를 기초로, 모델링, 유전 공학 및 적응 진화의 후속 과정을 아닐린 생산자에 적용하여 생성을 더 증가시킬 수 있다.
아닐린의 대규모 생성을 위해, 재조합 유기체를, 혐기성 조건하에서 유기체의 성장을 촉진하는, 당해 분야에 공지된 배지를 사용하여 발효조에서 배양한다. 발효는 배치식, 유가식 또는 연속 방식으로 수행한다. 혐기성 조건은 먼저 배지를 질소로 스파징한 후 배양 용기를 밀폐(예를 들면, 플라스크를 격막 및 크림프-캡으로 밀폐할 수 있다)함으로써 유지된다. 제한된 통기를 위해 작은 구멍을 제공함으로써 미세호기성 조건도 또한 이용할 수 있다. 배지의 pH는 H2SO4와 같은 산을 첨가하여 7의 pH에서 유지시킨다. 성장률은 분광광도계(600 nm)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정하고, 글루코스 흡수율은 시간경과에 따른 탄소 공급원 고갈을 모니터함으로써 측정한다. 바람직하지 않은 알콜, 유기산 및 잔류 글루코스와 같은 부산물은, 글루코스 및 알콜용 굴절률 검출기 및 유기산용 UV 검출기를 사용하여, HPX-087 컬럼(바이오래드)을 갖는 HPLC(시마주)에 의해 정량화할 수 있다[Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775-779 (2005)].
본 출원 전체에 걸쳐 다양한 출판물이 참조되었다. 이들 출판물의 개시내용은 유전자 은행 및 GI 번호 공개를 포함하여 그 전체로, 본 발명이 관련된 당해 분야의 수준을 보다 상세히 설명하기 위해 본 출원에 참고로 인용된다. 본 발명을 상기에 나타낸 실시예와 관련하여 기술하였지만, 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 다양한 변형을 행할 수 있음을 주지해야 한다.
본 발명을 개시된 태양들과 관련하여 기술하였지만, 당해 분야에 숙련된 자라면 상기에 상술된 특정 예 및 연구가 단지 본 발명을 예시하는 것임을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 진의에서 벗어나지 않고 다양한 변형을 행할 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 본 발명은 하기의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (46)

  1. 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 아닐린 경로가 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제 및 아미노데옥시코리스메이트 리아제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    3-데옥시-D-아라비노-헵툴로손산-7-포스페이트(DAHP) 신타제를 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  4. 청구항 1에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  5. 청구항 1에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  6. 청구항 5에 있어서,
    3개의 외인성 핵산이 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  7. 청구항 1에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    4개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  9. 청구항 1에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 5개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    5개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 및 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  11. 청구항 1에 있어서,
    하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  12. 청구항 1에 있어서,
    실질적으로 혐기성 배양 배지에 존재하는 비-천연 미생물 유기체.
  13. 청구항 1의 비-천연 미생물 유기체를 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 및 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    DAHP 신타제를 추가로 포함하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 추가로 포함하는 방법.
  16. 청구항 13에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성 배양 배지에 존재하는 방법.
  17. 청구항 13에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  18. 청구항 13에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    3개의 외인성 핵산이 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제 및 아미노데옥시코리스메이트 리아제를 암호화하는 방법.
  20. 청구항 13에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    4개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제 및 4-아미노벤조에이트 카복실리아제를 암호화하는 방법.
  22. 청구항 13에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 5개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    5개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 신타제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제, 4-아미노벤조에이트 카복실리아제, 및 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 암호화하는 방법.
  24. 청구항 13에 있어서,
    하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 방법.
  25. 아닐린을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는 아닐린 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 아닐린 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 아닐린 경로가 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  26. 청구항 25에 있어서,
    DAHP 신타제를 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  27. 청구항 25에 있어서,
    3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  28. 청구항 25에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  29. 청구항 28에 있어서,
    2개의 외인성 핵산이 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  30. 청구항 25에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  31. 청구항 30에 있어서,
    3개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  32. 청구항 25에 있어서,
    각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  33. 청구항 32에 있어서,
    4개의 외인성 핵산이 3-데하이드로퀴네이트 신타제, DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화하는 비-천연 미생물 유기체.
  34. 청구항 25에 있어서,
    하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  35. 청구항 25에 있어서,
    실질적으로 혐기성 배양 배지에 존재하는 비-천연 미생물 유기체.
  36. 청구항 25의 비-천연 미생물 유기체를 아닐린을 생성하기 위한 조건하에서 및 아닐린을 생성하기에 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함하는, 아닐린의 제조 방법.
  37. 청구항 36에 있어서,
    DAHP 신타제를 추가로 포함하는 방법.
  38. 청구항 36에 있어서,
    3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 추가로 포함하는 방법.
  39. 청구항 36에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성 배양 배지에 존재하는 방법.
  40. 청구항 36에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서,
    2개의 외인성 핵산이 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화하는 방법.
  42. 청구항 36에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 3개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  43. 청구항 42에 있어서,
    3개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제 및 안트라닐레이트 데카복실라제를 암호화하는 방법.
  44. 청구항 36에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 각각 아닐린 경로 효소를 암호화하는 4개의 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서,
    4개의 외인성 핵산이 DAHP 신타제, 안트라닐레이트 신타제, 안트라닐레이트 데카복실라제, 및 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제, 시키메이트 데하이드로게나제 또는 퀴네이트/시키메이트 데하이드로게나제, 시키메이트 키나제, 3-포스포시키메이트-1-카복시비닐트랜스퍼라제 및 코리스메이트 신타제로부터 선택된 효소를 암호화하는 방법.
  46. 청구항 36에 있어서,
    하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 방법.
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