CN106062178B - 具有增加的碳通量效率的方法和生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基‑CoA合成酶或转移酶的第一衰减以及琥珀酰基‑CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基‑CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。

Description

具有增加的碳通量效率的方法和生物
发明背景
本发明提供了非天然存在的微生物，其具有通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量。本发明还提供使用该微生物减少通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。
通过过量CO2生产的碳损失可以来自中心代谢的三个主要路线：戊糖磷酸途径、乙醛酸支路和氧化三羧酸(TCA)循环。该戊糖磷酸途径的主要的CO2生成反应是磷酸葡萄糖脱氢酶。在该TCA循环和乙醛酸支路中可促成碳损失的酶包含，例如丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸氧化酶、α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和苹果酸酶。
碳损失也可以来自其他的代谢反应，其包含，例如甘氨酸裂解系统、甲酸氢裂解酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、乙酰乳酸合酶和2-氧代-4-甲基-3-羧基戊酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱羧酶和参与脂肪酸生物合成的酶。
因此，需要用于降低碳损失并提高碳通量效率的替代手段。本发明满足了这种需要，还具有相关的优点。
发明概述
本发明涉及一种非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。该琥珀酰基-CoA合成酶可以由sucCD编码。该琥珀酰基-CoA转化酶可以是YciA CoA水解酶这种酶。该微生物可以进一步包含吡啶核苷酸转氢酶的增加的表达，包含其中该吡啶核苷酸转氢酶由pntAB编码。该微生物还可以包含非琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的TCA循环酶的衰减。该微生物可以包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该生物衍生化合物可以是4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺或甲基丙烯酸或本文披露的其他化合物。本发明涉及用于提高生物衍生化合物的产量的其他遗传改变。
附图说明
图1示出了生成CO2的中心代谢途径，包含(1)该戊糖磷酸途径；(2)完全氧化的TCA循环；以及(3)该乙醛酸支路。缩写：Glc是葡萄糖，G6P是葡萄糖-6-磷酸，F6P是果糖-6-磷酸，FBP是果糖-1，6-双磷酸，G3P是甘油醛-3-磷酸，PEP是磷酸烯醇丙酮酸，Pyr是丙酮酸，cit是柠檬酸，Icit是异柠檬酸，AKG是α-酮戊二酸，Succ是琥珀酸，Fum是富马酸，Mal是苹果酸，OAA是草酰乙酸，6PGL是6-磷酸葡糖酸内酯，Ru5P是核酮糖-5-磷酸，E4P是赤藓糖-4-磷酸，S7P是景天庚酮糖-7-磷酸，以及Glx是乙醛酸。
发明详述
本发明提供非天然存在的微生物，其具有通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量，其中该微生物包含一种或多种遗传破损。本发明还提供使用该微生物减少通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。
如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本文提供的微生物使用时，意指该微生物具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性代谢多肽包含，例如将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的酶或蛋白质、三羧酸(TCA)循环酶、吡啶核苷酸转氢酶、NADH脱氢酶、泛醇氧化酶、甲基萘醌生物合成酶、甲基萘醇生物合成酶(menaquinol biosyntheticenzyme)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)以及生物衍生的产物生物合成途径内的酶或蛋白质。
代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的遗传修饰。本文披露了示例性代谢修饰。
本发明的该非天然存在的微生物可以包含稳定的遗传改变，这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物。一般地，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，以及更具体地，稳定的遗传修饰将超过50代，包括永久地。
如本文所用，当关于微生物使用时，术语“分离”意指当相关微生物在自然界中被发现时，基本上不含至少一种组分的生物。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。因此，当分离的微生物在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时，它部分或全部地从其他物质中分离。分离的微生物的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所用，术语“微生物”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞存在的生物。因此，该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。
关于具有参考的基因破坏或其他遗传改变的微生物使用时，亲本微生物或亲本的微生物被理解为是指这样的微生物或菌株，如果将该参考的基因破坏或其他遗传改变排除在比较之外，则其具有的基因型与具有该参考的基因破坏或其他遗传改变的微生物基本相似。因此，亲本微生物是指菌株的基本上相似的基因型，其中该参考的基因破坏或其他遗传改变被引入以生成修饰的生物。可以理解的是，亲本微生物可以例如，根据是否考虑单个或多个遗传改变，通过一种以上的遗传改变(基因添加和/或破坏)而不同。本领域的技术人员将很容易理解这样的亲本微生物的含义，因为该微生物被认为是用于观察一个或多个遗传改变的影响的，如本领域中所理解的，适当的对照物。
如本文所用，术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基(酶的非蛋白质部分)，它的存在为许多酶(脱辅基酶)的活性所需以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。
如本文所用，当关于培养或培育条件使用时，术语“基本上厌氧”意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10％。该术语还意在包括在小于约1％的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。
如本文所用，“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质，如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质(如质粒)被引入。因此，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物。当关于生物合成活性使用时，该术语指被引入宿主有关生物的活性。来源可以是例如，表达引入宿主微生物后有关活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指包含在微生物体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同的来源的分子或活性而“同源”指来自宿主微生物的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可以利用异源编码核酸和同源编码核酸的其一或两者。
理解的是，当微生物内包含一种以上的外源性核酸时，所述一种以上的外源性核酸指相关的编码核酸或者生物合成活性，如上文所讨论。进一步理解的是，如本文所披露，这类一种以上的外源性核酸可以被引入在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或者在其组合上的宿主微生物，并且仍然被看作是一种以上的外源性核酸。例如，如本文所披露，微生物可被设计以表达两种或者两种以上的编码所需的途径酶或者蛋白质的外源性核酸。在两种编码所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情况下，理解的是，该两种外源性核酸可以作为单一核酸被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上，可以被整合入位于单个位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种外源性核酸。同样，理解的是，两种以上的外源性核酸可以任何所需的组合形式被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上的宿主生物，可以被整合入位于单一位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种或者两种以上的外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，相关的外源性核酸或者生物合成活性的数量指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量，而非被引入宿主生物的单独的核酸的数量。
如本文所用，术语“基因破坏”或其语法上的等同物，意指使所编码的基因产物无活性或减弱的遗传改变。该遗传改变可以是，例如，整个基因的缺失、转录或翻译所需的调节序列的缺失、导致截短的基因产物的基因的一部分的缺失或者通过使所编码的基因产物失活或减弱的任何各种突变策略。基因破坏的一种特别有用的方法是完全的基因缺失，因为它减少或消除了本发明的该非天然存在的微生物中遗传回复的发生。基因破坏还包括无效突变，这指基因或包含基因的区域内导致该基因不被转录成RNA和/或翻译成功能性基因产物的突变。这类无效突变可以产生于许多类型的突变，包括，例如，失活点突变、基因的一部分的缺失、整个基因缺失或染色体片段的缺失。
如本文所用，术语“衰减(attenuation)”或其语法上的等同物意指使削弱、降低或减少酶或蛋白质的活性或量。如果酶或蛋白质的活性或量的衰减引起该活性或量下降到低于给定蛋白质或酶发挥功能所需的临界水平，则该衰减可以模拟完全破坏。然而，模拟一种反应的完全破坏的酶或蛋白质的活性或量的衰减仍能足以使单独的反应继续发挥功能。例如，内源性酶或蛋白质的衰减可以足以模拟相同的酶或蛋白质的完整破坏，以用于将琥珀酰基-CoA转化为本发明的琥珀酸或其他酶或蛋白质，但酶或蛋白质的其余活性或量仍能足以维持其他反应，如对宿主微生物生存、繁殖或生长有益的反应。酶或蛋白质的衰减也可以是按一定的量削弱、降低或减少该酶或蛋白质的活性或量，该量足以减少通过本发明的氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量或足以削弱、降低或减少本发明的其他酶或蛋白质的活性，但并不一定模拟该酶或蛋白质的完全破坏。
在基因破坏的情况下，一种特别有用的稳定的遗传改变是基因缺失。使用基因缺失来引入稳定的遗传改变对降低该遗传改变之前回复到表型的可能性是特别有用。例如，生物化学品的稳定的生长偶联生产可以，例如通过删除编码催化一组代谢修饰中的一个或多个反应的酶的基因得以实现。生物化学品的生长偶联生产的稳定性可以通过多种删除，显著降低每个受破坏的活性发生的多种补偿回复的可能性而得以进一步增强。
如本文所用，术语“琥珀酰基-CoA转化酶”是指识别作为底物的琥珀酰基-CoA并且可以将琥珀酰基-CoA转化为其相应的酸式琥珀酸盐的酶。琥珀酰基-CoA转化酶包含CoA水解酶、CoA转移酶和CoA合成酶。CoA水解酶在本领域中也被称为硫酯酶以及CoA合成酶在本领域中也被称为CoA酸-硫醇连接酶。示例性CoA水解酶包含乙酰基-CoA水解酶、琥珀酰基-CoA水解酶和YciA CoA水解酶。示例性CoA转移酶包括Cat1 CoA转移酶、AarC CoA转移酶和乙酰乙酰基-CoA转移酶。示例性CoA合成酶包括琥珀酸-CoA连接酶和琥珀酰基-CoA合成酶，如SucCD。本文中披露了各种其他示例性琥珀酰基-CoA转化酶。
如本文所用，术语“产琥珀酸酶”当关于在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的酶使用时，意在指在该途径之内催化该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化步骤的酶或在该途径之内催化该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化步骤上游的反应的酶。因此，产琥珀酸酶，若衰减，将导致在提及的多步骤途径之内琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化的减少或消除。示例性的具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径包含精氨酸降解、赖氨酸生物合成以及蛋氨酸生物合成途径。
如本文所用，术语“过量的CO2”意在指在如下反应中经由完全葡萄糖氧化产生的CO2：
C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O
相比之下，如本文使用，术语“过量的CO2”不意在指化学计量地伴随葡萄糖到本发明的生物衍生产品或此类代谢工程化生物合成途径的副产物的转化的CO2。使用1，4-丁二醇(1，4-BDO)时，例如，为了说明的目的，该术语并不意在指如下用于1，4-BDO的生物合成的反应中产生的CO2：
C6H12O6+1/2O2→C4H10O2+2CO2+H2O
过量的CO2百分比指代谢为过量的CO2的糖的百分比。
如本文所用，术语“生物基”指全部或部分地由本发明的生物衍生化合物组成的如上所述的产物。与生物基产物形成对照的是石油源产物，其中这样一种产物衍生自或合成自石油或石化原料。
如本文所用，术语“生物衍生的”意在指衍生自或合成自生物的靶分子或化学品。在本发明的情况下，代谢工程微生物被用于经由三羧酸(TCA)循环底物，如琥珀酰基-CoA，α-酮戊二酸(AKG)以及乙酰基-CoA，可选地进一步包含通过乙酰乙酰基-CoA和/或丙二酰基-CoA，以生物合成方式生产生物衍生化合物或其中间体。
本领域的技术人员会理解所述遗传改变(包括本文示例性的代谢修饰)是关于合适的宿主生物(如大肠杆菌)及其相应的代谢反应或所需的代谢途径的所需的遗传物质(如基因)的合适的来源生物描述的。然而，如果有各种各样的生物的完整的基因组测序和基因组学领域的高水平技能，本领域的技术人员将能够很容易地将本文提供的教诲和指导应用于基本上所有的其他生物。例如，本文示例性的大肠杆菌代谢改变可以通过纳入来自非相关物种的物种的相同或类似的编码核酸很容易地应用到其他物种。一般地，这类遗传改变包括例如，物种同系物的遗传改变，以及具体地，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。
直系同源是通过垂直传递相关且导致不同的生物内基本上相同或相似的功能的一种或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶因环氧化物水解的生物功能可以被认为是直系同源。例如，当基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过进化自共同的祖先相关时，所述基因通过垂直传递相关。如果基因共有足够量的三维结构但不一定共有序列相似性以表明它们进化自共同的祖先达到基本序列相似性无法识别的程度，也认为它们是直系同源。直系同源的基因可以编码具有约25％到100％氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25％的蛋白质的基因其三维结构也显示出相似性，则所述基因也可以被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶)被认为通过垂直传递产生自共同的祖先。
直系同源包括通过例如，进化在结构或整体活性方面趋异的基因或其编码基因产物。例如，当一种物种编码显示两种功能的基因产物以及当这类功能在第二个物种内已经分为不同的基因时，这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源。对于生化产品的生产，本领域的技术人员会理解含待引入或破坏的代谢活性的直系同源的基因将被选择用于该非天然存在的微生物的构建。显示各自活性的直系同源的例子是当两个或两个以上物种之间或一个单一物种内部不同的活性已经分为不同的基因产物的情况。具体的例子是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)分离为作为纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个例子是支原体5′-3′核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶其一或两者的直系同源，反之亦然。
相反，旁系同源是通过例如，复制然后进化趋异相关的同系物并具有相似或共同的，但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如，相同物种或源自不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源，因为它们代表两种不同的酶类，协同进化自共同的祖先，催化不同的反应并在相同的物种内具有不同的功能。旁系同源是来自彼此具有显著的序列相似性的相同物种的蛋白质，这表明它们是同源的或通过协同进化自共同的祖先而相关。旁系同源蛋白质家族的群体包括HipA同系物、荧光素酶基因、肽酶以及其他。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可以替代一种不同的物种内有关基因功能。替代包括例如，能够在起源物种内执行与所述不同的物种内所述有关功能相比基本上相同或相似的功能。虽然一般地，非直系同源基因置换可看作是与编码有关功能的已知基因结构相关，不过结构相关性差但功能相似的基因及其相应的基因产物仍然会如本文所用，落入所述术语的含义之内。功能相似性要求例如，与编码试图被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域具有至少一些结构相似性。因此，直系同源基因包括例如，旁系同源或不相关的基因。
因此，识别和构建具有通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量或具有本文披露的其他代谢修饰的本发明的该非天然存在的微生物时，本领域的技术人员会将本文提供的教诲和指导应用于特定的物种并会理解代谢修饰的识别可以包括直系同源的识别和包含或灭活。如果编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置换存在于参照微生物内，本领域的技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。类似地，对于基因破坏，在宿主微生物中进化上相关的基因也可以被破坏或删除，以减少或消除靶向破坏的酶活性的功能冗余。
直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，对两种多肽的核酸或氨基酸序列的检验将揭示所比较的序列之间的序列同一性和相似性。基于这种相似性，本领域的技术人员可以确定相似性是否足够高以表明蛋白质是通过进化自共同的祖先而相关的。本领域的技术人员熟知的算法(如Align、BLAST、Clustal W以及其他)比较并确定原始序列相似性或同一性，以及还确定序列内空隙的存在或大小，其可以被赋予权数或得分。这类算法在本领域也已知并同样适用于确定核苷酸序列的相似性或同一性。足够的相似性以确定相关性的参数的计算基于熟知的用于计算统计相似性的方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及确定的所述匹配的程度。如果需要，两个或两个以上序列的计算机对比还可以由本领域的技术人员进行可视优化。相关的基因产物或蛋白质应该具有高度的相似性，例如，25％到100％的序列同一性。不相关的蛋白质可以具有同一性，所述同一性基本上与预计将发生的几率相同，如果扫描一个具有相当规模的数据库(约5％)。5％到24％之间的序列可代表或不代表足以得出所比较的序列具有相关性的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下，可以进行额外的确定这种匹配的程度的统计分析，以确定这些序列的相关性。
用于使用例如，所述BLAST算法确定两个或两个以上序列的相关性的示例性参数可以如下文描述。简言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年1月5日)以及以下参数执行：矩阵：0BLOSUM 62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：3；过滤器：开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(1998年9月16日)以及以下参数执行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸：2；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：11；过滤器：关。本领域的技术人员会知道对以上参数作何修改会例如，增加或减少比较的严格性，以及确定两个或两个以上序列的相关性。
本文一般地参照代谢反应、反应物或其产物，或者具体地参照一种或多种编码酶(所述酶与所参照的代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的代谢反应、反应物或产物)的核酸或基因对本发明进行描述。除非本文另有明确规定，本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样，除非本文另有明确规定，对反应物或产物的参照也是对反应的参照以及对任何这些代谢组分的参照也是参照一种或者多种的编码酶或蛋白质的基因，所述酶催化所参照的反应、反应物或产物以及所述蛋白质包含在所参照的反应、反应物或产物中。同样地，考虑到熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应；或者与所述反应，以及所述反应的反应物和产物相关的蛋白质的参照。
本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减或转移酶以及琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。该衰减可以是基因破坏。该琥珀酰基-CeA合成酶或转移酶由表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因或与表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因具有至少70％同一性的直系同源物编码。
微生物经代谢工程化以合成碳基目标产品或如本文中所提到的生物衍生化合物的收率可以通过将损失的碳作为代谢副产物还原为过量的CO2得以提高。可用于还原过量的CO2副产物的一个代谢路径是三羧酸(TCA)循环。在该TCA循环中进行干预的有用的点在于由琥珀酰基-CoA合成酶催化的琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。因此，减少通过氧化的TCA循环的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量提供了有用的益处。
例如，琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化的衰减导致在该TCA循环以及乙醛酸支路的后续代谢步骤中由酶(包含，例如苹果酸酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶以及丙酮酸氧化酶)产生的过量的CO2副产物的减少。附加地，琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化的衰减还经由通过该氧化TCA循环的重复几轮的碳通量的减少而导致过量的CO2副产物的减少。将损失的碳作为代谢副产物还原为过量的CO2提高了碳基生物衍生化合物的生产收率，因为这提高了生物合成可用碳的量。更大的碳可用性可以提高微生物之内从所有的代谢工程化途径生物合成生物基化合物的收率，包含依赖于TCA循环底物的工程化途径以及那些不依赖于TCA循环底物的工程化途径。在生物衍生化合物利用TCA循环中间体或琥珀酸上游的底物的情况下，该TCA循环之内该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化的衰减还减少了进入上游TCA循环中间体的碳的量，从而增加了进入生物衍生的目标化合物的碳通量的量。
在一种实施方式中，本发明的微生物包含两种不同的琥珀酰募-CoA转化酶的衰减。一种衰减包含琥珀酰基-CoA合成酶。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性的减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
琥珀酰基-CoA合成酶在微生物中无处不在。例如，形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶催化该TCA循环之内琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。因此，琥珀酰基-CoA合成酶的衰减将碳损失还原为CO2副产物并提高了生物衍生的产物收率。示例性的形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶由大肠杆菌的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因(Buck等人，Biochemistry 24：6245-6252(1985))编码。类似的酶被发现于结核分支杆菌、智人、布氏锥虫以及阴道滴虫中。用于本发明的这类形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶的示例性基因在表1中总结如下。
表1.示例性的形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶
<u>蛋白质</u> <u>GenBank ID</u> <u>GI号</u> <u>生物</u>
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
sucC CCE36484.1 378544211 结核分支杆菌
sucD CCE36485.1 378544212 结核分支杆菌
SUCLA2 NP_003841.1 11321583 智人
SUCLG1 CAG33420.1 48146395 智人
Tb927.3.2230 XP_843817.1 72386785 布氏锥虫
Tbl0.6k15.3250 XP_822976.1 71747842 布氏锥虫
a-SCS2 AAC41558.1 538509 阴道滴虫
b-SCS AAA30326.1 162521 阴道滴虫
如下文进一步所述，在本发明的该微生物中，琥珀酰基-CoA合成酶而非形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶还可以作为琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减被衰减。这类琥珀酰基-CoA合成酶而非形成ADP的合成酶被示范于下文的表11以及与其相关的说明中。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物，其中第一衰减包含琥珀酰基-CoA合成酶。该琥珀酰基-CoA合成酶可以是包含，例如sucCD的形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶或它可以是非形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶，如形成GDP的琥珀酰基-CoA合成酶；或它可以是如本文所述的具有琥珀酰基-CoA活性的另一种CoA合成酶。
本发明的该微生物还可以包含琥珀酰基-CoA转化酶的第二衰减。本发明的微生物中的该第二衰减可以是对应于该第一衰减的琥珀酰基-CoA转化酶而非该琥珀酰基-CoA合成酶。因此，本发明的微生物中的第一以及第二衰减对应于不同的蛋白质或酶。该第一衰减涉及对应于琥珀酰基-CoA合成酶的琥珀酰基-CoA转化酶而该第二衰减涉及不同的琥珀酰基-CoA转化酶。该第二不同的琥珀酰基-CoA转化酶可以是不同于对应于该第一衰减的该琥珀酰基-CoA合成酶的琥珀酰基-CoA合成酶或它可以是如本文所述的CoA水解酶或CoA转移酶。
然而不受限于理论，在酶活性被破坏的微生物宿主中，一种或多种内源性酶可以补偿受破坏的酶活性。例如，琥珀酰基-CoA合成酶(SucCD)活性不足的微生物宿主仍然能够经由其他内源性酶将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸。能够将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的内源性CoA水解酶、CoA转移酶或CoA合成酶的删除可以进一步减少琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化，包含在sucCD-破坏的宿主生物中完全TCA循环通量的减少，从而减少呼吸作用以及过量的CO2副产物的生成。
有各种将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的内源性酶，其可以经破坏用于减少琥珀酸合成以及减少CO2副产物的产生。例如，琥珀酰基-CoA到琥珀酸的单步骤转化由CoA合成酶、CoA转移酶以及CoA水解酶催化。该琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化可以是该酶的主要生理功能，大肠杆菌琥珀酰基-CoA合成酶(sucCD)的情况一样；或者它可以是次要活性。任何这些酶，单独或结合其他琥珀酰基-CoA转化酶的编码基因可以经破坏以使该TCA循环衰减以及减少本发明的微生物中CO2副产物的产生。下文进一步描述了对应于编码琥珀酰基-CoA转化酶的基因，适用于用作本发明的该微生物中的第二衰减的示例性CoA水解酶、CoA-转移酶以及CoA合成酶。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
CoA水解酶或硫酯酶在酶类EC 3.1.2(包含琥珀酰基-CoA水解酶)中，以及将酰基-CoA分子水解为其相应的酸类。这类CoA水解酶可以作为编码琥珀酰基-CoA转化酶的基因的第二衰减被包含在本发明的微生物中。
几种CoA水解酶可作用于琥珀酰基-CoA，包含乙酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)、棕榈酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)、琥珀酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.3)以及酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。还将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的其他乙酰基-CoA水解酶包含来自褐鼠大脑的acot12(Robinson等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.71：959-965(1976))以及来自绵羊和豌豆的酶(Zeiher等人，Plant.Physiol.94：20-27(1990)；Snoswell和Tubbs，Biochem J 171(2)：299-303(1978))。人过氧化物酶体酰基-CoA硫酯酶ACOT4催化琥珀酰基-CoA的水解(Hunt等人，FASEB J20：1855-64(2006)；Westin等人，J Biol Chem 280：38125-32(2005))。具有琥珀酰基-CoA水解酶活性的还有另一种酶是绿脓假单胞菌的PA5202酶(Gonzalez等人，Biochem J 445-455(2012))。示例性CoA水解酶在表2中总结如下。
表2.示例性CoA水解酶
Figure BDA0001066214540000111
Figure BDA0001066214540000121
该yci基因编码CoA水解酶以及已经显示水解一系列的酰基-CoA底物，包含如本文所述的乙酰基-CoA、丁酰募-CoA、癸酰募-CoA以及棕榈酰基-CoA以及琥珀酰基-CoA(还参见，例如Zhuang等人，Biochem47：2789-96(2008))。在本发明的一个实施方式中，具有由yciA编码的蛋白质的衰减的微生物显示在该TCA循环之内琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化的减少，证实了YciA具有琥珀酰基-CoA活性。示例性的具有琥珀酰基-CoA水解酶活性的YciA酶包含大肠杆菌以及流感嗜血杆菌的yciA。示例性琥珀酰基-CoA水解酶在表3中总结如下。
表3.示例性CoA水解酶
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
yciA YP_005828226.1 386264733 流感嗜血杆菌
yciA NP_415769.1 16129214 大肠杆菌
如下文进一步所述，YciA CoA水解酶的该琥珀酰基-CoA水解酶活性被观察到基本上减少了还具有第二琥珀酰基-CoA转化酶的衰减的生物中琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。如本文中披露，虽然编码将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的该TCA循环酶琥珀酰基-CoA合成酶(sucCD)的基因的基因破坏导致了琥珀酸产量的减少，由yciA编码的蛋白质的进一步衰减导致了从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的产量的大量且非加和性减少。相反，还对乙酰基-CoA具有活性的其他水解酶的衰减已经收获不同的结果。
与广泛的酰基-CoA底物反应的酶还可以作用于琥珀酰募-CoA。例如，除了与琥珀酰基-CoA反应之外，由来自褐鼠大脑的acot12编码的酶(Robinson等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.71：959-965(1976))还可以与丁酰基-CoA、己酰基-CoA以及丙二酰基-CoA反应，表明对中链和/或长链硫酯具有活性的CoA水解酶可以作用于琥珀酰基-CoA。在这方面，由acot8编码的人二羧酸硫酯酶显示出对戊二酰基-CoA、己二酰基-CoA、环庚基-CoA、癸二酰基-CoA以及癸基二酰基-CoA的活性(Westin等人，J.Biol.Chem.280：38125-38132(2005))。这种酶的最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解一系列的中链以及长链CoA硫酯(Naggert等人，J Biol Chem 266：11044-11050(1991))。类似的酶还被表征在大鼠肝脏中(Deana R.，Biochem Int 26：767-773(1992))。大肠杆菌中具有CoA水解酶活性的附加的酶包含bioH、entH、fadM、frsA、paaI、tesA、tesC、ybaW、ybfF ybhC、ydiI、yeiG、yigI、yiiD、yjfP、yjjU、ypfH、yqiA、ybgC以及ybdB(Kuznetsova，等人，FEMS MicrobiolRev，2005，29(2)：263-279；Song等人，J Biol Chem，2006，281(16)：11028-38；Guo等人，Biochemistry 48：1712-1722(2009))。将棕榈酰基-CoA用作该酰基-CoA底物在高通量筛选中确认上文大肠杆菌酶的大部分(Kuznetsova等人，如上)。
来自酿酒酵母的乙酰基-CoA水解酶ACH1表示另一种候选水解酶(Buu等人，J.Biol.Che例.278：17203-17209(2003))。具有酰基-CoA水解酶活性的附加的酶包含结核分支杆菌的该棕榈酰基-CoA水解酶(Wang等人，Chem.Biol.14：543-551(2007))。另一种示例性CoA水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过位点定向诱变被转换为对戊二酰募-CoA、乙酰基-CoA以及3-丁烯酰基-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶(Mack等人，FEBS.Lett.405：209-212(1997))。示例性CoA水解酶在表4中总结如下。那些具有琥珀酰基-CoA水解酶活性的CoA水解酶可应用为本发明的琥珀酰基-CoA转化酶以及可以因此靶向用于衰减。附加的CoA水解酶可以通过与本文所述的任何候选CoA水解酶的序列相似性得以确认。
表4.示例性CoA水解酶
Figure BDA0001066214540000131
Figure BDA0001066214540000141
CoA转移酶(包含琥珀酰基-CoA转移酶)催化CoA部分从酰基-CoA到羧酸接受体的可逆转移。如下表5中所列的EC类中的CoA转移酶已经显示催化琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。
表5.示例性CoA转移酶
EC号 酶名称
2.8.3.2 草酸CoA-转移酶
2.8.3.5 3-酮酸CoA-转移酶
2.8.3.6 3-氧代己二酸CoA-转移酶
2.8.3.7 琥珀酸-柠苹酸CoA-转移酶
2.8.3.8 乙酸CoA-转移酶
2.8.3.13 琥珀酸：羟甲基戊二酸CoA转移酶
2.8.3.15 琥珀酰基-CoA：苯甲基琥珀酸CoA转移酶
2.8.3.16 甲酰基-CoA转移酶
例如，克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物已显示分别展示出琥珀酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA和丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A 105：2128-2133(2008)；Sohling等人，J Bacteriol.178：871-880(1996))。琥珀酰基-CoA转移酶活性还存在于阴道滴虫、布氏锥虫、氨基丁酸梭菌以及牙龈红棕色单胞菌中(Riviere等人，J.Biol.Chem.279：45337-45346(2004)；van Grinsven等人，J.Biol.Chem.283：1411-1418(2008))。醋化酯杆菌使用琥珀酰基-CoA：乙酸CoA转移酶来完成其不寻常的TCA循环(Mullins等人JBacteriol 190：4933-40(2008))。示例性琥珀酰基-CoA转移酶在表6中总结如下。
表6.示例性CoA转移酶
Figure BDA0001066214540000142
Figure BDA0001066214540000151
其他转移酶还可以显示出琥珀酰基-CoA转移酶活性以及适用于作为本发明的琥珀酰基-CoA轮化酶的衰减靶向。例如，将乙酰基-CoA用作CoA供体的脂肪酰基-CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)以及atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰基-CoA转移酶(Korolev等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58：2116-2121(2002)；Vanderwinkel等人，33：902-908(1968))。对于链长C3-C6的底物，这种酶具有广泛的底物范围(Sramek等人，Arch Biochem Biophys 171：14-26(1975))以及已经显示将CoA部分从各种支链和直链3-氧代以及酰基-CoA底物转移至乙酸(Matthies等人，Appl Environ.Microbiol 58：1435-1439(1992)；(Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.33：902-908(1968；Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.33：902-908(1968))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Duncan等人，68：5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人，Appl Environ Microbiol 56：1576-1583(1990)；Wiesenborn等人，Appl EnvironMicrobiol 55：323-329(1989))和糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人，Biosci.BiotechnolBiochem.71：58-68(2007))中。这些示例性CoA转移酶适用于衰减为本发明的琥珀酰基-CoA转化酶。示例性CoA转移酶在表7中总结如下。
表7.示例性CoA转移酶
基因 GI# 登录号 生物
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
actA 62391407 YP_226809.1 谷氨酸棒杆菌
cg0592 62389399 YP_224801.1 谷氨酸棒杆菌
ctfA 15004866 NP_149326.1 丙酮丁醇梭菌
ctfB 15004867 NP_149327.1 丙酮丁醇梭菌
ctfA 31075384 AAP42564.1 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB 31075385 AAP42565.1 糖乙酸多丁醇梭菌
YgfH编码大肠杆菌中的丙酰基CoA：琥珀酸CoA转移酶(Haller等人，Biochemistry，39(16)4622-4629)。接近的同系物可以发现于，例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220、肠沙门氏菌亚种血清亚利桑那菌，以及中间耶尔森氏菌ATCC29909中。这些蛋白质确认如下。大肠杆菌(yfdW)以及产甲酸草酸杆菌(frc)的甲酰基-CoA转移酶可以将琥珀酰基-CoA用作CoA供体(Sidhu等人，J Bacteriol 3378-81(1997)；Toyota等人，J Bacteriol190：7(2008))。大肠杆菌中可以催化琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化的其他CoA转移酶包含yfdW、yrdE、caiB以及ydiF。这类附加的示例性CoA转移酶适用于衰减为本发明的琥珀酰基-CoA转化酶。示例性CoA转移酶在表8中总结如下。
表8.示例性CoA转移酶
<u>蛋白质</u> <u>GenBank ID</u> <u>GI号</u> <u>生物</u>
ygfH NP_417395.1 16130821 大肠杆菌
CIT292_04485 ZP_03838384.1 227334728 杨氏柠檬酸杆菌
SARI_04582 YP_001573497.1 161506385 肠沙门氏菌
yinte0001_14430 ZP_04635364.1 238791727 中间耶尔森氏菌
frc O06644 21542067 产甲酸草酸杆菌
yfdW NP_416875.1 16130306 大肠杆菌
yfdE NP_416872.4 162135906 大肠杆菌
caiB NP 414580.1 16128032 大肠杆菌
ydiF NP_416209.1 16129650 大肠杆菌
琥珀酰基-CoA：3：酮酸-CoA转移酶(SCOT)酶还催化琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。这类酶由恶臭假单胞菌中的pcaI以及pcaJ编码(Kaschabek等人，J Bacteriol.184：207-215(2002))。类似的酶被发现于不动杆菌属ADP1(Kowalchuk等人，Gene 146：23-30(1994))、天蓝色链霉菌以及克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)(以前是属B13)(Gobel等人，JBacteriol.184：216-223(2002)；Kaschabek等人，J Bacteriol.184：207-215(2002))中。附加的示例性琥珀酰基-CoA：3：酮酸-CoA转移酶已经被表征在幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人，J Biol.Chem.272：25659-25667(1997))，枯草芽孢杆菌(Stols等人，Protein Expr.Purif.53：396-403(2007))、野猪以及智人(Fukao，T.，等人，Genomics68：144-151(2000)；Tanaka，H.，等人，Mol Hum Reprod 8：16-23(2002))中。因此，这些示例性CoA转移酶适用于衰减为本发明的琥珀酰基-CoA转化酶。示例性CoA转移酶在表9中总结如下。
表9.示例性CoA转移酶
Figure BDA0001066214540000161
Figure BDA0001066214540000171
许多转移酶具有广泛的特异性并因此可以将多样的，尤其是乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2-甲基乙酰乙酸、3-酮己酸、3-酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3-巯基丙酸、丙酸、乙烯基乙酸、丁酸用作CoA接受体。例如，来自肠罗斯氏菌属A2-183的酶显示具有丁酰基-CoA：乙酸：CoA转移酶以及丙酰基-CoA：乙酸：CoA转移酶活性(Charrier等人，Microbiology 152，179-185(2006))。接近的同系物可以发现于，例如肠罗斯氏菌L1-82、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)DSM 16841、直肠真杆菌ATCC 33656中。具有丙酰基-CoA转移酶活性的另一种酶可以发现于丙酸梭菌中(Selmer等人，Eur J Biochem 269，372-380(2002))。这种酶可以将乙酸、(R)-乳酸、(S)-乳酸、丙烯酸以及丁酸用作CoA接受体(Selmer等人，Eur J Biochem 269，372-380(2002)；Schweiger和Buckel，FEBS Letters，171(1)79-84(1984))。接近的同系物可以发现于，例如诺氏梭菌NT、拜氏梭菌NCIMB 8052和肉毒杆菌C菌株Eklund中。YgfH编码大肠杆菌中的丙酰基CoA：琥珀酸CoA转移酶(Haller等人，Biochemistry，39(16)4622-4629)。接近的同系物可以发现于，例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220、肠沙门氏菌亚种血清亚利桑那菌，以及中间耶尔森氏菌ATCC 29909中。具有琥珀酰基-CoA转移酶活性的那些CoA转移酶可适用为本发明的琥珀酰基-CoA转化酶并因此可以靶向用于衰减。示例性CoA转移酶在表10中总结如下。
表10.示例性CoA转移酶
<u>蛋白质</u> <u>GenBank ID</u> <u>GI号</u> <u>生物</u>
Ach1 AAX19660.1 60396828 肠罗斯氏菌属A2-183
ROSINTL182_07121 ZP_04743841.2 257413684 肠罗斯氏菌
ROSEINA2194_03642 ZP_03755203.1 225377982 肠罗斯氏菌inulinivorans
EUBREC_3075 YP_002938937.1 238925420 直肠真杆菌
pct CAB77207.1 7242549 丙酸梭菌
NT01CX_2372 YP_878445.1 118444712 诺氏梭菌NT
Cbei_4543 YP_001311608.1 150019354 拜氏梭菌
CBC_A0889 ZP_02621218.1 168186583 肉毒杆菌
CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶出现在6.2.1酶类(包含琥珀酰基-CoA合成酶)中，以及催化酰基-CoA底物到其酸产物的转化。如前所述，在本发明的微生物中，编码CoA合成酶的基因可以被用作对应于琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减或对应于琥珀酰基-CoA转化酶的第二衰减。描述了适用于在本发明的微生物中衰减的示例性CoA合成酶(见表1以及相应的说明)。下文描述了适用于在本发明的微生物中衰减的其他示例性CoA合成酶。
将ATP或GTP转化为ADP或GDP的CoA合成酶是可逆的以及可以催化琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化。AMP形成酶催化酸到酰基-CoA的活化。用于将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的CoA合成酶包含琥珀酸-CoA连接酶(形成GDP，EC 6.2.1.4)、琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP，EC6.2.1.5)以及乙酸-CoA连接酶(形成ADP，EC 6.2.1.13)。
用于衰减为琥珀酰基-CoA合成酶或为琥珀酰基-CoA转化酶的另一种适用的CoA合成酶包含形成ADP的乙酰基-CoA合成酶(ACD，EC 6.2.1.13)。这种CoA合成酶是一种将酰基-CoA酯类到其相应的酸类的转化与伴随的ATP的合成进行偶联的酶。
形成ADP的琥珀酰基-CoA合成酶在本文中有示范(见表1以及相应的说明)。简言之，这些琥珀酰基-CoA合成酶由大肠杆菌的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码以及类似的酶被发现于结核分支杆菌、智人、布氏锥虫以及阴道滴虫中(表1)。这些CoA合成酶适用于衰减为本发明的琥珀酰基-CoA合成酶或为琥珀酰基-CoA转化酶。
具有广泛的底物特异性的CoA合成酶还可以作用于琥珀酰基-CoA。例如，来自闪烁古生球菌的由AF1211编码的ACD I已经显示作用于各种直链以及支链底物，包含异丁酸、异戊酸和富马酸(Musfeldt等人，J Bacteriol.184：636-644(2002))。闪烁古生球菌中由AF1983编码的第二可逆ACD还显示具有广泛的底物范围(Musfeldt和Schonheit，JBacteriol.184：636-644(2002))。来自超嗜热泉古菌需氧热棒菌的由PAE3250编码的ACD显示出与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA(优选的底物)以及苯基乙酰基-CoA反应的所有被表征的ACD的最广泛的底物范围(Brasen等人，Arch Microbiol 182：277-287(2004))。定向进化或工程可以被用来修饰这种酶以在宿主生物的生理温度下起作用。来自死海盐盒菌的酶(注释为琥珀酰基-CoA合成酶)接受，例如丙酸、丁酸以及支链酸类(异戊酸以及异丁酸)作为底物，以及显示显示按向前和逆向方向运行(Brasen等人，Arch Microbiol 182：277-287(2004))。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及需氧热棒菌的酶均已被克隆，功能表达以及表征于大肠杆菌(Brasen和Schonheit，同上；Musfeldt和Schonheit，JBacteriol.184：636-644(2002))。来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶已被证实作用于几种脂肪族底物，包含乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸以及辛酸类以及作用于芳香族化合物，如苯乙酸和苯氧乙酸类(Fernandez-Valverde等人，Appl.Environ.Microbiol.59：1149-1154(1993))。来自豌豆根瘤菌的一种相关的酶丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)能够将几种二酸，即乙基-、丙基-、烯丙基-、异丙基-、二甲基-、环丙基、环丙基亚甲基-、环丁基-和苯甲基丙二酸转化为其相应的一硫代酯类(Pohl等人，J.Am.Chem.Soc.123：5822-5823(2001))。示例性CoA合成酶在表11中总结如下。具有琥珀酰基-CoA合成酶活性的那些CoA合成酶可适用为本发明的琥珀酰基-CoA合成酶或琥珀酰基-CoA转化酶以及可以因此靶向用于衰减。
表11.示例性CoA合成酶
<u>蛋白质</u> <u>GenBank ID</u> <u>GI号</u> <u>生物</u>
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 需氧热棒菌菌株IM2
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豌豆根瘤菌
多步骤代谢途径而非该TCA循环还可以靶向用于琥珀酰基-CoA转化酶的衰减以导致从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量减少。例如，虽然CoA水解酶、转移酶以及合成酶在单个酶催步骤中将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸，但是本领域的技术人员将理解的是，其他多个酶代谢途径还可以催化这种净反应。可以被用于在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的衰减的示例性多步骤途径包含：(1)精氨酸降解，(2)赖氨酸生物合成，以及(3)蛋氨酸生物合成途径。该琥珀酰基-CoA到琥珀酸的反应的净化学计量如下文表12中所示。
表12.多步骤途径中琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净化学计量
Figure BDA0001066214540000191
与本文披露的所有的其他衰减一样，在多步骤途径之内产琥珀酸酶的衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
在上文示例性多步骤途径之内的该产琥珀酸酶包含在每个途径之内催化该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化步骤的酶以及在该途径之内催化该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化步骤上游的将阻止下游形成琥珀酸的反应的任何酶。有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解的是，在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的众多其他多步骤途径之内的酶还可以靶向用于衰减以减少从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量。这类酶包含，例如，将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的那些途径酶以及在该琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化步骤上游，若衰减，将导致该多步骤途径内下游琥珀酸的损失或消除的那些酶。
本发明的非天然存在的微生物包含编码琥珀酰基-CoA转化酶的基因或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。因此，在本实施方式中，该非天然存在的微生物可以包含琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的超过一种的第二衰减。对两种或更多第二衰减的包含可以进一步减少通过氧化的TCA循环的碳通量，从而附加地减少CO2副产物形成。因此，本发明的微生物可以包含编码琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多第二衰减。有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解有多少以及哪一种第二衰减对于特定的应用有用。
因此，本发明进一步提供一种具有第一以及至少第二衰减的非天然存在的微生物。该第一衰减可以是琥珀酰基-CoA合成酶以及该琥珀酰基-CoA合成酶可以，例如，由sucCD编码。该第一衰减还可以是琥珀酰基-CoA转移酶。该第一衰减还可以是由表1或11中所列的基因编码的琥珀酰基-CoA合成酶。该第一衰减还可以是由表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因编码的琥珀酰基-CoA合成酶或琥珀酰基-CoA转移酶。该至少第二衰减可以是在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶。该至少第二衰减可以是由表1-11中所列的基因编码的CoA水解酶、CoA转移酶或CoA合成酶或该至少第二衰减可以是表12种所列的一种或多种产琥珀酸酶。该至少第二衰减可以是由该基因yciA编码的YciA CoA水解酶。该至少第二衰减可以是两种或更多，包含若干到许多琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶。
本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有编码琥珀酰基-CoA合成酶的基因的第一衰减以及编码在多步骤途径之内的琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减，其中经由氧化三羧酸(TCA)途径的琥珀酸产量的水平相比没有该第二衰减的微生物，被减少了25％或更多。本领域的技术人员理解的是，没有该第二衰减的微生物指缺乏该第二衰减的遗传修饰的微生物，以及活性可以媲美这类缺乏该第二衰减的遗传修饰的生物。
如前所述，琥珀酰基-CoA合成酶以及编码，例如琥珀酰基-CoA转化酶的至少第二基因的衰减均导致相比单独具有琥珀酰基-CoA合成酶的衰减的生物，经由氧化的TCA途径的琥珀酸产量的大量且非加和性减少。经由氧化TCA的琥珀酸产量的减少可以是，例如20％或更多，包含25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的减少。因此，本发明的微生物可以具有相比没有第二衰减的微生物，减少了25％或更多的琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性的水平。该琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性可以被减少了，例如20％或更多，包含25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的减少。进一步地，本发明的微生物可以具有相比没有所述第二衰减的微生物，减少了25％或更多的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的13C通量水平。该从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的13C通量可以被减少了，例如20％或更多，包含25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的减少。
琥珀酰基-CoA合成酶以及编码，例如琥珀酰基-CoA转化酶的至少第二基因的破坏均还导致相比单独具有琥珀酰基-CoA合成酶的衰减的生物，经由氧化的TCA产生的过量的CO2的减少。经由氧化的TCA产生的过量的CO2的减少相比没有第二衰减的微生物可以是，例如10％或更多。如前所述，过量的CO2的减少便于更多的碳通量进入生物衍生化合物的生产以及，因此获得更大收率的这类生物衍生化合物。因此，经由氧化的TCA的过量的CO2产生的减少可以是，例如15％或更多，包含20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的减少。
以类似的方式，琥珀酰基-CoA合成酶以及编码，例如琥珀酰基-CoA转化酶的至少第二基因的破坏均附加地导致相比单独具有琥珀酰基-CoA合成酶的衰减的生物，每个细胞的氧利用率的减少。该每个细胞的氧利用率的减少相比没有第二衰减的微生物可以是，例如10％或更多。该微生物的氧利用率的减少对微-厌氧以及厌氧培养条件中生物衍生化合物的生产是有用的。因此，每个细胞对氧(O2)的利用率的减少可以是，例如15％或更多，包含20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的减少。
因此，本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或在多步骤途径之内的产琥珀酸酶的至少第二衰减，其中经由氧化的TCA的过量的CO2的水平相比没有该第二衰减的微生物(即相比具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减的亲本的微生物)，被减少了10％或更多。附加地，每个细胞的氧(O2)利用率的水平相比没有该第二衰减的微生物(即相比具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减的亲本的微生物)，被减少了10％或更多。
本发明附加地提供一种非天然存在的微生物，其具有吡啶核苷酸转氢酶的增加的表达(NAD(P)转氢酶)。该增加的表达可以是单独或结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如增加如本文所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中的NAD(P)转氢酶的表达。因此，本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减以及进一步包含增加的表达的NAD(P)转氢酶。该增加的表达可以是编码NAD(P)转氢酶的外源性核酸的表达。该增加的表达还可以包含，例如，上调转氢酶编码基因的表达或通过去除编码该转氢酶的基因的负向调节。上调的例子包含，例如修饰启动子以使其更有力，增加一个或多个核糖体结合位点的强度，取代更有力的启动子和/或可选地增加该基因的副本数。去除负向调节的例子包含修饰基因顺式调节元件或反式调节元件。该吡啶核苷酸转氢酶可以是质子-移位转氢酶。
在这方面，本发明的该非天然存在的微生物可以进一步包含增加该微生物中NAD(P)转氢酶的表达的一种或多种遗传修饰。NAD(P)转氢酶催化减少的当量在NAD(H)和NADP(H)之间的转移，与质子在膜上的移位偶联(Jackson，FEBS Letters 545：18(2003))。在本实施方式中，过量的CO2的产生通过减少通过氧化的TCA循环以及通过该戊糖磷酸途径的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量得以进一步减少。
可用于通过增加其在本发明的宿主微生物中的表达而减少过量的CO2的产生的一种NAD(P)转氢酶可以是该NAD(P)转氢酶PntAB或其同系物。PntAB或其他NAD(P)转氢酶的表达可以通过，例如内源性编码基因的过表达和/或外源性编码核酸的表达而发生。如下文进一步所述，各种其他用于增加内源性或外源性核酸的表达的方法也是可用的，包含，例如，掺入更有力的启动子和/或内源性编码核酸类、外源性编码核酸类或两者的正向调节元件。本领域的技术人员将领会的是，这类方法的一些或全部可以单独或结合使用以提高编码核酸的表达。可以发现来自大肠杆菌的pntA以及pntB的核苷酸以及氨基酸序列被描述于Clarke等人，158：647-653(1986)。
进一步提供了一种非天然存在的微生物，其具有TCA循环酶的衰减。该TCA循环酶的衰减可以单独或结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如，在如本文所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中编码TCA循环酶的内源性核酸的衰减。在后一个例子中，的TCA循环酶的衰减不同于该第一衰减和第二衰减。该衰减可以是在该TCA循环之内琥珀酰基-CoA合成酶的衰减。例如，该衰减可以是，例如，琥珀酸脱氢酶、富马酸酶以及苹果酸脱氢酶。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性的减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
本文所述的该遗传改变适用于起始于任何代谢中间体(包含，例如在该TCA循环之内的底物或中间体以及在其他代谢途径之内的底物或中间体)，对生物衍生化合物的微生物生产。因此，本文所述的该遗传改变适用于从琥珀酰基-CoA到琥珀酸产量的减少，过量的CO2的减少和O2利用率的减少以及如下文进一步所述，用于增加ATP可用性。例如，关于由TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物进行描述时，琥珀酰基-CoA合成酶的衰减仍然允许琥珀酰基-CoA上游的TCA中间体以及底物被用于生物衍生化合物的生产。如本文所述，琥珀酰基-CoA合成酶的衰减，单独或结合第二衰减琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶减少了进入下游TCA循环中间体的碳通量以及增加了可用于生物衍生化合物生物合成的碳通量。可用于生物衍生化合物合成的示例性TCA循环中间体包含α-酮戊二酸(AKG)以及琥珀酰基-CoA。示例性TCA循环底物包含乙酰基-CoA。
如本文所用，“TCA循环中间体，’指被用来通过乙酸的氧化而生成能量的九种TCA循环底物或产物的一种。这九种底物是柠檬酸、顺式-乌头酸、d-异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰基-CoA、琥珀酸、富马酸、苹果酸以及草酰乙酸。如本文所用，“TCA循环底物”指被用于该TCA循环的底物而非上文九种化合物。例如，乙酰基-CoA是TCA循环底物，因为它结合草酰乙酸以形成柠檬酸。
本发明的生物衍生化合物包含，但不限于醇类，乙二醇类、有机酸类、烯属烃类、二烯类、有机胺类、有机醛类、维生素类、营养保健品以及药品。适用于通过使用经代谢工程化以生物合成生物衍生化合物的本发明的微生物而合成的这些类型的生物衍生化合物之内的具体的生物衍生化合物包含，例如4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。因此，本发明附加地提供一种非天然存在的微生物，其具有用于从TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该生物衍生化合物可以是4HB、1，4-BDO、1，3-BDO、PHB、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。该微生物可以包括该代谢工程化途径，可选地结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如用于在如前所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中从TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。
在上述类型之内的还可适用于使用本发明的微生物而合成的其他生物衍生化合物示范如下。例如，本发明的醇类(包含生物燃料醇类)包含优选地具有C3到C10个碳原子的伯醇类、仲醇类、二醇类以及三醇类。醇类包含正丙醇以及异丙醇。生物燃料醇类是优选地C3-C10以及包含1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、1-戊醇、异戊烯醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲募-1-丁醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、1-庚醇、4-甲基-1-己醇、以及5-甲募-1-己醇。二醇包含丙烷二醇类以及丁二醇类，包含1，4丁二醇，1，3-丁二醇以及2，3-丁二醇。脂肪醇类包含C4-C27脂肪醇类，包含C12-C18，尤其是C12-C14，包含饱和的或不饱和的直链脂肪醇类。
本发明的进一步示例性生物衍生化合物包含：(a)1，4-丁二醇及其中间体，如4-羟基丁酸(4-羟基丁酸盐，4-羟基丁酸酯(4-HB))；(b)丁二烯(1，3-丁二烯)及其中间体，如1，4-丁二醇，1，3-丁二醇，2，3-丁二醇，巴豆基醇，3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)以及3-丁烯-1-醇；(c)1，3-丁二醇及其中间体，如3-羟基丁酸酯(3-HB)、2，4-戊二烯酸、巴豆基醇或3-丁烯-1-醇；(d)己二酸酯、6-氨基己酸(6-ACA)、己内酰胺、六亚甲基二胺(HMDA)以及乙酰丙酸及其中间体，例如己二酰基-CoA、4-氨基丁酰基-CoA；(e)甲基丙烯酸(2-甲基-2-丙烯酸)及其酯类，如甲基丙烯酸甲酯以及其他甲基丙烯酸酯酯类(统称为甲基丙烯酸酯类)、3-羟基异丁酸和/或2-羟基异丁酸及其中间体；(f)甘醇类，包含1，2-丙烷二醇(丙二醇)、1，3-丙烷二醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、新戊二醇以及双酚A及其中间体；(g)琥珀酸及其中间体；以及(H)脂肪醇类，其是含有一种或多种羟基基团以及4或更多个碳原子的链的脂肪族化合物；或脂肪酸类其脂肪醛类，其优选地是C4-C27个碳原子。脂肪醇类包含饱和的脂肪醇类、不饱和的脂肪醇类以及直链饱和的脂肪醇类。脂肪醇类的实例包含丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基以及十二烷基醇类；及其相应的氧化衍生物，即具有相同数目的碳原子的脂肪醛类或脂肪酸类。优选的脂肪醇类、脂肪醛类以及脂肪酸类具有C8到C18个碳原子，尤其是C12-C18、C12-C14，以及C16-C18，包含C12、C13、C14、C15、C16、C17、以及C18个碳原子。优选的脂肪醇类包含直链不饱和的脂肪醇类，如十二烷醇(C12；月桂醇)、十三烷醇(C13；1-十三醇、十三醇、异十三醇)、十四烷醇(C14；1-十四醇)、十五烷醇(C15；1-十五醇、十五醇)、十六醇(C16；1-十六烷醇)、十七醇(C17；1-n-十七烷醇、十七烷醇)以及十八醇(C18；1-十八烷醇)以及包含棕榈油醇(C16不饱和的；顺式-9-十六碳烯-1-醇)的不饱和的对应物；或其相应的脂肪醛类或脂肪酸类。
1，4-丁二醇及其中间体，如4-羟基丁酸(4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯、4-HB)是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2008年9月25日公开的标题为Compositions and Methods for the Biosynthesis of 1，4-Butanediol andIts Precursors的WO2008115840A2以及US20090075351；2010年12月9日公开的标题为Process of Separating Components of A Fermentation Broth的WO2010141780A1以及US20110003355；2010年12月9日公开的标题为Microorganisms for the Production of1，4-Butanediol and Related Methods的WO2010141920A2以及US20110045575；2010年3月18日公开的标题为Microorganismsfor the Production of 1，4-Butanediol的WO2010030711A2以及US20100112654；2010年6月24日公开的标题为Microorganisms andMethods for Conversion of Syngas and Other Carbon Sources to Useful Products的WO2010071697A1以及US20100304453；2009年7月30日公开的标题为Methods andOrganisms for Utilizing Synthesis Gas or Other Gaseous Carbon Sources andMethanol的WO2009094485A1以及US20090191593；以及2009年2月19日公开的标题为Methods and Organisms for the Growth-Coupled Production of1，4-Butanediol的WO2009023493A1以及US20090047719，其全部通过引用被并入本文。示例性BDO途径被描述于上述引用中以及可以包含，例如α-酮戊二酸脱氢酶以及CoA-依赖性琥珀半醛脱氢酶；或α-酮戊二酸脱羧酶；或谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶以及谷氨酸脱羧酶；4-羟基丁酸盐脱氢酶；4-羟基丁酰基-CoA：乙酰基-CoA转移酶；或丁酸激酶以及磷酸转丁酰酶、醛脱氢酶，以及醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶(见US 20090075351，其通过引用被并入本文)。
丁二烯及其中间体，如1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、1，3-丁二醇、巴豆基醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)以及3-丁烯-1-醇是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。除直接发酵以产生丁二烯之外，1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、巴豆基醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇可以经分离，纯化(用于任何用途)，然后通过基于金属的催化被化学脱水为丁二烯。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2011年11月10日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的WO2011140171A2以及US20110300597；2012年2月9日公开的标题为Microorganisms and Methods for theBiosynthesis of Aromatics，2，4-Pentadienoate and 1，3-Butadiene的WO2012018624A2以及US20120021478；2013年3月21日公开的标题为Microorganisms and Methods forProducing Alkenes 的WO2013040383A1以及US20130122563；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing Butadiene and Methods Related thereto的WO2012177710A1以及US20130011891；2012年8月9日公开的标题为Microorganisms andMethods for the Biosynthesis of Butadiene的WO2012106516A1以及US20120225466；以及2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for Producing 2，4-Pentadienoate，Butadiene，Propylene，1，3-Butanediol and Related Alcohols的WO2013028519A1以及US20130109064，其全部通过引用被并入本文。
1，3-丁二醇及其中间体，如2，4-戊二烯酸、巴豆基醇或3-丁烯-1-醇，是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2011年6月16日公开的标题为Methods and Organisms for Converting Synthesis Gas or Other Gaseous CarbonSources and Methanol to 1，3-Butanediol的WO2011071682A1以及US20110129904；2011年3月17日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Co-Production ofIsopropanol with Primary Alcohols，Diolsand Acids的WO2011031897A以及US20110201068；2010年11月4日公开的标题为Organisms for the Production of 1，3-Butanediol的WO2010127319A2以及US20100330635；2013年5月16日公开的标题为Eukaryotic Organisms and Methods for Increasing the Availability of CytosolicAcetyl-CoA，and for Producing 1，3-Butanediol的WO2013071226A1以及US20130066035；2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for Producing 2，4-Pentadienoate，Butadiene，Propylene，1，3-Butanediol and Related Alcohols的WO2013028519A1以及US 20130109064；2013年3月14日公开的标题为EukaryoticOrganisms and Methods for Producing 1，3-Butanediol的WO2013036764A1以及US20130066035；2013年1月24日公开的标题为Methods for Increasing Product Yields的WO2013012975A1；以及2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing1，3-Butanediol and Methods Related Thereto的WO2012177619A2以及US20120329113，其全部通过引用被并入本文。
己二酸酯、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺以及乙酰丙酸；及其中间体，如4-氨基丁酰基-CoA是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2010年11月11日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis ofAdipate，Hexamethylenediamine and 6-Aminocaproic Acid的WO2010129936A1以及US20120282661；2013年1月24日公开的标题为Methods for Increasing Product Yields的WO2013012975A1；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing6-Aminocaproic Acid的WO2012177721A1；2012年7月26日公开的标题为Methods forIncreasingProduct Yields的WO2012099621A1以及US20110201089；以及2009年12月17日公开的标题为Microorganisms for theProduction of Adipic Acid and otherCompounds的WO2009151728以及US20090305364，其全部通过引用被并入本文。
甲基丙烯酸(2-甲基-2-丙烯酸)被用于制备其酯类，统称为甲基丙烯酸酯类(如甲基丙烯酸甲酯，其最为显著地被用于聚合物的制造中)。甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类(如甲基丙烯酸甲酯)以及前体(如3-羟基异丁酸和/或2-羟基异丁酸)及其中间体是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2012年10月4日公开的标题为Microorganisms for Producing Methacrylic Acid and Methacrylate Esters andMethods Related Thereto的WO2012135789A2以及US20130065279；以及2009年11月5日公开的标题为Microorganisms for the Production of Methacrylic Acid的WO2009135074A2以及US20090275096，其全部通过引用被并入本文。
1，2-丙烷二醇(丙二醇)、正丙醇、1，3-丙烷二醇以及甘油；及其中间体是生物衍生化合物，其可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2009年11月9日公开的标题为Primary Alcohol Producing Organisms的WO2009111672A1以及US20090275097；2011年3月17日的标题为Microorganisms and Methods for the Co-Production ofIsopropanol with Primary Alcohols，Diols and Acids的WO2011031897A1以及US20110201068；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing N-Propanol 1，3-Propanediol，1，2-Propanediol or Glycerol and Methods RelatedThereto的WO2012177599A2，其全部通过引用被并入本文。
可用于生产产品(包含聚合物(如聚丁烯琥珀酸或PBS)、1，4-丁二醇、四氢呋喃、吡咯烷酮、溶剂、油漆、除冰剂、塑料、燃料添加剂、织物、地毯、颜料以及清洁剂)的琥珀酸及其中间体是可以经由本文所述的以及如下公开物中的酶催途径制成的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2008年7月2日公开的标题为Methods and Organisms for the Growth-Coupled Production ofSuccinate的EP1937821A2，2007年3月15日公开的标题为Methods and Organisms for theGrowth-coupled Production of Succinate的WO/2007/030830以及US20070111294，其全部通过引用被并入本文。本领域的技术人员理解的是，将琥珀酸作为所需产物生产可以适用于本发明的该微生物，如果需要，尤其是那些具有不导致琥珀酸产量减少的代谢修饰(例如，影响琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化的代谢修饰)的微生物。
包含脂肪酸类及其脂肪醛类的伯醇类以及脂肪醇类(还称为长链醇类)；及其中间体是生物衍生化合物，其可以经由如下公开物中的酶催途径制成。合适的生物衍生化合物途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于：2009年9月11日公开的标题为Primary Alcohol Producing Organisms的WO2009111672以及US20090275097；2012年12月27日公开的标题为Microorganism for Producing Primary Alcohols and RelatedCompounds and Methods Related Thereto的WO2012177726，其全部通过引用被并入本文。
本发明的该微生物可以被用来经由乙酰募-CoA(可选地包含进一步通过乙酰乙酰基-CoA和/或琥珀酰基-CoA)生产的进一步合适的生物衍生化合物被包含在本发明中。熟知的示例性生物衍生化合物，用于其生产的途径以及酶，用于筛选的方法以及用于分离的方法被发现于如下专利以及公开物：琥珀酸(美国公开2007/0111294、WO 2007/030830、WO2013/003432)、3-羟基丙酸(3-羟基丙酸酯)(美国公开2008/0199926、WO 2008/091627、美国公开2010/0021978)、1，4-丁二醇(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO 2009/023493、美国专利7858350、WO 2010/030711、美国公开2011/0003355、WO2010/141780、美国专利8129169、WO 2010/141920、美国公开2011/0201068、WO2011/031897、美国专利8377666、WO2011/047101、美国公开2011/0217742、WO 2011/066076、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、4-羟基丁酸(4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯)(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO 2009/023493、美国专利7858350、WO2010/030711、美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国专利8129155、WO 2010/071697)、γ-丁内酯(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO 2009/023493、美国专利7858350、WO 2010/030711、美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2011/0217742、WO 2011/066076)、4-羟基丁酰募-CoA(美国公开2011/0003355、WO2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、4-羟基丁醛(美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、腐胺(美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、烯烃类(如丙烯酸以及丙烯酸酯)(美国专利8026386、WO 2009/045637)、乙酰基-CoA(美国专利8323950、WO 2009/094485)、甲基四氢叶酸(美国专利8323950、WO 2009/094485)、乙醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、异丙醇(美国专利8129155、WO 2010/071697、美国公开2010/0323418、WO 2010/127303、美国公开2011/0201068、WO 2011/031897)、正丁醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、异丁醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、正丙醇(美国公开2011/0201068、WO 2011/031897)、甲基丙烯酸(甲基丙烯酸)(美国公开2011/0201068、WO2011/031897)、伯醇(美国专利7977084、WO2009/111672、WO 2012/177726)、长链醇(美国专利7977084、WO 2009/111672、WO 2012/177726)、己二酸(脂肪酸)(美国专利8062871、WO2009/151728、美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、6-氨基己酸酯(6-氨基己酸)(美国专利8062871、WO 2009/151728、美国专利8377680、WO 2010/129936、WO2012/177721)、己内酰胺(美国专利8062871、WO 2009/151728、美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、六亚甲基二胺(美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、乙酰丙酸(美国专利8377680、WO 2010/129936)、2-羟基异丁酸(2-羟基异丁酸)(美国专利8241877、WO 2009/135074、美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、3-羟基异丁酸(3-羟基异丁酸)(美国专利8241877、WO 2009/135074、美国公开2013/0065279、WO2012/135789)、甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)(美国专利8241877、WO 2009/135074、美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、甲基丙烯酸酯(美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、富马酸(延胡索酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、苹果酸(苹果酸酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、丙烯酸(羧酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、甲基乙基酮(美国公开2010/0184173、WO 2010/057022、美国专利8420375、WO 2010/144746)、2-丁醇(美国公开2010/0184173、WO 2010/057022、美国专利8420375、WO 2010/144746)、1，3-丁二醇(美国公开2010/0330635、WO 2010/127319、美国公开2011/0201068、WO 2011/031897、美国专利8268607、WO 2011/071682、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519、美国公开2013/0066035、WO 2013/036764)、环己酮(美国公开2011/0014668、WO 2010/132845)、对苯二甲酸盐(对苯二甲酸)(美国公开2011/0124911、WO 2011/017560、美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、粘康酸酯(粘康酸)(美国公开2011/0124911、WO 2011/017560)、苯胺(美国公开2011/0097767、WO 2011/050326)、对甲基苯甲酸酯(对甲基苯甲酸)(美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、乙二醇(美国公开2011/0312049、WO 2011/130378、WO 2012/177983)、丙烯(美国公开2011/0269204、WO2011/137198、美国公开2012/0329119、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、丁二烯(1，3-丁二烯)(美国公开2011/0300597、WO 2011/140171、美国公开2012/0021478、WO2012/018624、美国公开2012/0225466、WO 2012/106516、美国公开2013/0011891、WO 2012/177710、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、toluene(美国公开2012/0021478、WO2012/018624)、苯(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、(2-羟基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、苯甲酸酯(苯甲酸)(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、苯乙烯(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、2，4-戊二烯酸(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、3-丁烯-1-醇(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、3-丁烯-2-醇(美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、1，4-环己烷二甲醇(美国公开2012/0156740、WO 2012/082978)、巴豆基醇(美国公开2013/0011891、WO2012/177710、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、烯属烃(美国公开2013/0122563、WO 2013/040383)；或己内酯(美国公开2013/0144029、WO 2013/067432)途径。以上所列的披露了生物衍生化合物途径的专利以及专利申请公开物通过引用特此被并入本文。
本发明附加地提供一种非天然存在的微生物，其具有提高三磷酸腺苷(ATP)的可用性的遗传改变。提高ATP的可用性的该遗传改变可以是单独或结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如提高如前所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中的ATP的可用性的遗传改变。因此，本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减，以及进一步具有提高该微生物中的三磷酸腺苷(ATP)的可用性遗传改变。提高ATP的可用性的该遗传改变可以包含增加NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的表达。
催化该氧化的TCA循环中从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化的一种或多种基因的衰减由于能量或氧化还原限制，可以导致一些菌株背景(background)中生长速率的减小。这种生长缺陷可以通过提高ATP的可用性或改善该菌株的能量收率或能量效率的碳节约策略得以克服。这类策略包含，例如(1)使电子传递链工程化，以及(2)用生成ATP的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)取代或补充磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)。下文进一步详细地描述了每个策略。除了其在具有TCA循环酶的衰减的宿主微生物中的用途之外，这些遗传改变的每个还类似地适用于提高ATP或改善从非TCA循环中间体或底物的底物生成生物衍生化合物的宿主微生物的能量收率或能量效率。
在这方面，微生物的生长以及能量收率可以通过使电子传递链工程化得以改善以更高效地生产ATP。例如，大肠杆菌的呼吸链包含各种NADH脱氢酶。该NADH脱氢酶在该呼吸链的电子输入侧上包含Ndh-I、Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB。例如，大肠杆菌的呼吸链在该输出侧上还包含四种不同的泛醇氧化酶。该泛醇氧化酶包含细胞色素bo氧化酶、细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶(Bekker等人，JBacteriol 191：5510-17(2009))。该细胞色素氧化酶具有不同的节能效率。由cyo操纵子编码的细胞色素bo复合物积极地泵送电子越过膜并导致H+/2e-化学计量学为4。细胞色素bd-I复合物看起来没有积极地泵送质子，但是由于膜的周质侧上醌醇的氧化以及后续对来自膜的细胞质侧的被用于形成水的质子的摄取，净电子转移导致H+/2e-化学计量学为2。这种氧化酶由cyd操纵子编码。直到最近，由appBC编码的细胞色素bd-II氧化酶的质子移位化学计量学仍然未知，但是现在已有描述说，这种氧化酶是非生电的(Bekker等人，同上)。YgiN也是非生电的(Portnoy等人，AEM 74：7561-69(2008))。该NADH脱氢酶还具有不同的节能效率以及只有由nuo编码的Ndh-1移位质子。NADH脱氢酶I(nuo)以及由cyoABCDE编码的细胞色素bo氧化酶是这种链的最高效的组分，每种针对每对被转移的电子移位四个质子。当该电子传递链利用细胞色素氧化酶Cyo以及该NADH脱氢酶Nuo时，该呼吸链的能量效率是最大的。因此可以进行Cyo和/或Nuo的表达水平的优化以提高该电子传递链的效率以及生物的生长以及能量收率。
有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解的是，有各种不同的可以被用来提高该电子传递链的效率，从而提高细胞生长以及能量收率的方法。一种方法涉及增加NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)的表达和/或增加细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)的表达。表达可以通过，例如内源性编码基因的过表达和/或外源性编码核酸的表达得以提高。内源性基因的过表达包含，例如如本文所述的负向调节的上调以及去除。为了示范的目的而提及外源性编码核酸的表达时，可以被用来提高该电子传递链的效率的一种方法涉及表达编码NADH脱氢酶Ndh-I或细胞色素bo氧化酶的外源性核酸。替代性方法涉及表达编码NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的一种或多种外源性核酸。该电子传递链的这些酶的一种或两者的外源性表达或内源性过表达将提高其电子传递可用性并因此提高其效率。如下文进一步所述，各种其他方法也可用于增加内源性或外源性核酸的表达，包含，例如掺入内源性编码核酸、外源性编码核酸或两者的更有力的启动子和/或正向调节元件。本领域的技术人员将领会的是，这类方法的一些或全部可以单独或结合使用以增加编码核酸的表达。
电子传递效率以及ATP生成的提高还可以通过，例如一种或多种，包含所有的其余的内源性NADH脱氢酶或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减得以获得。类似地，一种或多种，包含所有的其余的内源性泛醇氧化酶的衰减还可以经生成以提高效率。以类似的方式，掺入一种或多种，包含所有的其余的NADH脱氢酶以及NAD(P)H：奎宁氧化还原酶以及一种或多种，包含所有的其余的泛醇氧化酶两者的衰减可以类似地提高效率。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
电子传递中涉及的其余的内源性NAD(P)H脱氢酶或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶包含NAD(P)H脱氢酶或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB(非Ndh-I NADH脱氢酶)。这些脱氢酶或氧化还原酶的一种或多种可以经衰减以提高电子传递效率以及提高ATP收率，因为这将导致通过Ndh-I的电子传递增加。因此，本发明的该微生物可以具有Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor或MdaB的一种或多种的衰减，包含所有的这些NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减。类似地，本发明的微生物可以具有上文七种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的所有组合的衰减，包含，例如两种、三种、四种、五种以及六种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的所有组合的衰减。如上所述的一种或多种非Ndh-I NADH脱氢酶的衰减可以单独在本发明的微生物中生成以提高电子传递效率以及ATP可用性或结合如前所述的NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的增加的表达使用。
电子传递中涉及的其余的内源性泛醇氧化酶包含细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶(非细胞色素bo氧化酶)。编码一种或多种这些氧化酶的基因可以经破坏以提高电子传递效率以及提高ATP收率，因为这类衰减或破坏将导致通过细胞色素bo氧化酶的电子传递增加。因此，本发明的该微生物可以具有细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶或醌醇单加氧酶的一种或多种的衰减，包含所有的这些泛醇氧化酶的衰减。类似地，本发明的微生物可以具有上文三种泛醇氧化酶的所有组合的衰减，包含，例如两种泛醇氧化酶的所有组合的衰减。如上所述的一种或多种非细胞色素bo氧化酶的衰减可以单独在本发明的微生物中生成以提高电子传递效率以及ATP可用性或结合如前所述的NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的增加的表达使用。
如同针对该内源性NAD(P)H脱氢酶或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶而非Ndh-I(即该非Ndh-I NADH脱氢酶)的一些或全部或该泛醇氧化酶非细胞色素bo氧化酶(即该非细胞色素bo氧化酶)的一些或全部的衰减，针对非Ndh-I NADH脱氢酶以及非细胞色素bo氧化酶两者的一种或多种的衰减可以经生成以提高电子传递效率以及提高ATP收率，因为这类衰减将导致通过Ndh-I NADH脱氢酶以及细胞色素bo氧化酶的电子传递增加。因此，本发明的该微生物可以具有Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor或MdaB的一种或多种的衰减，包含针对所有这些NAD(P)H脱氢酶以及NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减，以及细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶或醌醇单加氧酶的一种或多种的衰减，包含针对所有些泛醇氧化酶的衰减。一种示例性组合包含Ndh-II，bd-I氧化酶或Ndh-II以及bd-I氧化酶的衰减。类似地，本发明的微生物可以具有上文七种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的所有组合的衰减，包含，例如两种、三种、四种、五种以及六种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的所有组合的衰减，以及可以具有上文三种泛醇氧化酶的所有组合的衰减，包含，例如两种泛醇氧化酶的所有组合的衰减。如上所述的一种或多种非Ndh-I NADH脱氢酶和/或非细胞色素bo氧化酶的衰减可以单独在本发明的微生物中生成以提高电子传递效率以及ATP可用性或结合如前所述的NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的增加的表达使用。
可用于衰减以改善该电子传递链的能量效率并从而提高ATP的可用性的示例性非Ndh-INADH脱氢酶以及非细胞色素bo氧化酶在表14中总结如下。
表14.示例性非Ndh-INADH脱氢酶以及非细胞色素bo氧化酶
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
appB NP_415498.1 16128945 大肠杆菌
appC NP_415497.1 16128944 大肠杆菌
ygiN NP_417501.1 16130925 大肠杆菌
mdaB NP 417500.1 16130924 大肠杆菌
wrbA P0A8G6.2 67475535 大肠杆菌
yieF POAGE6.1 84028020 大肠杆菌
Qor NP_418475.1 16131877 大肠杆菌
ytfG NP_418632.1 16132033 大肠杆菌
cydA NP_415261.2 90111166 大肠杆菌
cydB NP_415262.1 16128709 大肠杆菌
ndh NP_415627.1 16129072 大肠杆菌
本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有一种或多种甲基萘醇或二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。该一种或多种甲基萘醇或二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减可以是单独或结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如在如前所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中一种或多种甲基萘醇或二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。因此，本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减，以及进一步具有一种或多种甲基萘醇或二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。该衰减可以是一种或多种甲基萘醇生物合成酶、一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶或一种或多种甲基萘醇生物合成酶以及一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。编码示例性甲基萘醇以及二甲基甲基萘醇生物合成酶的基因如表15中所列。
可以用于改善该电子传递链的效率以及增加ATP收率的相关的遗传改变是改变醌池的组成，以便总的泛醌以及泛醇池得以增加以及甲基萘醌和甲基萘醇池得以减少。该醌池的组成可以通过氧可用性得以调节(Shestopalov等人，FEBS Lett 404：2-3：272-4(1997))。Cyo以及Cyd均可以氧化泛醌醇。然而，Cyd还可以氧化甲基萘醇而Cyo显示对甲基萘醇几乎没有活性。因此可以利用甲基萘醌和/或甲基萘醇生物合成的破坏以通过将醌池的分布移向泛醌以及泛醌醇而增加通过Cyo的通量，从而导致更节能的呼吸作用。
可用于衰减以改善该电子传递链的能量效率从而提高ATP的可用性的示例性甲基萘醌生物合成酶在表15中总结如下。
表15.示例性甲基萘醌生物合成酶
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
menF NP_416768.4 90111411 大肠杆菌
menD NP_416767.1 16130199 大肠杆菌
menH YP_026269.1 49176426 大肠杆菌
menC NP_416764.1 16130196 大肠杆菌
menE NP_416763.1 16130195 大肠杆菌
menB NP_416765.1 16130197 大肠杆菌
menI AAC74756.1 1787976 大肠杆菌
menA NP_418365.1 16131768 大肠杆菌
menG YP_026269.1 49176426 大肠杆菌
本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有用生成ATP的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK；还称为PPCK)补充或取代的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)。该取代或补充可以是单独的或结合本文所述的任何遗传改变，包含，例如在如本文所述的具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减的一种非天然存在的微生物中用生成ATP的PEPCK取代或补充PPC。因此，本发明还提供一种非天然存在的微生物，其具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或产琥珀酸酶的第二衰减，以及进一步具有用生成ATP的PEPCK补充或取代的PPC。
可以被用来提高本发明的宿主微生物中的ATP可用性的另一种遗传改变包含用生成ATP的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK取代或补充PPC。
通过在大肠杆菌中的示范方式，例如，两种酶催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及草酰乙酸的相互转化。一种酶对应于PEP羧化酶(PPC，EC 4.1.1.31)以及第二种酶对应于PEP羧激酶(PPCK，EC 4.1.1.49)。这些酶的每种催化的反应被总结在如下式中。
(PPC)PEP+CO2+H2O→OAA+Pi
(PEPCK)PEP+CO2+ATP→OAA+ADP
如上文所示和所述，PPC和PEPCK酶两者均催化PEP羧基化为草酰乙酸。经由PEPCK的草酰乙酸形成生成了ATP，这改善了TCA循环破坏的和非破坏的TCA循环菌株中的ATP可用性。PEPCK活性可以取代PPC活性；或可以对其进行补足(补充)。下文进一步详细地描述了示例性PEPCK酶。本领域的技术人员还会知道的是，用重碳酸盐、天冬氨酸盐或过量的CO2对本文所述的方法中的介质的补充可以有助于实现更高的生长速率。
PPC的补充包含，例如内源性PEPCK编码核酸的过表达和/或编码PEPCK的外源性核酸的表达。过表达包含，例如如本文所述的负向调节的上调以及去除。如同本文所述的外源性编码核酸的任何表达，该外源性核酸可以是与宿主微生物同源的编码核酸或它可以是与宿主异源的编码核酸。PPC的取代包含，例如内源性PPC的衰减以及内源性PEPCK编码核酸的过表达和/或编码PEPCK的外源性核酸的表达。该衰减可以是基因破坏或本文所述的或本领域熟知的导致基因表达或基因产物活性减少的其他遗传改变。这类方法包含，例如，改变该编码基因的启动子、调节区或基因表达调节子。
如下文进一步所述，各种用于增加内源性或外源性核酸的表达的方法也是可用的，包含，例如，掺入内源性编码核酸、外源性编码核酸或两者的更有力的启动子和/或正向调节元件。本领域的技术人员将领会的是，这类方法的一些或全部可以单独或结合使用以提高编码核酸的表达。
关于示例性PEPCK酶，酿酒酵母以及大肠杆菌的PEPCK酶分别由PCK1以及pckA编码(Valdes-Hevia等人，FEBS.Lett.258：313-316(1989)；Kim等人，Appl Environ Microbiol70：1238-1241(2004))。大肠杆菌PEPCK主要在糖异生过程起作用。然而，内源性大肠杆菌PEPCK对从PEP到草酰乙酸的活性已经在大肠杆菌K-12的ppc突变体中得以证实(Kwon等人，J Micro Biotech 16：1448-1452(2006))。这些菌株显示没有生长缺陷以及已经提高了高NaHCO3浓度下琥珀酸的产量。因此，用PEPCK取代PPC可以被用来进一步提高ATP的生成。欲通过PEPCK提高ATP生成的替代性代谢设计可以包含减少对草酰乙酸的亲合力。例如，大肠杆菌PEPCK酶在消耗草酰乙酸的方向的活性可以通过在草酰乙酸结合位点(pck R65Q)引入氨基酸取代得以减小(Cotelesage等人，Int.J Biochem.Cell Biol.39：1204-1210(2007))。在一些生物，尤其是瘤胃细菌中，PEPCK对于从PEP生产草酰乙酸以及生成ATP是非常有效的。这类有效的PEPCK酶还适于被用于经修饰以提高ATP生产的本发明的该微生物中。已经被克隆入大肠杆菌以及类似地适于被用于本发明的该微生物的PEPCK基因的例子包含来自那些来自产琥珀酸曼氏杆菌(Lee等人，Biotechnol.Bioprocess Eng.7：95-99(2002))、产琥珀酸厌氧螺菌(Laivenieks等人，Appl Environ Microbiol 63：2273-2280(1997))以及琥珀酸放线杆菌(Kim等人，Appl Environ Microbiol 70：1238-1241(2004))的基因。来自大黍(Megathyrsus maximus)的PEPCK酶对于CO2(被认为是在大肠杆菌酶中限制速率的底物)具有低Km(Chen等人，Plant Physiol 128：160-164(2002)；Cotelesage等人，Int.J Biochem.Cell Biol.39：1204-1210(2007))。还有另一种候选酶是流感嗜血杆菌的PEPCK酶。示例性PEPCK酶在表16中总结如下。
表16.示例性PEPCK酶
<u>蛋白质</u> <u>GenBank ID</u> <u>GI号</u> <u>生物体</u>
PCK1 NP_013023 6322950 酿酒酵母
pck NP_417862.1 16131280 大肠杆菌
pckA YP_089485.1 52426348 产琥珀酸曼氏杆菌
pckA O09460.1 3122621 产琥珀酸厌氧螺菌
pckA Q6W6X5 75440571 琥珀酸放线杆菌
AF532733.1：1..1929 AAQ10076.1 33329363 Megathyrsus maximus
pckA P43923.1 1172573 流感嗜血杆菌
衰减或减小表达(包含，例如内源性PPC酶的编码核酸的基因破坏)可以有益于防止或减少具有PEPCK的ATP消耗循环以及确保PEPCK是草酰乙酸的主要来源。示例性PPC酶由大肠杆菌中的ppc(Kai等人，Arch.Biochem.Biophys.414：170-179(2003)、扭脱甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人，J.Bacteriol.175：3776-3783(1993)以及谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人，Mol.Gen.Genet.218：330-339(1989)编码。示例性PPC酶在表17中总结如下。
表17.示例性PPC酶
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Ppc NP_418391 16131794 大肠杆菌
ppcA AAB58883 28572162 扭脱甲基杆菌
Ppc ABB53270 80973080 谷氨酸棒杆菌
在包含具有减少的琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性的宿主的本发明的宿主微生物中PEPCK或PPC的草酰乙酸形成活性可以通过PEPCK和/或PPC的过表达得以提高。PEPCK活性可以通过提高细胞内PEP的可用性进一步得以改善。这种提高可以例如，通过葡萄糖PTS系统的破坏和/或增加非PTS系统(如葡萄糖透性酶、葡萄糖促进剂或葡萄糖ABC运载体)的表达得以实现。用于增加细胞内PEP的另一种策略是衰减催化磷酸烯醇丙酮酸到丙酮酸的ADP-依赖性转化的丙酮酸激酶。上述基因表达的衰减和增加可以通过本文所述的任何方法(包含，例如一种或多种编码基因的基因破坏以破坏PTS体系和/或丙酮酸激酶)以及通过用于增加上文示范的基因的表达的内源性基因的过表达或外源性编码核酸的表达发生。其破坏可以改善具有减少的琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性的菌株中PEP到草酰乙酸的转化的示例性基因被示于如下表18中。
表18.其破坏改善PEP到草酰乙酸的转化的示例性基因
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
pykA NP_416368.1 16129807 大肠杆菌
pykF NP_416191.1 16129632 大肠杆菌
ptsI NP_416911.1 16130342 大肠杆菌
ptsH NP_416910.1 16130341 大肠杆菌
Crr NP_416912.1 16130343 大肠杆菌
ptsG NP_415619.1 16129064 大肠杆菌
manX NP_416331.1 16129771 大肠杆菌
manY NP_416332.1 16129772 大肠杆菌
manZ NP_416333.4 345452720 大肠杆菌
本发明的该非天然存在的微生物包含本文所述的该遗传改变的所有组合以及置换。因此，如本文关于遗传改变的某些示例性组合所阐述的，本文所述的任何遗传改变可以组合本文所述的一种或多种遗传改变以生成具有由其导致的一种或多种代谢特征的一种非天然存在的微生物。不同的遗传改变的组合可以包含，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种或更多种组合的遗传改变，包含具有本文所述的任何数目的遗传改变乃至本文所述的所有遗传改变的组合的微生物。相应地，为了说明的目的，下文对各种遗传改变组合的某些进行了示范。然而，根据本文提供的教导和启示，本领域的技术人员会理解上文或下文未做示范的所有的其他组合被包含在本发明之内，如同本文对其做了描述。
例如，在一种示例性实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有YciA CoA水解酶的衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该TCA循环中间体或TCA循环底物可以是，例如α-酮戊二酸、琥珀酰基-CoA和/或乙酰基-CoA。该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的表达。编码该吡啶核苷酸转氢酶的该外源性核酸可以是，例如pntAB。
具有YciACoA水解酶的衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以包含，例如TCA循环酶的衰减。从TCA循环中间体或TCA循环底物生产的该生物衍生化合物可以包含，例如4HB、1，4-BDO、1，3-BDO、PHB、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。
具有YciA水解酶衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以包含，例如提高该微生物中三磷酸腺苷(ATP)的可用性的遗传改变。该遗传改变可以是，例如，NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的增加的表达以及可以包含，例如，编码该NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的外源性核酸的表达。
具有YciA水解酶衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，选自Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB的一种或多种NAD(P)H脱氢酶或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减，选自细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶的一种或多种泛醇氧化酶的衰减或选自由Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB组成的组的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减；和/或选自由细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶组成的组的一种或多种泛醇氧化酶的衰减。
具有YciA水解酶衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减或一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。
具有YciA水解酶衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，提高该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达的遗传改变。PEPCK的增加的表达可以来自编码PEPCK的外源性核酸的增加的表达。
具有YciA水解酶衰减以及用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的衰减。在另一种实施方式中，该微生物可以进一步包括提高该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或其组合的表达的遗传改变。这类微生物可以进一步包括丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减。在仍然另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括蛋白质编码ClpA、丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减(见实施例)。
根据本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解的是，遗传改变的任何上述组合可以进一步组合本文所述的任何单个或多个其他遗传改变。
在进一步的示例性实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有YciA CoA水解酶的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸。该吡啶核苷酸转氢酶可以是pntAB。
具有YciA CoA水解酶的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如提高微生物中的ATP的可用性的遗传改变。该遗传改变可以是，例如，NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶或NADH脱氢酶Ndh-I以及细胞色素bo氧化酶两者的增加的表达以及可以包含，例如，编码该NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的外源性核酸的表达。
具有YciA CoA水解酶的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，选自Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减，选自细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶的一种或多种泛醇氧化酶的衰减或选自由Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB组成的组的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减以及选自由细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶组成的组的一种或多种泛醇氧化酶的衰减。
具有YciA CoA水解酶的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减，一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减或一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减以及一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。
具有YciA CoA水解酶的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，增加微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达的遗传改变。PEPCK的增加的表达可以来自编码PEPCK的外源性核酸的增加的表达。
具有编码YciA CoA水解酶的基因的衰减以及具有编码吡啶核苷酸转氢酶的外源性核酸的该非天然存在的微生物可以单独包含或结合提高ATP的可用性的遗传改变，微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的衰减。在另一种实施方式中，该微生物可以进一步包括增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或其组合的表达遗传改变。这类微生物可以进一步包括丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减。在仍然另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括蛋白质编码ClpA、丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减(见实施例)。
有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员会理解的是，遗传改变的任何上述组合可以进一步组合本文所述的任何单个或多个其他遗传改变。
在仍然另一种示例性实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有增加NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的表达的遗传改变。
该非天然存在的微生物可以进一步包含编码NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶选自Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB的一种或多种内源性核酸的衰减，选自细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶的一种或多种泛醇氧化酶的衰减或选自由Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB组成的组的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减以及选自由细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶组成的组的一种或多种泛醇氧化酶的衰减。
具有增加NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的表达的遗传改变的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减，一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减或一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减以及一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。
具有增加NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的表达的遗传改变的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达的遗传改变。PEPCK的增加的表达可以来自编码PEPCK的外源性核酸的增加的表达。
具有增加NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)以及细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的表达的遗传改变的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的衰减。在另一种实施方式中，该微生物可以进一步包括增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或其组合的表达的遗传改变。这类微生物可以进一步包括丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减。在仍然另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括蛋白质编码ClpA、丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减(见实施例)。在另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括选自如下的遗传改变：由cydA或cyB和/或pykF编码的蛋白质的衰减，增加pntAB的表达的遗传改变或其组合。
有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员会理解的是，遗传改变的任何上述组合可以进一步组合本文所述的任何单个或多个其他遗传改变。
在仍然另一种示例性实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有选自Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB(即非Ndh-I NADH脱氢酶)的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减，选自细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶(即非细胞色素bo氧化酶)的一种或多种泛醇氧化酶的衰减或选自由Ndh-II、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor以及MdaB组成的组的一种或多种NAD(P)H脱氢酶和/或NAD(P)H：奎宁氧化还原酶的衰减，以及选自由细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-II氧化酶以及醌醇单加氧酶组成的组的一种或多种泛醇氧化酶的衰减。
具有一种或多种非Ndh-I NADH脱氢酶和/或非细胞色素bo氧化酶的衰减的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减，一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减或一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减以及一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。
具有一种或多种非Ndh-I NADH脱氢酶和/或非细胞色素bo氧化酶的衰减的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达的遗传改变。PEPCK的增加的表达可以来自编码PEPCK的外源性核酸的增加的表达。
具有一种或多种非Ndh-I NADH脱氢酶和/或非细胞色素bo氧化酶的衰减的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的衰减。在另一种实施方式中，该微生物可以进一步包括增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或其组合的表达的遗传改变。这类微生物可以进一步包括丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减。在仍然另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括蛋白质编码ClpA、丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减(见实施例)。
根据本文提供的教导和启示，本领域的技术人员会理解的是，遗传改变的任何上述组合可以进一步组合本文所述的任何单个或多个其他遗传改变。
在进一步的示例性实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其具有一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减，一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减或一种或多种甲基萘醇生物合成酶的衰减以及一种或多种二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减。
具有编码甲基萘醇和/或二甲基甲基萘醇生物合成酶的一种或多种内源性核酸的衰减的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如，增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达的遗传改变。PEPCK的增加的表达可以来自编码PEPCK的外源性核酸的增加的表达。
具有一种或多种甲基萘醇和/或二甲基甲基萘醇生物合成酶的衰减的该非天然存在的微生物可以进一步包含，例如该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的衰减。在另一种实施方式中，该微生物可以进一步包括增加该微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或其组合的表达的遗传改变。这类微生物可以进一步包括丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减。在仍然另一种实施方式中，该非天然存在的微生物可以进一步包括蛋白质编码ClpA、丙酮酸激酶或葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的衰减(见实施例)。
有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员会理解的是，遗传改变的任何上述组合可以进一步组合本文所述的任何单个或多个其他遗传改变。
通过关于上文披露以及示范的各种组合以及置换的举例，本发明进一步提供任何上述示例性实施方式的一种非天然存在的微生物，包含其中该微生物选自细菌、酵母、真菌或另一种适用于发酵过程的微生物。该非天然存在的微生物可以是细菌以及该细菌可以是大肠杆菌。
通过关于本文披露和示范的各种组合以及置换的举例附加地提供包含选自如下的遗传改变的一种非天然存在的微生物：(1)cydA或cydB的衰减，以及一种或多种选自如下的遗传改变：(a)增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(b)由pykF编码的蛋白质的衰减；(c)由sucCD编码的蛋白质的衰减；(d)由yciA编码蛋白质的衰减；(e)增加由ackA编码的蛋白质以及由pta编码的蛋白质的表达的遗传改变；(f)增加由cyoB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(g)由pykA编码的蛋白质的衰减；(H)由arcA编码的蛋白质的衰减；(i)由crr编码的蛋白质的衰减；(j)由clpA编码的蛋白质的衰减；以及(k)由menC编码的蛋白质的衰减；以及(2)选自如下的遗传改变：(a)由sucCD以及yciA编码的蛋白质的衰减；(b)由sucCD以及yciA编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(c)由sucCD以及yciA编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由cyoB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(d)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由cyoB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(e)由sucCD、yciA以及menC编码的蛋白质的衰减以及具有增加由cyoB编码的蛋白质的表达的遗传改变，(f)由sucCD、yciA、cydA或cydB以及menC编码的蛋白质的衰减以及具有增加由cyoB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(g)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(h)由sucCD以及cydA或cydB以及pykF编码的蛋白质的衰减；(i)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(j)由sucCD以及cydA或cydB以及pykF编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(k)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(1)由sucCD、yciA以及cydA或cydB以及pykF编码的蛋白质的衰减；(m)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(n)由sucCD、yciA以及cydA或cydB以及pykF编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(o)由sucCD、yciA，以及cydA或cydB以及menC编码的蛋白质的衰减；(P)由sucCD、yciA以及cydA或cydB以及menC编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(q)由sucCD以及pykF编码的蛋白质的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(R)由clpA编码的蛋白质的衰减；(S)由menC编码的蛋白质的衰减；(t)由menC以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(u)由pykF和/或pykA编码的蛋白质的衰减；(v)具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(w)cydA或cydB以及sucCD、arcA以及crr的衰减，以及具有增加由ackA以及pta编码的蛋白质的表达的遗传改变；(x)cydA或cydB以及arcA的衰减；(y)cydA或cydB的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变；(z)cydA或cydB以及pykF的衰减；以及(aa)cydA或cydB以及pykF的衰减，以及具有增加由pntAB编码的蛋白质的表达的遗传改变。
上述非天然存在的微生物可以进一步包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该生物衍生化合物可以是4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇的。附加地，该微生物可以是细菌以及该该细菌可以是大肠杆菌。
如本文所述，衰减是使被编码的基因产物失活或活性减少的遗传改变。在一些实施方式中，该衰减可以包含完全的基因删除。在一些实施方式中，其他的衰减方法(包含破坏基因的方法)包含，例如通过寡核苷酸的遗漏或添加或通过使基因无法运行的突变的移码方法。本领域的技术人员将认识到基因删除的有用性，尽管如此，由于稳定性，它使得该非天然存在的生物回复到尚未发生衰减的亲本显型。虽然本文中示范为代谢改变，尤其是一种或多种衰减，理解的是，减少或防止有关代谢活性的活性的任何衰减在需要时可以被引入宿主微生物中。
具有如本文所述的一种或多种衰减的本发明的该非天然存在的微生物可以通过如本文所述的衰减或基因破坏而产生。简言之，有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解的是，要引入代谢改变，如酶的衰减，可能需要破坏反应中涉及的一种或多种酶的催化活性。替代性地，遗传改变可以包含破坏酶活性或最大活性所需的调节蛋白质或辅因子的表达。进一步地，酶催反应所需的辅因子的遗传损失还可以与编码该酶的基因的破坏具有相同的作用。破坏可以通过各种方法(包含，例如编码基因的删除或一种或多种的编码基因序列中遗传改变的掺入)发生。靶向用于破坏的编码基因可以是编码催化活性中涉及的酶的一个、一些或全部基因。例如，在靶向催化活性中涉及单个酶的情况下，破坏可以通过减小或消除被编码的基因产物的催化活性的遗传改变而发生。类似地，在该单个酶是多聚体(包含杂聚体)的情况下，破坏可以通过减少或破坏被编码的基因产物的一种或所有亚基的功能的遗传改变而发生。活性的破坏可以通过形成活性复合物所需的一种或多种亚基的结合活性的损失，通过多聚复合物的催化亚基的破坏或通过两者得以实现。还可以靶向多聚蛋白质结合以及活性等其他功能以便破坏本发明的代谢反应。这类其他功能为本领域的技术人员所熟知。类似地，靶酶活性可以通过破坏修饰和/或活化该靶酶的蛋白质或酶(例如，将脱辅酶转化为全酶所需的分子)的表达得以减小或消除。进一步地，单个多肽或多聚复合物的一些或全部功能可以根据本发明被破坏以便减小或消除本发明的反应或代谢修饰中涉及的一种或多种酶的催化活性。类似地，只要靶向反应被减少或消除，本发明的反应或代谢修饰中涉及的一些或全部酶便可以被破坏。
有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员还将理解的是，酶催反应可以通过减少或消除由共同基因和/或由该基因的显示类似的或基本上相同的活性的一种或多种直系同源物编码的反应得以衰减。该共同基因以及所有的直系同源物两者的减少可以导致靶向反应的任何催化活性的完全消除。然而，该共同基因或一种或多种直系同源物的破坏可以导致足以促进生长与产物生物合成的偶联的该靶向反应的催化活性的减小。本文示范的是编码用于各种代谢修饰的催化活性的共同基因及其直系同源物两者。本领域的技术人员将理解的是，编码靶向代谢反应的酶的一些或全部基因的破坏可以被实施于本发明的方法中以及被掺入本发明的该非天然存在的微生物中，以便实现通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量。有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员还将理解的是，酶催活性或表达可以使用熟知的方法进行衰减。酶活性或量的减小可以模仿基因的完全破坏，如果该减小导致该酶的活性下降到途径起作用正常所需的临界水平以下。通过各种技术而非基因破坏的使用对酶催活性的减小可能对生物的存活力是重要的。导致基因破坏的类似或相同的效果的减少酶催活性的方法包含，但不限于：减少基因转录或翻译；破坏mRNA、蛋白质或催化RNA的稳定性；以及使影响酶活性或动力学的基因突变(参见，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，NewYork(2001)；以及Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sohs，Baltimore，MD(1999))。自然或强加的调节性控制还可以实现酶衰减包含：启动子替换(见，Wang等人，Mol.Biotechnol.52(2)：300-308(2012))；转录因子的损失或改变(Dietrick等人，Annu.Rev.Biochem.79：563-590(2010)；以及Simicevic等人，Mol.Biosyst.6(3)：462-468(2010))；抑制性RNA或肽，如siRNA、反义RNA、RNA或肽/小分子结合适体、核酶、适配酶以及核糖开关的引入(Wieland等人，Methods56(3)：351-357(2012)；O’Sullivan，Anal.Bioanal.Chem.372(1)：44-48(2002)；以及Lee等人，Curr.Opin.Biotechnol.14(5)：505-511(2003))；以及减小或破坏酶催活性的药物或其他化学品(如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物)的添加。本领域技术人员也将理解和认识到的是，酶的衰减可以按各种水平进行。例如，在基因水平上，引起部分或完全无效表型的突变，如基因破坏；或导致掩蔽基因产物的活性的上位遗传效应突变(Miko，NatureEducation 1(1)(2008))，可以用来使酶衰减。在基因表达水平上，衰减的方法包括：将转录与内源或外源诱导剂(如异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG))偶合，然后在生产阶段中加入少量的诱导剂或不加入诱导物(Donovan等人，J.Ind.Microbiol.16(3)：145-154(1996)；以及Hansen等人，Curr.Microbiol.36(6)：341-347(1998))；引入或修饰基因的正或负调节物；修饰整合有基因的真核染色体区域中的组蛋白乙酰化/脱乙酰化(Yang等人，Curr.Opin.Genet.Dev.13(2)：143-153(2003)以及Kurdistani等人，Nat.Rev.Mol.CellBiol.4(4)：276-284(2003))；引入移位以破坏启动子或调节基因(Bleykasten-Brosshans等人，C.R.Biol.33(8-9)：679-686(2011)；以及McCue等人，PLoSGenet.8(2)：e1002474(2012))；翻转可移位的元件或启动子区域的取向，以调节相邻基因的基因表达(Wang等人，Genetics 120(4)：875-885(1988)；Hayes，Annu.Rev.Genet.37：3-29(2003)；在二倍体生物体中，删除导致杂合性损失的等位基因(Daigaku等人，Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms ofMutagenesis600(1-2)177-183(2006))；引入提高RNA降解的核酸(Houseley等人，Cell，136(4)：763-776(2009)；或在细菌中，例如，可导致RNA降解和核糖体失速的转印信使RNA(tmRNA)标记的引入(Sunohara等人，RNA10(3)：378-386(2004)；以及Sunohara等人，J.Biol.Chem.279：15368-15375(2004))。在翻译水平上，衰减可以包含：引入稀有密码子以限制翻译(Angov，Biotechnol.J.6(6)：650-659(2011))；引入阻断翻译的RNA干扰分子(Castel等人，Nat.Rev.Genet.14(2)：100-112(2013)；以及Kawasaki等人，Curr.Opin.Mol.Ther.7(2)：125-131(2005)；修饰编码序列外的区域，例如将二级结构引入未翻译区(UTR)以阻断翻译或降低翻译的效率(Pingnér等人，PLoS Comput.Biol.1(7)：e72(2005))；加入用于快速转录降解的RNA酶位点(Pasquinelli，Nat.Rev.Genet.13(4)：271-282(2012)；以及Arraiano等人，FEMS MicrobiDl.Rev.34(5)：883-932(2010)；引入反义RNA低聚物或反义转录物(Nashizawa等人Front.Biosci.17：938-958(2012))；引入RNA或肽适体、核酶、适体酶、核糖开关(Wieland等人，Me功ods 56(3)：351-357(2012)；O'Sullivan，Ahal.Bioanal.Chem.372(1)：44-48(2002)；以及Lee等人，Curr.Opin.Biotechnol.14(5)：505-511(2003))；或引入涉及可以防止或减少翻译的RNA结构的翻译调节元件，该翻译可以通过小分子的存在或不存在得以控制(Araujo等人，Comparative and FunctionalGenomics，Article ID 475731，8pages(2012))。在酶的定位和/或寿命的水平上，酶衰减可以包含：为了更快的蛋白质转换，添加降解标签(Hochstrasser，AnnualRev.Genet.30：405-439(1996)；以及Yuan等人，PLoS One8(4)：e62529(2013))；或添加定位标记，其导致该酶被分泌或定位到真核细胞中的亚细胞区室，其中该酶将不能够与它的正常底物反应(Nakai等人Genomics 14(4)：897-911(1992)；以及Russell等人，J.Bact.189(21)7581-7585(2007))。在翻译后调节水平上，酶衰减可以包含：增加已知抑制剂的细胞内浓度；或修饰翻译后的修饰位点(Mann等人，Nature Biotech.21：255-261(2003))。在酶活性的水平上，酶衰减可以包含：添加内源或外源性抑制剂，如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物，以减小酶的活性；对于需要辅因子的酶，限制必要辅因子(如维生素B12)的可用性；螯合酶活性所需的金属离子；或引入显性负突变。上述的用于衰减的技术的适用性可取决于给定的宿主微生物是原核的还是真核的，并且理解的是，本领域技术人员将容易作出对于给定的宿主，哪个是适当的技术的确定。
理解的是，增加所需的酶的表达的遗传改变一般地通过将编码该所需的酶的外源性核酸引入该微生物而进行。然而，有了本文提供的教导和启示，本领域的技术人员将理解的是，增加表达的遗传改变还可以包含内源性基因的基因表达或调节区的修饰。这类区包含，例如，启动子、增强子和/或其他调节区，如改变该编码核酸的稳定性或半衰期的序列。例如，更有力的启动子和/或增强子可以被包含或取代为内源性基因以使用本领域熟知的方法实现增加的表达。通过说明，将通过参考通过外源性编码核酸的引入而增加表达，对本发明进行描述。然而，这样的教导同样适用于通过增加表达以及调节元件的强度而增加表达。类似地，使表达衰减的遗传改变可以涉及改变被编码的蛋白质的活性的修饰或可以涉及如本文所披露的，转录或蛋白质水平上的调节分子。
本文所述的具有编码酶或蛋白质的外源性核酸的本发明的该非天然存在的微生物可以通过引入编码参与本文披露的一种或多种遗传改变的一种或多种酶或蛋白质的可表达的核酸而产生。用于引入编码核酸的示例性遗传改变包含，例如，编码吡啶核苷酸转氢酶、用于生物衍生化合物的生物合成的途径酶、NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的一种或多种外源性核酸的引入。依据选定用于生物衍生化合物的生物合成的宿主微生物，可以表达涉及编码的外源性核酸的表达的用于本文披露的一种或多种遗传改变的核酸。
宿主微生物可以选自以及该非天然存在的微生物可以生成于，例如细菌、酵母、真菌或各种其他适用于或适合于发酵过程的微生物的任意一种。示例性的细菌包括选自如下的任何物种：肠杆菌目，肠杆菌科家族，包含大肠杆菌和克雷伯杆菌属；气单胞菌目，琥珀酸弧菌科家族，包含厌氧螺菌属；巴斯德菌目，巴斯德菌科家族，包含放线杆菌和曼氏杆菌属；根瘤菌目，慢生根瘤菌科家族，包含根瘤菌属；芽胞杆菌目，芽胞杆菌科家族，包含芽胞杆菌属；放线菌目，棒状杆菌科和链霉菌科家族，分别包含棒状杆菌属和链霉菌属；红螺菌目，醋酸杆菌科家族，包含葡糖杆菌属；鞘氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科家族，包含酵单胞菌属；乳酸杆菌目，乳酸杆菌和链球菌科家族，分别包含乳酸杆菌属和乳球菌属；梭菌目，梭菌科家族，梭菌属；以及假单胞菌目，假单胞菌科家族，包含假单胞菌属。宿主细菌的非限制性物种包含大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、萤光假单胞菌以及恶臭假单胞菌。
类似地，酵母或真菌物种的典型物种包含选自如下的任何物种：酵母菌目，酵母菌科家族，包含酵母菌属、克鲁维酵母菌属和毕赤酵母属；酵母菌目，耶罗威亚酵母菌科家族，包含耶罗威亚酵母菌属；裂殖酵母菌目，裂殖酵母菌科家族，包含裂殖酵母菌属；散囊菌目，发菌科家族，包括曲霉属；以及毛霉菌目，毛霉菌科家族，包括根霉菌属。宿主酵母或真菌的非限制性物种包含酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、无根根霉菌、稻根霉菌、解脂耶罗维亚酵母等等。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物，因为其是一种适于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特别有用的宿主生物包括酵母，如酿酒酵母。理解的是，任何适合的宿主微生物可用以引入代谢和/或基因修饰，以生产所需的产品。
类似地，本领域的技术人员理解的是，宿主生物可以基于用于一种或多种衰减的引入的所需特性进行选择以减少通过氧化的TCA循环的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量或以减弱、减少或消除本发明的其他酶或蛋白质的活性。因此，理解的是，如果要将遗传修饰引入宿主生物以破坏基因，催化类似的、但非完全相同的代谢反应的任何同系物、直系同源物或类似物可以被类似地破坏以确保所需的代谢反应被充分破坏。由于不同的生物之间存在代谢网络间的某些差异，本领域的技术人员会理解在生物之间，给定的生物中实际的基因破坏可以存在差异。然而，考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员还会理解，本发明的方法可以应用于任何合适的宿主微生物以确认在有关的物种中构建会减少通过氧化的TCA循环的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的微生物所需的同源代谢改变。
用于本文披露的酶或蛋白质的编码核酸的源可以包括，例如其中被编码的基因产物能够催化参照反应的任何物种。这类物种既包括原核生物又包括真核生物，包括但不仅限于细菌(包括古生细菌和真细菌)以及真核生物(包括酵母)、植物、昆虫、动物以及哺乳动物(包括人)。针对这种源的示例性物种包含，例如大肠杆菌、酿酒酵母、产琥珀酸曼氏杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、大黍(Megathyrsus maximus)、流感嗜血杆菌、扭脱甲基杆菌、谷氨酸棒杆菌、褐鼠、智人、家鼠、绿脓假单胞菌、结核分支杆菌、发酵氨基酸球菌、共生梭菌、具核梭杆菌、克鲁佛氏梭菌、阴道滴虫、布氏锥虫、氨基丁酸梭菌、牙龈红棕色单胞菌W83、醋化醋杆菌、糖乙酸多丁醇梭菌、杨氏柠檬酸杆菌、肠沙门氏菌、中间耶尔森氏菌、产甲酸草酸杆菌、恶臭假单胞菌、不动杆菌属ADP1、天蓝色链霉菌、克氏假单胞菌、幽门螺杆菌、枯草芽孢杆菌、野猪、肠罗斯氏菌属A2-183、肠罗斯氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、直肠真杆菌、丙酸梭菌、诺氏梭菌NT、拜氏梭菌、肉毒杆菌、死海盐盒菌、闪烁古生球菌、闪烁古生球菌、需氧热棒菌菌株IM2、豌豆根瘤菌，以及本文披露的或可作为相应基因的源生物的其他示例性物种。然而，今天超过550个物种的完整的基因组序列是可得的(这些物种中超过一半的基因组序列在公用数据库，如NCBI中可以得到)，包括395种微生物基因组和各种酵母、真菌、植物以及哺乳动物基因组，在这种情况下，编码针对近缘或远缘物种中一种或多种基因的必要的活性的基因的识别(包括，例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换)以及生物之间遗传改变的互换在本领域是常规且公知的。因此，实现本文所述的关于特定生物(如大肠杆菌)的通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量的代谢改变可以以同样的方式很容易地应用到其他微生物，包括原核和真核生物。考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会得知在一种生物中示范的代谢改变可以同样地应用于其他生物。
在某些情况下，例如当替代性代谢酶或蛋白质存在于本文没有明确披露的物种中时，可以通过，例如来自催化相似的、但非完全相同的代谢反应以取代参照反应的一种或多种物种的一种旁系同源物或多种旁系同源物的外源性表达，赋予该宿主物种所需的活性。由于不同的生物之间存在代谢反应间的某些差异，本领域的技术人员会理解不同生物之间的实际的基因用法可以存在差异。然而，考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员还会理解，本发明的教诲和方法可以通过利用对本文那些示例性的微生物所作的同源遗传改变应用于所有的微生物，以在有关的物种中构建会显示所需的代谢活性的微生物。
编码本文所述的酶或蛋白质的核酸分子也可以包括与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸杂交的核酸分子或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。杂交条件可以包含为本领域技术人员所熟知的高度严格、中度严格或低度严格性杂交条件，如本文所述的那些条件。类似地，可以在本发明中使用的核酸分子可被描述为与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸具有特定百分比的序列同一性。例如，该核酸分子可以与本文所述的核酸具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
严格的杂交是指其中杂交的多聚核苷酸是稳定的条件。正如为本领域的技术人员已知，杂交的多聚核苷酸的稳定性被反映在杂化物的熔化温度(Tm)中。在一般情况下，杂交的多聚核苷酸的稳定性是盐浓度(如钠离子浓度)和温度的函数。杂交反应可以在较低度严格性，继之以多样化，但更高度严格性洗涤条件下进行。对杂交严格性的引用涉及这样的洗涤条件。高度严格的杂交包含仅仅允许于65℃在0.018MNaCl中形成稳定的多聚核苷酸的那些核酸序列的杂交的条件，例如，如果杂交物于65℃在0.018M NaCl中是不稳定的，如本文所考虑，其在高度严格性条件下是不稳定的。高度严格性条件可以，例如通过于42℃在50％甲酰胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2％SDS中杂交，然后于65℃在0.1XSSPE和0.1％SDS中洗涤而提供。非高度严格的杂交条件的杂交条件也可以被用以描述本文所披露的核酸序列。例如，短语中度严格的杂交是指等同于如下的条件：于42℃在50％甲酰胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2％SDS中杂交，继之以于42℃在0.2X SSPE、0.2％SDS中洗涤。短语低度严格性杂交是指等同于如下的条件：于22℃在10％甲酰胺、5X Denhart氏溶液、6X SSPE、0.2％SDS中杂交，继之以于37℃在1X SSPE、0.2％SDS中洗涤。Denhart氏溶液包含1％聚蔗糖、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20X SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙烯酰胺四乙酸(EDTA))包含3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其他合适的低度、中度、高度严格性杂交缓冲液和条件为本领域技术人员所熟知以及被描述于，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约(2001)；以及Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley andSohs，马里兰州巴尔的摩(1999)。
编码本文所述的酶或蛋白质的核酸分子可与本文所披露的核苷酸序列具有至少特定的序列同一性。相应地，在本发明的一些方面，编码本文所述的酶或蛋白质的核酸分子与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸；或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子具有至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性；或者完全相同的核苷酸序列。
序列同一性(也称同源性或相似性)是指两种核酸分子之间或两种多肽之间的序列相似性。同一性可以通过比较每种可为比较之目的而进行比对的序列中的位置来确定。当所比较序列中的位置由相同的碱基或氨基酸占据时，则在该位置的分子是一致的。序列之间的同一性的程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目的函数。确定其序列同一性百分比的两种序列的比对可以通过使用本领域中已知的软件程序(例如(作为举例)Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sohs，马里兰州巴尔的摩(1999)中所述的那些)来进行。优选地，将缺省参数用于比对。本领域中熟知的可以使用的一种比对程序是设置为默认参数的BLAST。具体地，程序是使用下列缺省参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；切断＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50序列；排序＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+瑞士蛋白质+SP更新+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心中找到。
可以例如，通过本领域熟知的重组和检测方法操作用于构建和测试生产具有通过氧化的TCA循环的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量的非天然存在的宿主的表达水平的方法。这类方法的描述可以见于，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sohs，马里兰州巴尔的摩(1999)。
可以利用本领域熟知的技术(包括但不限于接合、电穿孔术、化学转换法、转导、转染和超声转换)将外源性核酸序列稳定或瞬时地引入宿主细胞。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源性表达，真核细胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码导向信号(targeting signal)，如N-末端线粒体导向信号或其他导向信号，如果需要，其可以在转换进入原核宿主细胞之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致了大肠杆菌中表达的上调(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280：4329-4338(2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达，可以在胞质溶胶中表达基因，而不添加前导序列；或者可以通过添加适于宿主细胞的合适的导向序列(如线粒体导向或分泌信号)将基因导向线粒体或其他细胞器或者导向分泌。因此，理解的是，对核酸序列的适当的以去除或包含导向序列的修改可被纳入外源性核酸序列中，以提供所需的特性。此外，以本领域熟知的技术可以使基因经受密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
表达载体可以被构建以包括如本文所示范的可操作地连接于宿主生物中功能性的表达调控序列的一种或多种蛋白质或酶编码核酸。适用于本发明的宿主微生物的表达载体包括，例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体(包括可操作地用以稳定地整合到宿主染色体的载体和选择序列或标记)。此外，该表达载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达调控序列。还可以包括，例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中没有的关键营养物的选择标记基因。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子以及本领域公知的诸如此类的表达调控序列。当两个或两个以上外源性编码核酸被共同表达时，两个核酸都可以被插入，例如单一表达载体或独立表达载体。对于单一载体表达，编码核酸可被可操作地连接到一个共同的表达调控序列或连接到不同的表达调控序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以利用本领域熟知的方法确定代谢或合成途径中涉及的外源性核酸序列的转换。这类方法包括，例如核酸分析法，如Northern印迹法或mRNA聚合酶链反应(PCR)扩增；或基因产物表达免疫印迹法；或其他合适的测试被引入的核酸序列或其相应的基因产物的表达的分析方法。本领域的技术人员理解的是，以足以生产所需产品的量来表达外源性核酸以及进一步理解的是，可以利用本领域熟知的和本文披露的方法优化表达水平以获得足够的表达。
经设计的菌株可以通过测量生长速率、底物摄取速率和/或产品/副产物的分泌速率而得以表征。培养物可以被培育并用作用于新鲜分批培养物(在指数式生长期间对其进行测量)的接种物。生长速率可以通过使用分光光度计(A600)而测量光密度来确定。培养物上清液中的葡萄糖和其他有机酸副产物的浓度可以如本文所披露，通过熟知的方法(如HPLC、GC-MS或适于分析所需产品的其他熟知的分析方法)得以确定，并被用于计算摄取和分泌速率。
本发明提供一种生产生物衍生化合物的方法。该方法包含培养一种非天然存在的微生物，其具有本文所述的一种或多种代谢修饰以及用于生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该代谢修饰包含衰减和/或遗传改变，如本文所述的外源性编码核酸的表达。该代谢工程化途径可以将TCA循环中间体或TCA循环底物用于生物衍生化合物生产或利用衍生自非TCA循环代谢途径的底物。
在一个实施方式中，本发明提供一种生产生物衍生化合物的方法。该方法包含在足以生产所述生物衍生化合物的条件下培养一种非天然存在的微生物达足够的时间段，该微生物具有琥珀酰基-CoA合成酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减以及具有用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该非天然存在的微生物可以附加地包含一种或多种代谢修饰，包含乃至本文所述的所有的代谢修饰。
此外，本发明提供一种用于减少非天然存在的微生物中从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化，减少非天然存在的微生物中过量的CO2的产生，减少非天然存在的微生物中通过氧化的TCA循环的通量，降低每个非天然存在的微生物的氧利用率和/或增加非天然存在的微生物中ATP的可用性的方法。该方法包含培养具有如本文所述的一种或多种代谢修饰的一种非天然存在的微生物。该非天然存在的微生物可以作为参考或对照物被用于生成具有代谢工程化途径的生物以，例如生产生物衍生化合物。
可以利用熟知的方法进行适用于本文所述的工程化的一种或多种遗传改变测试的纯化和/或测定。可以为每个设计的待测菌株培育合适的复制品，如一式三份的培养物。例如，可以监测宿主中工程化的反应的代谢产物和副产物的形成。例如，可以通过各种方法，例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)或者其他利用本领域熟知的例行程序的合适的分析方法来分析产物和/或任何中间体。也可以利用培养上清液对工程化的代谢产物在发酵肉汤中的释放进行测试。可以利用，例如针对葡萄糖和醇的折光率检测器以及针对有机酸的紫外检测器(Lin等人，Biotechnol.Bioeng.90：775-779(2005))通过HPLC或本领域熟知的其他合适的测定和检测方法对副产物和残余葡萄糖进行定量。也可以利用本领域熟知的方法对来自外源性外源性核酸序列的个别酶或蛋白质活性进行测定。这类方法被示范于下文的实施例中。本领域熟知的其他方法还可以被用来测定本文所述的一种或多种代谢活性的产生。
来自本文所述的任何遗传改变的产物(包含，例如生物衍生化合物)可以利用本领域熟知的各种方法从培养物中的其他组分中分离。这类分离方法包括，例如萃取程序以及包括如下的方法：连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法以及超滤法。所有上述方法是本领域公知的。
本文所述的任何非天然存在的微生物可以被培养以生产和/或分泌，例如本发明的生物衍生化合物。例如，生产本发明的生物衍生化合物的宿主微生物可以被培养用于这类化合物的生物合成生产。相应地，在一些实施方式中，本发明提供具有本文所述的生物衍生化合物的培养基。在一些方面，该培养基也可以分离自产生了该生物衍生化合物的本发明的该非天然存在的微生物。用于从培养基分离微生物的方法是本领域公知的。示例性方法包含过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降等等。
为了生产生物衍生化合物，在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养重组菌株。在发酵罐中保持厌氧条件以降低整个过程的消耗，这在有时候是需要的并且肯定是非常可取的。这种条件的获取可以通过，例如首先用氮喷射该培养基，然后用垫片和钳口盖密封烧瓶。对于培育不遵循厌氧的菌株，可以通过在该垫片上打一小孔进行有限通气来采用微氧或者基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。示例性的有氧和厌氧条件的描述见于，例如2007年8月10日提交的美国公开号2009/0047719。如本文所披露，可以以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。如果需要的话，发酵也可以以两个阶段进行。第一阶段可以是有氧的，以顾及高生长以及因此高生产率，继之以高生物衍生化合物收率的厌氧阶段。
如果需要，可以将培养基的pH值保持为所需的pH值，特别是按需要通过添加碱(如NaOH或其他碱)或酸保持为中性pH值(如约7的pH值)，以将培养基保持在所需的pH值。可以通过利用分光光度计(600nm)测量光密度确定生长速率，以及可以通过监测随着时间的推移碳源的消耗确定葡萄糖摄取速率。
生长培养基可以包括，例如任何可以向该非天然存在的微生物提供碳源的碳水化合物源。这类源包括，例如：糖类(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉)或甘油，以及理解的是，碳源被单独用作唯一的碳源或组合本文所述的或本领域已知的其他的碳源。其他碳水化合物源包括，例如可再生的原料和生物质。可在本发明的方法中用作原料的示例性类型的生物质包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木素原料或原料的木素部分。这类生物质原料包含，例如用作碳源的碳水化合物底物(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉)。考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会理解除上文那些示例性的原料和生物质，可再生的原料和生物质也可用以培养本发明的用于减少从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化，减少过量的CO2的产生，减少通过氧化的TCA循环的通量，降低每个非天然存在的微生物的氧利用率或增加ATP的可用性的微生物。
培养条件可以包括，例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所描述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本文提供的生物合成产物的特别有用的收率。
如本文所描述，一种用于实现减少从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的转化，减少过量的CO2的产生，减少通过氧化的TCA循环的通量，降低每个微生物的氧利用率或增加ATP的可用性的示例性培育条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本发明的该非天然存在的微生物可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括，例如培养菌分批发酵或连续发酵以便培养基中溶解的氧浓度保持在0和10％的饱和度之间。基本上厌氧的条件还包括在保持在小于1％的氧气氛中的密封室内部的液体培养基中或固体琼脂上培育或静置细胞。可以通过，例如用N2/CO2混合物或一种或多种其他合适的非氧气体喷射培养菌来保持氧的百分比。
本文所述的培养条件可以按比例扩大并连续增长，以用于制造所需的产品。示例性的培养程序包括，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或者连续发酵和连续分离。所有这些过程都为本领域所熟知。发酵程序对于工业规模的所需的产品的生物合成生产是特别有用的。一般地以及与非连续培养程序一样，所需的产品的连续和/或接近连续的生产将包括在足够的营养物和培养基中培养本发明的非天然存在的微生物，以维持和/或接近维持指数期的生长。这种条件下的连续培养可以包括，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天的培育或培养。此外，连续培养可以包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周乃至数月。替代性地，如果适于具体的应用，本发明的生物可以培养数小时。理解的是，连续和/或接近连续培养的条件还可以包括这些示例性周期之间的所有的时间间隔。进一步理解的是，本发明的该微生物的培养时间是足以生产足够量的用于所需目的的产品的时间段。
发酵程序为本领域所熟知。简言之，可以以，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离的方式利用用于生物衍生化合物的生物合成生产的发酵。分批和连续发酵程序的例子为本领域所熟知。
理解的是，在本文提供的本发明的定义内提供基本上不影响本发明的各种实施方式的活性的修饰。因此，以下实施例旨在说明但不限制本发明。
实施例I
YciA、YbfF、YdiI的删除
本实施例描述了宿主菌株6286中三种内源性CoA水解酶的删除以及对该宿主菌株6286中琥珀酸产量的影响。
96孔板的培养条件.将96孔板中的所有的培养物在1.2ml的M9培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中生长，该培养基补充有10mM NaHCO3以及100mM MOPS以改善缓冲能力。还添加了5％葡萄糖形式的碳源。通过用两个透气性粘合密封件覆盖该板获得微需氧条件。将该密封件的边缘用胶带贴住以减少蒸发。在37℃下培养所有的培养物。用于生物质、BDO、4HB和琥珀酸的定量的分析方法被报道于US20140030779和Yim等人，NatureChemicalBiology 7：445-452(2011)中。
为了测试内源性CoA水解酶对琥珀酰基-CoA到琥珀酸转化的影响，将宿主菌株6286中的yciA、ybfF以及ydiI删除。菌株6619衍生自删除了yciA的菌株6286。菌株6620衍生自删除了ydiI的菌株6286。菌株6618衍生自删除了ybfF的菌株6286。
菌株6286衍生自菌株6025，额外地删除了琥珀酸脱氢酶(sdhA)。菌株6025衍生自其构建被描述于US20110045575、US20140030779以及Yim等人，Nature Chemical Biology7：445-452(2011)的菌株ECKh-432。该ECKh-432基菌株中显著的修饰包含adhE、ldhA、pflB以及mdh中的删除。菌株6025还含有将琥珀酰基-CoA转化为BDO的基因的染色体整合的副本。这些基因包含CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸酯脱氢酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶(ALD)、4-羟基丁醛还原酶(ADH)以及4-羟基丁酰基-CoA转移酶。菌株6025还含有四种原生的醇脱氢酶基因adhP、yqhD、yahK以及yjgB中的删除。这种菌株还具有细胞色素氧化酶、cyoABCD以及appBC、琥珀酰基-CoA合成酶(sucCD)、乙醛酸支路(aceBAK)、前噬菌体整合位点(yciI)以及鞭毛的生物合成基因(flhCD、motA)、预想到的运载体(yebQ)、酰基-CoA水解酶(ybgC、tesB、ybhC)、天冬氨酸-氨裂解酶(aspA)、铁色素/噬菌体/抗生素外膜孔蛋白(fhuA)、谷氨酸合酶(gltBD)、低特异性苏氨酸醛缩酶(ltaE)、PEP羧激酶(pckA)、甘氨酸裂解系统组分(gcvT)、麦芽糖外膜孔蛋白/λ噬菌体受体蛋白质(lamB)和菌毛基因(fimABCDEFGHI)的删除。此外，ppc的天然启动子被更强的组成型启动子所取代。菌株6025还包含灭活的arcA基因(Silverman等人，JBacteriol.173(18)：5648-5652(1991))。对一些原生的基因进行染色体过表达：ackA、pta、sucA、sucB和lpdA。
yciA、ydiI以及ybfF的删除使用如前所述的两步双交换同源重组方法得以实现(Yim等人，Nature Chem Biol 7：445-52(2011)；US20140030779)。重组经由来自pRED-Amp(德国海德堡的Gene Bridges)的λ噬菌体红色基因的表达催化。编码来自枯草芽孢杆菌和卡那霉素抗性的果聚糖蔗糖酶(sacB)的基因被整合到染色体中。卡那霉素被用于选择成功的整合体。在第二个双交换同源重组步骤中，用适当的DNA序列(删除或插入或突变)取代含有果聚糖蔗糖酶基因和卡那霉素抗性克隆物的整合序列，以及对蔗糖抗性克隆物进行卡那霉素敏感性选择。经由标准分子生物学技术构建上面概述的同源重组步骤中使用的DNA序列。重组后，对包含修饰的染色体区域进行PCR扩增以及测序，以便验证预期的修饰是否按计划发生。因此，对覆盖任何调节序列的侧翼区(500-1000nt之间)进行序列验证。
如下引物被用来确认yciA、ydiI以及ybfF删除：
Figure BDA0001066214540000561
结果，如下的核苷酸被删除：1，309，961-1，310，181(yciA)、711，267-712，043(ybfF)以及1，763，374-1，763，651(ydiI)。
菌株6286具有破坏或改变该TCA循环的若干遗传修饰。arcA的灭活实现了通过该氧化的TCA循环的增加的通量。破坏ArcA调节子还提高了细胞色素氧化酶(cyo以及cyd两者)相对于ArcA-野生型菌株的表达水平。破坏的sucCD(琥珀酰基-CoA合成酶)减少了从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的TCA循环通量。该TCA循环通过将琥珀酸转化为富马酸的琥珀酸脱氢酶的删除被进一步破坏。表19显示96孔板中从有和没有yciA的菌株6286生产BDO以及副产物。内源性琥珀酰基-CoA到琥珀酸的活性导致这种菌株中琥珀酸的积聚。菌株6286中yciA的删除导致琥珀酸的产量减少，显示出减少的琥珀酰基-CoA到琥珀酸的活性。附加地，在删除了yciA的细胞中观察到较高的BDO以及4HB，这为这种菌株中进入BDO途径的增加的通量提供了支持。
表19.删除以及未删除yciA、ybfF以及ydiI的茵株6286中BDO的生产。显示了四种复制培养物。所有的浓度以mM为单位并在96孔板中培养24小时的时间后进行测定。
菌株 修饰 OD BDO 4HB Succ BDO/Succ
6286 3.58 71.0 8.9 19.0 3.7
6286 3.57 74.6 9.7 18.8 4.0
6286 3.6 77.4 8.9 18.7 4.1
6286 3.42 70.8 9.9 19.0 3.7
6619 YciA删除 3.59 86.4 15.1 6.4 13.4
6619 YciA删除 3.43 82.0 14.2 6.5 12.5
6619 YciA删除 3.66 90.1 14.9 6.9 13.0
6619 YciA删除 3.77 88.9 15.4 6.7 13.2
6618 YbfF删除 4.05 59.4 7.7 38.4 1.4
6618 YbfF删除 3.89 64.4 8.9 34.4 1.9
6618 YbfF删除 3.87 52.4 8.5 40.6 1.3
6618 YbfF删除 3.72 58.3 7.9 39.0 1.5
6620 YdiI删除 3.86 73.4 10.3 23.4 3.1
6620 YdiI删除 3.52 89.2 10.6 24.1 3.7
6620 YdiI删除 4.04 77.9 10.5 25.2 3.1
6620 YdiI删除 3.49 81.7 9.2 24.9 3.3
实施例II
通过YciA删除减少过量的CO2
本实施例描述了有和没有yciA的菌株的生长期13C通量分析，证实了具有破坏的sucCD的菌株中yciA的删除导致减少的琥珀酰基-CoA到琥珀酸通量以及减少的过量的CO2。该实施例还显示对呼吸链的能量效率的改变可以改善删除了YciA的菌株的生长速率。
生长期13C通量分析实验和计算方法是本领域中已知的并且被描述于Yang，T.H.，13C-Based Metabolic Flux Analysis：Fundamentals and Practice，in SystemsMetabolic Engineering：Methods and Protocols 297-334(Alper，H.S.ed.，2013)。总之，于摇瓶中在补充有均一标记的13C-葡萄糖的M9基本培养基中培育培养物。对对数中期指数生长中的培养物取样。对代谢产物(生物质成分和分泌的代谢产物)进行分离并通过质谱法定量。根据浓度测量值，计算出细胞生产和消耗的所有细胞外物种(包括生物量和CO2)的累计收率系数。通过如先前所述的气相色谱-质谱(GCMS)分析13C标记形式的代谢产物(Fischer和Saucr，Eur.J.Biochem.270：880-891(2003))。使用包括中心代谢和BDO生产反应的反应网络，进行数值优化以估算来自通过实验获得的代谢物浓度和13C标记形式的体内通量。
进行生长期13C通量分析以评估yciA对中心代谢途径的影响。在本实施例中使用的菌株是6025(yciA+)、6616(6025 ΔyciA)和6729(6025+cyoABCD ΔyciA)。菌株6025、6616和6729的中心代谢途径之间的通量(每单位葡萄糖)分布被示于表20中。
表20.菌株6025、6616和6729的中心代谢途径之间的通量(每单位葡萄糖)分布
Figure BDA0001066214540000581
该结果显示相比该6025对照物，菌株6616和6729中从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的通量分别从32％减少到12％和15％。yciA的删除没有显著地改变通过戊糖磷酸途径的通量。6616和6729中每单位葡萄糖的过量的CO2由于减少的琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性从2.35减少到1.89-1.90。
在6025菌株背景中，6025、6616以及6729的生长速率的比较显示yciA和cyo两者的破坏对生长速率有显著影响。作为唯一的细胞色素氧化酶的删除了yciA和cyd的菌株(6616)相比cyd和cyo两者均存在的菌株(6729)，以显著较慢的速率生长。更高能效的细胞色素氧化酶的再引入提高了每单位葡萄糖的ATP可用性，以及部分地缓解了TCA循环破坏导致的ATP短缺。
实施例III
YciA删除菌株中比耗氧量的减少
本实施例描述了有和没有YciA的菌株中每个细胞的比耗量的减少。
预计具有衰减的TCA循环的菌株进行呼吸作用和利用氧的能力下降。为了评估YciA删除是否对耗氧能力有影响，对有和没有该YciA删除的菌株进行补料分批好氧发酵。评估的菌株是6435和6729。菌株6435衍生自恢复了野生型cyoABCD的6025。菌株6729衍生自删除了yciA的6435。
使用补充有20g/L葡萄糖的M9基本培养基，在2L BiostatB+生物反应器(Sartorius；CedexFrance)中按1L初始培养物体积进行补料分批发酵。将温度控制在35℃，以及使用2M NH4OH或Na2CO3将pH控制在6.75。以好氧方式培育细胞以及没有强加营养物质限制。使用Presens Oxy4溶解的氧探头测量氧气。
生物质、时间、比耗氧速率(S-OUR)和瞬时比摩尔耗氧速率(ISMOUR)示于表21中。根据培养物OD(1OD当量＝0.4g干细胞重量/L)计算生物质测量值。该瞬时比摩尔耗氧速率是耗氧速率差除以生物质差除以测量值的时间间隔。
表21.菌株6729和6435中的生物质、时间、S-OUR和ISMOUR.
Figure BDA0001066214540000591
在发酵的所有的时间段，菌株6729证实了相比6435，减小的比耗氧速率。6729中的生物质形成速率也较慢。
实施例IV
YciA删除组合PntAB过表达减少了过量的CO2
本实施例描述了有和没有转氢酶(pntAB)的基于质粒的过表达的yciA删除菌株的生长期13C通量分析。
用于pntAB的表达载体的开发.载体骨架从Expressys(expressys.de)的RolfLutz博士处获得。载体和菌株基于先前描述的pZ表达系统(Lutz和Bujiard，Nucleic AcidsRes.25：1203-1210(1997))。具体地，获得含有作为填充片段的萤光素酶基因的pZS*13luc。为了用两侧有适当的限制性酶位点的lacZ-α片段取代荧光素酶填充片段，首先通过用EcoRI和XbaI消化将该萤光素酶填充片段从每个载体中去除。该lacZ-α片段是用以下引物从pUC19扩增的PCR：lacZα-RI
5′GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTT(SEQ IDNO：7)
AC3′
lacZα3′BB
5′-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3′(SEQ ID NO：8)。
这生成了具有EcoRI位点、NheI位点、核糖体结合位点、SalI位点和起始密码子的5′端的片段。该片段的3′端包含终止密码子、XbaI、HindIII和AvrII位点。PCR产物用EcoRI和AvrII消化并连接到用EcoRI和XbaI消化的基本载体(XbaI和AvrII具有相容性末端并生成非位点)。因为NheI和XbaI限制性酶位点生成可以连接在一起的相容性末端(但在连接后生成不由任一酶消化的位点)，所以克隆到载体中的基因可以是以生物砖(Biobrick)的形式组合起来(openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology：BioBricks)。简言之，该方法允许通过使用相同的2个限制性位点，使数量不受限制的基因加入到载体中，只要该位点看起来不在该基因的内部，因为该基因之间的该位点在每次添加后都被破坏。最初，来自这些载体的表达较低，以及随后使用
Figure BDA0001066214540000601
定点诱变试剂盒(马萨诸塞州伊普斯威奇的NEB)对其进行修饰以在EcoRI和NheI位点之间插入间隔序列AATTAA。这消除了结合有RBS和起始密码子的RNA中假定的茎环结构。
所有载体都具有pZ命名，其后是表明复制源、抗生素抗性标记和启动子/调控单元的字母和数字。复制源是第二个字母，以及基于ColE1的源以E，基于p15A的源以A以及基于pSC101的源以S(以及较低拷贝数版本的pSC101被命名为S*)表示。第一个数字代表该抗生素抗性标记(1为氨苄青霉素，2为卡那霉素，3为氯霉素)。最后一个数字定义了调节有关的基因的启动子(1为PLtetO-1，2为PLlacO-1以及3为PAllacO-1)以及这些启动子的每个逐渐由其相应的诱导剂分子活化(pLtetO可通过四环素诱导；pLlacO-1和pAllacO-1可以用IPTG诱导)。进一步设计基本载体pZS*13S。
除了上面提到的“诱导型”启动子之外，从注册表(partsregistry.org)中采样一组“组成型”启动子。然后将这些“组成型”启动子中的每一个引入pZS*13S载体骨架以经由先前描述的序列与连接独立性克隆方法(SLIC)取代pA1lacO-1诱导型启动子(Li等人，Nature Methods 4：251-256(2007))。针对这些采样的“组成型”启动子(p100、p104、p105、p107、p108、p111、p115&p119)，进行了实验，以建立由蛋白质表达水平验证的启动子强度级。为了这些实验，选择p115进行pntAB表达。为了进一步下拨pntAB的蛋白质表达水平，使用RBS计算器(salis.psu.edu/software/)对启动子和基因编码序列之间的核糖体结合位点(RBS)相应地作了修改。
下文列出了用于将pntAB插入pZS*13S载体骨架的SLIC引物。下面的情况表示针对载体骨架退火的序列，而上面的情况表示针对基因的编码区域退火的序列。
1.phtAB
正向SLIC引物：gaggagaagtcgacATGAACGAACAATATTCCGCATTGCG(SEQ ID NO：9)
反向SLIC引物：ggaagctttctagaTTAGCCGGTATTACGCATACCTGCC(SEQ ID NO：10)。
通量分析结果.如前所述进行生长期13C通量分析以评价pntAB过表达对通过戊糖磷酸途径的通量，该琥珀酰基-CoA到琥珀酸反应以及过量的CO2形成的影响。预期pntAB的过表达通过消耗NADH而生成NADPH减少了通过戊糖磷酸途径的通量。本实施例中使用的菌株是用如下质粒的一种转换的6729(6025+cyoABCD ΔyciA)：(1)pZS*-p115-空载体，(2)pZS*-p115-6K-RBS-pntAB，(3)pZS*-p115-13K-RBS-pntAB，(4)pZS*-p115-pntAB。质粒2-4以增加的水平表达由pntAB编码的结合膜的转氢酶，其中p115-pntAB的表达最强。
每个菌株/质粒组合的中心代谢途径中通量(每单位葡萄糖)的分布被示于表22中。
表22.用如下质粒的一种转换的6729(6025+cyoABCD ΔyciA)的中心代谢途径中通量(每单位葡萄糖)的分布：(1)pZS＊-p115-空载体，(2)pZS＊-p115-6K-RBS-pntAB，(3)pZS＊-p115-13K-RBS-pntAB，(4)pZS＊-p115-pntAB.
Figure BDA0001066214540000611
生长期通量分析确认了pntAB OE通过减少通过该戊糖磷酸途径和该氧化的TCA循环的通量(通过该琥珀酰基-CoA到琥珀酸反应得以控制)减少了过量的CO2。
实施例V
利用CydAB删除增加培育收率
本实施例证实了可以通过经由cydAB删除改善电子传递链的能量效率获得提高的培育收率。
通过删除编码细胞色素bd-I复合物的cydAB使由cyo操纵子编码的细胞色素bo复合物称为主要的细胞色素氧化酶复合物。该细胞色素bo复合物积极地泵送电子越过膜以及导致H+/2e-化学计量学为4。该细胞色素bd-I复合物看起来没有积极地泵送质子。然而，由于该膜的周质侧上醌醇的氧化胞以及在水的形成中使用的来自该膜的胞质侧的质子的随后摄取，净电子转移导致H+/2e-化学计量学为2。由于细胞色素bo复合物具有比该细胞色素bd-I复合物更多的质子移位化学计量学，电子传递链的能量效率可以通过cydAB的删除得以改善。
宿主菌株7032类似于如上所述的6025。它包含恢复的野生型cyo操纵子而且是sucCD。宿主菌株7143衍生自7032，但包含cydAB的删除。使用如Yim等人(Yim等人，NatureChem Biol 7：445-52(2011))和US20140030779中所述的两步骤双交换同源重组方法实现cydA和cydB的删除。重组经由来自pRED-Amp(德国海德堡的Gene Bridges)的λ噬菌体红色基因的表达催化。编码来自枯草芽孢杆菌和卡那霉素抗性的果聚糖蔗糖酶(sacB)的基因被整合到染色体中。卡那霉素被用于选择成功的整合体。在第二个双交换同源重组步骤中，用适当的DNA序列(删除或插入或突变)取代含有果聚糖蔗糖酶基因和卡那霉素抗性基因的整合序列，以及对蔗糖抗性克隆物进行卡那霉素敏感性选择。经由标准分子生物学技术构建上面概述的同源重组步骤中使用的DNA序列。重组后，对包含修饰的染色体区域进行PCR扩增以及测序，以便验证预期的修饰是否按计划发生。因此，对覆盖任何调节序列的侧翼区(500-1000nt之间)进行序列验证。
如下引物被用来确认cydAB删除：
引物命名 引物序列 SEQ ID NO
cydAB F1 AGCCAGGCAGTGGGATTGTG 11
cydAB R1 GGCAAACATCTACATCGCATTC 12
结果，如下的核苷酸被删除：1，309，961-1，310，181(cydAB)。
使用补充有20g/L葡萄糖的M9基本培养基，在2L BiostatB+生物反应器(Sartorius；CedexFrance)中按1L初始培养物体积进行补料分批发酵。将温度控制在35℃，以及使用2M NH4OH或Na2CO3将pH控制在6.75。以好氧方式培育细胞直到达到45mmol O2/kg/hr的基于重量的峰值耗氧速率(wOUR)。此时，总供氧量(mmol/hr)保持不变，但由于越来越大的液体体积，该wOUR逐渐减小，导致微需氧条件[溶解氧(DO)浓度＝0(即低于检出限)；耗氧速率＝氧转移速率]。9小时时所有的培养物达到DO＝0。总发酵时间为24小时。因此，大部分的增长发生在氧气受限的条件下。没有强加营养物质限制。使用Presens Oxy4溶解的氧探头测量氧气。
形成的总生物质、消耗的氧以及每单位消耗的氧形成的生物质如表23中所报告。根据培养物OD(1OD当量＝0.4g干细胞重量/L)和液体体积计算生物质值。cydAB的删除允许每单位消耗的氧分子形成更大量的生物质。由于cyd菌株中氧的生物质收率较高，较低峰值的wOUR可被用以生成相同量的作为cyd+菌株的细胞团块。因此，相比cyd+菌株中，cyd菌株中CO2呼吸收率损失较低。
表23.发酵24小时时为菌株7032和7143提供的总生物质形成量、消耗的氧以及每单位消耗的氧生成的生物质
Figure BDA0001066214540000621
实施例VI
通过PykF的删除和/或PntAB的过表达增加SucCD CydAB删除菌株的产物收率
本实施例证实了在sucCD cydAB删除菌株中每单位生物质的BDO产量可以通过pntAB过表达和/或pykF的删除得以提高。
如实施例V中所述删除了菌株7143中的pykF。菌株7143缺乏sucCD以及cydAB两者。来自菌株7143的pykF的删除产生菌株7342。使用如前所述(Yim等人，Nature Chem Biol 7：445-52(2011))和US20140030779的两步骤双交换同源重组方法实现pykF的删除。如下引物被用来确认pykF删除：
引物命名 引物序列 SEQ ID NO
pykF F1 AGCCAGGCAGTGGGATTGTG 13
pykF R1 GGCAAACATCTACATCGCATTC 14
结果，如下核苷酸被删除了：1，309，961-1，310，181(pykF)。
使用实施例IV中所述的表达载体过表达菌株7143和7342中的pntAB基因。pZS*-p115-13K-RBS-pntAB由于减少的RBS强度导致pntAB表达低于pZS*-pi15-pntAB。如实施例I中所述在96孔板中培养菌株。表24显示每单位生成的生物质合成的BDO的量在删除pykF后得以提高。表24还显示这种提高在pntAB过表达后在菌株7143和菌株7342两者中得以放大。
表24.有和没有增加的pntAB表达的菌株7143和7342中每单位OD的BDO产量。示出96孔板中培养时间达24小时之后四种复制培养物的平均值。
Figure BDA0001066214540000631
实施例VII
删除PvkF和/或过表达PntAB后增加SucCD CydAB YciA删除茵株的产物收率
本实施例证实了在sucCD cydAB yciA删除菌株中每单位生物质的BDO产量可以通过pntAB过表达和/或pykF的删除得以提高。
如实施例V中所述删除了菌株7143中的yciA。菌株7143缺乏sucCD以及cydAB两者。来自菌株7143的yciA的删除产生菌株7170。使用Yim等人(Yim等人，Nature Chem Bioiol7：445-52(2011))和US20140030779中所述的两步骤双交换同源重组方法实现yciA的删除。如下引物被用来确认yciA删除：
引物命名 引物序列 SEQ ID
yciA F1 AGCCAGGCAGTGGGATTGTG 15
yciA R1 GGCAAACATCTACATCGCATTC 16
结果，如下核苷酸被删除了：1，309，961-1，310，181(yciA)。
如实施例V中所述删除了菌株7170中的pykF。菌株7170缺乏sucCD、yciA和cydAB。来自菌株7170的pykF的删除产生菌株7341。使用如Yim等人(Yim等人，Nature ChemBiol 7：445-52(2011))和US20140030779中所述的两步骤双交换同源重组方法实现pykF的删除。如下引物被用来确认pykF删除：
引物命名 引物序列 SEQ ID NO
pykF F1 AGCCAGGCAGTGGGATTGTG 17
pykF R1 GGCAAACATCTACATCGCATTC 18
结果，如下核苷酸被删除了：1，309，961-1，310，181(pykF)。
使用实施例IV中所述的表达载体过表达菌株7170和7341中的pntAB基因。pZS*-p115-13K-RBS-pntAB由于减少的RBS强度导致pntAB表达低于pZS*-p115-pntAB。如实施例I中所述在96孔板中培养菌株。表25显示每单位生成的生物质合成的BDO的量在删除pykF后得以提高。表25还显示这种提高在pntAB过表达后在菌株7170和7341两者中得以放大。
表25.有和没有增加的pntAB表达的茵株7170和7341中每单位OD的BDO产量。示出96孔板中培养时间达24小时之后四种复制培养物的平均值。
Figure BDA0001066214540000641
实施例VIII
通过PntAB的过表达增加SucCD PykF删除菌株的BDO产量
本实施例证实了在sucCDpykF菌株中BDO的产量可以通过过表达pntAB得以提高。
宿主菌株7032类似于如上所述的6025。它包含恢复的野生型cyo操纵子而且是sucCD。使用实施例IV中所述的表达载体过表达菌株7032中的pntAB基因。pZS*-p115-13K-RBS-pntAB由于减少的RBS强度导致pntAB表达低于pZS*-p115-pntAB。如实施例I中所述在96孔板中培养菌株。表26显示过表达pntAB后合成的BDO的量得以提高。
表26.有和没有增加的pntAB表达的菌株7023中的BDO产量。示出96孔板中培养时间达24小时之后四种复制培养物的平均值。
菌株 质粒 关键的代谢修饰 BDO(mM)
7023 无 ΔsucCD、ΔpykF 50.0
7023 pZS*-p115-13k-RBS-pntAB ΔsucCD、ΔpykF、过表达的pntAB 62.3
7023 pZS*-p115-pntAB ΔsucCD、ΔpykF、过表达的pntAB 53.0
实施例IX
通过删除Cyd增加SucCD YciA删除菌株的BDO产量
本实施例证实了在sucCD yciA菌株中BDO的产量可以通过删除cydAB得以提高。
宿主菌株7313类似于上文所述的菌株7341。这两种菌株均含有恢复的野生型cyo操纵子以及是pykF、yciA和sucCD。菌株7341含有cydAB基因中的删除。表27显示菌株7341相比7313，合成的BDO的量得以提高。
表27.茵株7313和7341的BDO产量。示出96孔板中培养时间达24小时之后四种复制培养物的平均值。
茵株 质粒 关键的代谢修饰 BDO(mM)
7313 无 ΔsucCD、ΔyciA、ΔpykF 47
7341 无 ΔsucCD、ΔyciA、ΔpykF、ΔcydAB 57
实施例X
ClpA删除中改善的生长速率
本实施例证实了在具有灭活的ClpA蛋白质或clA基因删除的菌株中改善的生长速率。
ClpA是ClpAP和ClpAXP蛋白酶复合物(不同群体的能量依赖性伴侣蛋白/蛋白酶复合物的成员)的ATP-依赖性伴侣蛋白组分(Reid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(7)：3768-3772(2001)；Kessel等人，J.Mol.Biol.250(5)：587-594(1995))。ClpAP蛋白酶在不同的细胞活性中起作用，包括积聚的和ssrA-标记的蛋白的降解，固定相的适应和生存能力以及响应于碳饥饿和环境应激的蛋白的调节(Gottesman等人，Genes Dev.12：1338-47(1998))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
clpA NP_415403.1 GI：16128850 大肠杆菌
clpP NP_414971.1 16128422 大肠杆菌
clpX NP_414972.1 16128423 大肠杆菌
5723中clpA的恢复.设计实验以测试clpA恢复到野生型是否对生长有影响。在菌株中发现了clpA基因中的碱基对删除(碱基对254)。这种删除的功能性效果是ClpA蛋白质，以及ClpAP和ClpAPX蛋白酶复合物的过早截断，从而实现其失活。将5723中的clpA基因恢复至野生型并对其进行关于野生型clpA和具有突变的clpA之间的生长差异的测试。具有SacBKan盒的菌株版本将500个碱基对插入到clpA基因中。
测试菌株在BIOscreen的FM1培养基中的生长情况。将clpA基因恢复到其野生型形式对5723中的生长稍有损害。具有SacBKan盒的版本不具有相同的损害。这些结果表明蛋白酶的ClpA组分的删除或衰减提高了生长速率。
本申请全文中已经引用了各种出版物。本申请中特此以引用方式并入这些出版物披露的全文(包括GenBank和GI号码公布)，以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。虽然已经就上文提供的实施例对本发明进行了描述，但是应该理解的是，在不脱离本发明精神的情况下，可以作出各种修改。
Figure IDA0001066214610000011
Figure IDA0001066214610000021
Figure IDA0001066214610000031
Figure IDA0001066214610000041

Claims (8)

1.一种非天然存在的微生物，其包含：衰减由cydA或cydB或其直系同源基因编码的细胞色素氧化酶的遗传改变，和提高由pntAB或其直系同源基因编码的NAD(P)转氢酶的表达的遗传改变；以及衰减由sucCD或其直系同源基因编码的琥珀酰基-CoA合成酶的遗传改变，和衰减由yciA或其直系同源基因编码的CoA水解酶的遗传改变。
2.权利要求1所述的非天然存在的微生物，其进一步包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。
3.权利要求2所述的非天然存在的微生物，其中，所述生物衍生化合物选自由如下组成的组：4-羟基丁酸酯(4HB)、1,4-丁二醇(1,4-BDO)、1,3-丁二醇(1,3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。
4.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物选自由如下组成的组：细菌、酵母和适用于发酵过程的其他微生物。
5.权利要求4所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物是细菌。
6.权利要求5所述的非天然存在的微生物，其中，所述细菌是大肠杆菌。
7.权利要求2所述的非天然存在的微生物，其中，该生物衍生化合物的收率相对于缺乏所述遗传改变是提高的。
8.一种生产生物衍生化合物的方法，包含在足以生产所述生物衍生化合物的条件下将权利要求2所述的非天然存在的微生物培养达足够的时间段。
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