BR112016014779B1 - Organismos microbianos que não ocorrem naturalmente, e método de produção de um composto bioderivado - Google Patents

Abstract

ORGANISMOS MICROBIANOS QUE OCORREM DE FORMA NÃO NATURAL, SEU COMPOSTO BIODERIVADO E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO. A presente invenção refere-se a um organismo microbiano que ocorre de forma não natural compreendendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA ou transferase e, pelo menos, uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou a um gene que codifica uma enzima de succinato de produção dentro de uma via de várias etapas que tem uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato.

Description

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se aos organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente tendo reduzido o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo. A presente invenção também fornece métodos de redução do fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo usando os organismos microbianos.

[002] A perda de carbono, por excesso de produção de CO2, pode vir de três rotas principais no metabolismo central: a via das pentoses fosfato, desvio glioxilato e o ciclo oxidativo do ácido tricarboxílico (TCA). A principal reação de geração de CO2 da via das pentoses fosfato desidrogenase é fosfogluconato. As enzimas que podem contribuir para a perda de carbono no ciclo do TCA e glioxilato de derivação incluem, por exemplo, piruvato desidrogenase, piruvato formiato liase, oxidase do piruvato, desidrogenase de alfa-cetoglutarato, isocitrato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxicinase, e enzima málico.

[003] A perda de carbono também pode vir de outras reações metabólicas que incluem, por exemplo, o sistema de glicina clivagem, formiato \liase de hidrogênio, formiato desidrogenase, glutamato descarboxilase, oxidase do piruvato, acetolactato-sintase e 2-oxo-4- metil-3-carboxipentanoato descarboxilase, descarboxilase do aspartato, descarboxilase da lisina, descarboxilase diaminopimelato e enzimas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos.

[004] Dessa maneira, existe uma necessidade de meios alternativos para diminuir a perda de carbono e aumentar a eficiência do fluxo de carbono. A presente invenção satisfaz esta necessidade e proporciona também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção refere-se a um organismo microbiano que não ocorre naturalmente compreendendo uma primeiro atenuação de uma sintetase de succinil-CoA ou transferase e, pelo menos, uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou a um gene que codifica uma enzima de produção de succinato dentro de uma via de múltipla etapas que tem uma conversão líquida de succinil- CoA a succinato. A sintetase de succinil-CoA redutase pode ser codificada por sucCD. A enzima de conversão da succinil-CoA redutase pode ser a enzima YciA CoA-hidrolase. O organismo microbiano pode ainda incluir o aumento da expressão de uma transhidrogenase piridina de nucleotídeo incluindo onde transhidrogenase piridina de nucleotídeo é codificada por pntAB. O organismo microbiano pode também incluir atenuação de um ciclo do TCA de enzima diferente de uma sintetase de succinil-CoA redutase ou transferase. O organismo microbiano pode incluir uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermediário de TCA ou um ciclo do substrato de TCA. O composto bioderivado pode ser 4- hidroxibutirato (4HB), 1,4-butanodiol (1,4-BDO), 1,3-butanodiol (1,3- BDO), poli-hidroxilbutanoato (PHB), butadieno, adipato, 6- aminocaproato , caprolactama ou o ácido metacrílico, ou outros compostos descritos na presente invenção. A presente invenção refere- se a outras alterações genéticas para aumentar a produção de um composto bioderivado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[006] A Figura 1 mostra as vias metabólicas centrais geradoras de CO2, incluindo (1) a via da pentose fosfato; (2) o ciclo completo TCA oxidativo; e (3) o desvio glioxilato. Abreviaturas: Glc é glicose, G6P é a glicose-6-fosfato, F6P é frutose-6-fosfage, FBP é frutose-1,6-bifosfato, G3P é gliceraldeído-3-fosfato, PEP fosfoenolpiruvato é, Pir é piruvato, cit é citrato, ICIT é isocitrato, AKG é alfa-cetoglutarato, Succ é succinato, Fum é fumarato, Mal é malato, OAA é oxaloacetato, 6PGL é 6- phospogluconolactone, Ru5P é ribulose-5-fosfato, E4P é eritrose-4- fosfato, S7P é sedoeptulose-7-fosfato, e Glx é glioxilato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[007] A presente invenção refere-se aos organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente com fluxo de carbono reduzido de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo, em que o organismo microbiano inclui uma ou mais rupturas genéticas. A presente invenção também fornece os métodos de redução do fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo usando os organismos microbianos.

[008] Tal como usado na presente invenção, o termo "que não ocorre naturalmente" quando usado em referência a um organismo microbiano ou microrganismo da presente invenção destina-se a significar que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética que não são normalmente encontradas em uma cepa que não ocorre naturalmente das espécies referenciadas, incluindo as cepas de tipo selvagem das espécies referenciadas. As alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações de introdução de ácidos nucleicos que codificam para polipeptídeos expressáveis metabólicos, outras adições de ácido nucleico, deleções de ácido nucleico e / ou outras rupturas funcionais do material genético do organismo microbiano. Tais modificações incluem, por exemplo, as regiões de codificação e os seus fragmentos funcionais, para heterólogo, homólogo ou ambos os polipeptídeos heterólogos e homólogos das espécies mencionadas. As modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras não- codificantes, em que as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Os polipeptídeos metabólicos ilustrativos incluem, por exemplo, enzimas ou proteínas que convertem succinil-CoA para succinato, enzimas do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA), transhidrogenase piridina de nucleotídeo, NADH dehirogenase, oxidase ubiquinol, enzimas biossintéticas menaquinona, menaquinol enzimas biossintéticas, fosfoenoilpiruvato carboxiquinase (PEPCK) , carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) e enzimas ou proteínas dentro de uma via biossintética do produto bioderivado.

[009] Uma modificação metabólica refere-se a uma reação bioquímica que é alterada do seu estado de ocorrência natural. Por isso, os microrganismos que não ocorrem de forma natural podem ter modificações genéticas para meio dos ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos metabólicos, ou seus fragmentos funcionais. As modificações metabólicas exemplificativos são descritas na presente invenção.

[0010] Os organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção podem conter alterações genéticas estáveis, que refere-se a microrganismos que podem ser cultivados por mais de cinco gerações sem perda da alteração. Em geral, as alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem maior do que 10 gerações, particularmente as modificações estáveis irão persistir mais do que cerca de 25 gerações, e mais particularmente, as modificações genéticas estáveis serão maior do que 50 gerações, incluindo indefinidamente.

[0011] Tal como usado na presente invenção, o termo "isolado" quando usado em referência a um organismo microbiano pretende significar um organismo que é substancialmente livre de, pelo menos, um componente uma vez que o organismo microbiano referenciado é encontrado na natureza. O termo inclui um organismo microbiano que é removido a partir de alguns ou todos os componentes, uma vez que se encontra no seu ambiente natural. O termo também inclui um organismo microbiano que é removido a partir de alguns ou todos os componentes uma vez que o organismo microbiano é encontrado em ambientes que não ocorrem de forma natural. Por conseguinte, um organismo microbiano isolado é parcialmente ou completamente separado de outras substâncias, uma vez que é encontrado na natureza ou que é cultivado, armazenado ou subsistiu em ambientes que não ocorrem de forma natural. Exemplos específicos de organismos microbianos isolados incluem micróbios parcialmente puros, micróbios substancialmente puros e micróbios cultivados em um meio que é o que não ocorre naturalmente.

[0012] Tal como usado na presente invenção, os termos "microbianos", "organismo microbiano" ou "microorganismo" pretendem significar qualquer organismo que existe como uma célula microscópica que se encontra incluída dentro dos domínios de Archaea, bactérias ou eukarya. Portanto, o termo destina-se a englobar as células ou organismos procariotas ou eucariotas que possuem um tamanho microscópico e inclui bactérias, arquebactérias e eubactérias de todas as espécies, bem como microrganismos eucarióticos, tais como leveduras e fungos. O termo também inclui as culturas de células de todas as espécies que podem ser cultivadas para a produção de um bioquímico.

[0013] Um organismo microbiano principal ou organismo microbiano parental, quando utilizado em referência a um organismo microbiano tendo uma ruptura do gene referenciado ou outra alteração genética, é entendido para significar um organismo ou cepa tendo um genótipo substancialmente semelhante como o organismo microbiano tendo a referenciada ruptura do gene ou outra alteração genética se a ruptura do gene referenciado ou outra alteração genética foram excluídas da comparação. Por conseguinte, um organismo microbiano- mãe refere-se a um genotipo substancialmente semelhante de uma cepa em que a ruptura do gene referenciado ou outra alteração genética é introduzida para gerar um organismo modificado. Entende-se que um organismo microbiano principal pode diferir em mais do que uma alteração genética, qualquer adição de genes e / ou ruptura, por exemplo, dependendo se uma única ou múltiplas alterações genéticas estão a ser consideradas. Uma pessoa que é versada na técnica vai facilmente compreender o significado de um organismo microbiano principal tal em que o organismo microbiano é considerado um controle apropriado, tal como é entendido na técnica, para observar o efeito de uma ou mais alterações genéticas.

[0014] Tal como usado na presente invenção, o termo "CoA" ou "coenzima A"é entendido significar um cofator orgânico ou grupo prostético (porção não proteica de uma enzima), cuja presença é necessária para a atividade de muitas enzimas (a apoenzima) para formar um sistema de enzima ativa. Coenzima A funciona em determinadas enzimas de condensação, atua em acetila ou outro grupo acila de transferência e na síntese de ácidos graxos e oxidação, a oxidação de piruvato e de outras formas de acetilação.

[0015] Tal como usado na presente invenção, o termo "substancialmente anaeróbio"quando usado em referência a uma condição de cultura ou crescimento destina-se a significar que a quantidade de oxigênio é menos do que cerca de 10 % de saturação de oxigênio dissolvido no meio líquido. O termo também pretende incluir as câmaras seladas de forma líquida ou sólida mantida com uma atmosfera de menos do que cerca de 1 % de oxigênio.

[0016] O termo "exógeno"como é usado na presente invenção pretende significar que a molécula de referência ou a atividade de referência é introduzida no organismo hospedeiro microbiano. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, por meio da introdução de um ácido nucleico que codifica para o material genético de acolhimento tal como por meio da integração em um cromossoma do hospedeiro, ou como material genético não cromossômico, tal como um plasmídeo. Portanto, o termo, como é utilizado em relação à expressão de um ácido nucleico de codificação refere-se a introdução do ácido nucleico que codifica em uma forma expressável para o organismo microbiano. Quando utilizado em referência a uma atividade biossintética, o termo refere-se a uma atividade que é introduzida no organismo hospedeiro de referência. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico que codifica homólogo ou heterólogo que expressa a atividade referenciada na introdução, o organismo microbiano hospedeiro. Portanto, o termo "endógeno"refere-se a uma molécula de referência ou atividade que está presente no hospedeiro. Do mesmo modo, quando o termo utilizado em referência a expressão de um ácido nucleico de codificação refere-se a expressão de um ácido nucleico de codificação contida dentro do organismo microbiano. O termo "heterólogo"refere-se a uma molécula ou a atividade derivada a partir de uma fonte diferente da espécie referenciada aao passo que "homólogo"refere-se a uma molécula ou a atividade derivada do organismo microbiano hospedeiro. Por conseguinte, a expressão exógena de um ácido nucleico de codificação da presente invenção pode utilizar qualquer um ou ambos de um ácido nucleico de codificação heteróloga ou homóloga.

[0017] Entende-se que, quando mais do que um ácido nucleico exógeno está incluído em um organismo microbiano que mais do que os ácidos nucleicos exógenos refere-se ao ácido nucleico referenciado codificado ou a atividade biossintética, como discutido acima. Considera-se ainda, como descrito na presente invenção, que tal mais de ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos no organismo microbiano hospedeiro em moléculas de ácido nucleico separadas, em moléculas de ácido nucleico policistrônicas, ou uma combinação dos mesmos, e ainda ser considerado como mais do que um ácido nucleico exógeno. Por exemplo, como descrito na presente invenção um organismo microbiano pode ser manipulado para expressar dois ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam para uma enzima ou proteína de via desejada. No caso em que dois ácidos nucleicos exógenos que codificam para uma atividade desejada são introduzidos em um organismo microbiano hospedeiro, entende-se que os dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos como um único ácido nucleico, por exemplo, em um único plasmídeo, em plasmídeos separados, pode ser integrado no cromossoma do hospedeiro em um único local ou múltiplos locais, e ainda podem ser considerados como dois ácidos nucleicos exógenos. Do mesmo modo, entende-se que mais do que dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro em qualquer combinação desejada, por exemplo, em um único plasmídeo, em plasmídeos separados, podem ser integrados no cromossoma do hospedeiro em um único local ou múltiplos locais , e ainda podem ser considerados como dois ou mais ácidos nucleicos exógenos, por exemplo três ácidos nucleicos exógenos. Dessa maneira, o número de ácidos nucleicos exógenos referenciados ou atividades biossintéticas refere-se ao número de ácidos nucleicos que codifica ou o número de atividades biossintéticas, e não o número de ácidos nucleicos separados introduzidos no organismo hospedeiro.

[0018] Tal como usado na presente invenção, o termo "ruptura do gene", ou seus equivalentes gramaticais dos mesmos, pretende significar uma alteração genética que processa o produto do gene codificado inativo ou atenuado. A alteração genética pode ser, por exemplo, eliminação de todo o gene, a eliminação de uma sequência reguladora necessária para a transcrição ou tradução, a eliminação de uma porção do gene que resulta em um produto de gene truncado, ou por meio de qualquer de várias estratégias de mutações que inativam ou atenuam o produto do gene codificado. Um método particularmente útil de ruptura do gene é a eliminação do gene completo, pois reduz ou elimina a ocorrência de reversão genética nos microrganismos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção. Uma ruptura de genes inclui também uma mutação nula, que se refere a uma mutação dentro de um gene ou de uma região que contém um gene que resulte na não o gene a ser transcrito em RNA e / ou traduzido para um produto génico funcional. Tal mutação nula pode surgir a partir de muitos tipos de mutações incluindo, por exemplo, a inativação de mutações pontuais, eliminação de uma porção de um gene, delecções de genes inteiros ou eliminação de segmentos cromossômicos.

[0019] Tal como usado na presente invenção, o termo "atenuar", ou seus equivalentes gramaticais destes, destina-se a significar a enfraquecer, reduzir ou diminuir a atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína. A atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína pode imitar a ruptura completa se a atenuação faz com que a quantidade ou atividade venha a cair abaixo de um nível crítico necessário para uma dada proteína ou enzima a funcionar. No entanto, a atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína que imita a ruptura completa para uma reação ainda pode ser suficiente para uma reação separada para continuar a funcionar. Por exemplo, a atenuação de uma enzima ou proteína endógena pode ser suficiente para imitar a ruptura completa da mesma enzima ou proteína para a conversão de succinil-CoA a succinato ou outra enzima ou proteína da presente invenção, mas a restante atividade ou quantidade de enzima ou de proteínas ainda pode ser suficiente para manter outras reações, uma vez que uma reação é benéfica para o microbiana organismo hospedeiro para sobreviver, reproduzir ou crescer. A atenuação de uma enzima ou proteína também pode ser o enfraquecimento, redução ou diminuição da atividade ou quantidade da enzima ou proteínas em uma quantidade que é suficiente para reduzir o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativa da presente invenção ou para enfraquecer , reduzir ou diminuir a atividade de outras enzimas ou proteínas da presente invenção, mas não necessariamente imitando a ruptura completa da enzima ou proteína.

[0020] No caso de rupturas do gene, uma alteração genética estável particularmente útil é uma eliminação do gene. O uso de uma eliminação do gene para introduzir uma alteração genética estável é particularmente útil para reduzir a probabilidade de uma reversão para um fenótipo anteriormente à alteração genética. Por exemplo, a produção de acoplamento de crescimento estável de um bioquímico pode ser conseguida, por exemplo, por meio da eliminação de um gene que codifica uma enzima que catalisa uma ou mais reações dentro de um conjunto de modificações metabólicas. A estabilidade da produção acoplado ao crescimento de uma bioquímica pode ser ainda melhorada através de múltiplas deleções, reduzindo significativamente a probabilidade de múltiplas reversões compensatórias que ocorrem para cada atividade que sofre ruptura.

[0021] Tal como usado na presente invenção, o termo "enzima conversora da succinil-CoA-redutase" pretende significar uma enzima que reconhece succinil-CoA como um substrato e pode converter succinil-CoA no seu succinato ácido correspondente. As enzimas de conversão succinil-CoA incluem hidrolases, CoA CoA transferase e CoA sintetase. As hidrolases CoA são também conhecidas na técnica como tioésterases sintetases e CoA são também conhecidas na técnica como CoA-ligase-ácido tiol. As hidrolases CoA exemplificativas incluem acetil- CoA-hidrolase, succinil-CoA-hidrolase e YciA CoA-hidrolase. As transferases exemplificativas incluem CoA-CoA transferase Cat1, AARC CoA transferase e acetoacetil-CoA-transferase. As sintetases CoA exemplificativas incluem succinato-CoA-ligase e sintetase de succinil-CoA, tais como SucCD. Várias outras enzimas de conversão exemplares de succinil-CoA redutase são descritas na presente invenção.

[0022] Tal como usado na presente invenção, o termo "enzima que produz succinato" quando usado em referência a uma enzima dentro de uma via de múltiplas etapas que tem uma conversão líquida de succinil- CoA a succinato pretende significar uma enzima que catalisa succinil- CoA a succinato na etapa de conversão dentro da via ou uma enzima que catalisa uma reação a montante da succinil-CoA a succinato na etapa de conversão dentro da via. Por conseguinte, uma produção de enzima succinato, se atenuada, iria resultar na redução ou eliminação da conversão de succinil-CoA a succinato dentro de uma via de várias etapas referenciadas. Exemplos de vias de etapas múltiplos que têm uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato incluem a degradação de arginina, lisina e biossíntese de metionina vias de biossíntese.

[0023] Tal como usado na presente invenção, o termo "excesso de CO2" pretende significar CO2 produzido através da oxidação completa de glicose, na reação seguinte:

[0024] Em comparação, o termo "excesso de CO2", como é usado na presente invenção, não pretende referir-se ao CO2 que estequiometricamente acompanha a conversão da glicose para um produto bioderivado das invenções ou subprodutos de tais via biossintética metabolicamente manipuladas. Usando o 1,4-butanodiol (1,4-BDO) para fins ilustrativos, por exemplo, o termo não pretende referir-se ao CO2 produzido na reação seguinte para a biossíntese de 1,4-BDO: A porcentagem do excesso de CO2 refere-se à porcentagem de açúcar metabolizado a um excesso de CO2.

[0025] Tal como usado na presente invenção, o termo "base biológica"entende-se um produto, tal como descrito na presente invenção que é constituído, no todo ou em parte, de um composto bioderivado da presente invenção. Um produto de base biológica está em contraste com um produto à base de petróleo, em que um tal produto é obtido a partir de ou sintetizado a partir de matéria-prima de petróleo ou uma petroquímica.

[0026] Tal como usado na presente invenção, o termo "composto bioderivado" pretende significar uma molécula alvo ou químico que é derivado a partir de ou sintetizado por meio de um organismo biológico. No contexto da presente invenção, os organismos microbianos metabolicamente modificados são utilizados para produzir biossinteticamente um composto bioderivado ou seu intermediário através do ácido tricarboxílico substratos de ciclo (TCA), tais como succinil-CoA, a-cetoglutarato (AKG) e acetil-CoA redutase, incluindo opcionalmente ainda mais através de acetoacetil-CoA e / ou a malonil- CoA.

[0027] As pessoas que são versadas na técnica irão entender que as alterações genéticas, incluindo as alterações metabólicas na presente invenção exemplificadas, estão descritas com referência a um organismo hospedeiro adequado tal como E. coli e as suas correspondentes reações metabólicas ou de um organismo fonte adequado para desejado material genético tais como genes de uma via metabólica desejado. No entanto, dada a sequenciação completa do genoma de uma ampla variedade de organismos e ao elevado nível de habilidade na área da genômica, as pessoas que são versadas na técnica serão prontamente capazes de aplicar os ensinamentos e orientação fornecidos na presente invenção, essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas de E. coli exemplificadas na presente invenção podem ser facilmente aplicadas a outras espécies, incorporando o mesmo ou análogo de ácido nucleico que codifica a partir de outras espécies do que as espécies mencionadas. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de espécies homólogas, em geral, e em particular, ortólogos, parálogos ou deslocamentos de genes nonortólogos.

[0028] Um ortólogo é um gene ou genes que estão relacionados pela descida vertical e são responsáveis por, substancialmente, as mesmas funções ou idênticas em diferentes organismos. Por exemplo, hidrolase de epóxido camundongo e hidrolase de epóxido humana pode ser considerada ortólogos para a função biológica de hidrólise de epóxidos. Os genes estão relacionados pela descida vertical quando, por exemplo, eles partilham similaridade de sequência de quantidade suficiente para indicar que são homólogos, ou relacionado por meio da evolução de um antepassado comum. Os genes podem também ser considerados ortólogos se eles compartilham estrutura tridimensional, mas não necessariamente semelhança de sequência, de uma quantidade suficiente para indicar que eles evoluíram a partir de um antepassado comum na medida em que a semelhança de sequência primária não é identificável. Os genes que estão ortólogos podem codificar as proteínas com semelhança de sequência de cerca de 25 % a 100 % de identidade de sequência de aminoácidos. Os genes que codificam as proteínas que partilham uma semelhança de aminoácidos de 25 % menos que também podem ser considerados ter surgido por descida vertical, se a sua estrutura tridimensional também mostra semelhanças. Os membros da família de protease de serina de enzimas, incluindo ativador de plasminogênio de tecido e da elastase, são considerados ter surgido por meio da descida vertical a partir de um antepassado comum.

[0029] Os ortólogos incluem os genes ou seus produtos de genes codificados que, por meio, por exemplo, evolução, já divergiram em estrutura ou atividade global. Por exemplo, quando uma espécie codifica um produto de gene que exibe duas funções e se tais funções têm sido separadas em genes distintos em uma segunda espécie, os três genes e seus produtos correspondentes são considerados ortólogos. Para a produção de um produto bioquímico, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que o gene ortólogo abriga a atividade metabólica a ser introduzida ou interrompida a qual é para ser escolhida para a construção do microorganismo que não ocorre de forma natural. Um exemplo de ortólogos que exibe atividades separáveis é onde as atividades distintas foram separadas em produtos de genes distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma única espécie. Um exemplo específico é a separação de proteólise elastase e a proteólise do plasminogênio, dois tipos de atividade de protease de serina, em moléculas diferentes como o ativador do plasminogênio e elastase. Um segundo exemplo é a separação de micoplasma 5'-3 'exonuclease e polimerase de DNA de Drosophila atividade III. A polimerase de DNA da primeira espécie pode ser considerada um ortólogo a um ou ambos de a exonuclease ou a polimerase a partir de uma segunda espécie e vice- versa.

[0030] Em contraste, os parálogos são homólogos relacionados por, por exemplo, duplicação seguida por divergência evolutiva e tem funções semelhantes ou comuns, mas não idênticas. Parálogos podem ter origem ou derivam a partir de, por exemplo, da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Por exemplo, hidrolase de epóxido microssomal (hidrolase de epóxido I) e hidrolase de epóxido solúvel (hidrolase de epóxido II) pode ser considerada parálogos porque representam duas enzimas distintas, que co-evoluíram a partir de um antepassado comum, que catalisam reações distintas e possuem funções distintas na mesma espécies. Parálogos são proteínas a partir da mesma espécie com similaridade de sequência significativa entre si, sugerindo que são homólogos ou estão relacionados através de co- evolução de um antepassado comum. Grupos de famílias de proteínas parálogas incluem homólogos Hipa, genes de luciferase, peptidases, e outros.

[0031] Um deslocamento gene nonortólogo é um gene nonortólogo de uma espécie que pode substituir a função do gene referenciado em uma espécie diferente. A substituição inclui, por exemplo, ser capaz de realizar substancialmente a mesma ou uma função semelhante nas espécies de origem em relação à função referenciada nas diferentes espécies. Embora geralmente, um deslocamento do gene nonortólogo vai ser identificável como estruturalmente relacionado com um gene conhecido que codifica a função referenciada, os genes menos estruturalmente relacionados mas funcionalmente similares e seus correspondentes produtos do gene, no entanto, ainda vão cair dentro do significado do termo tal como é usado na presente invenção. A semelhança funcional requer, por exemplo, pelo menos, alguma semelhança estrutural no local ativo ou região de ligação de um produto do gene nonortólogo em comparação com um gene que codifica para a função que se pretende substituída. Por conseguinte, um gene nonortólogo inclui, por exemplo, um parálogo ou um gene relacionado.

[0032] Portanto, na identificação e construção dos organismos microbianos que não ocorre naturalmente da presente invenção, o fluxo de carbono tem reduzido a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo ou tem outras modificações metabólicas descritas na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica entenderão com aplicação nos ensinamentos e orientações proporcionadas na presente invenção para uma espécie em particular que a identificação de modificações metabólicas podem incluir a identificação e a inclusão ou inativação de ortólogos. Na medida em que os deslocamentos de genes parálogos e / ou nonortólogos estão presentes no microrganismo referenciado que codifica uma enzima que catalisa uma reação metabólica semelhante ou substancialmente semelhante, as pessoas que são versadas na técnica também podem utilizar estes genes evolutivamente similares. Da mesma forma para uma ruptura do gene, os genes evolutivamente relacionados podem também ser interrompidos ou eliminados em um organismo hospedeiro microbiano para reduzir ou eliminar a redundância funcional de atividades enzimáticas orientadas para o rompimento.

[0033] Os deslocamentos dos genes ortólogos, parálogos e nonortólogo podem ser determinados por meio dos métodos bem conhecidos das pessoas que são versadas na técnica. Por exemplo, a inspecção das sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos por dois polipeptídeos irá revelar identidade de sequência e semelhanças entre as sequências comparadas. Com base em tais semelhanças, uma pessoa que é versada na técnica pode determinar se a semelhança é suficientemente elevada para indicar que as proteínas estão relacionadas através da evolução de um antepassado comum. Algoritmos bem conhecidos das pessoas que são versadas na técnica, tais como Align, BLAST, Clustal W e outros comparam e determinam uma semelhança de sequência em bruto ou identidade, e também determinam a presença ou o significado de lacunas na sequência que pode ser atribuída a um peso ou pontuação . Tais algoritmos são também conhecidos na técnica e são igualmente aplicáveis para a determinação de similaridade de nucleotídeos ou identidade de sequência. Os parâmetros para semelhança suficiente para determinar parentesco são calculados com base em métodos bem conhecidos para calcular a similaridade estatística, ou a chance de encontrar uma correspondência similar em um polipeptídeo aleatório, e o significado da combinação determinada. Uma comparação computador de duas ou mais sequências pode, se desejado, também ser optimizada visualmente por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Os produtos de genes relacionados ou as proteínas podem ser esperados tendo uma alta semelhança, por exemplo, 25 % a 100 % de identidade de sequência. As proteínas que não estão relacionadas podem ter uma identidade que é essencialmente a mesma que seria de esperar a ocorrência aleatória, se um banco de dados de tamanho suficiente for digitalizado (cerca de 5 %). As sequências entre 5 % e 24 % podem ou não representar uma homologia suficiente para concluir que as sequências comparadas estão relacionadas. As análises estatísticas adicionais para determinar o significado de tais combinações, dado o tamanho do conjunto de dados podem ser realizadas para determinar a relevância destas sequências.

[0034] Exemplos de parâmetros para determinar parentesco entre duas ou mais sequências utilizando o algoritmo BLAST, por exemplo, podem ser descritos a seguir. Resumidamente, os alinhamentos da sequência de aminoácidos podem ser realizados utilizando BLASTP Versão 2.0.8 (Jan-05-1999) e os seguintes parâmetros: Matriz: BLOSUM62 0; espaço aberto: 11; extensão do espaço : 1; x_dropoff: 50; espera: 10,0; WordSize: 3; Filtro: ligado. Os alinhamentos de sequências de ácido nucleico podem ser realizados utilizando BLASTN Versão 2.0.6 (Sept-16-1998) e os seguintes parâmetros: Partida: 1; Incompatibilidade: -2; espaço aberto: 5; extensão do espaço : 2; x_dropoff: 50; espera: 10,0; WordSize: 11; Filtro: desligado. As pessoas que são versadas na técnica saberão que podem ser feitas modificações aos parâmetros acima, para aumentar ou diminuir o rigor da comparação, por exemplo, e determinar a relação entre duas ou mais sequências.

[0035] A presente invenção é descrita com referência geral para a reação metabólica, reagente ou produto dos mesmos, ou com referência específica a um ou mais ácidos nucleicos ou genes que codificam uma enzima associada com ou catalisador, ou uma proteína associada com, a reação, reagente ou produto metabólico referenciado. A menos que seja de outro modo expressamente indicado neste documento, as pessoas que são versadas na técnica entenderão que a referência a uma reação também constitui referência aos reagentes e produtos da reação. De modo semelhante, a menos que de outro modo expressamente indicado na presente invenção, a referência a um reagente ou produto, também referente a reação, e a referência a qualquer um destes componentes metabólicos também referencia o gene ou genes que codificam as enzimas que catalisam ou proteínas envolvidas na reação, reagente ou produto referenciado. Da mesma forma, tendo em conta os campos bem conhecidos de bioquímica, enzimologia e genômica metabólica, a referência na presente invenção feita a um gene ou ácido nucleico que codifica constitui também uma referência à enzima codificada correspondente e a reação que catalisa ou uma proteína associada com a reação, bem como os reagentes e produtos da reação.

[0036] A presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase succcinyl-CoA-transferase ou e pelo menos uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou um gene que codifica uma enzima de de produção de succinato dentro de uma via de múltiplas etapas tendo uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato. A atenuação pode ser uma ruptura do gene. A sintetase de succinil-CoA ou transferase é codificada por um gene apresentado nas Tabelas 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 ou um ortólogo possuindo pelo menos 70 % de identidade com um gene apresentado nas Tabelas 1, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.

[0037] Os rendimentos a partir de organismos microbianos metabolicamente manipulados para sintetizar os produtos alvo à base de carbono, ou compostos bioderivados como referido na presente invenção, podem ser aumentados por meio da redução da perda de carbono em excesso de CO2 como um subproduto metabólico. Uma via metabólica que está disponível para a redução do excesso de subproduto CO2 é o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA). Um ponto útil no ciclo do TCA de intervenção é a conversão de succinil-CoA a succinato que é catalisado por sintetase de succinil-CoA. Dessa maneira, reduzindo o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo fornece benefícios úteis.

[0038] Por exemplo, a atenuação da conversão de succinil-CoA a succinato resulta na redução do excesso de subproduto de CO2 produzido pelas enzimas em etapas subsequentes metabólicas no ciclo do TCA e derivação glioxilato, incluindo, por exemplo, enzima málico, piruvato desidrogenase, piruvato liase formiato e piruvato oxidase. Além disso, a atenuação de succinil-CoA a succinato de conversão também resulta na redução do excesso de subproduto de CO2 por meio da diminuição de ciclos repetidos de fluxo de carbono através do ciclo do TCA oxidativo. A redução da perda de carbono em excesso de CO2 como um subproduto metabólico aumenta o rendimento da produção de compostos bioderivados à base de carbono, porque aumenta a quantidade de carbono disponível para a biosíntese. A maior disponibilidade de carbono pode aumentar o rendimento de biossíntese de compostos de base biológica de todas as vias de metabolicamente manipuladas dentro de um organismo microbiano, incluindo as vias de engenharia que são dependentes de um substrato do ciclo do TCA bem como aqueles que são independentes de um substrato do ciclo do TCA. Quando um composto bioderivado utiliza um ciclo de TCA intermediário ou substrato a montante de succinato, atenuando a conversão de succinil-CoA a succinato dentro do ciclo do TCA também reduz a quantidade de carbono que entra os intermediários do ciclo do TCA a jusante, aumentando desse modo a quantidade de fluxo de carbono para o bioderivado alvo composto.

[0039] Em uma modalidade, os organismos microbianos da presente invenção incluem a atenuação de duas diferentes enzimas de conversão de succinil-CoA. Uma atenuação inclui uma sintetase de succinil-CoA. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrita na presente invenção ou conhecida na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou a atividade do produto do gene. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[0040] As sintetases de succinil-CoA são onipresentes entre os organismos microbianos. Por exemplo, as enzimas de sintetase de succinil-CoA de formação de ADP catalisam a conversão de succinil- CoA a succinato dentro do ciclo do TCA. A atenuação de uma sintetase de succinil-CoA-redutase, por conseguinte, reduz as perdas de carbono em subproduto de CO2 e melhora os rendimentos do produto bioderivado. As enzimas de sintetase de succinil-CoA de formação de ADP exemplificativos são codificado=as por sucCD de E. coli e os genes LSC1 e LSC2 de Saccharomyces cerevisiae (Buck et al, Biochemistry. 24: 6245 a 6252 (1985)). As enzimas semelhantes são encontradas em Mycobacterium tuberculosis, o Homo sapiens, Trypanosoma brucei e Trichomonas vaginalis. Os genes exemplificativos para tais enzimas de sintetase de succinil-CoA de formação de ADP da presente invenção encontram-se resumidos a seguir na Tabela 1. Tabela 1. Exemplos de sintetases de succinil-CoA de formação de ADP

[0041] Tal como descrito mais adiante, as sintetases succinil-CoA ao invés das sintetases de succinil-CoA de formação de ADP podem também ser atenuadas nos organismos microbianos da presente invenção, como uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil- CoA. Tais sintetases de succinil-CoA além das sintetases de formação de ADP são exemplificadas a seguir na Tabela 11 e a descrição com elas relacionadas. Por conseguinte, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, em que uma primeira atenuação inclui uma sintetase de succinil-CoA. A sintetase de succinil-CoA pode ser uma sintetase de succinil-CoA de formação de ADP, incluindo, por exemplo, sucCD ou pode ser uma sintetase de succinil-CoA de não formação de ADP, tais como sintetase de succinil- CoA de formação de GDP, ou pode ser uma outra sintetase de CoA tendo atividade de sintetase de succinil-CoA como descrito na presente invenção.

[0042] Os microrganismos da presente invenção podem também incluir uma segunda atenuação de uma enzima de conversão da succinil-CoA. A segunda atenuação em um organismo microbiano da presente invenção pode ser uma enzima conversora de succinil-CoA além da sintetase de succinil-CoA correspondente a primeira atenuação. Dessa maneira, as primeiras e segundas atenuações em um organismo microbiano da presente invenção correspondem a diferentes proteínas ou enzimas. A primeira atenuação é dirigida a uma enzima conversora de sintetase de succinil-CoA correspondente a um succinil- CoA enquanto que a segunda refere-se a uma enzima conversora da succinil-CoA diferente. A segunda enzima conversora de succinil-CoA redutase pode ser diferente de uma sintetase de sintetase de succinil- CoA diferente de succinil-CoA correspondente a primeira atenuação ou pode ser uma CoA hidrolase ou uma CoA-transferase como descrito na presente invenção.

[0043] Embora não estando limitado pela teoria, em hospedeiros microbianos, onde uma atividade enzimática é interrompida, uma ou mais enzimas endógenas podem compensar a atividade da enzima interrompida. Por exemplo, hospedeiros microbianos deficientes na atividade de sintetase de succinil-CoA (SucCD) ainda são capazes de converter succinil-CoA a succinato através de outras enzimas endógenas. A eliminação de uma CoA hidrolase endógena, a enzima CoA-transferase ou CoA sintetase capaz de converter succinil-CoA a succinato pode reduzir ainda mais a conversão de succinil-CoA a succinato, incluindo a redução de completa fluxo ciclo de TCA em organismos hospedeiros sucCD-interrompidos, e, dessa maneira, reduzindo a respiração e geração de CO2 subproduto excesso.

[0044] Há uma variedade de enzimas endógenas que convertem succinil-CoA a succinato que podem ser interrompidas para a redução da síntese de succinato e redução da produção de CO2 subproduto. Por exemplo, a conversão de uma etapa de succinil-CoA a succinato é catalisada por CoA sintetase, enzimas CoA-transferase e CoA- hidrolase. A conversão de succinil-CoA a succinato pode ser a principal função fisiológica da enzima, como é o caso de E. coli, sintetase de succinil-CoA (sucCD), ou pode ser uma atividade lateral. Os genes que codificam para qualquer uma destas enzimas sozinhas ou em combinação com outras enzimas de conversão succinil-CoA redutase podem ser interrompidos para atenuar o ciclo do TCA e reduzir a produção de subproduto CO2 em um organismo microbiano da presente invenção. Exemplos de hidrolases CoA, CoA-transferase e CoA sintetases aplicáveis para utilização como uma segunda atenuação nos organismos microbianos da presente invenção, o que corresponde a um gene que codifica uma enzima de conversão da succinil-CoA redutase, são descritos mais abaixo. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrita na presente invenção ou conhecida na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou produção dos genes. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[0045] As enzimas CoA-hidrolase ou tioesterase estão na classe de enzimas CE 3.1.2, incluindo hidrolases succinil-CoA, e hidrolisam as moléculas de acil-CoA nos seus ácidos correspondentes. Tais hidrolases CoA redutase podem ser incluídas em um organismo microbiano da presente invenção como uma segunda atenuação de um gene que codifica uma enzima de conversão da succinil-CoA.

[0046] Várias hidrolases CoA são ativas em succinil-CoA incluindo acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), palmitoil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.2), succinil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.3) e acil-CoA hidrolase (CE 3.1.2.20). Outras hidrolases acetil-CoA que também convertem succinil-CoA a succinato incluem acot12 de cérebro de Rattus norvegicus (Robinson et al, Biochem.Biophis.Res.Commun 71: 959 a 965 (1976)) e enzimas de Ovis aries e Pisum sativum (Zeiher et al, Plant.Phisiol 94: 20 a 27 (1990); e Snoswell Tubbs, J Biochem 171 (2): 299 a 303 (1978)). O peroxissomal humano acil-CoA tioesterase ACOT4 catalisa a hidrólise do succinil-CoA (Hunt et al, FASEB J 20: 1855-1864 (2006); Westin et al, J Biol Chem 280: 38125 a 32 (2005)). Ainda uma outra enzima com atividade de hidrolase de succinil-CoA-redutase é a enzima de Pseudomonas aeruginosa PA5202 (Gonzalez et al, Biochem J 445 a 455 (2012)). As hidrolases CoA exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 2. Tabela 2. Exemplos de CoA Hidrolases

[0047] O gene yciA codifica uma CoA hidrolase e foi demonstrado para hidrolisar uma variedade de substratos de acil-CoA redutase, incluindo acetil-CoA, butiril-CoA, decanoil-CoA e palmitoil-CoA e succinil-CoA, tal como descrito na presente invenção (vide também, por exemplo, Zhuang et al, Biochem 47: 2789 a 96 (2008)). Em uma modalidade da presente invenção, os organismos microbianos com atenuação da proteína codificada por yciA exibem um decréscimo de succinil-CoA a succinato de conversão dentro do ciclo do TCA, demonstrando que YciA tem atividade succinil-CoA. Exemplos de enzimas YciA possuindo atividade hidrolase de succinil-CoA-redutase incluem yciA de E. coli e Haemophilus influenzae. Exemplos de hidrolases de succinil-CoA redutase estão resumidos abaixo na Tabela 3. Tabela 3. Exemplos de CoA Hidrolases

[0048] Tal como descrito mais abaixo, observou-se a atividade de hidrolase de succinil-CoA de YciA CoA-hidrolase para diminuir substancialmente a conversão de succinil-CoA a succinato em organismos também tendo a atenuação de uma segunda enzima de conversão de succinil-CoA. Tal como descrito na presente invenção, apesar de uma ruptura do gene do gene de codificação enzima do ciclo de TCA sintetase de succinil-CoA (sucCD) que converte succinil-CoA para succinato ter resultado na produção de succinato diminuída, uma atenuação adicional da proteína codificada por yciA resultou em uma redução substancial e não aditiva na produção succinato de succinil- CoA. Em contraste, as atenuações de outras hidrolases também que possuem atividade para acetil-CoA produziram resultados diferentes.

[0049] As enzimas que reagem com uma ampla gama de substratos de acil-CoA redutase podem também ser ativas em succinil-CoA. Por exemplo, para além de reagir com succinil-CoA, a enzima codificada pela acot12 de cérebro de Rattus norvegicus (Robinson et al, Biochem.Biophis.Res.Commun 71: 959 a 965 (1976)) também podem reagir com butiril- CoA, hexanoil-CoA e malonil-CoA, o que indica que hidrolases CoA tendo atividade durante longos tioésteres de cadeia média e / ou podem ser ativos em succinil-CoA. Neste âmbito, a tioesterase de ácido dicarboxílico humana, codificada por acot8, exibe uma atividade em glutaril-CoA, adipil-CoA, CoA-suberila, sebacyl-CoA, e dodecanedioyl-CoA (Westin et al., J. Biol. 280 : 38125 a 38132 (2.005)). O homólogo de E. coli mais próximo a esta enzima, TESB, também pode hidrolisar uma variedade de tioésteres CoA de cadeia média e longa (Naggert et al, J Biol Chem 266: 11.044 a 11.050 (1991)). Uma enzima semelhante também foi caracterizada no fígado de camundongo (Deana R., Biochem Int 26: 767 a 773 (1992)). Outras enzimas com atividade CoA hidrolase em E. coli incluem BIOH, Enth, FADM, FRSA, paaI, Tesa, TESC, ybaW, ybfF ybhC, ydiI, yeiG, yigI, yiiD, yjfP, yjjU, ypfH, yqiA, ybgC e ybdB (Kuznetsova, et al, FEMS Microbiol Rev, 2005, 29 (2): 263-279; Song et al, Chem J. Biol, 2006, 281 (16): 11028 a 38; Guo et al, Biochemistry 48: 1712 a 1722 (2009)). Na maioria, as enzimas de E. coli acima foram identificadas em um rastreio de alto rendimento usando palmitoil-CoA como substrato acil-CoA (Kuznetsova et al, supra).

[0050] A hidrolase de acetil-CoA, ACH1, a partir de S. cerevisiae representa outra hidrolase candidato (Buu et al, J. Biol 278: 17203 a 17209 (2003)). As enzimas adicionais com atividade de hidrolase de acil-CoA-hidrolase incluem o palmitoil-CoA de Mycobacterium tuberculosis (Wang et al, Chem.Biol 14: 543 a 551 (2007)). Outra CoA- hidrolase exemplar é o glutaconate CoA-transferase de Acidaminococcus fermentans. Esta enzima foi transformada por meio da mutagênese dirigida a uma hidrolase de acil-CoA com atividade em glutaril-CoA, acetil-CoA e 3-butenoil-CoA (Mack et al, FEBS.Lett 405: 209 a 212 (1997)) . As hidrolases CoA exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 4. Estas hidrolases possuindo atividade de CoA- hidrolase succinil-CoA são aplicáveis como enzima conversora da succinil-CoA da presente invenção e podem, portanto, ser alvo de atenuação. As enzimas de CoA hidrolase redutase adicionais podem ser identificadas por meio da similaridade de sequência com qualquer um dos candidatos de CoA hidrolase descritos na presente invenção. Tabela 4. Exemplos de CoA Hidrolases

[0051] As CoA transferases, incluindo transferases de succinil-CoA, catalisam a transferência reversível de uma porção CoA a partir de uma acil-CoA para um aceitador de ácido carboxílico. As enzimas CoA transferase nas classes EC listadas abaixo na Tabela 5 foram mostradas para catalisar a conversão de succinil-CoA a succinato. Tabela 5. Exemplos de CoA Transferases

[0052] Por exemplo, os produtos do gene de cat1, cat2, e cat3 de Clostridium kluyveri têm mostrado exibir succinil-CoA, 4-hidroxibutiril- CoA, e atividade de transferase butiril-CoA-redutase, respectivamente (Seedorf et al., Proc. Natl.Acad.Sci EUA. 105: 2.128 a 2.133 (2008); Sohling et al, J Bacteriol 178: 871 a 880 (1996)). A atividade de transferase succinil-CoA também está presente em Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Clostridium aminobutyricum e Porphiromonas gingivalis (Riviere et al, J. Biol 279: 45337 a 45346 (2004); van Grinsven et al, J. Biol . Chem 283: 1411 a 1418 (2008)). Acetobacter aceti utiliza um succinil-CoA-CoA transferase de etila para completar o seu ciclo de TCA incomum (Mullins et al J Bacteriol 190: 4933 a 40 (2008)). Exemplos de transferases de succinil-CoA redutase estão resumidos a seguir na Tabela 6. Tabela 6. Exemplos de CoA Transferases

[0053] Outras transferases podem também exibir atividade de transferase succinil-CoA e são aplicáveis para a segmentação como uma atenuação de uma enzima conversora do succinil-CoA da presente invenção. Por exemplo, uma transferase de acil-CoA graxo que utiliza acetil-CoA redutase como o doador de CoA-transferase é acetoacetil- CoA-redutase, codificada pelo E. coli atoA (subunidade alfa) e genes Atod (subunidade beta) (Korolev et al., Acta Crystallogr .D.Biol.Crystallogr 58: 2116 a 2121 (2002); Vanderwinkel et al, 33: 902 a 908 (1968)). Esta enzima tem uma gama ampla de substrato em substratos de comprimento de cadeia C3-C6 (Sramek et al, Arch Biochem Biophis 171: 14 a 26 (1975)) e tem sido demonstrada para transferir a fração de CoA para acetato a partir de uma variedade de substratos de acil-CoA e 3-oxo ramificados e lineares (Mathies et al, Appl Environ.Microbiol 58: 1435 a 1439 (1992); (1968; Vanderwinkel et al, Biochem.Biophis.Res.Commun 33: 902 a 908 (1968) . As enzimas semelhantes no Corynebacterium glutamicum ATCC 13032: Vanderwinkel et al, 33 Biochem.Biophis.Res.Commun. (Duncan et al., 68: 5.186 a 5.190 (2002)), o Clostridium acetobutylicum (Cary et al, Appl Environ Microbiol 56: 1576 a 1583 (1990); Wiesenborn et al, Appl Environ Microbiol 55: 323329 (1989)), e Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al, Biochem 71 Biosci.Biotechnol : 58 a 68 (2007)). Estas CoA transferases exemplificativas são aplicáveis para atenuação como enzima conversora da succinil-CoA da presente invenção. CoA transferases exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 7. Tabela 7. CoA Transferases exemplars

[0054] YgfH codifica uma propionil-CoA : succinato CoA transferase em E. coli (Haller et al, Biochemistry, 39 (16) 4622 a 4629.). Os homólogos próximos podem ser encontrados em, por exemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella enterica subsp. arizonae serotipo, e Yersinia intermedia ATCC 29909. Estas proteínas são identificadas a seguir. As enzimas transferase de formil-CoA redutase de E. coli (yfdW) e Oxalobacter formigenes (FRC) podem utilizar succinil-CoA como um doador CoA (Sidhu et al, J Bacteriol 3378 a 81 (1997); Toyota et al, J Bacteriol 190: 7 (2008)). Outros CoA transferase em E. coli que podem catalisar a conversão de succinil-CoA a succinato incluem yfdW, yrdE, CAIB e ydiF. Tais CoA transferases adicionais, exemplares são aplicáveis para atenuação como enzima conversora da succinil-CoA da presente invenção. As CoA transferases exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 8. Tabela 8. Exemplos de CoA Transferases

[0055] As enzimas de succinil-CoA: 3: oxoácido-CoA transferase (SCOT) também catalisam a conversão de succinil-CoA a succinato. As enzimas desta classe são codificadas por pcaI e pcaJ em Pseudomonas putida (Kaschabek et al, J Bacteriol 184: 207 a 215 (2002)). As enzimas semelhantes são encontradas em Acinetobacter sp. ADP1 (Kowalchuk et al, Gene 146: 23 a 30 (1994).), Streptomyces coelicolor e Pseudomonas knackmussii (anteriormente B13 sp.) (Gobel et al, J Bacteriol 184: 216-223 (2002); Kaschabek et al ., J Bacteriol 184: 207 a 215 (2002)). Succinil-CoA: 3: oxoácido-CoA transferases redutase adicionais exemplares têm sido caracterizadas no Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al, J. Biol 272: 25659 a 25667 (1997))., Bacillus subtilis (Stols et al, Protein Expr.Purif 53: 396 a 403 (2007)) Sus scrofa e Homo sapiens (Fukao, T., et al, Genomics 68: 144 a 151 (2000); Tanaka, H., et al, Mol Hum Reprod 8: 16 a 23 (2002)). Por conseguinte, estas CoA-transferases exemplificativas são aplicáveis para atenuação como a enzima conversora da succinil-CoA da presente invenção. CoA transferases exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 9. Tabela 9. CoA Transferases exemplares

[0056] Muitas transferases têm ampla especificidade e, dessa maneira, podem utilizar os aceitadores CoA tão diversos como o acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3- ketohexanoato, 3-ketopentanoato, valerato, crotonato, 3- mercaptopropionato, propionato de etila, acetato de vinila, butirato , entre outros. Por exemplo, uma enzima a partir de Roseburia sp. A2- 183 mostrou ter butiril-CoA: acetato : CoA transferase e atividade de propionil-CoA: acetato: CoA transferase (Charrier et al, Microbiology 152, 179 a 185 (2006).). Os homólogos próximos podem ser encontrados em, por exemplo, Roseburia intestinalis L1-82, Roseburia inulinivorans DSM 16841, Eubacterium rectale ATCC 33656. Uma outra enzima com atividade de transferase propionil-CoA redutase pode ser encontrada em Clostridium propionicum (Selmer et al., Eur J Biochem 269 , 372 a 380 (2002)). Esta enzima pode utilizar acetato, (R) -lactato, (S) -lactato, acrilato, e butirato como o aceitador de CoA (Selmer et al, Eur J Biochem 269, 372 a 380 (2002); e. Schweiger Buckel, FEBS Letters , 171 (1) 79 a 84 (1984)). Os homólogos próximos podem ser encontrados em, por exemplo, Clostridium novyi NT, Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, e Clostridium botulinum C Str. Eklund. YgfH codifica um propionil-CoA CoA transferase succinato em E. coli (Haller et al, Biochemistry, 39 (16) 4622-4629.). Os homólogos próximos podem ser encontrados em, por exemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella enterica subsp. arizonae serotipo, e Yersinia intermedia ATCC 29909. Tais CoA transferases tendo atividade de transferase succinil-CoA são aplicáveis como enzima conversora da succinil-CoA da presente invenção e podem, portanto, ser alvo de atenuação. CoA transferases exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 10. Tabela 10. Exemplos de CoA Transferases

[0057] CoA-ligase de ácido tiol ou CoA sintetase ocorre na classe de enzimas6.2.1, incluindo as sintetases succinil-CoA, e catalisa a conversão de substratos de acil-CoA para os seus produtos ácidos. Como descrito anteriormente, um gene que codifica uma sintetase CoA pode ser utilizado tanto como uma primeira atenuação correspondente a uma sintetase de succinil-CoA quanto como uma segunda atenuação correspondente a uma enzima de conversão da succinil-CoA-redutase em um organismo microbiano da presente invenção. As sintetases CoA exemplificativas aplicáveis para a atenuação de um organismo microbiano da presente invenção são descritas (vide Tabela 1 e a descrição correspondente). Outras sintetases CoA exemplares aplicáveis para a atenuação de um organismo microbiano da presente invenção são descritas abaixo.

[0058] As sintetases CoA redutase que convertem o ATP ou GTP para o ADP ou o PIB é reversível e pode catalisar a conversão de succinil-CoA a succinato. As enzimas de formação de AMP catalizam a ativação de um ácido de um derivado acil-CoA. As enzimas de sintetase CoA para a conversão de succinil-CoA a succinato incluem succinato- CoA-ligase (de formação de GDP, EC 6.2.1.4), succinato-CoA-ligase (de formação de ADP , EC 6.2.1.5), e acetato-CoA-ligase (de formação de ADP, 6,2 CE .1.13).

[0059] Outra CoA sintetase aplicável para atenuação como uma sintetase de succinil-CoA ou como uma enzima de conversão da succinil-CoA inclui Acetil-CoA-sintetase de formação de ADP (ACD, EC 6.2.1.13). Esta sintetase CoA redutase é uma enzima que acopla a conversão de ésteres de acil-CoA para os seus ácidos correspondentes com a síntese de ATP concomitante.

[0060] As enzimas de sintetase de succinil-CoA de formação de ADP são exemplificadas na presente invenção (vide a Tabela 1 e a descrição correspondente). Resumidamente, estas sintetases succinil- CoA são codificadas por sucCD de E. coli e os genes e LSC1 LSC2 de Saccharomyces cerevisiae e as enzimas semelhantes são encontradas em Mycobacterium tuberculosis, Homo sapiens, Trypanosoma brucei e Trichomonas vaginalis (Tabela 1). Estas sintetases CoA são aplicáveis para atenuação ou como uma sintetase de succinil-CoA ou como uma enzima de conversão da succinil-CoA da presente invenção.

[0061] As enzimas de sintetase CoA com ampla especificidade de substrato também podem estar ativas em succinil-CoA. Por exemplo, ACD I a partir de Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1211, tem sido demonstrada que opera sobre uma variedade de substratos de cadeia linear e ramificada incluindo isobutirato, isopentanoato, e fumarato (Musfeldt et al, J Bacteriol 184: 636 a 644 ( 2002)). Um segundo ACD em Archaeoglobus fulgidus reversível, codificado por AF1983, também foi mostrado ter uma ampla gama de substratos (Musfeldt e schonheit, J Bacteriol 184: 636 a 644 (2002)). ACD codificado por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílico de Pyrobaculum aerophilum mostrou a faixa de substrato mais ampla de todos ACDs caracterizados, reagindo com acetil-CoA, isobutiril-CoA (substrato preferido) e fenilacetil-CoA (Brasen et al, Arch Microbiol 182: 277 a 287 (2004)). A evolução ou engenharia dirigida pode ser utilizada para modificar esta enzima para operar à temperatura fisiológica do organismo hospedeiro. A enzima de Haloarcula marismortui (anotada como uma sintetase de succinil-CoA) aceita, por exemplo, propionato, ácidos butirato, e substratos de cadeia ramificada (isovalerato e isobutirato), e foi mostrada para operar medianste as instruções dianteiras e reversas (Brasen et al, Arch Microbiol 182: 277 a 287 (2004)). As enzimas de A. fulgidus, H. e P. marismortui aerophilum têm sido clonadas, expressas de forma funcional, e caracterizadas em E. coli (Brasen e schonheit, supra; e Musfeldt schonheit, J Bacteriol 184: 636 a 644 (2002). ). A ligase de acila CoA a partir de Pseudomonas putida foi demonstrada para trabalhar em vários substratos alifáticos incluindo ácidos acético, propiónico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico, e ácidos octanoico e em compostos aromáticos tais como os ácidos fenilacético e fenoxiacético (Fernandez-Valverde et al., Appl.Environ.Microbiol 59: 1149 a 1154 (1993)). Uma enzima relacionada, malonil-CoA sintetase (6.3.4.9) a partir de Rhizobium leguminosarum poderia converter vários diácidos, ou seja, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil-, e benzil-malonato nos seus correspondentes monotioésters (Pohl et al, J.Am.Chem.Soc 123: 5822 a 5823 (2001)). As sintetases CoA exemplificativas estão resumidas a seguir na Tabela 11. Estas sintetases de CoA sintetase com atividade succinil-CoA são aplicáveis tanto como uma sintetase de succinil-CoA ou succinil-CoA da enzima conversora da presente invenção e pode, portanto, ser alvo de atenuação. Tabela 11. Exemplos de CoA Sintetases

[0062] As vias metabólicas de múltiplas etapas que não seja o ciclo do TCA também podem ser direcionadas para a atenuação de uma enzima conversora de succinil-CoA a resultar em um fluxo de carbono reduzido de succinil-CoA a succinato. Por exemplo, enquanto CoA hidrolases, transferases e sintetases convertem succinil-CoA a succinato em um única etapa enzimática, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que outras vias metabólicas de multi-enzima podem também catalisar esta reação líquida. Exemplos de vias de etapas múltiplas que podem ser utilizadas para a atenuação de uma enzima de produção de succinato dentro de uma via de múltiplas etapas que tem uma conversão líquida de succinil- CoA a succinato incluem: (1) a degradação de arginina, (2) a biossíntese de lisina, e (3) vias de metionina biossíntese. A estequiometria líquida do succinil-CoA a succinato de reação é mostrada na Tabela 12 abaixo. Tabela 12. Estequiometria Líquida de succinil-CoA para Succinato nas vias de de múltiplas etapas

[0063] Tal como acontece com todas as outras atenuações descritas na presente invenção, a atenção de um enzima que produz succinato dentro de uma via de várias etapas pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética no presente documento ou bem descrita conhecido na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou atividade do produto de genes. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[0064] O succinato que produz as enzimas dentro dos percursos de múltiplas etapas exemplares acima incluem as enzimas que catalisam a etapa de conversão de succinil-CoA a succinato dentro de cada via, bem como qualquer uma das enzimas que catalisam uma reação a montante da etapa de conversão de succinil-CoA a succinato dentro da via que iria proibir a formação a jusante do succinato. Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica irão entender que as enzimas dentro numerosas outras vias de etapas múltiplas que têm uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato também podem ser alvo de atenuações para reduzir o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato . Tais enzimas incluem, por exemplo, as enzimas da via que convertem succinil-CoA a succinato, bem como as enzimas a montante da etapa de conversão de succinil-CoA a succinato que, se atenuada, resulta na perda ou eliminação de succinato a jusante na via de múltiplas etapas.

[0065] Um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, da presente invenção inclui, pelo menos, uma segunda atenuação de um gene de codificação succinil-CoA da enzima de conversão ou um gene que codifica uma enzima de produção de succinato dentro de uma via de múltiplas etapas que tem uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato. Por conseguinte, nesta modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural, pode incluir mais do que uma segunda atenuação de succinil-CoA da enzima de conversão, ou de uma enzima de produção de succinato. A inclusão de duas ou mais atenuações pode reduzir ainda mais o fluxo de carbono através de um ciclo de TCA oxidativo, reduzindo dessa maneira, adicionalmente, a formação de produtos secundários de CO2. Dessa maneira, um organismo microbiano da presente invenção pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais segundas atenuações de um gene que codifica uma enzima de conversão de succinil-CoA ou que codifica uma enzima de produção de succinato dentro uma via de múltiplas etapas que tem uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato. Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que quantas e quais segundas atenuações são úteis para uma aplicação particular.

[0066] Dessa maneira, a presente invenção proporciona ainda um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira e pelo menos uma segunda atenuação. A primeira atenuação pode ser um sintetase de sintetase de succinil-CoA e a redutase de succinil-CoA pode ser, por exemplo, codificada por sucCD. A primeira atenuação também pode ser uma transferase de succinil-CoA. A primeira atenuação também pode ser uma sintetase de succinil-CoA codificada por um gene apresentado nas Tabelas 1 ou 11. A primeira atenuação também pode ser uma sintetase de succinil-CoA-transferase ou succinil- CoA codificada por um gene apresentado nas Tabelas 1, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. A pelo menos segunda atenuação pode ser uma enzima de conversão de succinil-CoA de uma enzima de produção de succinato dentro de uma via de múltiplas etapas que tem uma conversão líquida de succinil-CoA a succinato. A pelo menos segunda atenuação pode ser uma CoA hidrolase, CoA-CoA transferase sintetase ou codificada por um gene apresentado nas Tabelas 1-11 ou pelo menos a segunda atenuação pode ser uma ou mais enzimas produtoras de succinato apresentadas na Tabela 12. A pelo menos segunda atenuação pode ser yciA CoA-hidrolase codificada pelo gene yciA. A pelo menos segunda atenuação pode ser duas ou mais, incluindo várias para muitas enzimas succinil-CoA de conversão ou uma enzima de produção de succinato.

[0067] A presente invenção também proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de um gene que codifica uma sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, uma segunda atenuação de gene de codificação enzima de conversão de succinil-CoA ou uma enzima que produz succinato dentro de uma via de múltiplas etapas, em que o nível de produção através de uma via de succinato de ácido tricarboxílico oxidativo (TCA) é reduzida em 25 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausente da segunda atenuação. É compreendido por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica que um organismo microbiano ausente da segunda atenuação refere-se a um organismo microbiano que não possui a modificação genética da segunda atenuação, e a atividade pode ser comparada a um tal organismo ausente da modificação genética da segunda atenuação.

[0068] Conforme descrito anteriormente, a atenuação de ambos sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, um segundo gene que codifica, por exemplo, succinil-CoA da enzima de conversão, resulta em um decréscimo significativo e não aditivo na produção de succinato através de uma via de TCA oxidativo em comparação com uma atenuação de organismo tendo uma sintetase sozinha de succinil-CoA. A redução na produção de succinato através de TCA oxidativa pode ser, por exemplo, 20 % ou mais, incluindo uma redução de 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou mais. Por conseguinte, um organismo microbiano da presente invenção pode ter um nível de atividade de succinil-CoA a succinato reduzido em 25 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausente de uma segunda atenuação. A atividade de succinil-CoA a succinato pode ser reduzida, por exemplo, 20 % ou mais, incluindo uma redução de 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou mais. Além disso, um organismo microbiano da presente invenção pode ter um nível de fluxo de 13C a partir de succinil-CoA a succinato reduzido em 25 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausente da referida segunda atenuação. 13C fluxo de succinil-CoA a succinato pode ser reduzido, por exemplo, 20 % ou mais, incluindo uma redução de 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou mais.

[0069] A ruptura de ambas uma sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, um segundo gene que codifica, por exemplo, uma enzima conversora da succinil-CoA também resulta em uma redução do excesso de CO2 produzido através TCA oxidativo em comparação com um organismo possuindo atenuação de um succinil -COA sintetase sozinho. A redução do excesso de produção de CO2 por meio de TCA oxidativa pode ser, por exemplo, 10 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausentes de uma segunda atenuação. Como descrito anteriormente, um decréscimo em excesso de CO2 facilita um maior fluxo de carbono para a produção de compostos bioderivados e, por conseguinte, maiores rendimentos de tais compostos bioderivados. Por conseguinte, uma redução em excesso e produção de CO2 através de TCA oxidativa pode ser, por exemplo, 15 % ou mais, incluindo uma redução de 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou mais.

[0070] De forma similar, a ruptura de ambas uma sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, um segundo gene que codifica, por exemplo, um succinil-CoA da enzima de conversão, adicionalmente, resulta na utilização de oxigênio diminuído por meio da célula em relação a um organismo tendo uma atenuação de um sintetase de succinil-CoA sozinho. A redução na utilização de oxigênio por célula pode ser, por exemplo, 10 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausentes de uma segunda atenuação. A diminuição da utilização do oxigênio do organismo microbiano é útil para a produção de composto bioderivado em condições de cultura micro- anaeróbica e anaeróbica. Por conseguinte, uma utilização de redução de oxigênio (O2) por célula pode ser, por exemplo, 15 % ou mais, incluindo uma redução de 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % , 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou mais.

[0071] Consequentemente, a presente invenção também fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, uma segunda atenuação de succinil-CoA da conversão de enzima ou uma enzima de produção de succinato dentro de uma via de várias etapas, em que um nível de excesso de CO2 através de TCA oxidativo é reduzido em 10 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausente da segunda atenuação (isto é, em relação a um organismo microbiano parental tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA). Além disso, a utilização do nível de oxigênio (O2) por célula é reduzida em 10 % ou mais em comparação com um organismo microbiano ausente da segunda atenuação (isto é, em relação a um organismo microbiano parental tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA).

[0072] A presente invenção proporciona adicionalmente um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, tendo um aumento da expressão de uma transhidrogenase piridina de nucleotídeo (transhidrogenase NAD (P)). A expressão aumentada pode ser por si só ou em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, aumentar a expressão de uma transhidrogenase NAD (P) em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA de uma enzima ou de produção de succinato como descrito na presente invenção. Dessa maneira, a presente invenção também fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou uma enzima de produção de succinato e ainda incluindo o aumento da expressão de uma transhidrogenase NAD (P). A expressão aumentada pode ser a expressão de uma transhidrogenase exógena que codifica o ácido nucleico de NAD (P). O aumento da expressão também pode incluir, por exemplo, até que regula a expressão do gene que codifica transhidrogenase ou através da remoção de regulação negativa de um gene de codificação transhidrogenase. Exemplos de regulação acima incluem, por exemplo, a modificação do promotor para torná-lo mais forte, aumentando a força do (s) local (s) de ligação ribossômica (s), substituindo um promotor forte e / ou, opcionalmente, o aumento do número de cópias do gene. Exemplos de remoção de regulação negativa incluem a modificação do gene elementos cis reguladoras ou elementos trans reguladores. A transhidrogenase piridina de nucleotídeo pode ser uma transhidrogenase-translocação de prótons.

[0073] A este respeito, os organismos microbianos que não ocorrem de forma natural da presente invenção podem ainda incluir uma ou mais modificações genéticas que aumentam a expressão de uma transhidrogenase NAD (P) no organismo microbiano. Uma transhidrogenase NAD (P) catalisa a transferência de equivalentes redutores entre NAD (H) e de NADP (H), acoplado à translocação de prótons através de uma membrana (Jackson, FEBS Letters 545: 18 (2003)). Nesta modalidade, a produção de CO2 em excesso é ainda mais reduzida através da redução do fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo, bem como através da via da pentose fosfato.

[0074] Uma transhidrogenase NAD (P) útil para reduzir a produção de excesso de CO2, aumentando a sua expressão em um organismo microbiano hospedeiro da presente invenção pode ser a transhidrogenase NAD (P) PntAB ou seus homólogos. A expressão de outras transhidrogenases NAD (P) ou PntAB pode ocorrer por, por exemplo, a sobre-expressão de um gene endógeno de codificação e / ou expressão de um ácido nucleico de codificação exógena. Como descrito mais abaixo, vários outros métodos estão também disponíveis para aumentar a expressão de qualquer um endógeno ou o ácido nucleico exógeno incluindo, por exemplo, incorporando os promotores mais fortes e / ou elementos reguladores positivos de ambos os ácidos nucleicos que codificam endógenos, que codificam os ácidos nucleicos exógenos, ou ambos. As pessoas que são versadas na técnica apreciarão que alguns ou todos estes métodos podem ser utilizados, isoladamente ou em combinação, para aumentar a expressão de um ácido nucleico de codificação. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos para pntA e pntB a partir de Escherichia coli podem ser encontradas descritas em Clarke et al, 158: 647 a 653 (1986).

[0075] Ainda é proporcionado um organismo microbiano que não ocorre de forma natural tendo a atenuação de uma enzima do ciclo do TCA. A atenuação de um enzima do ciclo do TCA pode estar sozinha ou em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, a atenuação de um ácido nucleico endógeno que codifica uma enzima do ciclo do TCA em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA de uma enzima ou de produção de succinato como descrito na presente invenção. Neste último exemplo, a atenuação de uma enzima do ciclo do TCA é diferente das primeira e segunda atenuações. A atenuação pode ser de uma sintetase de succinil-CoA dentro do ciclo do TCA. Por exemplo, a atenuação pode ser, por exemplo, desidrogenase de ácido succínico, fumarase e malato-desidrogenase. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrito na presente invenção ou conhecido na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou a atividade do produto do gene. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[0076] As alterações genéticas descritas na presente invenção são aplicáveis para a produção microbiana de compostos bioderivados iniciando a partir de qualquer intermediário metabólico, incluindo, por exemplo, substratos ou intermediários do ciclo do TCA bem como substratos ou intermediários dentro de outras vias metabólicas. Dessa maneira, as alterações genéticas descritas na presente invenção são aplicáveis para a redução da produção de succinato de succinil-CoA, a redução do excesso de CO2 e a redução de utilização O2 bem como para aumentar a disponibilidade de ATP, tal como descrito mais abaixo. Descrito em referência à produção de um composto bioderivado a partir de um ciclo intermediário de TCA ou um ciclo do substrato de TCA, por exemplo, a atenuação de uma sintetase de succinil-CoA ainda permite a utilização de intermediários TCA e substratos a montante do succinil- CoA para ser utilizado na produção de um composto bioderivado. A atenuação de uma sintetase de succinil-CoA, por si só ou em combinação com uma segunda atenuação de succinil-CoA para a conversão de enzima ou uma enzima de produção de succinato como descrito na presente invenção, reduz o fluxo de carbono em intermediários do ciclo do TCA a jusante e aumenta o fluxo de carbono disponíveis para biossíntese do composto bioderivado. Exemplos de intermediários do ciclo do TCA úteis para a síntese do composto bioderivado incluem a-cetoglutarato (AKG) e succinil-CoA. Um substrato do ciclo de TCA exemplificativo inclui acetil-CoA.

[0077] Tal como usado na presente invenção, um "um intermediário do ciclo de TCA " refere-se a um dos nove substratos ciclo de TCA ou produtos utilizados para gerar energia através da oxidação de acetato. Estes nove substratos são o citrato, cis-aconitato, isocitrato-d, a- cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato. Um "substrato do ciclo de TCA", tal como usado na presente invenção refere-se a um substrato usado no ciclo do TCA diferente dos acima mencionados nove compostos. Por exemplo, acetil-CoA é um substrato do ciclo de TCA porque combina com oxaloacetato para formar citrato.

[0078] Os compostos bioderivados da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, álcoois, glicóis, ácidos orgânicos, alcenos, dienos, aminas orgânicas, aldeídos orgânicos, vitaminas, produtos nutracêuticos e farmacêuticos. compostos bioderivados específicos dentro destas categorias de compostos bioderivados que são aplicáveis a ser sintetizados utilizando um organismo microbiano da presente invenção metabolicamente manipulado para a biossíntese dos compostos bioderivados que incluem, por exemplo, 4-hidroxibutirato (4HB), 1,4-butanodiol (1,4- BDO), 1,3-butanodiol (1,3-BDO), poli- hidroxilbutanoato (PHB), butadieno, adipato, 6-aminocaproato, caprolactama, ácido metacrílico, isopropanol, álcoois de cadeia longa, hexametilenediameno, metacrilato de metila, butanol, 3-buteno -1-ol, 3- buteno-2-ol e álcool de crotila. Dessa maneira, a presente invenção proporciona adicionalmente um organismo microbiano que não ocorre naturalmente possuindo uma via de metabolicamente manipulado para produzir um composto bioderivado a partir de um substrato de ciclo do TCA. O composto bioderivado pode ser 4HB, 1,4-BDO, 1,3-BDO, PHB, butadieno, adipato, 6-aminocaproato, caprolactama, ácido metacrílico, isopropanol, os álcoois de cadeia longa, hexametilenediameno, metacrilato de metila, butanol, 3-buteno -1-ol, 3-buteno-2-ol e álcool de crotila. O organismo microbiano pode compreender a via metabolicamente manipulada opcionalmente em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um substrato do ciclo de TCA em um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda uma atenuação de succinil-CoA da conversão de enzima ou uma enzima de produção de succinato tal como descrito anteriormente.

[0079] Outros compostos bioderivados dentro das categorias acima referidas que são também aplicáveis a ser sintetizado utilizando um organismo microbiano da presente invenção são exemplificados abaixo. Para exemplos, os álcoois da presente invenção, incluindo álcoois de biocombustível, incluem os álcoois primários, álcoois secundários, dióis e trióis possuindo, de preferência, C3-C10 átomos de carbono. Os álcoois incluem n-propanol e isopropanol. Os álcoois de bio-combustível são, de preferência C3-C10 e incluem 1-propanol, isopropanol, 1- butanol, isobutanol, 1-pentanol, Isopentenol, 2-metil-1-butanol, 3-metil- 1-butanol, 1-hexanol, 3-Metil-1-pentanol, 1-heptanol, 4-metil-1-hexanol, e 5-metil-1-hexanol. Os dióis incluem propanodióis e butanodióis, incluindo 1,4-butanodiol, 1,3-butanodiol e 2,3-butanodiol. Os álcoois graxos incluem álcoois graxos C27-C4, incluindo C12-C18, especialmente C12-C14, incluindo álcoois graxos de cadeia linear saturados ou insaturados.

[0080] Além disso, os compostos bioderivados exemplificativos da presente invenção incluem: (a) 1,4-butanodiol e intermediários dos mesmos, tais como ácido 4-hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4- hidroxibutirato (4-HB); (b) butadieno (1,3-butadieno) e intermediários dos mesmos, tal como 1,4-butanodiol, 1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, álcool de crotila, 3-buten-2-ol (metil vinil carbinol) e 3-buten-1 ol; (c) 1,3- butanodiol e intermediários dos mesmos, tal como 3-hidroxibutirato (3- HB), 2,4-pentadienoato, álcool de crotila ou 3-buten-1-ol; (d) adipato, 6- ácido aminocaproico (6-ACA), caprolactama, hexametilenodiamina (HMD a) e ácido levulínico e os intermediários dos mesmos, por exemplo, adipil-CoA, 4-aminobutiril-CoA; (e) ácido metacrílico (ácido 2- metil-2-propenoico) e os seus ésteres, tais como metacrilato de metila e outros ésteres de metacrilato (conhecidos coletivamente como metacrilatos), 3-hidroxiisobutirato e / ou 2-hidroxiisobutirato e seus intermediários; (f) glicóis, incluindo o 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, glicerol, etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, dipropileno glicol, tripropileno-glicol, neopentil-glicol e bisfenol A e seus intermediários; (G) ácido succínico e intermediários dos mesmos; álcoois e (h) graxos, que são os compostos alifáticos que contêm um ou mais grupos hidroxila e uma cadeia de 4 ou mais átomos de carbono, ou ácidos graxos e de ácidos graxos aldeídos dos mesmos, que são de preferência átomos de carbono C4-C27. Os álcoois graxos incluem álcoois graxos saturados, álcoois graxos insaturados e álcoois graxos de cadeia linear saturada. Exemplos de álcoois graxos incluem butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, undecila e álcoois de dodecila, e seus derivados oxidados correspondentes, isto é, aldeídos graxos ou ácidos graxos que têm o mesmo número de átomos de carbono. álcoois graxos preferidos, aldeídos graxos e ácidos graxos têm C8 a C18 átomos de carbono, especialmente C12-C18, C12-C14, e C16-C18, incluindo C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18 e átomos de carbono. álcoois graxos preferidos incluem álcoois lineares graxos insaturados, tais como dodecanol (C12; álcool de laurila), álcool de tridecila (C13; 1-tridecanol, tridecanol, isotridecanol), álcool de miristila (C14; 1-tetradecanol), álcool de pentadecila (C15; 1-pentadecanol, pentadecanol), álcool de cetila (C16; 1-hexadecanol), álcool de heptadecila (C17; 1-N-heptadecanol, heptadecanol) e álcool de estearila (C18; 1-octadecanol) e homólogos insaturados incluindo álcool de palmitoleíla (C16 insaturado; cis -9-hexadecen 1-ol), ou os seus aldeídos graxos ou ácidos graxos correspondentes.

[0081] 1,4-butanodiol e intermediários dos mesmos, tais como ácido 4-hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4-hidroxibutirato, 4-HB), são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. As vias adequadas dos compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontrados em: WO2008115840A2 publicado 25 de setembro de 2008 intitulada Composições e métodos para a biossíntese de 1,4-butanodiol e seus precursores e US20090075351; WO2010141780A1 publicada 09 de dezembro de 2010, intitulada Processo de componentes de separação de um caldo de fermentação e US20110003355; WO2010141920A2 publicado em 9 de Dezembro de 2010, intitulada Os microrganismos para a produção de 1,4-butanodiol e métodos relacionados e US20110045575; WO2010030711A2 publicada em 18 de Março de 2010 Microorganismos intitulado para a Produção de 1,4-butanodiol e US20100112654; WO2010071697A1 publicado 24 de junho de 2010 intitulada Microrganismos e métodos para conversão de gás de síntese e de outras fontes de carbono para produtos úteis e US20100304453; WO2009094485A1 publicada 30 de julho de 2009 Métodos de direito e Organismos para a utilização Síntese de gás ou outro gasosos fontes de carbono e metanol e US20090191593; e WO2009023493A1 publicada 19 de Fevereiro de 2009, intitulada Métodos e organismos para a produção, associados-crescimento de 1,4-butanodiol e US20090047719, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência. As vias exemplificativas BDO estão descritas nas referências acima e podem incluir, por exemplo, uma desidrogenase a-cetoglutarato, e uma desidrogenase semialdeído succínico dependente de CoA, ou uma descarboxilase a-cetoglutarato, ou um glutamato: transaminase semialdeído succinato e glutamato descarboxilase; uma desidrogenase 4-hidroxibutanoato; uma 4- hidroxibutiril-CoA-transferase de acetil-CoA, ou um butirato de cinase e uma fosfotransbutirilase, um aldeído desidrogenase, e um álcool desidrogenase, ou um álcool / aldeído desidrogenase, (vide o documento US 20090075351, a qual é incorporado na presente invenção por referência).

[0082] Butadieno e intermediários dos mesmos, tal como 1,4- butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,3-butanodiol, álcool de crotila, 3-buten-2-ol (metil vinil carbonila) e 3-buten-1- ol, são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. Além de fermentação direta para a produção de butadieno, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, álcool de crotila, 3-buten-2-ol (metil vinil carbonila) ou 3-buten-1-ol pode ser separado, purificado ( para qualquer uso) e, em seguida quimicamente desidratado para butadieno por meio da catálise baseado em metal. As vias adequadas de compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontradas em: WO2011140171A2 publicada 10 de novembro de 2011 intitulada Microrganismos e Métodos para a biossíntese de butadieno e US20110300597; WO2012018624A2 publicado 09 de fevereiro de 2012 intitulada Microrganismos e métodos para a biossíntese de compostos aromáticos, 2,4-pentadienoato e 1,3- butadieno e US20120021478; WO2013040383A1 publicado 21 de março de 2013 intitulada Microrganismos e métodos para produção de alcenos e US20130122563; WO2012177710A1 publicada em 27 de dezembro de 2012 Microorganismos para a Produção de butadieno e métodos relacionados à mesma e US20130011891; WO2012106516A1 publicada 09 de agosto de 2012 intitulada Microrganismos e Métodos para a biossíntese de butadieno e US20120225466; e WO2013028519A1 publicado 28 de fevereiro de 2013 intitulado Microorganismos e Métodos para Produzir 2,4-pentadienoato, butadieno, propileno, 1,3-butanodiol e álcoois relacionados e US20130109064, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência.

[0083] 1,3-butanodiol e intermediários dos mesmos, tal como 2,4- pentadienoato, álcool de crotila ou 3-buten-1-ol, são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. As vias adequadas compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontrados em: WO2011071682A1 publicado em 16 de junho de 2011 intitulado Métodos e organismos para converter Síntese de gás ou outras Fontes de carbono gasoso e metanol a 1,3-butanodiol e US20110129904; WO2011031897A publicado em 17 de março de 2011 intitulada Microrganismos e métodos para a co-produção de Isopropanol com álcoois primários, dióis e ácidos e US 20110201068; WO2010127319A2 publicada em 4 de Novembro de 2010 intitulado Organismos intitulado para a produção de 1,3-butanodiol e US20100330635; WO2013071226A1 publicado em 16 de maio de 2013, intitulada Organismos e Métodos eucarióticas para aumentar a disponibilidade de acetil-CoA citosólico, e para a produção de 1,3- butanodiol e US20130066035; WO2013028519A1 publicada 28 de fevereiro de 2013 intitulada Microrganismos e métodos para produzir 2,4-pentadienoato, butadieno, propileno, 1,3-butanodiol e álcoois relacionados e US 20130109064; WO2013036764A1 publicado em 14 de Março de 2013, intitulada Organismos e Métodos eucarióticos para a Produção de 1,3-butanodiol e US20130066035; WO2013012975A1 publicado em 24 de Janeiro de 2013 Métodos intitulado para aumentar a produção do produto; e WO2012177619A2 publicada em 27 de dezembro de 2012 Microorganismos para a Produção de 1,3-butanodiol e Métodos relacionadas com o mesmo e US20120329113, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência.

[0084] Adipato, ácido 6-aminocaproico, caprolactama, hexametilenodiamina e ácido levulínico, e seus intermediários, por exemplo 4-aminobutiril-CoA redutase, são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. As vias adequadas de compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontradas em: WO2010129936A1 publicada 11 de novembro de 2010 intitulada Microrganismos e Métodos para a biossíntese de Adipato, hexametilenodiamina e ácido 6-aminocaproico e US20120282661; WO2013012975A1 publicado em 24 de Janeiro de 2013 intitulada Métodos para aumentar a produção do produto; WO2012177721A1 publicada em 27 de dezembro de 2012 intitulada Microorganismos para a Produção de 6-aminocaproico; WO2012099621A1 publicada em 26 de julho de 2012 intitulada Métodos para aumentar o rendimento do produto e US20110201089; WO2009151728 e publicada em 17 de Dezembro de 2009 intitulado Microorganismos para a produção de ácido adípico e outros compostos e US20090305364, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência.

[0085] O ácido metacrílico (ácido 2-metil-2-propenoico) é utilizado na preparação dos seus ésteres, conhecidos coletivamente como metacrilatos (por exemplo, metacrilato de metila, que é utilizado principalmente na fabricação de polímeros). O ácido metacrílico, ésteres de metacrilato tal como metacrilato de metila, e precursores, tais como 3-hidroxiisobutirato e / ou 2-hidroxiisobutirato, e seus intermediários, são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. vias adequadas compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontrados em: WO2012135789A2 publicada em 04 de outubro de 2012 intitulada Microorganismos para produção de ácido metacrílico e ésteres de metacrilato e Métodos relacionados com o mesmo e US20130065279; e WO2009135074A2 publicado em 5 de Novembro de 2009, intitulado Microorganismos para a produção de ácido metacrílico e US20090275096, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência.

[0086] 1,2-propanodiol (propilenoglicol), n-propanol, 1,3- propanodiol e glicerol, e seus intermediários são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e nas seguintes publicações. As vias adequadas dos compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontradas em: WO2009111672A1 publicada 09 de novembro de 2009, intitulada Organismos produtores de álcool primário e US20090275097; WO2011031897A1 17 de março de 2011 intitulada Microrganismos e métodos para a co-produção de Isopropanol com álcoois primários, dióis e ácidos e US20110201068; WO2012177599A2 publicada em 27 de dezembro de 2012 intitulada Microorganismos para a Produção de N-Propanol 1,3-diol, 1,2-diol ou glicerol e Métodos relacionados com o mesmo, que são todos incorporados na presente invenção por referência.

[0087] O ácido succínico e seus intermediários, que são úteis para a produção de produtos, incluindo polímeros (por exemplo, succinato de polibutileno ou PBS), 1,4-butanodiol, tetra-pirrolidona, solventes, tintas, Descongeladores, plásticos, aditivos de combustíveis, tecidos, tapetes, pigmentos, e detergentes, são compostos bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas descritas na presente invenção e na publicação seguinte. As vias adequadas dos compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontrados em: EP1937821A2 publicada em 2 de julho de 2008 intitulada Métodos e Organismos para a Produção Acoplada de Crescimento do Succinate, WO / 2007/030830 publicado em 15 de março de 2007 intitulada Métodos e organismos para Produção Acoplada de crescimento de succinato e US20070111294, todos os quais são incorporados na presente invenção por referência. É compreendido por aquelas pessoas que são versadas na técnica que a produção de succinato como um produto desejado pode ser aplicável nos organismos microbianos da presente invenção, se desejado, nomeadamente os organismos microbianos que têm modificações metabólicas que não resultam em uma diminuição da produção de succinato, por exemplo, uma modificação que afete a conversão metabólica de succinil-CoA a succinato.

[0088] Os álcoois primários compostos e álcoois graxos (também conhecidos como álcoois de cadeia longa), incluindo ácidos graxos e de aldeídos graxos dos mesmos, e os intermediários dos mesmos, são bioderivados que podem ser feitos através de vias enzimáticas nas seguintes publicações. As vias adequadas compostos bioderivados e enzimas, métodos de rastreio e métodos para isolar são encontrados em: WO2009111672 publicado em setembro de 2009, intitulada Organismos de produção de álcool primário e US20090275097 11; WO2012177726 publicado em dezembro 27, 2012 intitulada Microorganismo para a produção de álcoois primários e compostos relacionados e métodos relacionados com essas atividades, que são todos incorporados na presente invenção por referência.

[0089] Os compostos bioderivados adequados adicionais que os organismos microbianos da presente invenção podem ser utilizados para produzir via acetil-CoA, incluindo ainda, opcionalmente, através de acetoacetil-CoA e / ou succinil-CoA redutase, estão incluídos na presente invenção. Exemplos de compostos bioderivados bem conhecidos, suas vias e a produção de enzimas, métodos para o rastreio e métodos para isolar são encontrados nas seguintes patentes e publicações: succinato (publicação US 2007/0111294, WO 2007/030830, WO 2013/003432), ácido 3-hidroxipropiónico (3- hidroxipropionato) (publicação US 2008/0199926, WO 2008/091627 publicação, US 2010/0021978), 1,4-butanodiol (patente US 8067214, WO 2008/115840, patente US 7947483, WO 2009/023493, patente US 7858350, WO 2010/030711, publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, patente US 8129169, WO 2010/141920, publicação US 2011/0201068, WO 2011/031897, patente US 8377666, WO 2011/047101, US publicação 2011/0217742, WO 2011/066076, US 2013/0034884 publicação, o documento WO 2012/177943), 4- hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4-hidroxibutirato, 4- hidroxibutirato) (patente US 8067214, WO 2008/115840, US patente 7947483, WO 2009/023493, patente US 7858350, WO 2010/030711, publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, patente US 8129155, WO 2010/071697), Y-butirolactona (US patente 8067214, WO 2008/115840, patente US 7947483, WO 2009/023493, patente US 7858350, WO 2010/030711, publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, publicação US 2011/0217742, WO 2011/066076), 4 - hidroxibutiril-CoA (publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, publicação US 2013/0034884, WO 2012/177943), 4-hidroxibutanal (publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, publicação US 2013/0034884, WO 2012/177943), putrescina (publicação US 2011/0003355, WO 2010/141780, US 2013/0034884 publicação, odocumento WO 2012/177943), olefinas (tais como ácido acrílico e éster de acrilato) (patente US 8026386, WO 2009/045637) , acetil-CoA redutase (patente US 8323950, WO 2009/094485), tetrahidrofolato de metila (patente US 8323950, WO 2009/094485), etanol (patente US 8129155, WO 2010/071697), isopropanol (patente US 8129155, WO 2010/071697 , publicação US 2010/0323418, WO 2010/127303, US 2011/0201068 publicação, o documento WO 2011/031897), n-butanol (patente US 8129155, WO 2010/071697), isobutanol (patente US 8129155, WO 2010/071697), n-propanol (US publicação 2011/0201068, WO 2011/031897), ácido metilacrílico (metacrilato) (publicação US 2011/0201068, WO 2011/031897), álcool primário (patente US 7977084, WO 2009/111672, WO 2012/177726), álcool de cadeia longa (patente US 7.977.084, WO 2009/111672, WO 2012/177726), adipato (ácido adípico) (patente US 8062871, WO 2009/151728, a patente US 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), 6-aminocaproato ( ácido 6-aminocaproico) (patente US 8062871, WO 2009/151728, patente US 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), caprolactama (patente US 8062871, WO 2009/151728, patente US 8377680, WO 2010/129936, O documento WO 2012/177721), hexametilenodiamina (patente US 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), ácido levulínico (patente US 8377680, WO 2010/129936), ácido 2-hidroxiisobutirico (2-hidroxiisobutirato) (patente US 8241877, WO 2009/135074, US 2013/0065279 publicação, documento WO 2012/135789), 3-hidroxiisobutirico ácido (3- hidroxiisobutirato) (patente US 8241877, WO 2009/135074, US 2013/0065279 publicação, o documento WO 2012/135789), ácido metacrílico (metacrilato) (US patente 8241877, WO 2009/135074, publicação US 2013/0065279, WO 2012/135789), éster de metacrilato (publicação US 2013/0065279, WO 2012/135789), fumarato (ácido fumárico) (patente US 8129154, WO 2009/155382) , malato (ácido málico) (patente US 8129154, WO 2009/155382), acrilato (ácido carboxílico) (patente US 8129154, WO 2009/155382), metil-etil-cetona (publicação US 2010/0184173, WO 2010/057022, a patente US 8420375, WO 2010/144746), 2-butanol (publicação US 2010/0184173, WO 2010/057022, patente US 8420375, WO 2010/144746), 1,3- butanodiol (publicação US 2010/0330635, WO 2010/127319, US publicação 2011/0201068, WO 2011/031897, patente US 8268607, WO 2011/071682, publicação US 2013/0109064, WO 2013/028519, publicação US 2013/0066035, WO 2013/036764), ciclohexanona (publicação US 2011/0014668 , WO 2010/132845), tereftalato (ácido tereftálico) (publicação US 2011/0124911, WO 2011/017560, publicação US 2011/0207185, WO 2011/094131, publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624), muconato (ácido mucínico) (US publicação 2011/0124911, WO 2011/017560), anilina (publicação US 2011/0097767, WO 2011/050326), p-toluato (ácido p-toluico) (publicação US 2011/0207185, WO 2011/094131, publicação US 2012 / 0021478, WO 2012/018624), (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi) fosfonato (publicação US 2011/0207185, WO 2011/094131, US 2012/0021478 publicação, o documento WO 2012/018624), etileno glicol (US publicação 2011/0312049, WO 2011/130378, WO 2012/177983), propileno (publicação US 2011/0269204, WO 2011/137198, US 2012/0329119 publicação, publicação US 2013/0109064, WO 2013/028519), butadieno (1 , 3-butadieno) (publicação US 2011/0300597, WO 2011/140171, publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624, publicação US 2012/0225466, WO 2012/106516, publicação US 2013/0011891, WO 2012/177710, publicação US 2013/0109064, WO 2013/028519), tolueno (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624), benzeno (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624), (2-hidroxi-4-oxobutoxi) fosfonato (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624), benzoato de (ácido benzoico) (US publicação 2012/0021478, WO 2012/018624), estireno (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624), 2,4-pentadienoato (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624, publicação US 2013/0109064, WO 2013 / 028519), 3-buteno-1-ol (publicação US 2012/0021478, WO 2012/018624, US 2013/0109064 publicação, o documento WO 2013/028519), 3-buteno-2-ol (publicação US 2013/0109064, WO 2013/028519), 1,4-ciclo-hexanodimetanol (publicação US 2012/0156740, WO 2012/082978), álcool de crotila (publicação US 2013/0011891, WO 2012/177710, US 2013/0109064 publicação, documento WO 2013/028519), alceno (publicação US 2013/0122563, WO 2013/040383), ou caprolactona (publicação US 2013/0144029, WO 2013/067432). As publicações de patentes e patentes de aplicativos listados acima, que descrevem as vias de compostos bioderivados incorporados são na presente invenção por referência.

[0090] A presente invenção proporciona adicionalmente um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de trifosfato de adenosina (ATP). A alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP pode ser por si só ou em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA de uma enzima ou de produção de succinato tal como descrito anteriormente. Dessa maneira, a presente invenção também fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou uma enzima que produz succinato, e tendo ainda uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de trifosfato de adenosina (ATP) no organismo microbiano. A alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP podem incluir o aumento da expressão de NADH dehirogenase Ndh-I, citocromo-oxidase ou ambos Bo NADH dehirogenase Ndh-I e citocromo Bo oxidase.

[0091] A atenuação de um ou mais genes que catalisam a conversão de succinil-CoA a succinato no ciclo do TCA oxidativo pode levar a uma redução na taxa de crescimento em alguns cepa fundos, devido a limitações de energia ou redox. Este defeito de crescimento pode ser ultrapassado por meio de estratégias de conservação de carbono que aumentam a disponibilidade de ATP ou melhoram o rendimento energético ou eficiência energética da cepa. Essas estratégias incluem, por exemplo, (1) engenharia da cadeia de transporte de elétrons, e (2) substituindo ou complementando carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) com carboxicinase Gerador de ATP de fosfoenoilpiruvato (PEPCK). Cada estratégia é descrita em maior detalhe abaixo. Em adição à sua utilização em organismos microbianos hospedeiro com atenuação de uma enzima do ciclo do TCA, cada uma destas alterações genéticas são igualmente aplicáveis para aumentar a ATP ou para melhorar o rendimento energético ou eficiência energética de organismos microbianos hospedeiras que gera um composto bioderivado a partir de um substrato que não seja um ciclo do TCA intermediário ou substrato.

[0092] A este respeito, um rendimento de crescimento e de energia de um organismo microbiano pode ser melhorado por meio da engenharia da cadeia de transporte de elétrons para serem mais eficientes na produção de ATP. A cadeia respiratória de, por exemplo, E. coli inclui várias desidrogenases NADH. As desidrogenases NADH incluem Ndh-I, II-Ndh, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor MdaB e no lado de entrada de elétrons da cadeia respiratória. A cadeia respiratória de, por exemplo, E. coli também inclui quatro diferentes oxidases ubiquinol no lado da saída. As oxidases do citocromo-oxidase incluem ubiquinol Bo, bd citocromo-oxidase I, Citocromo oxidase BD-II e mono-oxigenase quinol (Becker et al, J Bacteriol 191: 5510 a 17 (2009)). As oxidases do citocromo têm diferentes eficiências de conservação de energia. O complexo de citocromo Bo, codificado pelo operão cio, bombeia ativamente os elétrons sobre a membrana e resulta em uma estequiometria H + / 2e de 4. O complexo de citocromo I-bd não aparece para bombear de forma ativa os prótons, mas, devido à oxidação do quinol no lado periplasmático da absorção da membrana e posterior de prótons a partir do lado citoplasmático da membrana, que são utilizados na formação de água, o líquido de transferência de elétrons resulta em uma estequiometria de H + / 2e ~ 2. Esta oxidase é codificada pelo operon cyd. Até recentemente, a estequiometria de prótons de translocação de citocromo-oxidase BD-II, codificado por appBC, não era conhecida, mas agora tem sido descrito que esta oxidase é não-eletrogênica (Becker et al, supra). YgiN também é não- eletrogênica (Portnoy et al, AEM 74: 7561 a 69 (2008)). As desidrogenases NADH também têm diferentes eficiências de poupança energética e único Ndh-1, codificado por nuo, prótons translocados. NADH desidrogenase I (nuo) e citocromo bo oxidase codificado por cyoABCDE são os componentes mais eficientes desta cadeia, cada translocação de quatro prótons por par de elétrons transferidos. A eficiência energética da cadeia respiratória é máxima quando a cadeia de transporte de elétrons utiliza citocromo-oxidase Cyo e NADH desidrogenase Nuo. A optimização do nível de Cyo e / ou expressão nuo pode, portanto, ser realizada para aumentar a eficiência da cadeia de transporte de elétrons e a um rendimento de crescimento e de energia dos organismos.

[0093] Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que há uma variedade de abordagens diferentes que podem ser empregues para aumentar a eficiência da cadeia de transporte de elétrons e, dessa maneira, aumentando o crescimento celular e produção de energia. Uma abordagem envolve o aumento da expressão de NADH desidrogenase Ndh-I (nuo) e / ou o aumento da expressão da oxidase de citocromo Bo (cyoABCDE). A expressão pode ser aumentada através de, por exemplo, a sobre- expressão de um gene endógeno que codifica e / ou expressa um ácido nucleico de codificação exógena. A sobre-expressão de um gene endógeno inclui, por exemplo, a regulação e a remoção de regulação negativa, tal como descrito na presente invenção. Por referência à expressão de um ácido nucleico de codificação exógena para fins de exemplificação, uma abordagem que pode ser empregue para aumentar a eficiência da cadeia de transporte de elétrons envolve a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica o NADH dehirogenase Ndh-I ou citocromo Bo oxidase. Uma abordagem alternativa envolve a expressão de um ou mais ácidos nucleicos exógeno que codifica tanto um NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) quanto citocromo Bo oxidase (cyoABCDE). A expressão de exógeno ou a sobre-expressão de endógeno de um ou de ambos estes enzimas da cadeia de transporte de elétrons irá aumentar a sua disponibilidade para o transporte de elétrons e, portanto, aumentar a sua eficiência. Como descrito mais abaixo, vários outros métodos estão também disponíveis para aumentar a expressão de qualquer um endógeno ou o ácido nucleico exógeno incluindo, por exemplo, incorporando os promotores mais fortes e / ou elementos reguladores positivos de ambos os ácidos nucleicos que codificam os endógenos, os ácidos nucleicos que codificam o exógeno ou ambos. As pessoas que são versadas na técnica apreciarão que alguns ou todos estes métodos podem ser utilizados sozinhos ou em combinação para aumentar a expressão de um ácido nucleico de codificação.

[0094] Os aumentos na eficiência do transporte de elétrons e a geração de ATP também podem ser obtidos, por exemplo, a atenuação de um ou mais, incluindo todas, as restantes desidrogenases NADH endógeno ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina. Da mesma forma, a atenuação de uma ou mais, incluindo todas, as restantes oxidases ubiquinol endógenas também podem ser geradas para aumentar a eficiência. De forma semelhante, a incorporação de uma atenuação tanto de uma ou mais, incluindo todas, as restantes desidrogenases NADH e NAD(P)H : oxidorredutases quinina e uma ou mais, incluindo todas, as oxidases de ubiquinol restantes podem aumentar a eficiência semelhante. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrita na presente invenção ou conhecida na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou a atividade do produto do gene. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[0095] A desidrogenase NAD(P) H endógena restante ou NAD(P)H : Oxirredutases quinina envolvida no transporte de elétrons inclui desidrogenase NAD (P) H ou NAD(P)H : quinino Oxidorredutase Ndh-II, wrba, YhdH, YieF , YtfG, Qor e MdaB (desidrogenases não-Ndh-I NADH). Uma ou mais destas desidrogenases ou Oxirredutases pode ser atenuada para aumentar a eficiência de transporte de elétrons e aumentar o rendimento ATP, porque vai resultar em aumento de transporte de elétrons através de Ndh-I. Consequentemente, os organismos microbianos da presente invenção podem ter a atenuação de um ou mais dos Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor ou MdaB, incluindo a atenuação para todas estas desidrogenases NAD (P) H e / ou NAD(P)H : Oxirredutases quinino. Da mesma forma, um organismo microbiano da presente invenção pode ter atenuações para todas as combinações das acima sete desidrogenases NAD (P) H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina, incluindo, por exemplo, atenuações para todas as combinações de duas, três, quatro , cinco e seis desidrogenases NAD (P) H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina. Uma atenuação de uma ou mais desidrogenases não Ndh-I NADH, tal como descrito acima pode ser gerada em um organismo microbiano da presente invenção quer isoladamente para aumentar a eficiência do transporte de elétrons e a disponibilidade de ATP ou usado em conjunção com a expressão aumentada de dehirogenase NADH Ndh-I, citocromo-oxidase ou ambos Bo dehirogenase NADH Ndh-I e citocromo Bo oxidase como se descreveu anteriormente.

[0096] As oxidases ubiquinol endógenas restantes envolvidas no transporte de elétrons incluem citocromo oxidase BD-I, citocromo bd-II oxidase e mono-oxigenase quinol (oxidases bo non-citocromo). O gene que codifica uma ou mais dessas oxidases pode ser rompido para aumentar a eficiência do transporte de elétrons e aumentar a produção de ATP, porque uma tal atenuação ou ruptura irá resultar em um aumento de transporte de elétrons através da oxidase do citocromo Bo. Consequentemente, os organismos microbianos da presente invenção podem ter uma atenuação de um ou mais de citocromo oxidase BD-I, Citocromo oxidase BD-II ou mono-oxigenase quinol, incluindo uma atenuação para todas essas oxidases de ubiquinol. Da mesma forma, um organismo microbiano da presente invenção pode ter atenuações para todas as combinações dos três oxidases ubiquinol acima, incluindo, por exemplo, atenuações para todas as combinações de dois oxidases de ubiquinol. A atenuação de uma ou mais não-oxidases do citocromo bo, tal como descrito acima pode ser gerada em um organismo microbiano da presente invenção quer isoladamente para aumentar a eficiência do transporte de elétrons e a disponibilidade de ATP ou usado em conjunção com a expressão aumentada de NADH dehirogenase Ndh-I, citocromo Bo -oxidase ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I e citocromo Bo oxidase como se descreveu anteriormente.

[0097] Tal como com atenuações para algumas ou todas as desidrogenases NAD (P) H endógenas ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina exceto Ndh-I (isto é, as desidrogenases não Ndh-I NADH) ou algumas ou todas as oxidases ubiquinol exceto citocromo Bo oxidases (ou seja, o bo oxidases não-citocromo), atenuações para um ou mais de ambos uma desidrogenase não Ndh-I NADH e uma não-oxidase do citocromo bo podem ser geradas para aumentar a eficiência do transporte de elétrons e aumento rendimento de ATP porque tais atenuações irão resultar em aumento de transporte de elétrons através de Ndh-I NADH desidrogenase e citocromo bo oxidase. Consequentemente, os organismos microbianos da presente invenção podem ter uma atenuação de um ou mais dos Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor ou MdaB, incluindo uma atenuação para todas estas desidrogenases NAD (P) H e NAD (P ) H: oxidorredutases quinina, e uma atenuação de um ou mais de citocromo oxidase BD-I, Citocromo oxidase BD-II ou mono-oxigenase quinol, incluindo uma atenuação para todas essas oxidases de ubiquinol. Uma combinação exemplar inclui atenuação da Ndh-II, oxidase BD-I ou Ndh-II e Oxidase BD-I. Da mesma forma, um organismo microbiano da presente invenção pode ter atenuações para todas as combinações das acima sete desidrogenases NAD (P) H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina, incluindo, por exemplo, atenuações para todas as combinações de duas, três, quatro , cinco e seis desidrogenases NAD (P) H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina, e pode ter atenuações para todas as combinações das acima três oxidases ubiquinol incluindo, por exemplo, atenuações para todas as combinações de duas oxidases de ubiquinol. Uma atenuação de uma ou mais desidrogenases NADH não-Ndh-I e / ou não-citocromo bo oxidases como descrito acima pode ser gerada em um organismo microbiano da presente invenção quer isoladamente para aumentar a eficiência do transporte de elétrons e a disponibilidade de ATP ou utilizado em conjunto com o aumento expressão de NADH dehirogenase Ndh-I, citocromo-oxidase ou ambos Bo NADH dehirogenase Ndh-I e citocromo bo oxidase como se descreveu anteriormente.

[0098] Exemplos de desidrogenases NADH de não-Ndh-I e não- citocromo Bo oxidases que são úteis para a atenuação para melhorar a eficiência energética da cadeia de transporte de elétrons e, dessa maneira, aumentando a disponibilidade de ATP estão resumidos na Tabela 14 abaixo. Tabela 14. Exemplos desidrogenases NADH de não-Ndh-I e não- citocromo Bo oxidases

[0099] A presente invenção também proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol ou dimetilmenaquinol. A atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol ou dimetilmenaquinol pode ser isolada ou em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol ou dimetilmenaquinol em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de succinil- CoA da conversão de enzima ou uma enzima de produção de succinato tal como descrito anteriormente. Dessa maneira, a presente invenção também fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou uma enzima de produção de succinato, e possuindo adicionalmente uma atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol ou dimetilmenaquinol. A atenuação pode ser a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol, uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol ou uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrita na presente invenção ou conhecida na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou a atividade do produto do gene. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação. Os genes que codificam as enzimas biossintéticas de menaquinol e dimetilmenaquinol exemplares são apresentados na Tabela 15.

[00100] A alteração genética relacionada que pode ser empregue para melhorar a eficiência da cadeia de transporte de elétrons e aumentar o rendimento de ATP é alterar a composição do grupo de quinona, tais que o total de conjuntos de ubiquinona e ubiquinol são aumentados e os conjuntos de menaquinona e menaquinol são diminuídos . A composição do grupo quinona pode ser regulada por meio dadisponibilidade de oxigênio (Shestopalov et al, FEBS Lett 404: 2 a 3: 272 a 4 (1997)). Cyo e Cyd pode oxidar tanto o ubiquinol. No entanto, também pode oxidar Cyd menaquinol Cyo considerando que exibe pouca atividade para menaquinol. A interrupção de biossíntese de menaquinona e / ou a menaquinol pode, portanto, ser utilizada para o aumento de fluxo através de Cyo deslocando a distribuição do conjunto de quinona para a ubiquinona e ubiquinol, levando a respiração mais eficiente de energia.

[00101] As enzimas biossintéticas de menaquinona exemplares que são úteis para a atenuação para melhorar a eficiência energética da cadeia de transporte de elétrons e, dessa maneira, aumentando a disponibilidade de ATP estão resumidas na Tabela 15 abaixo. Tabela 15. Exemplos de Enzimas biossintéticas de menaquinona

[00102] A presente invenção também proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) complementada ou substituída com um carboxicinase fosfoenoilpiruvato geradora de ATP (PEPCK, também denominado PPCK). A substituição ou suplementação pode estar sozinha ou em combinação com qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, substituindo ou complementando PPC com um PEPCK gerador de ATP em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de um sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA de uma enzima ou de produção de succinato como descrito na presente invenção. Dessa maneira, a presente invenção também fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou uma enzima que produz succinato, e tendo ainda um PPC complementado ou substituído com um PEPCK gerador de ATP.

[00103] Outra alteração genética que pode ser empregada para aumentar a disponibilidade de ATP em organismos microbianos hospedeiros da presente invenção inclui substituir ou complementar PPC com um fosfoenoilpiruvato Gerador de ATP de carboxicinase PEPCK.

[00104] A título de exemplificação em E. coli, por exemplo, duas enzimas catalisam a interconversão de fosfoenolpiruvato (PEP) e oxaloacetato. Uma enzima corresponde a carboxilase PEP (PPC, EC 4.1.1.31) e a segunda enzima corresponde ao PEP carboxiquinase (PPCK, EC 4.1.1.49). As reações catalisadas por cada uma destas enzimas estão resumidas nas fórmulas abaixo.

[00105] Conforme ilustrado e descrito acima, ambas as enzimas PPC e PEPCK catalisam a carboxilação de PEP a oxaloacetato. A formação de oxaloacetato via PEPCK gera ATP, o que melhora a disponibilidade ATP no ciclo de TCA interrompida e linhagens de ciclo de TCA não interrompidas. A atividade PEPCK pode substituir a atividade de PPC, ou pode complementá-lo (suplemento). As enzimas de PEPCK exemplificativas estão descritas em maior detalhe abaixo. As pessoas que são versadas na técnica também saberão que a suplementação do meio nos métodos descrito na presente invenção com bicarbonato, aspartato ou CO2 em excesso pode ser útil para atingir taxas de crescimento mais elevadas.

[00106] A suplementação de PPC inclui, por exemplo, a sobre- expressão de PEPCK uma endógeno que codifica o ácido nucleico e / ou expressão de um ácido nucleico que codifica PEPCK exógeno. A super expressão inclui, por exemplo, a regulação e a remoção de regulação negativa, tal como descrito na presente invenção. Tal como acontece com qualquer expressão de um ácido nucleico de codificação exógena descrito na presente invenção, o ácido nucleico exógeno pode ser um ácido nucleico que codifica que é homólogo ao organismo microbiano hospedeiro ou pode ser um ácido nucleico que codifica que é heterólogo ao hospedeiro. A substituição de PPC inclui, por exemplo, a atenuação de PPC endógena e ou a sobre-expressão de PEPCK de um endógeno que codifica o ácido nucleico e / ou expressão de um ácido nucleico que codifica PEPCK exógeno. A atenuação pode ser uma ruptura do gene ou outra alteração genética descrita na presente invenção ou conhecida na técnica que resulta na diminuição da expressão do gene ou a atividade do produto do gene. Tais métodos incluem, por exemplo, alterar um promotor, a região reguladora ou um gene regulador de expressão do gene de codificação.

[00107] Conforme descrito mais abaixo, vários métodos também estão disponíveis para aumentar a expressão de qualquer um endógeno ou o ácido nucleico exógeno incluindo, por exemplo, incorporando os promotores mais fortes e / ou elementos reguladores positivos de um dos enantiômeros endógeno que codifica ácidos nucleicos, a nucleico de codificação exógena ácidos, ou ambos. As pessoas que são versadas na técnica apreciarão que alguns ou todos estes métodos podem ser utilizados sozinhos ou em combinação para aumentar a expressão de um ácido nucleico de codificação.

[00108] Com respeito às enzimas PEPCK exemplares, enzimas PEPCK de S. cerevisiae e de Escherichia colisão codificadas por pCK1 e pckA, respectivamente (Valdés-Hevia et al, FEBS.Lett 258: 313 a 316 (1989); Kim et. al., Appl Environ Microbiol 70: 1238 a 1241 (2004)). A E. coli PEPCK é principalmente ativa durante gliconeogênese. No entanto, a atividade da PEPCK endógeno de E. coli a partir de PEP oxaloacetato no sentido tem sido demonstrada em mutantes ppc de E. coli K-12 (Kwon et al, J. Micro Biotech. 16: 1448 a 1452 (2006)). Estas cepas não apresentam defeitos de crescimento e a produção tinha aumentado succinato a concentrações elevadas de NaHCO3. Dessa maneira, a substituição de PPC com PEPCK pode ser utilizada para aumentar ainda mais a produção de ATP. Um projeto metabólico alternativo para aumentar a geração de ATP através da PEPCK pode incluir a redução da afinidade a oxaloacetato. Por exemplo, a atividade da enzima de E. coli PEPCK no sentido consumindo-oxaloacetato pode ser reduzida através da introdução de uma substituição de aminoácidos no local de ligação oxaloacetato (PCK R65Q) (Cotelesage et al., Int.J Biochem.Cell Biol. 39: 1204 a 1210 (2007)). Em alguns organismos, particularmente as bactérias do rúmen, PEPCK é bastante eficiente na produção de oxaloacetato de PEP e na geração de ATP. Tais enzimas PEPCK eficientes também são aplicáveis para utilização nos organismos microbianos da presente invenção que são modificados para aumentar a produção de ATP. Exemplos de genes PEPCK que foram clonados em E. coli e de modo semelhante aplicáveis para utilização nos organismos microbianos da presente invenção incluem aqueles de Mannheimia succiniciproducens (Lee et al, Biotechnol.Bioprocess Eng. 7: 95 a 99 (2002)), (Laivenieks et al, Appl Environ Microbiol 63: 2.273 a 2.280 (1997)) (Anaerobiospirillum succiniciproducens. Kim et al, Appl Environ Microbiol 70: 1238 a 1241 (2004)), e succinogenes actinomycetemcomitans. A enzima PEPCK de Megathirsus maximus tem um Km baixo para o CO2, um substrato pensado para ser na enzima de E. coli (que limita a velocidade de Chen et al, Plant Phisiol 128: 60 a 164 (2002); Cotelesage et al, Int . J Biochem.Cell Biol 39: 1204 a 1210 (2007)). Ainda um outro candidato enzima é a enzima PEPCK de Haemophilus influenza. Exemplos de enzimas PEPCK estão resumidos na Tabela 16 abaixo. Tabela 16. Exemplos de Enzimas PEPCK

[00109] A atenuação ou a sintonização da sub-expressão, incluindo, por exemplo, ruptura de genes de um ácido nucleico que codifica para enzimas de PPC endógenos, pode ser benéfica para evitar ou reduzir um ciclo consumindo o ATP com PEPCK e para garantir que PEPCK seja a principal fonte de oxaloacetato . Exemplos de enzimas PPC são codificados por PPC em E. coli (Kai et al, Arch Biochem Biophis 414: 170 a 179 (2003), em PPCA Metilabacterium extorquens AM1 (Arps et al, J. Bacteriol 175: 3776 a 3783 (1993), e PPC em Corynebacterium glutamicum (Eikmanns et al, Mol Gen. Genet 218: 330 a 339 (1989) Exemplos de enzimas PPC estão resumidos na Tabela 17 abaixo. Tabela 17. Exemplos de Enzimas PPC

[00110] A atividade de formação de oxaloacetato de PEPCK ou PPC em um organismo microbiano hospedeiro da presente invenção, incluindo um hospedeiro tendo reduzido a atividade de succinil-CoA a succinato, pode ser aumentada por meio da sobre-expressão de PEPCK e / ou PPC. A atividade de PEPCK pode ser melhorada através do aumento da disponibilidade de PEP intracelular. Este aumento pode ser conseguido, por exemplo, por meio da ruptura do sistema de PTS de glicose e / ou aumento da expressão de um sistema de não-PTS, tais como glicose-permease, facilitador de glicose ou veículo ABC de glicose. Outra estratégia para aumentar PEP intracelular é atenuar piruvato quinase que catalisa a conversão dependente de ADP de fosfoenolpiruvato a piruvato. As atenuações e aumentos acima na expressão do gene podem ocorrer por meio de qualquer um dos métodos descrito na presente invenção, incluindo, por exemplo, a ruptura de genes de um ou mais genes que codificam para interceptar um sistema PTS e / ou piruvato-quinase e por meio da sobre-expressão de um gene endógeno ou a expressão de um ácido nucleico de codificação exógena para aumentar a expressão dos genes acima exemplificados. Exemplos de genes cuja ruptura pode melhorar a conversão de PEP a oxaloacetato em uma cepa com reduzida atividade de succinil-CoA a succinato são apresentados na Tabela 18 abaixo. Tabela 18. Genes exemplares cuja ruptura melhora a conversão de PEP a oxaloacetato

[00111] Os organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção incluem todas as combinações e trocas das alterações genéticas descritas na presente invenção. Dessa maneira, como estabelecido na presente invenção, no que se refere a certas combinações de exemplares de alterações genéticas, qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção podem ser combinadas com uma ou mais alterações genéticas descritas na presente invenção para gerar um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, tendo um ou mais das características metabólitas decorrentes. As combinações de diferentes alterações genéticas podem incluir, por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove ou mais combinações de alterações genéticas, incluindo um organismo microbiano tendo qualquer número de alterações genéticas descritas na presente invenção acima para a combinações de todas as alterações genéticas descritas na presente invenção. Por conseguinte, algumas das várias combinações de alterações genéticas são exemplificadas abaixo para fins de ilustração. No entanto, dados os ensinamentos e orientação fornecidos na presente invenção pelas pessoas que são versadas na técnica compreenderão que todas as outras combinações não exemplificadas acima ou abaixo estão incluídas no âmbito da presente invenção tal como é descrito na presente invenção.

[00112] Por exemplo, em uma modalidade exemplar, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de YciA CoA-hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermediário de TCA ou um ciclo do substrato de TCA. O ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode ser, por exemplo, a-KetoGluterate, succinil-CoA e / ou o acetil-CoA. O organismo microbiano que não ocorre naturalmente pode ainda incluir, por exemplo, a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica para uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina. O ácido nucleico exógeno que codifica a transhidrogenase de nucleotídeo de piridina pode ser, por exemplo, pntAB.

[00113] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de YciA CoA-hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, por exemplo, a atenuação de uma enzima de um ciclo do TCA. O composto bioderivado produzido a partir de um substrato do ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, por exemplo, 4HB, 1,4-BDO, 1,3-BDO, PHB, butadieno, adipato, 6-aminocaproato, caprolactama, ácido metacrílico, isopropanol, álcoois de cadeia longa, hexametilenediameno, metacrilato de metila, butanol, 3-buteno-1-ol, 3- buteno-2-ol e álcool de crotila.

[00114] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação YciA hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de trifosfato de adenosina (ATP) no organismo microbiano. A alteração genética pode ser, por exemplo, a expressão aumentada de NADH dehirogenase Ndh- I, citocromo Bo-oxidase ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I e citocromo Bo oxidase e pode incluir, por exemplo, a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica a NADH dehirogenase Ndh -I (nuo), citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh- I (nuo) e citocromo bo oxidase (cyoABCDE).

[00115] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação YciA hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma ou mais NAD(P)H desidrogenases ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionada a partir de Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB, a atenuação de uma ou mais oxidases ubiquinol selecionadas a partir de BD-I citocromo oxidase, oxidase do citocromo BD-II e mono-oxigenase quinol ou atenuação de uma ou mais Desidrogenases NAD(P)H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionada a partir do grupo que consiste em Ndh-II, wrba, YhdH , YieF, YtfG, Qor e MdaB e / ou atenuação de uma ou mais ubiquinol- oxidase selecionada a partir do grupo que consiste em citocromo- oxidase BD I, citocromo-oxidase BD II e mono-oxigenase quinol.

[00116] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação YciA hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol ou atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol.

[00117] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação YciA hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), no organismo microbiano. A expressão aumentada de PEPCK pode ser a partir de um aumento da expressão de PEPCK da codificação de ácido nucleico exógeno.

[00118] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de YciA hidrolase e uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermédio TCA ou o ciclo do substrato TCA pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) no organismo microbiano. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode compreender ainda uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), carboxilase fosfenolpiruvato (PPC), ou uma combinação dos mesmos no organismo microbiano. Um tal organismo microbiano pode ainda compreender uma atenuação de piruvato- quinase ou um sistema fosfotransferase glicose (PTS). Em ainda outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ainda compreender atenuação da proteína que codifica ClpA, piruvato-quinase ou um sistema fosfotransferase glicose (PTS) (vide Exemplos).

[00119] Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que qualquer uma das combinações acima de alterações genéticas podem ainda ser combinadas com qualquer outra alteração genética única ou múltipla descrita na presente invenção.

[00120] Em uma outra modalidade exemplar, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica para uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina. A transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode ser pntAB.

[00121] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica para uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode ainda incluir, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP no organismo microbiano. A alteração genética pode ser, por exemplo, a expressão aumentada de NADH dehirogenase Ndh-I, citocromo Bo oxidase ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I e citocromo Bo oxidase e pode incluir, por exemplo, a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica o NADH dehirogenase Ndh -I (nuo), citocromo bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) e citocromo bo oxidase (cyoABCDE).

[00122] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo a atenuação de um hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma ou mais Desidrogenases NAD(P)H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionadas de Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB, a atenuação de uma ou mais oxidases ubiquinol selecionadas a partir do citocromo Oxidase BD-I, citocromo-oxidase BD-II e mono-oxigenase quinol ou uma atenuação de uma ou mais NAD(P)H desidrogenases e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionadas a partir do grupo que consiste em Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB e atenuação de uma ou mais oxidases ubiquinol selecionadas a partir do grupo que consiste em citocromo-oxidase I-BD, BD citocromo-oxidase II e mono-oxigenase quinol.

[00123] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo a atenuação de um hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol ou atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol.

[00124] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de um hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), no organismo microbiano. A expressão aumentada de PEPCK pode ser a partir de um aumento da expressão de PEPCK codificação de ácido nucleico exógeno.

[00125] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo a atenuação de um gene que codifica uma hirolase YciA CoA e possuindo um ácido nucleico exógeno que codifica uma transhidrogenase de nucleotídeo piridina pode incluir, isoladamente ou em combinação com uma alteração genética que aumenta a disponibilidade de ATP, a atenuação de uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) no organismo microbiano. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode compreender ainda uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), carboxilase fosfenolpiruvato (PPC), ou uma combinação dos mesmos no organismo microbiano. Um tal organismo microbiano pode ainda compreender uma atenuação de piruvato- quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS). Em ainda outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ainda compreender atenuação da proteína que codifica ClpA, piruvato-quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS) (vide Exemplos).

[00126] Tendo em conta os ensinamentos e orientação fornecidos na presente invenção pelas pessoas que são versadas na técnica compreenderão que qualquer uma das combinações acima de alterações genéticas podem ainda ser combinadas com qualquer outra alteração genética única ou múltipla descrita na presente invenção.

[00127] Em ainda uma outra modalidade exemplar, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma NADH dehirogenase Ndh-I (nuo), citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) e citocromo bo oxidase (cyoABCDE).

[00128] O organismo microbiano que não ocorre de forma natural, pode incluir atenuação adicional de um ou mais ácidos endógenos nucleicos que codificam uma Desidrogenases NAD(P)H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionadas de Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB, atenuação de oxidases de um ou mais ubiquinol selecionadas a partir do citocromo Oxidase BD-I, citocromo oxidase BD- II e mono-oxigenase quinol ou atenuação de uma ou mais Desidrogenases NAD(P)H e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionadas a partir do grupo que consiste em Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB e atenuação de uma ou mais oxidase de ubiquinol selecionada a partir do grupo que consiste em citocromo Oxidase BD-I, citocromo BD-II oxidase e mono-oxigenase quinol.

[00129] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma NADH dehirogenase Ndh-I (nuo), citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) e citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) pode ainda incluir, por exemplo, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol, a atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetil menaquinol ou atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetil menaquinol.

[00130] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de NADH dehirogenase Ndh-I (nuo), citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) e citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) pode ainda incluir, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), no organismo microbiano. A expressão aumentada de PEPCK pode ser a partir de um aumento da expressão de PEPCK de codificação de ácido nucleico exógeno.

[00131] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma NADH dehirogenase Ndh-I (nuo), citocromo Bo oxidase (cyoABCDE) ou ambos NADH dehirogenase Ndh-I (nuo) e citocromo Bo oxidase (cyoABCDE ) pode ainda incluir, por exemplo, a atenuação de uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) no organismo microbiano. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode compreender ainda uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), carboxilase fosfenolpiruvato (PPC), ou uma combinação dos mesmos no organismo microbiano. Um tal organismo microbiano pode ainda compreender uma atenuação de piruvato- quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS). Em ainda outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ainda compreender atenuação da proteína que codifica ClpA, piruvato-quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS) (vide Exemplos). Em uma outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode compreender ainda uma alteração genética selecionada a partir de atenuação da proteína codificada por cyda ou CYB e / ou pykF, uma alteração genética que aumenta a expressão de pntAB, ou uma combinação dos mesmos.

[00132] Tendo em conta os ensinamentos e orientação fornecidos na presente invenção pelas pessoas que são versadas na técnica compreenderão que qualquer uma das combinações acima de alterações genéticas podem ainda ser combinadas com qualquer outra alteração genética única ou múltipla descritas na presente invenção.

[00133] Em ainda outra modalidade exemplar, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, tendo a atenuação de uma ou mais NAD(P)H desidrogenases e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionadas de Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB (isto é, um não-Ndh-I NADH desidrogenase), atenuação das oxidases de um ou mais ubiquinol selecionados a partir do citocromo Oxidase BD-I, citocromo oxidase BD- II e mono-oxigenase quinol (isto é, um não-citocromo Bo oxidase) ou a atenuação de uma ou mais NAD(P)H desidrogenases e / ou NAD(P)H : oxidorredutases quinina selecionados a partir do grupo que consiste em Ndh-II, wrba, YhdH, YieF, YtfG, Qor e MdaB e atenuação de uma ou mais oxidases ubiquinol selecionados a partir do grupo que consiste em citocromo-oxidase BD-I, citocromo oxidase BD-II e mono-oxigenase quinol.

[00134] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo a atenuação de uma ou mais não-Ndh-I-NADH desidrogenase e / ou uma oxidase não-citocromo bo pode ainda incluir, por exemplo, a atenuação de um ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol, a atenuação de uma ou enzimas biossintéticas de dimetil menaquinol ou atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e atenuação e uma ou mais enzimas biossintética de dimetilmenaquinol.

[00135] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de uma ou mais não-Ndh-I-NADH desidrogenase e / ou uma não-citocromo bo oxidase pode ainda incluir, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a expressão de um carboxicinase fosfoenoilpiruvato (PEPCK), no organismo microbiano. A expressão aumentada de PEPCK pode ser a partir de um aumento da expressão de PEPCK da codificação de ácido nucleico exógeno.

[00136] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de um ou mais não-Ndh-I NADH desidrogenase e / ou um não-citocromo bo oxidase pode ainda incluir, por exemplo, a atenuação de uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) no organismo microbiano. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode compreender ainda uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), carboxilase fosfenolpiruvato (PPC), ou uma combinação dos mesmos no organismo microbiano. Um tal organismo microbiano pode ainda compreender uma atenuação de piruvato-quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS). Em ainda outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ainda compreender atenuação da proteína que codifica ClpA, piruvato-quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS) (vide Exemplos).

[00137] Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que qualquer uma das combinações acima de alterações genéticas podem ainda ser combinadas com qualquer outra alteração genética única ou múltipla descrita na presente invenção.

[00138] Em uma modalidade exemplificativa, a presente invenção proporciona um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol, atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol ou atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e de atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de dimetilmenaquinol.

[00139] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de um ou mais ácidos nucleicos endógenos que codifica uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e / ou dimetilmenaquinol pode ainda incluir, por exemplo, uma alteração genética que aumenta a expressão de um carboxicinase fosfoenoilpiruvato (PEPCK) no organismo microbiano. A expressão aumentada de PEPCK pode ser a partir de um aumento da expressão de PEPCK da codificação de ácido nucleico exógeno.

[00140] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma atenuação de uma ou mais enzimas biossintéticas de menaquinol e / ou dimetilmenaquinol pode ainda incluir, por exemplo, a atenuação de uma carboxilase fosfoenoilpiruvato (PPC) no organismo microbiano. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode compreender ainda uma alteração genética que aumenta a expressão de um fosfoenoilpiruvato carboxicinase (PEPCK), carboxilase fosfenolpiruvato (PPC), ou uma combinação dos mesmos no organismo microbiano. Um tal organismo microbiano pode ainda compreender uma atenuação de piruvato-quinase ou sistema fosfotransferase glicose (PTS). Em ainda outra modalidade, o organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ainda compreender a atenuação da proteína que codifica ClpA, piruvato-quinase ou sistema de fosfotransferase glicose (PTS) (vide Exemplos).

[00141] Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que qualquer uma das combinações acima de alterações genéticas podem ainda ser combinadas com qualquer outra alteração genética única ou múltipla descrita na presente invenção.

[00142] A título de exemplo, em relação às várias combinações e trocas descritas e exemplificadas acima, a presente invenção proporciona ainda um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, de qualquer uma das modalidades exemplares acima, incluindo onde o organismo microbiano é selecionado a partir de bactérias, leveduras, fungos ou outro microorganismo aplicável a um processo de fermentação. O organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ser uma bactéria e as bactérias podem ser Escherichia coli.

[00143] Além disso é fornecida por meio de exemplo em relação às várias combinações e trocas descritas na presente invenção e exemplificadas um organismo microbiano que não ocorre de forma natural incluindo uma alteração genética selecionada a partir de: (1) atenuação de cyda ou cydB, de um ou mais de uma alteração genética selecionada a partir de (a) uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (B) atenuação da proteína codificada por pykF; (C) atenuação da proteína codificada por sucCD; (D) atenuação da proteína codificada por yciA; (E) uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por ACKA e uma proteína codificada por PTA; (F) uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por cyoB; (G) atenuação da proteína codificada por Pyka; (H) atenuação da proteína codificada por arcA; (I) atenuação da proteína codificada por crr; (J) atenuação da proteína codificada por ClpA; e (k) atenuação da proteína codificada por MenC; e (2) uma alteração genética selecionada a partir de (a) a atenuação das proteínas codificadas por sucCD e yciA; (B) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e yciA, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (C) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e yciA, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por cyoB; (D) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por cyoB; (E) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e MenC e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por cyoB, (f) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA, cyda ou cydB e MenC e tendo um alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por cyoB; (G) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e cyda ou cydB; (H) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e cyda ou cydB e pykF; (I) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e cyda ou cydB, e tendo uma alteração genética que aumenta expresion de uma proteína codificada por pntAB; (J) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e cyda ou cydB e pykF, e tendo uma alteração genética que aumenta expresion de uma proteína codificada por pntAB; (K) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB; (L) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB e pykF; (M) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (N) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB e pykF, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (O) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA, e cyda ou cydB e MenC; (P) atenuação das proteínas codificadas por sucCD, yciA e cyda ou cydB e MenC, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (Q) atenuação das proteínas codificadas por sucCD e pykF, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (R) atenuação da proteína codificada por ClpA; (S) atenuação da proteína codificada por MenC; (T) atenuação da proteína codificada por MenC e cyda ou cydB; (U) atenuação da proteína codificada por pykF e / ou Pyka; (V) ter uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (W) atenuação da cyda ou cydB e sucCD, Arca e CRR, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por ACKA e PTA; (X) atenuação da cyda ou cydB e ARCA; (Y) ou atenuação de cyda cydB, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB; (Z) atenuação da cyda ou cydB e pykF; e (AA) ou de atenuação de cyda cydB e pykF, e tendo uma alteração genética que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB.

[00144] O organismo microbiano que não ocorre naturalmente acima pode ainda incluir uma via metabolicamente manipulada para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo intermediário de TCA ou um ciclo do substrato de TCA. O composto bioderivado pode ser de 4- hidroxibutirato (4HB), 1,4-butanodiol (1,4-BDO), 1,3-butanodiol (1,3- BDO), poli-hidroxilbutanoato (PHB), butadieno, adipato, 6- aminocaproato, caprolactama, ácido metacrílico, isopropanol, os álcoois de cadeia longa, hexametilenediameno, metacrilato de metila, butanol, 3-buteno-1-ol, 3-buteno-2-ol e álcool de crotila. Além disso, o organismo microbiano pode ser uma bactéria e a bactéria pode ser E. coli.

[00145] Conforme descrito na presente invenção, uma atenuação é uma alteração genética que processa o produto do gene codificado inativo ou reduzido em atividade. Em algumas modalidades, a atenuação pode incluir uma eliminação completa do gene. Em algumas modalidades outros métodos para atenuar, incluindo os métodos para interceptar um gene incluem, por exemplo, troca da estrutura por meio da omissão ou adição de oligonucleotídeos ou por meio das mutações que tornam o gene inoperante. Uma pessoa que é versada na técnica irá reconhecer a utilidade de deleções de genes, no entanto, por causa da estabilidade que confere ao organismo que não ocorre de forma natural, a partir de reversão para um fenótipo parental, em que a atenuação não ocorreu. Embora exemplificadas na presente invenção como alterações metabólicas, em particular uma ou mais atenuações, é entendido que qualquer atenuação que reduz ou previne a atividade da atividade metabólica referenciada pode ser introduzida em um organismo hospedeiro microbiano, como desejado.

[00146] Os organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção tendo uma ou mais atenuações como descrito na presente invenção podem ser produzidos através da atenuação ou ruptura do gene, tal como descrito na presente invenção. Resumidamente, dados os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que a introdução de uma alteração metabólica, tais como a atenuação de uma enzima, que pode ser necessária para perturbar a atividade catalítica de uma ou mais enzimas envolvidas na reação. Alternativamente, uma alteração genética pode incluir interromper a expressão de uma proteína reguladora ou cofator necessário para a atividade enzimática ou atividade máxima. Além disso, a perda de genética de um cofator necessário para uma reação enzimática também pode ter o mesmo efeito que uma ruptura do gene de codificação da enzima. A ruptura pode ocorrer por meio de uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, eliminação de um gene que codifica ou incorpora uma alteração genética em uma ou mais das sequências de genes de codificação. Os genes que codificam orientados para o rompimento podem ser um, alguns, ou todos os genes que codificam as enzimas envolvidas na atividade catalítica. Por exemplo, quando uma única enzima está envolvida em uma atividade catalítica alvo, pode ocorrer ruptura por meio de uma alteração genética que reduz ou elimina a atividade catalítica do produto do gene codificado. Da mesma forma, em que a única enzima é multimérica, incluindo heteromérica, a ruptura pode ocorrer por meio de uma alteração genética que reduz ou destrói a função de uma ou todas as subunidades dos produtos de gene codificados. A destruição da atividade pode ser conseguida por meio da perda da atividade de ligação de uma ou mais subunidades necessárias para formar um complexo ativo, por meio da destruição da sub-unidade catalítica do complexo multimérico ou por ambos. Outras funções de associação da proteína multimérica e atividade também podem ser orientadas de forma a interromper uma reação metabólica da presente invenção. Tais outras funções são bem conhecidas das pessoas que são versadas na técnica. Do mesmo modo, uma atividade de enzima alvo pode ser reduzida ou eliminada por perturbar a expressão de uma proteína ou enzima que modifica e / ou ativa a enzima alvo, por exemplo, uma molécula necessária para converter uma apoenzima a uma holoenzima. Além disso, algumas ou todas as funções de um único polipeptídeo ou complexo multimérico pode ser interrompida de acordo com a presente invenção, a fim de reduzir ou abolir a atividade catalítica de uma ou mais enzimas envolvidas em uma reação ou modificação metabólica da presente invenção. Do mesmo modo, algumas ou todas as enzimas envolvidas em uma reação ou modificação metabólica da presente invenção podem ser interrompidas enquanto a reação alvo é reduzida ou eliminada.

[00147] Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica também compreenderão que uma reação enzimática pode ser atenuada através da redução ou eliminação de reações codificadas por meio de um gene comum e / ou por meio de um ou mais ortólogos daquele gene que exibem semelhante ou substancialmente a mesma atividade. A redução de ambos o gene comum e todos os ortólogos pode levar à completa eliminação de qualquer atividade catalítica de uma reação alvo. No entanto, a ruptura de qualquer gene comum ou um ou mais ortólogos pode conduzir a uma redução na atividade catalítica da reação alvo suficiente para promover o crescimento de acoplamento para a biossíntese de produto. Na presente invenção exemplificado são ambos os genes que codificam para as atividades catalíticas comuns para uma variedade de modificações metabólicas bem como os seus ortólogos. As pessoas que são versadas na técnica compreenderão que a ruptura de alguns ou de todos os genes que codificam uma enzima de uma reação metabólica alvo pode ser praticada nos métodos da presente invenção e incorporadas nos organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção a fim de alcançar reduzido fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo. Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica também compreenderão que a atividade enzimática ou a expressão pode ser atenuada utilizando os métodos bem conhecidos. A redução da atividade ou quantidade de uma enzima pode imitar a ruptura completa de um gene, se faz com que a redução da atividade da enzima venha a cair abaixo de um nível crítico que é normalmente necessário para uma via para funcionar. A redução da atividade enzimática por meio das várias técnicas em vez do uso de uma ruptura do gene pode ser importante para a viabilidade de um organismo. Os métodos de redução de atividade enzimática que resulta em efeitos semelhantes ou idênticos de uma ruptura do gene incluem, mas não estão limitados a: reduzindo a transcrição do gene ou da tradução; mRNA desestabilizador, a proteína ou RNA catalítico; e mutação de um gene que afeta a atividade da enzima ou cinética (vide, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (2001); e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)). Os controles reguladores naturais ou impostos também podem realizar a atenuação enzima incluindo : substituição do promotor (Vide, Wang et al, Mol Biotechnol 52 (2): 300 a 308 (2012)); perda ou alteração de fatores de transcrição (Dietrick et al, Annu Rev. Biochem 79: 563 a 590 (2010); e Simicevic et al, Mol Biosyst 6 (3): 462 a 468 (2010)); introdução de RNAs inibitórios ou peptídeos tais como RNAip, RNA anti-sentido, RNA ou peptídeo / aptâmeros de ligação, ribozimas, e aptazimas de troca ribo de molécula pequena (Wieland et al, Methods 56 (3): 351 a 357 (2012); O'Sullivan , Anal Bioanal Chem 372 (1): 44 a 48 (2002); e Lee et al, Curr Opin Biotechnol 14 (5): 505 a 511 (2003)); e adição de fármacos ou outras substâncias químicas que reduzem ou destroem a atividade enzimática tais como um inibidor de enzima, um antibiótico ou um fármaco específico para o alvo. Uma pessoa que é versada na técnica também irá reconhecer e entender que a atenuação de uma enzima pode ser feita em vários níveis. Por exemplo, ao nível do gene, uma mutação que causa um fenótipo parcial ou completo nulo, tal como uma ruptura do gene, ou uma mutação que causa efeitos genéticos epistáticos que mascaram a atividade de um produto génico (Miko, Nature Education 1 (1) (2008 )), pode ser usado para atenuar uma enzima. Ao nível de expressão do gene, os métodos para a atenuação incluem: O acoplamento de transcrição a um indutor endógeno ou exógeno, tal como isopropiltio-ß-galactosideo (IPTG), em seguida, adicionando pequenas quantidades de indutor ou nenhum indutor durante a fase de produção (Donovan et al, J. Ind Microbiol 16 (3): 145 a 154 (1996); e Hansen et al, Curr Microbiol 36 (6): 341 a 347 (1998)); introduzir ou modificar um regulador positivo ou negativo de um gene; modificar a acetilação / desacetilação da histona em uma região cromossômica eucariota onde um gene é integrado (Yang et al, Curr Opin Genet Dev 13 (2): 143 a 153 (2003) e Kurdistani et al, Nat Rev., Cell Biol mol 4 (4): 276 a 284 (2003)); introdução de uma transposição para interromper um promotor ou de um gene regulador (Bleykasten- Brosshans et al, Biol CR 33 (8 a 9): 679 a 686 (2011); e McCue et al, PLoS Genet 8 (2). : e1002474 (2012)); invertendo a orientação de um elemento transponível ou a região do promotor, de modo a modular a expressão de genes de um gene adjacente (Wang et al, Genetics 120 (4): 875 a 885 (1988); Hayes, Annu Rev. Genet 37: 3 a 29 (2003); em um organismo diplóide, a eliminação de um alelo resultando em perda de heterozigosidade (Daigaku et al, Mutation Research / Fundamentals ans Molecular Mecanisms of mutagenese 600 (1-2) 177a 183 (2006)); introduzindo Os ácidos nucleicos que aumentam a degradação de RNA (Houseley et al, Cell, 136 (4): 763-776 (2009); ou em bactérias, por exemplo, a introdução de uma etiqueta de transferência de RNA mensageiro (tmRNA), que pode levar a degradação de RNA. e parando ribossomal (Sunohara et al, RNA 10 (3): 378-386 (2004); e Sunohara et al, J. Biol Chem 279: 15368-15375 (2004)). No nível translacional, a atenuação pode incluir: a introdução de códons raros para limitar tradução (Angov, J. Biotechnol 6 (6): 650 a 659 (2011)); a introdução de moléculas de RNA de interferência que bloqueiam a tradução (Castel et al, Nat Genet 14 ( 2): 100 a 112 (2013); e Kawasaki et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 7 (2): 125 a 131 (2005); modificadores regiões fora da sequência de codificação, tal como a introdução de estrutura secundária para uma região não traduzida (UTR) para bloquear a tradução ou reduzir a eficiência de tradução (Ringnér et al, PLoS Comput Biol 1 (7): E72 (2005)); Adicionando os locais de RNase para rápida degradação transcrição (Pasquinelli, Nat Genet 13 (4): 271 a 282 (2012); e Arraiano et al, FEMS Microbiol Rev. 34 (5): 883 a 932 (2010) ; oligômeros introduzindo RNA ou transcritos anti-sentido (Nashizawa et al, Front Biosci 17: 938 a 958 (2012));. a introdução de RNA ou um peptídeo aptâmeros, ribozimas, aptazimas, ribotrocas (Wieland et al, Methods 56 (3) : 351 a 357 (2012); O'Sullivan, Anal Bioanal Chem 372 (1): 44 a 48 (2002); e Lee et al, Curr Opin Biotechnol 14 (5): 505 a 511 (2003)); ou a introdução de elementos reguladores translacionais que envolvem a estrutura do RNA que pode prevenir ou reduzir a tradução que pode ser controlada pela presença ou ausência de moléculas pequenas (Araújo et al, Comparative and Functional Genomics, artigo 475731, 8 páginas (2012)). A nível da localização da enzima e / ou a longevidade, a atenuação da enzima pode incluir: adição de uma etiqueta de degradação do volume de negócios de proteína mais rápido (Hochstrasser, Annual Rev. Genet 30: 405 a 439 (1996); e Yuan et al, PLoS One 8 (4): e62529 (2013)); ou a adição de uma etiqueta de localização que resulta na enzima ser segregada ou localizada a um compartimento subcelular de uma célula eucariótica, em que a enzima não seria capaz de reagir com o seu substrato normal (Nakai et al Genomics 14 (4): 897 a 911 (1992);. e Russell et al, J. Bact 189 (21) 7581 a 7585 (2007)). Ao nível da regulação pós-tradução, a atenuação de enzima pode incluir: o aumento da concentração intracelular de inibidores conhecidos; ou modificação de locais modificadas pós- tradução (Mann et al, Nature Biotech 21: 255 a 261 (2003)). Ao nível da atividade da enzima, a atenuação de enzima pode incluir: a adição de um inibidor endógeno ou um exógeno, tal como um inibidor de enzima, um antibiótico ou um fármaco específico para o alvo, para reduzir a atividade da enzima; limitando a disponibilidade dos cofatores essenciais, tais como a vitamina B12, para uma enzima, que requer a co-fator; quelar um ião metálico que é necessário para a atividade da enzima; ou a introdução de uma mutação dominante negativa. A aplicabilidade de uma técnica de atenuação descrita acima pode depender do fato de um determinado organismo microbiano hospedeiro ser procariótico ou eucariótico, e entende-se que uma determinação de qual é a técnica apropriada para um dado hospedeiro pode ser facilmente feita por meio de uma pessoa que é versada na técnica .

[00148] Entende-se que uma alteração genética que aumenta a expressão de um enzima desejada é geralmente realizada através da introdução no organismo microbiano um ácido nucleico exógeno que codifica para a enzima desejada. No entanto, dados os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que uma alteração genética para aumentar a expressão também pode incluir uma modificação de expressão do gene ou região reguladora de um gene endógeno. Tais regiões incluem, por exemplo, um promotor, um intensificador e / ou uma outra região reguladora, tal como uma sequência que altera a estabilidade ou a meia-vida do ácido nucleico de codificação. Por exemplo, um promotor forte e / ou um intensificador pode ser incluído ou substituído no gene endógeno para atingir o aumento de expressão, utilizando os métodos bem conhecidos na técnica. A título de ilustração, a presente invenção será descrita por meio de referência à expressão crescente através da introdução de um ácido nucleico de codificação exógena. No entanto, esses ensinamentos são igualmente aplicáveis para aumentar a expressão através do aumento da força de expressão e de elementos reguladores. Da mesma forma, uma alteração genética que atenua a expressão pode relacionar com modificações que alteram a atividade de uma proteína codificada ou pode relacionar-se a moléculas de regulação ao nível da transcrição ou da proteína, tal como descrito na presente invenção.

[00149] Os organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente da presente invenção tendo ácidos nucleicos exógenos que codificam para uma enzima ou proteína descrito na presente invenção podem ser produzidos através da introdução de ácidos nucleicos expressos, que codificam uma ou mais das enzimas ou proteínas que participam em uma ou mais das alterações genéticas descritas na presente invenção. As alterações genéticas exemplificativas para a introdução de um ácido nucleicos que codificam incluem, por exemplo, a introdução de um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma transhidrogenase de nucleotídeos de piridina, uma enzima via para a biossíntese de um composto bioderivado, NADH dehirogenase Ndh-I, citocromo Bo oxidase e / ou carboxicinase fosfoenoilpiruvato. Dependendo do organismo microbiano hospedeiro escolhido para a biossíntese de um composto bioderivado, ácidos nucleicos de uma ou mais das alterações genéticas descritas na presente invenção relativa à expressão de uma codificação de ácido nucleico exógeno podem ser expressos.

[00150] Os organismos microbianos hospedeiros podem ser selecionados a partir de, organismos microbianos que que não ocorrem naturalmente gerados em, por exemplo, bactérias, leveduras, fungos ou qualquer um de uma variedade de outros microrganismos ou aplicáveis apropriados para processos de fermentação. As bactérias exemplificativas incluem quaisquer espécies selecionadas a partir de Enterobacteriales, família Enterobacteriaceae, incluindo o gênero Escherichia e Klebsiella; a ordem Aeromonadales, família Succinivibrionaceae, incluindo o gênero Anaerobiospirillum; a ordem Pasteurellales, família Pasteurellaceae, incluindo os gêneros Actinobacillus e Mannheimia; a ordem Rhizobiales, família Bradyrhizobiaceae, incluindo o gênero Rhizobium; a ordem Bacillales, família Bacillaceae, incluindo o gênero Bacillus; a ordem Actinomycetales, famílias Corynebacteriaceae e Streptomycetaceae, incluindo o gênero Corynebacterium e o gênero Streptomyces, respectivamente; a ordem Rhodospirillales, família Acetobacteraceae, incluindo o gênero Gluconobacter; a ordem Sphingomonadales, família Sphingomonadaceae, incluindo o gênero Zymomonas; a ordem Lactobacillales, famílias Lactobacillaceae e Streptococcaceae, incluindo o gênero Lactobacillus e gênero Lactococcus, respectivamente; a ordem Clostridiales, família Clostridiaceae, gênero Clostridium; e a ordem Pseudomonadales, família Pseudomonadaceae, incluindo o gênero Pseudomonas. As espécies não limitativas de bactérias hospedeiras incluem Escherichia coli, Klebsiella oxitoca, succiniciproducens Anaerobiospirillum, succinogenes actinomycetemcomitans, succiniciproducens Mannheimia, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxidans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, e Pseudomonas putida.

[00151] Do mesmo modo, as espécies exemplificativas de levedura ou fungos espécies incluem quaisquer espécies selecionadas a partir da ordem Saccharomycetales, S família accaromycetaceae, incluindo os gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Pi chia; a ordem Saccharomycetales, família Dipodascaceae, incluindo o gênero Yarrowia; a ordem Schizosaccharomycetales, família Schizosaccaromycetaceae, incluindo o gênero Schizosaccharomyces; a ordem Eurotiales, família Trichocomaceae, incluindo o gênero Aspergillus; e a ordem Mucorales, família Mucoraceae, incluindo o gênero Rhizopus. espécies não limitativos de levedura hospedeira ou fungos incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Rhizopus arrhizus, Rhizobus oryzae, Yarrowia lipolitica, e semelhantes. E. coli é um organismo hospedeiro especialmente útil uma vez que é um organismo microbiano bem caracterizado adequado para engenharia genética. Outros organismos hospedeiros particularmente úteis incluem leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae. Entende-se que qualquer organismo hospedeiro microbiano adequado pode ser utilizado para introduzir as modificações metabólicas e / ou genéticas para produzir um produto desejado.

[00152] Do mesmo modo, é entendido por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica que um organismo hospedeiro pode ser selecionado com base nas características desejadas para a introdução de uma ou mais atenuações para reduzir o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo ou para enfraquecer , reduzir ou diminuir a atividade de outras enzimas ou proteínas da presente invenção. Dessa maneira, entende-se que, se uma modificação genética é para ser introduzida em um organismo hospedeiro para interromper um gene, quaisquer homólogos, ortólogos ou parálogos que catalisam semelhantes, mas as reações metabólicas não idênticas podem similarmente ser interrompidas para assegurar que uma reação metabólica pretendida seja suficientemente interrompida. Porque existem certas diferenças entre redes metabólicas entre diferentes organismos, as pessoas que são versadas na técnica irão entender que os genes interrompidos reais em um dado organismo podem diferir entre os organismos. No entanto, dados os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica também entenderão que os métodos da presente invenção podem ser aplicados a qualquer microorganismo hospedeiro adequado para identificar as alterações metabólicas cognatas necessárias para a construção de um organismo em uma espécie de interesse que irá reduzir o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo.

[00153] As fontes de ácidos nucleicos que codificam para uma enzima ou proteína descritas na presente invenção podem incluir, por exemplo, qualquer espécie de onde o produto do gene codificado é capaz de catalisar a reação de referência. Estas espécies incluem tanto organismos procariotas e eucariotas incluindo, mas não limitados a, bactérias, arquebactérias e eubactérias, incluindo, e eucariotas, incluindo fungos, plantas, insectos, animais, e de mamífero, incluindo o ser humano. As espécies exemplares para tais fontes incluem, por exemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Mannheimia succiniciproducens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, actinobacillus succinogenes, Megathyrsus maximus, Haemophilus influenza, Metylobacterium extorquens, Corynebacterium glutamicum, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculose, fermentans.Tais Acidaminococcus, Clostridium symbiosum, Fusobacterium nucleatum, Clostridium kluyveri, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Clostridium aminobutyricum, Porphiromonas gingivalis W83, Acetobacter aceti, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Citrobacter youngae, Salmonella entérica, Yersinia intermedia, Oxalobacter formigenes, Pseudomonas putida, Acinetobacter sp . ADP1, Streptomyces coelicolor, Pseudomonas knackmussii, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Sus scrofa, Roseburia sp. A2-183, Roseburia intestinalis, inulinivorans Roseburia, Eubacterium rectale, Clostridium propionicum, Clostridium novyi NT, Clostridium beijerinckii, Clostridium botulinum, Haloarcula marismortui, Archaeoglobus fulgidus, Archaeoglobus fulgidus, Pyrobaculum aerophilum Str. IM2, Rhizobium leguminosarum, bem como outras espécies exemplares descritas na presente invenção ou de organismos disponíveis como fonte para os genes correspondentes. No entanto, com a sequência completa do genoma disponível para agora mais de 550 espécies (com mais de metade destes disponíveis em bancos de dados públicos, como o NCBI), incluindo 395 genomas de microorganismos e uma variedade de leveduras, fungos, plantas e genomas de mamíferos, as identificação de genes que codificam a atividade requerida para um ou mais genes em espécies relacionadas ou distantes, incluindo, por exemplo, homólogos, ortólogos, parálogos e deslocamentos de genes nonortólogo de genes conhecidos, e o intercâmbio de alterações genéticas entre organismos é de rotina e bem conhecido na técnica. Por conseguinte, as alterações metabólicas que permitem o fluxo de carbono reduzido de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo descrito na presente invenção com referência a um determinado organismo, tal como E. coli podem ser facilmente aplicadas a outros microorganismos, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos semelhantes. Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica saberão que uma alteração metabólica exemplificado em um organismo pode ser aplicada igualmente a outros organismos.

[00154] Em alguns casos, tais como quando uma enzima metabólica alternativa ou proteína existe em espécies não explicitamente descritas na presente invenção, a atividade desejada, pode ser conferida para as espécies hospedeiras, por exemplo, expressão exógena de um parálogo ou parálogos a partir de um ou mais espécies que catalisa uma reação metabólica semelhante, mas não idêntico ao substituir a reação de referência. Porque existem certas diferenças entre as reações metabólicas entre diferentes organismos, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que a utilização de genes entre diferentes organismos real pode ser diferente. No entanto, dados os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica também compreenderão que os ensinamentos e os métodos da presente invenção podem ser aplicados a todos os organismos microbianos utilizando as alterações genéticas cognatos para os exemplificados na presente invenção para construir um organismo microbiano em um espécies de interesse que exibam a atividade metabólica desejado.

[00155] Uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma enzima ou proteína descrito na presente invenção também pode incluir uma molécula de ácido nucleico que hibrida com um ácido nucleico descrito na presente invenção pela SEQ ID NO, GenBank e / ou número de GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma nucleico molécula de ácido que codifica uma sequência de aminoácidos descrita na presente invenção pela SEQ ID NO, GenBank e / ou número de GI. As condições de hibridação podem incluir condições de hibridação de rigor altamente restringentes, moderadamente restringentes ou baixas que são bem conhecidas de uma pessoa que é versada na técnica, tais como as descritas na presente invenção. Da mesma forma, uma molécula de ácido nucleico que pode ser utilizada na presente invenção pode ser descrita como tendo uma certa identidade de sequência percentual a um ácido nucleico descrito na presente invenção pela SEQ ID NO, GenBank e / ou número de GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma nucleico molécula de ácido que codifica uma sequência de aminoácidos descrita na presente invenção pela SEQ ID NO, GenBank e / ou número de GI. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ter, pelo menos, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de um ácido nucleico descrito na presente invenção.

[00156] O termo hibridação rigorosa refere-se a condições sob as quais os polinucleotídeos hibridizados são estáveis. Como é conhecido das pessoas que são versadas na técnica, a estabilidade dos polinucleotídeos hibridados reflete-se na temperatura de fusão (Tf) dos híbridos. Em geral, a estabilidade de polinucleotídeos hibridados é uma função da concentração de sal, por exemplo, a concentração do íon sódio e da temperatura. A reação de hibridação pode ser realizada sob condições de baixo rigor, seguidas de lavagens de diferentes, mas mais elevada, estringência. Referência ao rigor de hibridação refere-se a condições de lavagem. A hibridação altamente restringente inclui condições que permitam a hibridação de apenas as sequências de ácidos nucleicos que formam polinucleotídeos hibridados estáveis em NaCl a 0.018M a 65 ° C, por exemplo, se um híbrido não é estável em NaCl a 0.018M a 65 ° C, não será estável sob condições de elevado rigor, tal como contemplado na presente invenção. As condições de elevado rigor podem ser proporcionadas, por exemplo, por meio da hibridação em formamida a 50 %, 5X solução de Denhart, 5X SSPE, 0,2 % SDS a 42 ° C, seguido por lavagem em 0,1 X SSPE, e 0,1 % de SDS a 65 ° C. As condições diferentes das condições de hibridação altamente rigorosas condições de hibridação podem também ser usadas para descrever as sequências de ácido nucleico descritas na presente invenção. Por exemplo, a frase de hibridação de rigor moderado refere-se a condições equivalentes a hibridação em formamida a 50 %, 5X solução de Denhart, 5X SSPE, 0,2 % SDS a 42 ° C, seguido por lavagem em 0,2 X SSPE, SDS a 0,2 %, a 42 ° C . A frase hibridação de baixo rigor refere-se a condições equivalentes a hibridação em 10 % de formamida, 5X solução de Denhart, 6x SSPE, SDS a 0,2 % a 22 ° C, seguido por lavagem em 1X SSPE, SDS a 0,2 %, a 37 ° C. A solução de Denhart contém 1 % de Ficoll, 1 % de polivinilpirrolidona, e 1 % de albumina de soro bovino (BSA). 20X SSPE (cloreto de sódio, fosfato de sódio, etileno-diamida do ácido tetra-acético (EDTA)) contém cloreto de sódio a 3 M, fosfato de sódio a 0,2 M e 0,025 M (EDTA). Outros tampões de hibridação de baixo, moderado e elevado rigor adequados e condições são bem conhecidos das pessoas que são versadas na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed, Laboratório de Cold Spring Harbor , Nova Iorque (2001); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

[00157] Uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma enzima ou proteína descrito na presente invenção pode ter, pelo menos, uma certa identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeos descrita na presente invenção. Dessa maneira, em alguns aspectos da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma enzima ou proteína descrito na presente invenção tem uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 65 % de identidade, pelo menos 70 % de identidade, pelo menos 75 % de identidade, pelo menos 80 % de identidade, em menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade, pelo menos 91 % de identidade, pelo menos 92 % de identidade, pelo menos 93 % de identidade, pelo menos 94 % de identidade, pelo menos 95 % de identidade, pelo menos 96 % de identidade, pelo menos 97 % de identidade, pelo menos 98 % de identidade, ou pelo menos 99 % de identidade, ou é idêntico, com um ácido nucleico descrito na presente invenção pela SEQ ID nO, GenBank e / ou número de GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos descrita na presente invenção pela SEQ ID NO, GenBank e / ou número de GI.

[00158] A identidade de sequência (também conhecida como homologia ou semelhança) refere-se à semelhança de sequências entre duas moléculas de ácido nucleico ou entre dois polipeptídeos. A identidade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência, que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de identidade entre as sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas partilhadas pelas sequências. O alinhamento das duas sequências para determinar a sua identidade de sequência percentual pode ser realizado utilizando os programas de software conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). De um modo preferido, os parâmetros por defeito são utilizados para o alinhamento. Um programa de alinhamento bem conhecido na técnica que pode ser utilizado é o BLAST configurado para os parâmetros por defeito. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, utilizando os seguintes parâmetros padrão: código genético = padrão; filter = none; vertente = ambos; corte = 60; espera = 10; Matrix = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = pontuação elevada; Bases de dados = não-redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traduções + SwissProteína + SPupdate + PIR. Detalhes destes programas podem ser encontrados no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia.

[00159] Os métodos para construir e testar os níveis de um hospedeiros que não ocorrem de forma natural, que reduziram o fluxo de carbono a partir de succinil-CoA a succinato através de um ciclo de TCA oxidativo de expressão podem ser realizados, por exemplo, por meio dos métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados descritos, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (2001); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

[00160] As sequências de ácido nucleico exógeno podem ser introduzidas de forma estável ou transientemente em uma célula hospedeira utilizando as técnicas bem conhecidas na literatura, incluindo, mas não limitado a, conjugação, eletroporação, transformação química, transdução, transfecção, transformação e ultrasom. Para a expressão exógena em E. coli ou outras células procarióticas, algumas sequências de ácido nucleico nos genes ou cDNA eucarióticos de ácidos nucleicos podem codificar os sinais de direccionamento, tais como um sinal de direcionamento mitocondrial ou outro N-terminal, o qual pode ser removido antes da transformação em hospedeira procariótica células, se desejado. Por exemplo, a remoção de uma sequência de comando mitocondrial levou a um aumento da expressão em E. coli (Hoffmeister et al, J. Biol Chem 280: 4329 a 4338 (2005)). Para a expressão exógena em leveduras ou outras células eucarióticas, os genes podem ser expressos no citoplasma sem a adição da sequência de comando, ou podem ser direcionados para a mitocôndria ou outros organelos, ou direcionados para secreção, através da adição de uma sequência de direcionamento adequado, tal como um direcionamento mitocondrial ou sinal de secreção apropriado para as células hospedeiras. Dessa maneira, entende-se que as modificações apropriadas a uma sequência de ácido nucleico para remover ou incluir uma sequência de direcionamento pode ser incorporada uma sequência de ácido nucleico exógeno para conferir as propriedades desejáveis. Além disso, os genes podem ser submetidos a optimização de códons com técnicas bem conhecidas na técnica para se conseguir a expressão optimizada das proteínas.

[00161] Um vetor de expressão ou vetores podem ser construídos de modo a incluir uma ou mais proteínas ou ácidos nucleicos que codifica a enzima tal como exemplificado na presente invenção operavelmente ligada a sequências de controle da expressão funcionais no organismo hospedeiro. Os vetores de expressão aplicáveis para utilização nos organismos hospedeiros microbianos da presente invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores de fagos, vetores virais, epissomas e cromossomas artificiais, incluindo os vetores e sequências de seleção ou marcadores operáveis para integração estável em um cromossoma hospedeiro. Além disso, os vetores de expressão podem incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão apropriadas. Os genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos, que, por exemplo, proporcionam resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências auxotróf iças, ou fornecem nutrientes críticos não no meio de cultura. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e indutíveis, estimuladores da transcrição, terminadores da transcrição, e semelhantes, que são bem conhecidos na técnica. Quando dois ou mais ácidos nucleicos que codificam exógenos devem ser co-expressos, ambos os ácidos nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um único vetor de expressão ou em vetores de expressão separados. Para um único vetor de expressão, os ácidos nucleicos de codificação podem ser operacionalmente ligados a uma sequência de controle da expressão comum ou ligados a sequências de controle de expressão diferentes, tais como um promotor indutível e um promotor constitutivo. A transformação de sequências de ácidos nucleicos exógenos envolvidas em uma via metabólica ou sintético pode ser confirmada utilizando os métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, a análise de ácidos nucleicos, tais como hibridações de Northern ou amplificação por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) do mRNA, ou imunotransferência para a expressão de produtos de genes, ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido nucleico introduzido ou o seu produto do gene correspondente. É compreendido por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica que o ácido nucleico exógeno é expresso em uma quantidade suficiente para produzir o produto desejado, e é ainda entendido que os níveis de expressão podem ser otimizados para obter uma expressão suficiente utilizando os métodos bem conhecidos na especialidade e tal como descrito na presente invenção.

[00162] As cepas modificadas podem ser caracterizadas por meio da medição da taxa de crescimento, a taxa de absorção de substrato, e / ou a taxa de secreção de produto / subproduto. As culturas podem ser cultivadas e utilizadas como inóculo para uma cultura de batelada fresco para que as medições sejam efetuadas durante o crescimento exponencial. A taxa de crescimento pode ser determinada medindo a densidade óptica usando um espectrofotômetro (A600). As concentrações de glicose e outros sub-produtos de ácidos orgânicos no sobrenadante da cultura podem ser determinadas por meio dos métodos bem conhecidos, tais como HPLC, GC-MS ou outros métodos analíticos conhecidos adequados para a análise do produto desejado, como descrito na presente invenção, e usados para calcular a absorção e taxas de secreção.

[00163] A presente invenção proporciona um método de produção de um composto bioderivado. O método inclui a cultura de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma ou mais modificações metabólicas descritas na presente invenção e um caminho metabolicamente manipulado para produzir um composto bioderivado. As modificações metabólicas incluem atenuações e / ou alterações genéticas tais como a expressão de um ácido nucleico de codificação exógena, tal como descrito na presente invenção. A via metabolicamente manipulada pode utilizar um ciclo de TCA substrato ou do ciclo de TCA intermediário para a produção de composto bioderivado ou utilizar um substrato derivado de uma via metabólica de um ciclo não-TCA.

[00164] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de um composto bioderivado. O método inclui a cultura de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma primeira atenuação de uma sintetase de succinil-CoA e, pelo menos, uma segunda atenuação de uma enzima de conversão de succinil-CoA ou a um gene que codifica uma enzima de de produção de succinato dentro de uma via de múltiplas etapas que tem um conversão líquida de succinil-CoA a succinato e possuindo uma via de metabolicamente manipulado para produzir um composto bioderivado a partir de um ciclo de TCA substrato ou do ciclo de TCA intermediário durante um período suficiente de tempo, sob condições suficientes para produzir o referido composto bioderivado. O organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode, adicionalmente, incluir uma ou mais modificações metabólicas, incluindo-se a todas as modificações metabólicas descritas na presente invenção.

[00165] Além disso, a presente invenção proporciona um método para diminuir a conversão de succinil-CoA a succinato em um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, a diminuição da produção de CO2 em excesso em um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, a diminuição do fluxo através de um ciclo de TCA oxidativo em um organismo microbiano que não ocorre de forma natural, diminuição da utilização de oxigênio por que não ocorrem de forma natural organismo microbiano e / ou aumentar a disponibilidade de ATP em um organismo microbiano que não ocorre de forma natural. O método inclui a cultura de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo uma ou mais modificações metabólicas tal como descrito na presente invenção. O organismo microbiano que não ocorre de forma natural pode ser usado como uma referência ou controle para a geração de um organismo possuindo uma via de metabolicamente engenharia para a produção de um composto bioderivado, por exemplo.

[00166] Os ensaios e / ou purificação adequados para testar uma ou mais alterações genéticas modificadas descritas na presente invenção podem ser realizados utilizando os métodos bem conhecidos. As repetições adequados, tais como culturas em triplicado podem ser cultivadas para cada cepa manipulada para ser testada. Por exemplo, o produto metabólico e a formação de subproduto das reações em engenharia de acolhimento podem ser monitorizados. Por exemplo, o produto e / ou quaisquer intermediários podem ser analisados por meio dos métodos tais como a HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho), CG-EM (cromatografia de gás de Espectroscopia de massa) e LC-MS (cromatografia líquida de espectroscopia de massa) ou outro método analítico adequado que utiliza os procedimentos de rotina bem conhecidos na técnica. A libertação de um produto metabólico de engenharia no caldo de fermentação também pode ser testada com sobrenadante de cultura. Derivados e glicose residual podem ser quantificados por meio de HPLC utilizando, por exemplo, um detector de índice de refração para a glicose e álcoois, e um detector de UV para os ácidos orgânicos (Lin et al, Biotechnol Bioeng 90: 775-779 (2005)), ou outros métodos de ensaio de detecção adequados e bem conhecidos na técnica. As atividades de enzimas ou de proteínas individuais a partir das sequências de ácidos nucleicos exógenos também podem ser ensaiadas utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos são exemplificados nos Exemplos abaixo. Outros métodos bem conhecidos na técnica também podem ser utilizados para ensaiar a produção de uma ou mais atividades metabólicas descritas na presente invenção.

[00167] Os produtos de qualquer uma das alterações genéticas descritas na presente invenção, incluindo, por exemplo, um composto bioderivado podem ser separados dos outros componentes na cultura usando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração, bem como os métodos que incluem a extração contínua líquido-líquido, pervaporação, filtração por membrana, separação por membrana, osmose, electrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de eliminação por tamanhos reversa, cromatografia de adsorção, e ultrafiltração. Todos os métodos acima referidos são bem conhecidos na técnica.

[00168] Qualquer um dos organismos microbianos que não ocorre naturalmente descrito na presente invenção pode ser cultivado para produzir e / ou segregar, por exemplo, um composto bioderivado da presente invenção. Por exemplo, um organismo microbiano hospedeira produtor de um composto bioderivado da presente invenção pode ser cultivado para a produção biossintética de tal composto. Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um meio de cultura tendo o composto bioderivado descrito na presente invenção. Em alguns aspectos, o meio de cultura pode também ser separado dos organismos microbianos que ocorrem de forma não-natural da presente invenção que produziram o composto bioderivado. Os métodos para a separação de um organismo microbiano a partir de meio de cultura são bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem filtração, floculação, precipitação, centrifugação, sedimentação, e semelhantes.

[00169] Para a produção de um composto bioderivado, as cepas recombinantes são cultivadas em um meio com fonte de carbono e outros nutrientes essenciais. Por vezes, é desejável e pode ser altamente desejável se manter as condições anaeróbicas no fermentador para reduzir o custo do processo global. Tais condições podem ser obtidas, por exemplo, primeiro por aspersão do meio com nitrogênio e, em seguida, selando os frascos com um septo e tampão firme de rosca. Para as cepas em que o crescimento não é observado em condições anaeróbicas, ondiçõesmicroaeróbia ou c substancialmente anaeróbicas podem ser aplicados por perfurar o septo com um pequeno buraco para permitir o arejamento limitado. Exemplos de condições anaeróbicas foram descritos anteriormente e são bem conhecidos na técnica. As condições aeróbias e anaeróbicas exemplificativas encontram-se descritas, por exemplo, na publicação Estado Unidos 2009/0047719, depositado 10 de Agosto de 2007. As fermentações podem ser realizadas em um batelada, batelada de alimetação ou forma contínua, tal como descrito na presente invenção. As fermentações também podem ser realizadas em duas fases, se o desejar. A primeira fase pode ser aeróbia para permitir um crescimento elevado e, por conseguinte, alta produtividade, seguida por meio de uma fase anaeróbica de rendimentos elevados de compostos bioderivados.

[00170] Se desejado, o pH do meio pode ser mantido a um pH desejado, em particular, de pH neutro, tais como um pH de cerca de 7 por adição de uma base, tal como NaOH ou outra base, ou de ácido, conforme necessário, para manter o meio de cultura a um pH desejável. A taxa de crescimento pode ser determinada medindo a densidade óptica usando um espectrofotômetro (600 nm), e a taxa de captação de glicose através da monitorização de depleção de fonte de carbono ao longo do tempo.

[00171] O meio de crescimento pode incluir, por exemplo, qualquer fonte de hidratos de carbono, que pode fornecer uma fonte de carbono para o microorganismo que não ocorre de forma natural. Tais fontes incluem, por exemplo: açúcares tais como glicose, xilase, arabinose, galactose, manose, frutose, sacarose e amido; ou glicerol, e entende-se que uma fonte de carbono pode ser utilizada isoladamente como a única fonte de carbono ou em combinação com outras fontes de carbono descritas na presente invenção ou conhecidas na técnica. Outras fontes de hidratos de carbono incluem, por exemplo, matérias-primas renováveis e biomassa. Exemplos de tipos de biomassa que podem ser utilizados como matérias-primas nos métodos da presente invenção incluem a biomassa celulósica, a biomassa hemicelulósica de matérias- primas e de lignina ou porções de matérias-primas. Tais matérias- primas de biomassa contêm, por exemplo, substratos de hidratos de carbono úteis como fontes de carbono tais como glicose, xilase, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Tendo em conta os ensinamentos e orientação proporcionados na presente invenção, as pessoas que são versadas na técnica compreenderão que matérias- primas renováveis e biomassa que não sejam aquelas que se exemplificaram acima também podem ser utilizadas para a cultura de organismos microbianos da presente invenção para diminuir a conversão de succinil-CoA para succinato, a diminuição da produção de excesso de CO2, diminuindo o fluxo através de um ciclo de TCA oxidativo, diminuindo a utilização de oxigênio por organismo microbiano, ou aumentando a disponibilidade de ATP.

[00172] As condições de cultura podem incluir, por exemplo, procedimentos de cultura líquidos, bem como outros procedimentos de fermentação e de cultura em larga escala. Como descrito na presente invenção, os rendimentos particularmente útil dos produtos biossintéticos da presente invenção podem ser obtidos em condições anaeróbicas ou condições de cultura substancialmente anaeróbicas.

[00173] Conforme descrito na presente invenção, uma condição de crescimento exemplar para alcançar a conversão decrescente a partir de succinil-CoA para succinato, a diminuição da produção de excesso de CO2, diminuindo o fluxo através de um ciclo de TCA oxidativo, diminuindo a utilização de oxigênio por organismo microbiano, ou aumentando a disponibilidade de ATP inclui as condições de cultura ou fermentação anaeróbica. Em certas modalidades, os organismos microbianos que não ocorrem de forma natural da presente invenção podem ser sustentados, em condições de cultura ou fermentação anaeróbicas ou condições substancialmente anaeróbicas. Resumidamente, uma condição anaeróbica refere-se a um ambiente isento de oxigênio. As condições substancialmente anaeróbicas incluem, por exemplo, uma cultura, a fermentação em bateladas ou fermentação contínua de tal modo que a concentração de oxigênio dissolvido no meio se mantenha entre 0 e 10 % de saturação. As condições substancialmente anaeróbicas também incluem o crescimento ou células em repouso, em forma líquida ou em agar sólido no interior de uma câmara selada mantida com uma atmosfera de menos de 1 % de oxigênio. A porcentagem de oxigênio pode ser mantida, por exemplo, purgando-se a cultura com um / mistura de CO2 N2 ou outro gás não-oxigênio ou gases adequados.

[00174] As condições de cultura descritas na presente invenção podem ser expandidas e crescidas continuamente para a fabricação de um produto desejado. Os procedimentos de crescimento exemplificativos incluem, por exemplo, alimentação em batelada e fermentação em bateladas de separação; fermentação em alimentação em batelada e separação contínua, ou fermentação contínua e separação contínua. Todos estes processos são bem conhecidos na técnica. Os procedimentos de fermentação são particularmente úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de um produto desejado. Em geral, e como com os procedimentos de cultura de células não-contínuos, a produção contínua e / ou quase contínua de um produto desejado irá incluir a cultura de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da presente invenção em nutrientes e formas suficientes para manter e / ou aproximadamente manter o crescimento em uma fase exponencial. A cultura contínua em tais condições podem incluir, por exemplo, o crescimento ou a cultura por 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Além disso, a cultura contínua pode incluir períodos de tempo mais longos de uma semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até vários meses. Alternativamente, os organismos da presente invenção podem ser cultivados durante horas, se apropriado para uma aplicação particular. É para ser entendido que as condições de cultura contínua e / ou quase contínua também podem incluir todos os intervalos de tempo entre esses períodos exemplares. É ainda entendido que o tempo de cultura, o organismo microbiano da presente invenção é, por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade suficiente de produto para uma finalidade desejada.

[00175] Os procedimentos de fermentação são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, a fermentação para a produção biossintética de um composto bioderivado pode ser utilizada em, por exemplo, alimentação em batelada e fermentação em bateladas de separação; fermentação em alimentação em batelada e separação contínua, ou fermentação contínua e separação contínua. Exemplos de processos em de fermentação em bateladas e contínuos são bem conhecidos na técnica.

[00176] Entende-se que as modificações que não afetam substancialmente a atividade das várias modalidades da presente invenção também são fornecidas dentro da definição fornecida na presente invenção. Por conseguinte, os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar a presente invenção.

EXEMPLO I Eliminação de YciA, YbfF, YdiI

[00177] Este exemplo descreve eliminação de três hidrolases CoA endógenas na cepa hospedeira 6286 e o efeito sobre a produção de succinato na cepa hospedeira 6286.

[00178] As condições de cultivo para placas de 96 cavidades. Todas as culturas em placas de 96 cavidades foram cultivadas em 1,2 ml de meio M9 (6,78 g / L de Na2HPO4, 3,0 g / L de KH2PO4, 0,5 g / L de NaCl, 1,0 g / L de NH4Cl, MgSO4 a 1 mM, CaCl2 a 0,1 mM) suplementado com NaHCO3 a 10 mM e MOPS a 100 mM para melhorar a capacidade de tamponamento. A fonte de carbono na forma de glicose a 5 % também foi adicionada. As condições microaeróbias foram obtidas cobrindo as placas com dois vedantes adesivos permeáveis ao gás. As bordas do selo foram gravadas para minimizar a evaporação. Todas as culturas foram cultivadas a 37 ° C. Os métodos Analíticos para a quantificação da biomassa, BDO, 4HB, e succinato foram relatados em US20140030779 e Yim et al, Nature Chemical Biology 7: 445 a 452 (2011).

[00179] Para testar o impacto das hidrolases CoA endógenas em succinil-CoA a succinato de conversão, yciA, ybfF e ydiI foram excluídos em cepa 6286. A cepa hospedeira 6619 foi derivada a partir da cepa 6286, com yciA excluído. A cepa 6620 foi derivada a partir da cepa 6286, com ydiI excluído. A cepa 6618 foi derivada a partir da cepa 6286, com ybfF excluído.

[00180] A cepa 6286 é derivada a partir da cepa 6025, com a eliminação adicional de succinato desidrogenase (SdhA). A cepa 6025 foi derivada a partir da cepa ECKh-432, cuja construção está descrita em US20110045575, US20140030779, Yim e et al, Nature Chemical Biology 7: 445-452 (2011). modificações notáveis na cepa de base ECKh-432 incluem eliminações em adhE, ldhA, pflB e mdh. A cepa 6025 também contém cromossomicamente as cópias de genes integradas que convertem succinil-CoA para BDO. Estes genes incluem uma desidrogenase CoA dependente de succinato de semialdeído, 4- hidroxibutirato desidrogenase, uma redutase 4-hidroxibutiril-CoA (ALD), uma redutase 4-hidroxibutiraldeído (ADH) e uma transferase de 4- hidroxibutiril-CoA. A cepa 6025 também contém deleções nos quatro genes nativos de álcool desidrogenase de ADHP, yqhD, Yahk, e yjgB. Esta cepa também tem deleções de oxidases do citocromo, cyoABCD e appBC, sintetase de succinil-CoA (sucCD), desvio de glicoxilato (aceBAK), um local de integração profago (yciI) e genes da biossíntese flagelares (flhCD, Mota), o veículo previsto (yebQ ), acil-CoA hidrolases (ybgC, TESB, ybhC), aspartato-amônia liase (Aspa), o / fago / porina ferricromo antibiótico da membrana externa (fhuA), glutamato sintase (gltBD), uma baixa especificidade treonina aldolase (ltaE), carboxicinase PEP (pckA), o componente do sistema de divisão da glicina (gcvt), maltose porina da membrana exterior / proteína do receptor de fago lambda (cordeiro), e os genes de fímbrias (fimABCDEFGHI). Além disso, o promotor nativo de PPC foi substituído com um promotor constitutivo forte. A cepa 6025 também contém um gene inativado Arca (Silverman et al, J Bacteriol 173 (18): 5648 a 5652 (1991)). Vários genes nativos são cromossomicamente super expressos: Acka, pta, Suca, sucB e IpdA.

[00181] As deleções de yciA, ydiI e ybfF foram alcançadas através de um método de recombinação homóloga de duas etapas de duplo cruzamento, tal como descrito anteriormente (Yim et al, Nature Chem Biol 7: 445 a 52 (2011); US20140030779). Recombinação foi catalisada através de expressão dos genes do fago lambda de pred-Amp vermelhos (gene Pontes, Heidelberg, Alemanha). Os genes que codificam levulanoinvertase (sacB) de Bacillus subtilis e resistência à canamicina foram integrados no cromossoma. A canamicina foi utilizada para selecionar para os integrantes sucesso. Em uma segunda etapa de recombinação homóloga de dupla troca, a sequência contendo o gene integrado do gene de resistência à canamicina e levanossacarase foi substituída com uma sequência apropriada de DNA (inserção ou eliminação ou mutação) e os clones resistentes à sacarose foram selecionados quanto à sensibilidade à canamicina. As sequências de DNA utilizadas nas etapas de recombinação homóloga descritas acima foram construídas através de técnicas de biologia molecular padrão. Após a recombinação, a região cromossômica englobando a modificação foi amplificada por PCR e sequenciada a fim de verificar que a modificação ocorreu esperado como planejado. As regiões de flanqueamento (entre 500-1000 nt) cobrindo qualquer sequência reguladora, por conseguinte, eram sequência verificadas.

[00182] Os seguintes iniciadores foram utilizados para confirmar as exclusões yciA, ydiI e ybfF:

[00183] Como resultado, os nucleotídeos seguintes foram excluídos: 1,309,961-1,310,181 (yciA), 711,267-712,043 (ybfF) e 1,763,3741,763,651 (ydiI).

[00184] A cepa 6286 tem várias modificações genéticas que interrompem ou alteram o ciclo de TCA. A inativação de arcA permite maior fluxo através do ciclo de TCA oxidativo. Interrompendo o regulador arcA também aumenta o nível de expressão de oxidases do citocromo (tanto CYO e CyD) em relação a um tipo de pressão de arcA selvagem. Ruptura de sucCD (sintetase de succinil-CoA) reduz o ciclo TCA de fluxo de succinil-CoA a succinato. O ciclo de TCA foi adicionalmente interrompido por meio da eliminação de succinato desidrogenase, que converte succinato a fumarato. A Tabela 19 mostra a produção de BDO e subproduto em placas de 96 cavidades a partir da cepa 6286, com e sem yciA. A atividade endógena de succinil-CoA a succinato resulta na acumulação de succinato nesta cepa. Eliminação de yciA na cepa 6286 resultou na redução da produção de succinato, indicando atividade reduzida de succinil-CoA a succinato. Adicionalmente, maior BDO e 4HB foram observados em células com yciA excluído, apoiando o fluxo aumentado para a via de BDO nesta cepa. Tabela 19. Produção de BDO em cepa 6286 com e sem eliminação de yciA, ybfF e ydiI. Quatro culturas de réplica foram mostradas. Todas as concentrações foram em mM e foram medidas após 24 horas de tempo de cultura em placas de 96 cavidades.

EXEMPLO II Redução do excesso de CO2 por Eliminação de YciA

[00185] Este exemplo descreve o crescimento da fase de análise de fluxo 13C de cepas com e sem yciA, demonstrando que a eliminação yciA em uma cepa com sucCD rompidos resultada em fluxo de succinil- CoA a succinato reduzido e redução do excesso de CO2. O exemplo mostra também que alterando a eficiência energética da cadeia respiratória pode melhorar a taxa de crescimento de cepas YciA excluídas.

[00186] O crescimento da fase de análise de fluxo 13C dos métodos experimentais e computacionais são conhecidos na técnica e são descritos em Yang, TH, Metabolic Analisis Flux Com base-13C: Fundamentos e Prática, em Sistemas de Engenharia Metabólica: Métodos e protocolos 297 a 334 (Alper, HS ed., 2013). Em resumo, as culturas foram cultivadas em frascos de agitação em meio mínimo M9 suplementado com 13C-glicose uniformemente marcado. As culturas foram amostradas em meados de log de fase de crescimento exponencial. Oos produtos metabólicos (componentes de biomassa e produtos metabólicos segregados) foram separados e quantificados por meio da espectrometria de massa. A partir de medições de concentração, coeficientes de rendimento cumulativos foram calculados para todas as espécies extracelulares produzidas e consumidas pelas células, incluindo a biomassa e CO2. Os 13C padrões de rotulagem dos produtos metabólicos foram analisados por meio da espectrometria de cromatografia de massa de gás (GCMS) como descrito anteriormente (Fischer e Sauer, Eur J. Biochem 270: 880-891 (2003)). Usando uma rede de reação compreendendo as reações produtoras metabólicas centrais e BDO, a otimização numérica foi realizada para estimar os fluxos in vivo a partir das concentrações dos metabólitos obtidos experimentalmente e os padrões de rotulagem 13C.

[00187] A análise de fluxo de crescimento de fase 13C foi realizada para avaliar o impacto da yciA em vias metabólicas centrais. As cepas utilizadas neste exemplo são 6025 (yciA +), 6616 (6025 ?yciA), e 6729 (6025 + cyoABCD ?yciA). A distribuição de fluxo (por glicose) entre vias metabólicas centrais para as cepas 6025, 6616,e 6729 está apresentada na Tabela 20. Tabela 20. A distribuição de fluxo (por glicose) entre vias metabólicas centrais para as cepas 6025, 6616 e 6729.

[00188] Os resultados mostram que em comparação com o controle 6025, o fluxo de succinil-CoA a succinato de cepas 6616 e 6729 foi reduzido de 32 % para 12 % e 15 %, respectivamente. A eliminação de yciA não alterou significativamente o fluxo através da via da pentose fosfato. O excesso de CO2 por glicose em 6616 e 6729 foi reduzido de 2,35 para 1,89-1,90 devido à diminuição da atividade de succinil-CoA a succinato.

[00189] Uma comparação das taxas de crescimento de 6025, 6616, e 6729 mostra que a ruptura de yciA CYO e ambos têm efeito significativo na taxa de crescimento, no fundo da cepa 6025. A cepa com yciA eliminado e cyd como a única citocromo oxidase (6616) cresce a uma taxa significativamente mais lenta do que a cepa em que ambos cyd e CYO estão presentes (6729). A re-introdução dw mais oxidase de citocromo de eficiência energética aumentou a disponibilidade ATP por glicose, e parcialmente aliviado a escassez ATP causada pela ruptura do ciclo de TCA.

EXEMPLO III Redução do consumo de oxigênio específico na cepa de eliminação YciA

[00190] Este exemplo descreve uma redução da absorção específica por célula em cepas com e sem YciA.

[00191] São esperadas que as cepas com ciclos TCA atenuadas venham a ter reduzida capacidade de respirar e utilizar oxigênio. Para avaliar se a eliminação de YciA tem um efeito sobre a capacidade de captação de oxigênio, um fermentação aeróbica em alimentação em batelada foi realizada em cepas com e sem a eliminação YciA. As cepas foram avaliadas 6435 e 6729. A cepa 6435 foi derivada a partir de 6025 com cyoABCD do tipo selvagem restaurado. A cepa 6729 foi derivada a partir de 6435 com yciA excluído.

[00192] As fermentações de alimentação em batelada foram realizadas com 1 L de volume de cultura inicial, em 2L de Biostat B + biorreactores (Sartorius; Cedex France) utilizando meio mínimo M9 suplementado com 20 g / L de glicose. A temperatura foi controlada a 35 ° C, e o pH foi controlado a 6,75 com 2 M de Na2CO3 ou NH4OH. As células foram cultivadas aerobicamente e não foram impostas limitações de nutrientes. O oxigênio foi medido utilizando uma sonda de oxigênio dissolvido PreSens Oxi4.

[00193] A biomassa, o tempo, a taxa de absorção de oxigênio específico (S-OUR) e taxa de consumo de oxigênio específico instantânea molar (ISMOUR) são mostrados na Tabela 21. A medida biomassa foi calculada a partir da cultura OD, (1 equivalente OD = 0,4 g seco peso de células por litro). A taxa de consumo de oxigênio molar específica instantânea é a diferença na velocidade de absorção de oxigênio dividida pela diferença na biomassa dividido pelo intervalo de tempo das medições. Tabela 21. Biomassa, tempo, S-OUR e ISMOUR em cepas 6729 e 6435.

[00194] Em todos os momentos da fermentação, a cepa 6729 demonstrou uma taxa de consumo de oxigênio específico reduzida em comparação com 6435. A taxa de formação de biomassa também foi mais lenta em 6729.

EXEMPLO IV Eliminação de YciA combinada com PntAB A sobreexpressão reduz o excesso de CO2

[00195] Este exemplo descreve o crescimento da análise de fluxo 13C das cepas de eliminação yciA com e sem sobre-expressão baseados em plasmídeo de transhidrogenase (pntAB).

[00196] O desenvolvimento de vetores de expressão para pntAB. As estruturas principais do vetor foram obtidas do Dr. Rolf Lutz de Expressys (expressys.de). Os vetores e cepas estão baseados no sistema de expressão descrito previamente pZ (Lutz e Bujard, Nucleic Acids Res. 25: 1203-1210 (1997)). Especificamente, PzS * 13luc foi obtido e continha o gene da luciferase como um fragmento de enchimento. Para substituir o fragmento de luciferase de enchimento com um fragmento de lacZ-alfa flanqueado por locais de enzimas de restrição adequadas, o fragmento de luciferase de enchimento foi primeiro removido de cada um dos vetores por digestão com EcoRI e Xbal. O fragmento de lacZ-alfa foi amplificado por PCR a partir de pUC19 com os seguintes iniciadores: lacZalpha-RI 5‘GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCA CTGGCCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 7) AC3‘ lacZalpha 3‘BB 5‘- GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGC AGA-3’ (SEQ ID NO: 8).

[00197] Isto gerou um fragmento com uma extremidade 5' do local EcoRI, NheI, um local de ligação ribossômica, um local SalI e o códon de iniciação. A extremidade 3 ' do fragmento continha o códon de paragem, Xbal, Hindi II, e os locais AvrII. O produto de PCR foi digerido com EcoRI e AvrII e ligado em vetores de base digeridos com EcoRI e Xbal (Xbal e AvrII possuem extremidades compatíveis e não geram um local). Como os locais de enzimas de restrição Nhel e Xbal geram extremidades compatíveis que podem ser ligadas umas as outras (mas geram um local após ligadura que não é digerido por qualquer uma das enzimas), os genes clonados nos vetores poderiam ser "Biobricked" em conjunto (openwetware.org/wiki/ Synthetic_Biology: BioBricks). Resumidamente, este método permite juntar um número ilimitado de genes no vetor utilizando os mesmos locais de restrição 2, desde que os locais não aparecem interno para os genes, porque os locais entre os genes são destruídos após cada adição. Inicialmente, a expressão era baixa a partir destes vetores, e foram posteriormente modificados utilizando o Phusion® Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB, Ipswich, Mass.) Para inserir a sequência AATTAA espaçadora entre os locais EcoRI e Nhel. Isso eliminou a estrutura de loop do tronco putativo no RNA que ligava o RBS e começava o códon.

[00198] Todos os vetores têm a designação pZ seguida por letras e os números indicam a origem de replicação, marcador de resistência a antibiótico e promotor unidade / reguladora. A origem de replicação é a segunda letra e é denotada por E de ColE1, A para S p15A e S para pSC101 (bem como uma cópia menor número de versão pSC101 designado S *) - origens de base. O primeiro número representa o marcador de resistência a antibiótico (1 para ampicilina, canamicina para 2, 3 para o cloranfenicol). O número final define o promotor que regulada do gene de interesse (uma para PLtetO-1, 2 para PLlacO-1 e 3 para PA1lacO-1) e cada um destes promotores ficou ativado por sua molécula indutor correspondente (pLtetO pode ser induzida por tetraciclina ; pLlacO-1 e pA1lacO-1 pode ser induzido por IPTG). Um vetor base, PZS * 13S, foi ainda concebido.

[00199] Além dos promotores "indutíveis"mencionados acima, um conjunto de promotores "constitutivos" foram amostrados a partir do Registro (partsregistry.org). Cada um destes promotores "constitutivos" foi então introduzido na estrutura principal do vetor PzS * 13S para substituir o promotor pA1lacO-1 indutível através de sequência e método de ligação independente da clonagem (SLIC) descrito anteriormente (Li et al, Nature Methods. 4: 251 a 256 (2007)). Destes promotores incluídos na amostra "constitutiva" (p100, p104, p105, p107, p108, P111, P115 e P119), os experimentos foram realizados para estabelecer uma ordem de força do promotor que foi verificado por níveis de expressão de proteína. Para estas experiências, P115 foi escolhido para a expressão pntAB. Para obter ainda mais para baixo os níveis de expressão de proteínas pntAB, o local de ligação ao ribossoma (RBS) entre promotor e gene sequência de codificação foi alterado em conformidade usando a calculadora RBS (salis.psu.edu/software/).

[00200] Os iniciadores utilizados para a inserção de SLIC pntAB na estrutura principal PzS * 13S do vetor estão listados abaixo. O caso mais baixo marca o recozimento das sequências para uma estrutura principal do vetor, enquanto o caso superior marca as sequências de hibridação para a região de codificação de um gene. 1. pntAB

[00201] Iniciador SLIC dianteiro: gaggagaagtcgacATGAACGAACAATATTCCGCATTGCG (SEQ ID NO: 9)

[00202] Iniciador SLIC reverso: ggaagctttctagaTTAGCCGGTATTACGCATACCTGCC (SEQ ID NO: 10).

[00203] Resultados da Análise de Fluxo. A análise de fluxo de fase de crescimento 13C foi realizada como descrito anteriormente para avaliar o impacto da sobreexpressão pntAB no fluxo através da via das pentoses fosfato, a reação de succinil-CoA a succinato e a formação de excesso de CO2. A sobre-expressão de pntAB era esperada para diminuir o fluxo através da via das pentoses fosfato pelo gerador de NADPH ao custo de NADH. A cepa utilizada neste exemplo é 6729 (6025 + cyoABCD ?yciA) transformada com um dos plasmídeos seguintes: (1) vetor PzS * -p115- vazio, (2) PzS * -p115-6K-RBS-pntAB, (3 ) PZS * -p115-13K-RBS-pntAB, (4) PZS * -p115-pntAB. Os plasmídeos 2 a 4 expressam a transhidrogenase ligada à membrana codificada por pntAB em níveis crescentes, com P115-pntAB sendo a expressão mais forte.

[00204] A distribuição de fluxo (por glicose) entre as vias metabólicas centrais para cada combinação de cepa / plasmídeo é mostrada na Tabela 22. Tabela 22. A distribuição de fluxo (por glicose) entre as vias metabólicas centrais para a cepa 6729 (6025 + cyoABCD ?yciA) transformada com um dos plasmídeos seguintes: (1) vetor PzS * - p115- vazio, (2) PzS * - p115-6K-RBS-pntAB, (3) PZS * -p115-13K- RBS-pntAB, (4) PZS * -p115-pntAB.

[00205] A análise de fluxo de fase Crescimento confirmou que pntAB OE diminuiu o excesso de CO2, reduzindo o fluxo através da via das pentoses fosfato e o ciclo do TCA oxidativo (controlado por meio da reação succinil-CoA a succinato).

EXEMPLO V Rendimento de Crescimento Aumentando com a Eliminação de CydAB

[00206] Este exemplo demonstra que um aumento do rendimento de crescimento pode ser obtido através da melhoria da eficiência energética da cadeia de transporte de elétrons através da eliminação de cydAB.

[00207] O complexo de citocromo Bo, codificado pelo operão cio, é processado ao complexo de citocromo-oxidase predominante por eliminação de cydAB, que codificam para o citocromo complexo BD-I. O complexo de citocromo Bo bombeia ativamente os elétrons sobre a membrana e resulta em uma estequiometria de H + / 2 de 4. O complexo do citocromo BD- I não aparece para bombear de forma ativa os prótons. No entanto, devido à oxidação do quinol no lado periplasmático da membrana e a subsequente absorção de prótons a partir do lado citoplasmático da membrana que são utilizados na formação de água, os líquidos resultados de transferência de elétrons de uma estequiometria de H + / 2 de 2 . Uma vez que o complexo citocromo Bo tem uma maior estequiometria de próton de translocação do que o citocromo do complexo BD- I, a eficiência energética da cadeia de transporte de elétrons pode ser melhorada pela eliminação da cydAB.

[00208] A cepa 7032 hospedeira é semelhante a 6025 descrita acima. Ele contém um operão cio do tipo selvagem restaurado e é sucCD. A cepa hospedeira 7143 é derivada de 7032, mas contém uma eliminação no cydAB. As deleções de cyda e cydB foram alcançadas usando uma dupla troca do método de recombinação homóloga em duas etapas, conforme descrito no Yim et al. (Yim et al, Nature Chem Biol 7: 445 a 52 (2011)) e US20140030779. Recombinação foi catalisada através de expressão dos genes do fago lambda vermelhos de pred-Amp (gene Pontes, Heidelberg, Alemanha). Os genes que codificam levulanoinvertase (sacB) de Bacillus subtilis e resistência à canamicina foram integrados no cromossoma. A canamicina foi utilizada para selecionar os integrantes de sucesso. Em uma segunda etapa de recombinação homóloga de dupla troca, a sequência contendo o gene integrado do gene de resistência à canamicina e levanossacarase foi substituída com uma sequência apropriada de DNA (inserção ou eliminação ou mutação) e os clones resistentes à sacarose foram selecionados quanto à sensibilidade à canamicina. As sequências de DNA utilizadas nas etapas de recombinação homóloga descritas acima foram construídas através de técnicas de biologia molecular padrão. Após a recombinação, a região cromossômica englobando a modificação foi amplificada por PCR e sequenciada a fim de verificar que a modificação ocorreu esperado como planeado. As regiões de flanqueamento (entre 500-1000 nt) cobrindo qualquer sequência reguladora, por conseguinte, foram verificadas.

[00209] Os seguintes iniciadores foram utilizados para confirmar as exclusões cydAB:

[00210] Como resultado, os nucleotídeos seguintes foram excluídos: 1,309,961-1,310,181 (cydAB).

[00211] As fermentações alimentação em batelada foram realizadas com 1 L de volume de cultura inicial, em 2L de Biostat B + biorreactores (Sartorius; Cedex France) utilizando meio mínimo M9 suplementado com 20 g / L de glicose. A temperatura foi controlada a 35 ° C, e o pH foi controlado a 6,75 com Na2CO3 ou NH4OH a 2 M. As células foram cultivadas em condições aeróbias até que uma taxa de consumo de oxigênio baseado no peso de pico (wOUR) de 45 mmol de O2 / Kg / hr foi atingido. Neste ponto, o fornecimento de oxigênio total (mmol / h) foi mantida constante, mas devido ao aumento de volume de líquido, o wOUR diminui gradualmente, resultando em condições microaeróbias [oxigênio dissolvido (OD) = concentração de 0 (isto é, abaixo dos limites de detecção); taxa de captação de oxigênio = taxa de transferência de oxigênio]. Todas as culturas atingiram DO = 0 a 9 horas. O tempo total de fermentação foi de 24 h. Dessa maneira, grande parte do crescimento ocorreu em condições limitadas de oxigênio. Não foram instituídas outras limitações nutricionais. O oxigênio foi medido utilizando uma sonda de oxigênio dissolvido PreSens Oxi4.

[00212] A biomassa total formada, o oxigênio consumido, e a biomassa formada por oxigênio consumido são relatados na Tabela 23. O valor de biomassa foi calculado a partir da cultura OD (1 equivalente OD = 0,4 g de peso celular seco por litro) e de volume de líquido. Eliminação de cydAB permitiu uma maior quantidade de biomassa a ser formada por meio da molécula de oxigênio consumido. Uma vez que o rendimento de biomassa em oxigênio é mais elevado nas cepas Qcyd, menor pico de wOUR pode ser usado para gerar a mesma quantidade de massa de células como cepas CyD +. Dessa maneira, as perdas de rendimento respiratório para CO2 são mais baixas em cepas cyd comparação com cepas CyD +. Tabela 23. Formação total de biomassa, oxigênio consumido, e biomassa gerada por oxigênio consumido são fornecidos para a cepa 7032 e 7143 em 24 horas de fermentação

EXEMPLO VI Aumentar o rendimento do produto de Cepas de eliminação de SucCD CydAB por meio da eliminação pela de PykF e / ou sobre- expressão de PntAB

[00213] Este exemplo demonstra que a produção de BDO por biomassa pode ser aumentada em cepas de eliminação sucCD cydAB pntAB por sobreexpressão e / ou eliminação de pykF.

[00214] pykF foi eliminado na cepa 7143 descrito no Exemplo V. A cepa 7143 carece de sucCD e cydAB. Eliminação de pykF a partir da cepa 7143 resultou na cepa 7342. A eliminação de pykF foi conseguida utilizando um método de recombinação homóloga de duas etapas de duplo cruzamento, tal como descrito anteriormente (Yim et al, Nature Chem Biol 7: 445 a 52 (2011)) e US20140030779. Os seguintes iniciadores foram utilizados para confirmar a eliminação pykF: Designação do Iniciador Sequência doIniciador SEQ ID NO

[00215] Como resultado, os nucleotídeos seguintes foram excluídos: 1,309,961-1,310,181 (pykF).

[00216] Os genes pntAB foram sobre-expressos em cepas 7143 e 7342, utilizando os vetores de expressão descritos no Exemplo IV. PZS * -p115-13K-RBS-pntAB resulta em menor expressão do que pntAB PZS * -p115-pntAB devido à força reduzida do RBS. As cepas foram cultivadas em uma placa de 96 cavidades como descrito no Exemplo I. A Tabela 24 mostra que a quantidade de BDO sintetizado por biomassa produzida é aumentada após a eliminação de pykF. Tabela 24 também mostra que este aumento é ampliada em ambos os cepa 7143 e tensão 7342 sobre superexpressão pntAB. Tabela 24. produção BDO per OD em cepas 7143 e 7342 com e sem aumento da expressão de pntAB. As médias de quatro culturas réplica são mostradas após 24 horas de tempo de cultura em placas de 96 cavidades.

EXEMPLO VII O aumento do rendimento do produto de cepas de eliminação SucCD CydAB YciA por meio da Eliminação de PykF e / ou sobre- expressão de PntAB

[00217] Este exemplo demonstra que a produção de BDO por biomassa pode ser aumentada em cepas de eliminação sucCD cydAB yciA pntAB por sobreexpressão e / ou eliminação de pykF.

[00218] yciA foi eliminado na cepa 7143 descrito no Exemplo V. A cepa 7143 carece de sucCD e cydAB. Eliminação de yciA a partir da cepa 7143 resultou na cepa 7170. A eliminação de yciA foi conseguida utilizando um método de troca dupla de recombinação homóloga de duas etapas tal como descrito em Yim et al. (Yim et al, Nature Chem Biol 7: 445-52 (2011)) e US20140030779. Os seguintes iniciadores foram utilizados para confirmar a eliminação yciA:

[00219] Como resultado, os nucleotídeos seguintes foram excluídos: 1,309,961-1,310,181 (yciA).

[00220] pykF foi eliminado na cepa 7170. A cepa 7170 carece de sucCD, yciA e cydAB. Eliminação de pykF a partir da cepa 7170 resultou na cepa 7341. A eliminação de pykF foi conseguida utilizando um método de dupla troca de recombinação homóloga de duas etapas tal como descrito em Yim et al. (Yim et al, Nature Chem Biol 7: 445 a 52 (2011)) e US20140030779. Os seguintes iniciadores foram utilizados para confirmar a eliminação pykF:

[00221] Como resultado, os nucleotídeos seguintes foram excluídos: 1,309,961-1,310,181 (pykF).

[00222] Os genes pntAB foram sobre-expressos em cepas 7170 e 7341, utilizando os vetores de expressão descritos no Exemplo IV. PZS * -p115-13K-RBS-pntAB resulta em menor expressão do que pntAB PZS * -p115-pntAB devido à força reduzida do RBS. As cepas foram cultivadas em uma placa de 96 cavidades como descrito no Exemplo I. A Tabela 25 mostra que a quantidade de BDO sintetizada por biomassa produzida é aumentada após a eliminação de pykF. Tabela 25 também mostra que este aumento é ampliada em ambos os cepa 7170 e a cepa 7341 mediante o aumento da expressão pntAB. Tabela 25. Produção BDO per OD em cepas 7170 e 7341 com e sem aumento da expressão de pntAB. As médias de quatro culturas de réplica são mostradas após 24 horas de tempo de cultura em placas de 96 cavidades.

EXEMPLO VIII O aumento do rendimento do produto de cepas de eliminação de SucCD PykF por meio da superexpressão de PntAB

[00223] Este exemplo demonstra que a produção de BDO pode ser aumentada em uma cepa sucCD pykF por sobre-expressam pntAB.

[00224] A cepa 7032 hospedeira é semelhante a cepa 6025 descrita acima. Ele contém um operão cio do tipo selvagem restaurado e é sucCD. Os genes foram sobre-expressos em pntAB na cepa 7032 utilizando os vetores de expressão descritos no Exemplo IV. PZS * - p115-13K-RBS-pntAB resulta em menor expressão do que pntAB PZS * -p115-pntAB devido à força reduzida do RBS. As cepas foram cultivadas em uma placa de 96 cavidades como descrito no Exemplo I. A Tabela 26 mostra que a quantidade de BDO sintetizado é aumentada após a sobre-expressão de pntAB. Tabela 26. Produção de BDO em cepa 7023 com e sem aumento da expressão de pntAB. As médias de quatro culturas de réplica são mostradas após 24 horas de tempo de cultura em placas de 96 cavidades.

EXEMPLO IX O aumento do rendimento do produto de cepas de eliminação SucCD YciA por meio da eliminação de Cyd

[00225] Este exemplo demonstra que a produção de BDO pode ser aumentada em uma cepa sucCD QyciA por eliminação cydAB.

[00226] A cepa 7313 hospedeira é semelhante a cepa 7341 descrita acima. Ambas as cepas contêm um operão cio do tipo selvagem restaurado e são pykF, QyciA e sucCD. A cepa 7341 contém uma eliminação nos genes cydAB. A Tabela 27 mostra que a quantidade de BDO sintetizada aumentada é a cepa 7341 contra 7313. Tabela 27. Produção de BDO em cepas 7313 e 7341. As médias de quatro culturas de réplica são mostrados após 24 horas de tempo de cultura em placas de 96 cavidades.

EXEMPLO XX Melhoria da taxa de crescimento na Eliminação de ClpA

[00227] Este exemplo demonstra uma melhor taxa de crescimento em cepas com a proteína ClpA inativada ou uma eliminação do gene ClpA.

[00228] ClpA é o componente chaperona dependente de ATP dos complexos de protease ClpAP e ClpAXP, os membros de um grupo diverso de complexos chaperona / protease dependente de energia (Reid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98 (7 ): 3768 a 3772 (2001); Kessel et al, J. Mol Biol 250 (5): 587 a 594 (1995)). As funções de protease ClpAP em diversas atividades celulares, incluindo degradação de proteínas agregadas e ssrA-tag, adaptação e viabilidade na fase estacionária e a regulação de proteínas de resposta à fome de carbono e estresse ambiental (Gottesman et al, Genes Dev. 12: 1338 a 1347 (1998)).

[00229] A restauração ClpA em 5723. As experiências foram concebidas para testar se a restauração da ClpA de tipo selvagem tem um efeito sobre o crescimento. Uma eliminação de pares de bases (no par de bases 254) no gene ClpA foi encontrada em uma cepa. O efeito funcional dessa eliminação é truncagem prematura, e, dessa maneira, de inativação, da proteína ClpA, e os complexos de protease ClpAP e ClpAPX. O gene ClpA foi restaurado para tipo selvagem em 5723 e testado para as diferenças no crescimento entre o tipo selvagem e ClpA ClpA com a mutação. Uma versão da cepa com um cassete inseriu SacBKan em 500 pares de bases no gene ClpA.

[00230] As cepas foram testadas para crescimento em meio FM1 na Bioscreen. A restauração do gene ClpA à sua forma de tipo selvagem ligeiramente prejudica o crescimento em 5723. A versão com a cassete SacBkan não tem o mesmo comprometimento. Estes resultados indicam que a eliminação ou atenuação de componente ClpA da taxa de crescimento de protease melhorou.

[00231] Ao longo deste pedido de Patente várias publicações têm sido referenciadas. As descrições destas publicações na sua totalidade, incluindo GenBank e publicações Número GI, são incorporadas na presente invenção por meio de referência neste pedido de modo a descrever mais completamente o estado da técnica à qual este invento pertence. Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos proporcionados acima, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem afastamento do espírito da presente invenção.

Claims (12)

1. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, caracterizado pelo fato de que compreende uma alteração genética de (a) atenuação de cydA ou cydB, e (b) uma ou mais alterações genéticas que aumenta a expressão de uma proteína codificada por pntAB, em que uma ou mais das alterações genéticas que aumentam a expressão da proteína codificada por pntAB compreendem a expressão de um ou mais ácidos nucleicos exógenos compreendendo pntAB, aumento do número de cópias de ptnAB, modificação de um promotor, potencializador ou outra região reguladora de pntAB, ou qualquer combinação dos mesmos.

2. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui atenuação adicional de sucCD.

3. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem ainda atenuação de pykF.

4. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem atenuação adicional de (c) sucCD e (d) pykF.

5. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem atenuação adicional de (c) SucCD e (d) yciA.

6. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem atenuação adicional de (c) sucCD, (d) pykF e (e) yciA.

7. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem atenuação adicional de (c) sucCD, (d) yciA e (e) menC.

8. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma via enzimática para a produção de um composto bioderivado a partir de um intermediário do ciclo TCA ou de um substrato do ciclo TCA; em que opcionalmente a referida via enzimática é selecionada do grupo que consiste em uma via de 4- hidroxibutirato (4HB), uma via de 1,4-butanodiol (1,4-BDO), uma via de 1,3-butanodiol (1,3-BDO), uma via de polihidroxibutanoato (PHB), uma via de butadieno, uma via do adipato, uma via do 6-aminocaproato, uma via da caprolactama, uma via do ácido metacrílico, uma via do isopropanol, uma via do álcool de cadeia longa, uma via da hexametilenodiamina, uma via do metacrilato de metila, uma via do butanol, uma via do 3-buteno-1-ol, uma via de 3-buteno-2-ol e uma via de álcool crotílico.

9. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o rendimento do composto bioderivado é aumentado em relação à ausência da referida alteração genética.

10. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em bactérias, leveduras, fungos ou outro microorganismo aplicável a um processo de fermentação; em que opcionalmente o referido organismo microbiano é uma bactéria; em que opcionalmente as referidas bactérias são Escherichia coli.

11. Método de produção de um composto bioderivado, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, como defindo em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, por um período de tempo suficiente, em condições suficientes para produzir o referido composto bioderivado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido composto bioderivado é selecionado do grupo que consiste em 4-hidroxibutirato (4HB), 1,4-butanodiol (1,4- BDO), 1,3-butanodiol (1,3-BDO), polihidroxibutanoato (PHB), butadieno, adipato, 6-aminocaproato, caprolactama, ácido metacrílico, isopropanol, álcoois de cadeia longa, hexametilenodiameno, metacrilato de metila, butanol, 3-buteno-1-ol, 3-buteno-2-ol e crotil-álcool.