KR20220012847A - 재생가능한 공급원으로부터 화학물질의 생산 - Google Patents

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Abstract

특히, 본 개시는 다양한 화합물 예컨대 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 6-히드록시 헥산산, 및 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 생합성 폴리펩티드, 방법, 및 비-천연 발생 미생물 유기체를 제공한다.

Description

재생가능한 공급원으로부터 화학물질의 생산
관련 출원에 관한 교차-참조
본 출원은 2019년 4월 25일 출원된 미국 가출원 제62/838,793호, 및 2019년 6월 28일 출원된 미국 가출원 제62/868,824호에 대한 우선권을 청구하고, 이들 각각의 전문은 참조로 본 명세서에 편입된다.
기술 분야
본 개시는 일반적으로 산업적으로 유용한 화학물의 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
아디프산 (AA)은 2012년 그 수요가 230만 미터톤으로 추정되는 광범위하게 사용되는 화학물이다 (IHS Chemical, Process Economics Program Report: Bio-Based Adipic acid (Dec. 2012)). 헥사메틸렌디아민 (HMDA)과 함께, 나일론6,6, 폴리에스테르 수지, 가소제, 식품, 및 다른 재료의 생산에서 사용된다. 따라서, 재생가능한 자원을 사용하여 높은 수율로 아디프산을 제조하는 방법이 매우 바람직하다.
1,5-펜탄디올은 폴리우레탄 및 폴리에스테르 (PDL)의 주요 성분이다. 1,6-헥산디올 (HDO)은 말단 히드록실 기를 갖는 선형 디올이다. 이것은 산업용 코팅 응용분야의 폴리에스테르, 자동차 응용분야용 2-성분 폴리우레탄 코팅에서 사용된다. 또한 이것은 파케이 바닥마감 및 가죽 코팅을 위한 엘라스토머 및 폴리우레탄 분산물에서 사용되는 마크로디올 예를 들어, 아디페이트 에스테르 및 폴리카르보네이트 디올의 제조에서 사용된다.
6-히드록시 헥산산 (6HH)은 환화되어 ε-카프로락톤을 만들 수 있고 이어서 아미노화되어 ε-카프로락탐을 만들 수 있다. ε-카프로락탐은 많은 상이한 산업에서 광범위하게 사용되는 중합체인, 나일론6의 제조에서 사용된다. ε-카프로락톤은 중합되어서 폴리카프로락톤 (PCL)을 특수 폴리우레탄의 제조를 위한 응용분야에서 사용되는 생분해성 폴리에스테르로 만든다.
2-케토 카르복실산은 수많은 산업적으로 관련된 화학물 및 약학 약물의 제조를 위한 유용한 중간체이다. 그들은 산업적으로 유용한 α-히드록시 카르복실산을 비롯하여, 아미노산의 제조를 위한 전구체이다.
특히, 본 개시는 소정 생합성 펩티드, 예를 들어, 다양한 효소가 많은 구현예에서, 그들의 천연 및/또는 특징규명된 기질과 구조적으로 상이한 기질로부터, 다양한 화합물을 효율적으로 제조하는데 이용될 수 있다는 인식을 포괄한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 이러한 효소를 이용하여 다양한 화합물을 제조하기 위한 기술 (예를 들어, 효소, 핵산, 유기체, 배양물 등)을 제공한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시는 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 예컨대 다양한 히드라타제-알돌라제가 그들의 전형적인 방향족 알데히드 기질 이외의 지방족 알데히드로부터 수많은 화합물을 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는
피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
일부 구현예에서, 알데히드, 예를 들어, 지방족 알데히드는 하기의 화학식 A-1의 구조, 또는 이의 염을
Ra-L2-L1-C(O)H,
A-1
상기 화학식에서, 갖는다:
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 임의로 독립적으로 치환되고;
-Cy-는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R"은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
R'은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택된 임의 치환된 기이거나, 또는 :
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 단일치환된 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2- 이다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 하기 화학식 P-2의 구조, 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH=CH-C(O)-C(O)OH,
P-2
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에 기술된 바와 같다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 알돌-탈수 생성물, 예를 들어, 화학식 P-2의 화합물 또는 이의 염은 일부 구현예에서, 다양한 생성물, 예컨대 1,5-펜탄디올, HDO, 6HH, 아디프산 등 (예를 들어, 도 2-5 참조) 및 그로부터 만들어진 다양한 중합체 생성물을 포함한, 그로부터 만들어진 다양한 생성물을 제공하기 위한 하나 이상의 생합성 과정을 통해서, 더욱 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 표시된 바와 같이, 알돌-탈수 생성물, 예를 들어, 화학식 P-2의 화합물 또는 이의 염은 또한 알돌 생성물, 예를 들어, 하기 화학식 P-1의 화합물, 또는 이의 염으로부터 제조될 수도 있다:
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-1
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 알돌 생성물을 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 제조된다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물은 적합한 기질을 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜 제조된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 다양한 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드가 그들의 천연 또는 비-천연 기질로부터 다양한 화합물을 제조하는데 이용될 수 있다는 것을 입증한다. 일부 구현예에서, 본 개시는
알켄을 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알켄 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고;
알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어 알켄 환원 생성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 알켄은 알돌-탈수 생성물, 예를 들어, 화학식 P-2 중 하나 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 하기 화학식 P-3의 구조, 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-3
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
특히, 본 명세서는 재생가능한 자원을 사용하여 2-케토 카르복실산, 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 및 6-히드록시 헥산산을 제조하기 위한 효소, 방법, 및 재조합 미생물을 개시한다.
일 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법이 제공한다:
Figure pct00001
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 피루베이트 및
Figure pct00002
을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와, 하나 이상의 비-천연 발생 미생물을 포함하는 유기체 또는 배양물 중에서 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고; 여기서 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법이 제공된다:
Figure pct00003
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 피루베이트 및
Figure pct00004
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 둘 이상의 비-천연 발생 미생물을 포함하는 유기체 또는 배양물 중에서 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고; 여기서 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법이 제공되고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00005
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계
를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00006
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계
를 포함하거나 또는 그로 이루어지고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00007
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계
를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00008
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00009
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계를 포함하고;
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00010
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계
를 포함하고;
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 아디프산을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00011
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계
를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 아디프산을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00012
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계
를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45, EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에서 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45, EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에서 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인된 효소의 군에서 선택된 효소, 또는 알돌-탈수 생성물의 형성을 촉진하는 이의 일부분 (예를 들어, 도메인, 아미노산 잔기의 세트 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있음) 등)과 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1 및 5-8로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1 및 5-8로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현되는 하나 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되는 하나 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법은 2-케토 카르복실산을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 2-케토 카르복실산을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 EC 번호 4.1.1.1; EC 번호 4.1.1.2; EC 번호 4.1.1.3; EC 번호 4.1.1.4; EC 번호 4.1.1.5; EC 번호 4.1.1.6; EC 번호 4.1.1.7; EC 번호 4.1.1.11; EC 번호 4.1.1.12; EC 번호 4.1.1.15; EC 번호 4.1.1.16; EC 번호 4.1.1.17; EC 번호 4.1.1.18; EC 번호 4.1.1.19; EC 번호 4.1.1.20; EC 번호 4.1.1.34; EC 번호 4.1.1.35; EC 번호 4.1.1.40; EC 번호 4.1.1.54; EC 번호 4.1.1.56; EC 번호 4.1.1.71; EC 번호 4.1.1.72; EC 번호 4.1.1.73; EC 번호 4.1.1.74; EC 번호 4.1.1.75; 또는 EC 번호 4.1.1.77 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.61을 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. NP_417279.1, NP_349892.1, NP_349891.1, BAB12273.1, L21902.1, Q94B07, AAB03015.1, NP_014032.1, NP_ 013892.1, NP_015019.1, NP_010996.2, ABX39192.1, XP_001210625.1, ABO67118, ABO68223, BAE77068.1, 또는 CAA47743.1 하에 확인되는 효소의 그룹으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. NP_417279.1, NP_349892.1, NP_349891.1, BAB12273.1, L21902.1, Q94B07, AAB03015.1, NP_014032.1, NP_ 013892.1, NP_015019.1, NP_010996.2, ABX39192.1, XP_001210625.1, ABO67118, ABO68223, BAE77068.1, 또는 CAA47743.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 Uniprot ID No. A0A286PH18 하에 확인되는 효소이고; 퀴논 옥시도리덕타제는 Uniprot ID No. P28304 하에 확인되는 효소이고; 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4 하에 확인되는 효소이고; 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 효소이고; 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 효소이고; 2-케토-산-데카르복실라제는 SEQ ID NO:83의 서열을 포함하는 효소이고; 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제, 퀴논 옥시도리덕타제, 2-케토-산-데카르복실라제, 및 1차 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 1,5-펜탄디올을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 EC 번호 1.2.99.6을 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 EC 번호 1.1.1을 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소이고; 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID Nos D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소이고; 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법은 1,6-헥산디올을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 1,6-헥산디올을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해서 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법은 6-히드록시-헥사노에이트를 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 6-히드록시-헥사노에이트를 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.258을 갖는 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 EC 번호 1.2.1.63을 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC6409 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 Uniprot ID No. Q7WVD0 또는 Q84H78 하에 확인되는 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 Uniprot ID No. Q9R2F4 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 Uniprot ID No. Q7WVD0 또는 Q84H78 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 Uniprot ID No. Q9R2F4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 확인된 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 확인된 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 아디프산을 제조하기 위한 방법은 아디프산을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 아디프산을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다. 일부 구현예에서,
Figure pct00013
는 3-히드록시-프로파날이다. 일부 구현예에서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 알돌라제 히드라타제 효소를 코딩하는 제1 외생성 핵산을 포함하는 재조합 미생물 유기체를 제공하고, 여기서 재조합 미생물 유기체는 야생형 또는 미변형의 동일 미생물 유기체와 비교하여 퀴논 증가된 양의 옥시도리덕타제를 발현하도록 추가로 변형되고, 임의로 미생물 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 클로스트리듐 (clostridium) 종, 또는 이. 콜라이 (E. coli)이다. 일부 구현예에서, 유기체는 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 제2 외생성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동시키는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 대안적으로, 제1 및 제2 핵산은 동일 프로모터 조절 엘리먼트의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 프로모터 또는 인핸서로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는다. 일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각이 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각이 동일 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각이 그들 자신의 별도 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시킬 수 있다:
Figure pct00014
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다. 일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 생성시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 탄소원으로부터 피루베이트의 생성을 개선시키도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 탄소원은 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 재조합 미생물 유기체를 포함하는 배양물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 미생물 유기체의 개체군을 제공한다. 일부 구현예에서, 개체군은 실질적으로 균질하다.
다른 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 개체군을 포함하는 배양물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 외생성 핵산의 발현을 촉진하는 적합한 조건 하에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 개체군 또는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 제조하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 외생성 핵산은 야생형 또는 미변형 대응 미생물 유기체와 비교하여 과발현된다. 일부 구현예에서, 방법은 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 배양물 또는 미생물 유기체로부터 단리시키는 단계를 더 포함한다.
도 1 은 예로서 피루베이트 및 알데히드로부터 2-케토 카르복실산의 생성을 위한 2-효소 생합성 경로를 도시한다. 알돌-탈수 생성물 (예를 들어, 본 명세서에 기술될 알돌 축합 생성물)은 이론으로 국한하려는 의도없이, 도시된 바와 같은 단계 1 및 2를 통해서, 단일 효소 (예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 예컨대 히드라타제-알돌라제 (일부 구현예에서, Ads-Hyd라고 함))에 의해 촉매되는 과정으로부터 생성될 수 있다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 예시된 알돌 축합 생성물 중 이중 결합은 E 또는 Z 로서 존재할 수 있다. 많은 구현예에서, 예시된 바와 같은 단계 3은 예를 들어 퀴논의 환원을 위해 NADH 및/또는 NADPH를 이용하는 EC 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)에 속하는 하나인, 옥시도리덕타제에 의해 촉매될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 다양한 알데히드가 이용될 수 있다. 예를 들어, 예시된 알데히드에서, 일부 구현예에서, R은 H, CH3, CH2CH3, OH, CH2OH, 또는 CH2CH2OH이다.
도 2 는 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (6H2KH) 중간체를 통한 1,5-펜탄디올의 생성을 위한 생합성 경로를 도시한다. 본 명세서에서 사용되는, 3HPA는 3-히드록시-프로파날을 지칭하고; 6H4H2KH는 4,6-디히드록시-2-케토-헥사노에이트를 지칭하고; 6H3(E)2KH는 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥세노에이트를 지칭하고; 5HPeA는 5-히드록시 펜타날을 지칭한다. NADH는 예시된 목적을 위한 경로의 많은 환원 단계를 위한 보조인자로서 도시된다. NADPH 또는 NADH는 보조인자일 수 있다.
도 3 은 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (6H2KH) 중간체를 통한 1,6-헥산디올의 생성을 위한 생합성 경로를 도시한다. 본 명세서에서 사용되는, 3HPA는 3-히드록시-프로파날을 지칭하고; 6H4H2KH는 4,6-디히드록시-2-케토-헥사노에이트를 지칭하고; 6H3(E)2KH는 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥세노에이트를 지칭하고; 6H2HH는 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 지칭하고; 6HH-CoA는 6-히드록시-헥사노일-CoA를 지칭하고; 6HH는 6-히드록시 헥사노에이트를 지칭하고; 6H2HH-CoA는 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 지칭하고; 6HHA는 6-히드록시 헥사날을 지칭한다. NADPH 또는 NADH는 보조인자일 수 있다. 단계 5 및 8은 단일 CoA-트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매된다. 6HH-CoA는 단계 5 반응을 위한 도너로서 그리고 6H2HH는 예시적인 목적을 위한 억셉터로서 도시된다. 다른 CoA-에스테르 또는 카르복실산은 생체 내에서 이러한 효소에 대한 도너 및 억셉터로서 제공될 수 있다.
도 4 는 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (6H2KH) 중간체를 통한 6-히드록시 헥사노에이트의 생성을 위한 생합성 경로를 도시한다. 본 명세서에서 사용되는, 3HPA는 3-히드록시-프로파날을 지칭하고; 6H4H2KH는 4,6-디히드록시-2-케토-헥사노에이트를 지칭하고; 6H3(E)2KH는 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥세노에이트를 지칭하고; 6H2HH는 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 지칭하고; 6HH-CoA는 6-히드록시-헥사노일-CoA를 지칭하고; 6HH는 6-히드록시 헥사노에이트를 지칭하고; 6H2HH-CoA는 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 지칭한다. NADPH 또는 NADH는 보조인자일 수 있다. 단계 5 및 8은 단일 CoA-트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매된다. 6HH-CoA는 단계 5 반응을 위한 도너로서 그리고 6H2HH는 예시적인 목적을 위한 억셉터로서 도시된다. 다른 CoA-에스테르 또는 카르복실산은 생체 내에서 이 효소에 대한 도너 및 억셉터로서 제공될 수 있다.
도 5 는 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (6H2KH) 중간체를 통한 아디프산의 생성을 위한 생합성 경로를 도시한다. 본 명세서에서 사용되는, 3HPA는 3-히드록시-프로파날을 지칭하고; 6H4H2KH는 4,6-디히드록시-2-케토-헥사노에이트를 지칭하고; 6H3(E)2KH는 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥세노에이트를 지칭하고; 6H2HH는 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 지칭하고; 6HH-CoA는 6-히드록시-헥사노일-CoA를 지칭하고; 6HH는 6-히드록시 헥사노에이트를 지칭하고; 6H2HH-CoA는 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 지칭하고; 6KHA는 6-옥소-헥사노에이트를 지칭한다. NADPH 또는 NADH는 보조인자일 수 있다. 단계 5 및 8은 단일 CoA-트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매된다. 6HH-CoA는 단계 5 반응을 위한 도너로서 그리고 6H2HH는 예시적인 목적을 위한 억셉터로서 도시된다. 다른 CoA-에스테르 또는 카르복실산은 생체내에서 이러한 효소에 대한 도너 및 억셉터로서 제공될 수 있다.
도 6 은 보조인자 NADH 및 NADPH를 사용하여 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥세노에이트를 6-히드록시-2-케토-헥세노에이트로 환원을 위한 퀴논 옥시도리덕타제-1 (Qor-1)의 활성을 도시한다.
정의
본 명세서에서 사용되는, 일정 용어는 하기에 정의된 의미를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 표시하지 않으면 단수 및 다수 참조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 구성요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지는 않는다는 것을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 조성물 또는 방법에 임의의 본질적으로 중요한 다른 구성요소를 배제한다는 것을 의미할 수 있다. "이루어지는"은 실질적 방법 단계 및 청구된 조성물에 대한 다른 성분의 미량 초과의 구성요소를 배제하는 것을 의미할 수 있다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 양태는 본 개시의 범주 내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물은 추가 단계 및 성분을 포괄할 수 있거나 (포함하는) 또는 대안적으로 중요하지 않은 단계 및 조성물을 포괄할 수 있거나 (본질적으로 이루어지는) 또는 대안적으로, 오직 명시된 방법 단계 또는 조성물을 의도 (이루어지는)하고자 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드"는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌-탈수 생성물의 합성에 관여되는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌라제 폴리펩티드, 히드라타제, 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드 (예를 들어, 히드라타제-알돌라제)일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드 (예를 들어, 히드라타제-알돌라제)일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 자연계, 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 자연계에서 발견되는 기준 알돌-탈수 생합성 폴리펩티드)에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생합성 폴리펩티드는 적절한 기준 알돌-탈수 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 자연계에서 발견되고/되거나 본 명세서 (예를 들어, 하나 이상의 관련 표 (예를 들어, 표 1 및 5-8))에서 표시되는 바와 같음) 또는 이의 일부분 (예를 들어, 관련 반응을 촉매하는 부분 (예를 들어, 도메인 (예를 들어, 관련 촉매 도메인) 및/또는 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있는) 아미노산 잔기의 세트)과 특징적 서열 엘리먼트 및/또는 전체 동일성 백분율을 공유한다.
본 명세서에서 사용되는, "알돌-탈수 생성물"은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기에 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물을 의미한다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 화학식 P-2의 화합물 또는 이의 염이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "알돌 생성물"은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기의 베타-탄소에 부착된 히드록실 기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 알돌 반응의 생성물이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 화학식 P-1의 구조 또는 이의 염을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "알돌 생성물 생합성 폴리펩티드"는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌 생성물의 합성에 관여하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌라제 폴리펩티드, 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드 (예를 들어, 히드라타제-알돌라제)일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌라제 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 자연계, 예를 들어 미생물 (예를 들어, 자연계에서 발견되는 기준 알돌 생합성 폴리펩티드)에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로 또는 추가로 일부 구현예에서, 알돌 생합성 폴리펩티드는 적절한 기준 알돌 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 자연계에서 발견되고/되거나 본 명세서 (예를 들어, 하나 이상의 관련 표)에서 표시되는 바와 같음) 또는 이의 일부분 (예를 들어, 관련 반응을 촉매하는 부분 (예를 들어, 도메인 (예를 들어, 관련 촉매 도메인) 및/또는 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있는) 아미노산 잔기의 세트)과 특징적 서열 엘리먼트 및/또는 전체 동일성 백분율을 공유한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드"는 본 명세서에 기술된 바와 같이 이중 결합의 단일 결합으로의 전환 (및 알켄 환원 생성물의 형성)에 관여하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 퀴논 옥시도리덕타제일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 자연계, 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 자연계에서 발견되는 기준 알켄 환원 생합성 폴리펩티드)에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 알돌 생합성 폴리펩티드는 적절한 기준 알돌 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 자연계에서 발견되고/되거나 본 명세서 (예를 들어, 하나 이상의 관련 표)에서 표시되는 바와 같음) 또는 이의 일부분 (예를 들어, 관련 반응을 촉매하는 부분 (예를 들어, 도메인 (예를 들어, 관련 촉매 도메인) 및/또는 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있는) 아미노산 잔기의 세트)과 특징적 서열 엘리먼트 및/또는 전체 동일성 백분율을 공유한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "지방족"은 완전 포화되거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄 (즉, 미분지) 또는 분지쇄, 치환 또는 미치환 탄화수소 사슬, 또는 완전 포화되거나 또는 하나 이상의 불포화 단위 (방향족이 아님)를 함유하는 치환 또는 미치환 단환식, 이환식, 또는 다환식 탄화수소 고리, 또는 이의 조합을 의미한다. 일부 구현예에서, 지방족 기는 1-50 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 지방족 기는 1-20 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-10 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-9 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-8 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-7 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-6 지방족 탄소 원자를 함유한다. 여전히 다른 구현예에서, 지방족 기는 1-5 지방족 탄소 원자를 함유하고, 또 다른 구현예에서, 지방족 기는 1, 2, 3, 또는 4 지방족 탄소 원자를 함유한다. 적합한 지방족 기는 선형 또는 분지형, 치환 또는 미치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 기 및 이의 하이브리드 예컨대 (시클로알킬)알킬, (시클로알케닐)알킬 또는 (시클로알킬)알케닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "알킬"은 당분야에서의 이의 통상의 의미이고, 직쇄 알킬 기, 분지쇄 알킬 기, 시클로알킬 (지환족) 기, 알킬 치환된 시클로알킬 기, 및 시클로알킬 치환된 알킬 기를 포함하는, 포화 지방족 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알킬은 1-100 탄소 원자를 갖는다. 일정 구현예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 이의 골격에 약 1-20 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄 경우 C1-C20, 분지쇄 경우 C2-C20), 및 대안적으로, 약 1-10을 갖는다. 일부 구현예에서, 시클로알킬 고리는 그들 고리 구조에 약 3-10 탄소 원자를 가지고 이러한 고리는 단환식, 이환식, 또는 다환식이고, 대안적으로, 고리 구조에 약 5, 6 또는 7 탄소를 갖는다. 일부 구현예에서, 알킬 기는 저급 알킬 기일 수 있고, 저급 알킬 기는 1-4 탄소 원자를 포함한다 (예를 들어, 직쇄 저급 알킬 경우 C1-C4).
본 명세서에서 사용되는, "아르알킬", "아르알콕시", 또는 "아릴옥시알킬"에서 처럼 더 큰 모이어트의 일부로서 또는 단독으로 사용되는, 용어 "아릴"은 총 5원 내지 30원 고리 구성원을 갖는 단환식, 이환식 또는 다환식 고리계를 지칭하고, 고리계 중 적어도 하나의 고리는 방향족이다. 일부 구현예에서, 아릴 기는 총 5원 내지 14원 고리 구성원을 갖는 단환식, 이환식 또는 다환식 고리계이고, 고리계 중 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 고리계 중 각각의 고리는 3원 내지 7원 고리 구성원을 함유한다. 일부 구현예에서, 아릴 기는 바이아릴 기이다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시의 일정 구현예에서, "아릴"은 하나 이상의 치환기를 보유할 수 있는, 제한없이, 페닐, 바이페닐, 나프틸, 바이나프틸, 안트라실 등을 포함하는 방향족 고리계를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아릴"의 범주 내에는 또한 방향족 고리가 하나 이상의 비-방향족 고리, 예컨대 인다닐, 프탈이미딜, 나프티미딜, 펜안트리디닐, 또는 테트라히드로나프틸 등에 융합된 기가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "시클로지방족", "카르보시클", "카르보시클릴", "카르보시클릭 라디칼", 및 "카르보시클릭 고리"는 상호교환적으로 사용되고, 달리 명시하지 않으면, 3원 내지 30원 고리 구성원을 갖는, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 포화 또는 부분 불포화되나, 비-방향족, 환형 지방족 단환식, 이환식, 또는 다환식 고리계를 지칭한다. 시클로지방족 기는 제한없이, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로헵테닐, 시클로옥틸, 시클로옥테닐, 노르보르닐, 아다만틸, 및 시클로옥타디에닐을 포함한다. 일부 구현예에서, 시클로지방족 기는 3-6 탄소를 갖는다. 일부 구현예에서, 시클로지방족 기는 포화되고 시클로알킬이다. 용어 "시클로지방족"은 또한 하나 이상의 방향족 또는 비방향족 고리에 융합된 지방족 고리, 예컨대 데카히드로나프틸 또는 테트라히드로나프틸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로지방족 기는 이환식이다. 일부 구현예에서, 시클로지방족 기는 삼환식이다. 일부 구현예에서, 시클로지방족 기는 다환식이다. 일부 구현예에서, "시클로지방족"은 완전 포화되거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만, 방향족은 아니고, 분자의 나머지에 단일 부착점을 갖는 C3-C6 단환식 탄화수소, 또는 C8-C10 이환식 또는 다환식 탄화수소, 또는 완전 포화되거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만, 방향족은 아니고, 분자의 나머지에 단일 부착점을 갖는, C9-C16 다환식 탄화수소를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "헤테로지방족"은 당분야에서 제공되는 이의 통상의 의미이고, 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 이종원자 (예를 들어, 산소, 질소, 황, 규소, 인 등)로 독립적으로 치환된 본 명세서에 기술된 바와 같은 지방족 기를 지칭한다. 일부 구현예에서, C, CH, CH2, 및 CH3 으로부터 선택되는 하나 이상의 단위는 하나 이상의 이종원자 (이의 산화 및/또는 치환된 형태 포함)로 독립적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로지방족 기는 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, 헤테로지방족 기는 헤테로알케닐이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "헤테로알킬"은 당분야에서 제공되는 이의 통상의 의미이고 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 이종원자 (예를 들어, 산소, 질소, 황, 규소, 인 등)로 독립적으로 치환된 본 명세서에 기술된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 헤테로알킬 기의 예는 알콕시, 폴리(에틸렌 글리콜)-, 알킬-치환된 아미노, 테트라히드로퓨라닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, 더 큰 모이어티, 예를 들어, "헤테로아르알킬", 또는 "헤테로아르알콕시"의 일부로서 또는 단독으로 사용되는, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 총 5원 내지 30원 고리 구성원을 갖는 단환식, 이환식 또는 다환화학식 고리계를 지칭하고, 고리계 중 적어도 하나의 고리는 방향족이고 적어도 하나의 방향족 고리 원자는 이종원자이다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴 기는 5 내지 10 고리 원자 (즉, 단환식, 이환식 또는 다환식), 일부 구현예에서 5, 6, 9, 또는 10 고리 원자를 갖는 기이다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴 기는 6, 10, 또는 14 π 전자를 환식 배열 중에 공유하고; 탄소 원자이외에도, 1 내지 5 이종원자를 갖는다. 헤테로아릴 기는 제한없이, 티에닐, 퓨라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 푸리닐, 나프티리디닐, 및 프테리디닐을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 헤테로바이아릴 기, 예컨대 바이피리딜 등이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 고리는 하나 이상의 아릴, 시클로지방족, 또는 헤테로시클릴 고리에 융합된 기를 포함하고, 라디칼 또는 부착점은 헤테로방향족 고리 상에 있다. 비제한적인 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조퓨라닐, 디벤조퓨라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카르바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 및 피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-3(4H)-온을 포함한다. 헤테로아릴 기는 단환식, 이환식 또는 다환식일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기", 또는 "헤테로방향족"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 임의의 이들 용어는 임의 치환되는 고리를 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하고, 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의 치환된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "이종원자"는 탄소 또는 수소가 아닌 원자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이종원자는 붕소, 산소, 황, 질소, 인, 또는 규소 (질소, 황, 인, 또는 규소의 산화된 형태; 질소 (예를 들어, 4차화된 형태, 이미늄 기 등에서와 같은 형태 등), 인, 황, 산소의 하전된 형태 등 포함)이다. 일부 구현예에서, 이종원자는 산소, 황 또는 질소이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "헤테로시클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릭 라디칼", 및 "헤테로시클릭 고리"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 포화 또는 부분 불포화되고 하나 이상의 이종원자 고리 원자를 갖는 단환식, 이환화학식 또는 다환식 고리 모이어티 (예를 들어, 3-30원)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 포화 또는 부분 불포화되고, 탄소 원자 이외에, 하나 이상, 바람직하게 1 내지 4의, 상기 정의된 바와 같은, 이종원자를 갖는 안정한 5-원 내지 7-원 단환식 또는 7-원 내지 10-원 이환식 헤테로시클릭 모이어티이다. 헤테로시클의 고리 원자를 참조하여 사용될 때, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 예로서, 산소, 황 및 질소로부터 선택되는 0-3 이종원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 고리에서, 질소는 N (3,4-디히드로-2H-피롤릴에서 처럼), NH (피롤리디닐에서 처럼), 또는 +NR (N-치환된 피롤리디닐에서 처럼)일 수 있다. 헤테로시클릭 고리는 임의의 이종원자 또는 탄소 원자에서 이의 현수기에 부착되어서 안정한 구조를 생성시킬 수 있고 임의의 고리 원자는 임의 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화된 헤테로시클릭 라디칼의 예는 제한없이, 테트라히드로퓨라닐, 테트라히드로티에닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴뉴클리디닐을 포함한다. 용어 "헤테로시클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릴 고리", "헤테로시클릭 기", "헤테로시클릭 모이어티" 및 "헤테로시클릭 라디칼"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 또한 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴, 또는 시클로지방족 고리, 예컨대 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 펜안트리디닐, 또는 테트라히드로퀴놀리닐에 융합된 기를 포함한다. 헤테로시클릴 기는 단환식, 이환식 또는 다환식일 수 있다. 용어 "헤테로시클릴알킬"은 헤테로시클릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하고, 알킬 및 헤테로시클릴 부분은 독립적으로 임의 치환된다.
임의 치환된: 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 개시의 화학적 독립체, 예를 들어, 다양한 화합물은 임의 치환 및/또는 치환된 모이어티를 함유할 수 있다. 일반적으로, 용어 "치환된"은 지정된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환기로 치환된 것을 의미한다. 달리 표시하지 않으면, "임의 치환된" 기는 그 기의 각각의 치환가능한 위치에서 적합한 치환기를 가질 수 있고, 임의의 소정 구조 중 하나 초과의 위치가 명시된 기로부터 선택되는 하나 초과의 치환기로 치환될 수 있을 경우에, 치환기는 모든 위치에서 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 임의 치환된 기는 치환된다. 일부 구현예에서, 임의 치환된 기는 미치환된다. 본 개시에서 고려되는 치환기의 조합은 바람직하게 적합하거나 또는 화학적으로 실현가능한 화합물의 형성을 발생시키는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "안정한"은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 목적을 위해 그들 생성, 검출, 및, 일정 구현예에서, 그들 회수, 정제, 및 사용을 가능하게 하는 조건을 가할 때 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 의미한다.
치환가능한 원자, 예를 들어 적합한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4R○; -(CH2)0-4OR○; -O(CH2)0-4R○, -O-(CH2)0-4C(O)OR○; -(CH2)0-4CH(OR○)2; R○로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4Ph; R○로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R○로 치환될 수 있는, -CH=CHPh; R○로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R○)2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)R○; -N(R○)C(S)R○; -(CH2)0-4N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)C(S)NR○ 2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○; -N(R○)N(R○)C(O)R○; -N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)N(R○)C(O)OR○; -(CH2)0-4C(O)R○; -C(S)R○; -(CH2)0-4C(O)OR○; -(CH2)0-4C(O)SR○; -(CH2)0-4C(O)OSiR○ 3; -(CH2)0-4OC(O)R○; -OC(O)(CH2)0-4SR○, -SC(S)SR○; -(CH2)0-4SC(O)R○; -(CH2)0-4C(O)NR○ 2; -C(S)NR○ 2; -C(S)SR○; -(CH2)0-4OC(O)NR○ 2; -C(O)N(OR○)R○; -C(O)C(O)R○; -C(O)CH2C(O)R○; -C(NOR○)R○; -(CH2)0-4SSR○; -(CH2)0-4S(O)2R○; -(CH2)0-4S(O)2OR○; -(CH2)0-4OS(O)2R○; -S(O)2NR○ 2; -(CH2)0-4S(O)R○; -N(R○)S(O)2NR○ 2; -N(R○)S(O)2R○; -N(OR○)R○; -C(NH)NR○ 2; -Si(R○)3; -OSi(R○)3; -B(R○)2; -OB(R○)2; -OB(OR○)2; -P(R○)2; -P(OR○)2; -P(R○)(OR○); -OP(R○)2; -OP(OR○)2; -OP(R○)(OR○); -P(O)(R○)2; -P(O)(OR○)2; -OP(O)(R○)2; -OP(O)(OR○)2; -OP(O)(OR○)(SR○); -SP(O)(R○)2; -SP(O)(OR○)2; -N(R○)P(O)(R○)2; -N(R○)P(O)(OR○)2; -P(R○)2[B(R○)3]; -P(OR○)2[B(R○)3]; -OP(R○)2[B(R○)3]; -OP(OR○)2[B(R○)3]; -(C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌)O-N(R○)2; 또는 -(C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌)C(O)O-N(R○)2 이고, 상기 화학식에서, 각각의 R○는 본 명세서에 정의된 바와 같이 치환될 수 있고 독립적으로 수소, C1-20 지방족, 질소, 산소, 황, 규소 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 1-5 이종원자를 갖는 C1-20 헤테로지방족, -CH2-(C6-14 아릴), -O(CH2)0-1(C6-14 아릴), -CH2-(5-14원 헤테로아릴 고리), 질소, 산소, 황, 규소 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 0-5 이종원자를 갖는, 5-20원, 단환식, 이환식, 또는 다환식, 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기 정의와 무관하게, R○의 2개 독립 존재는 그들의 개재 원자(들)와 함께, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는, 질소, 산소, 황, 규소, 및 인으로부터 독립적으로 선택되는 0-5 이종원자를 갖는 5-20원, 단환식, 이환식, 또는 다환식, 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리를 형성한다.
R°(또는 그들의 개재 원자와 함께 R○의 2개 독립 존재에 의해 형성되는 고리) 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0-2CH(OR●)2; -O(haloR●), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR●, -(CH2)0-2SR●, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR● , -(C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌)C(O)ORl, 또는 -SSR● 이고, 각각의 R● 은 미치환되거나 또는 "할로"가 선행되는 경우에 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 및 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된다. R○ 의 포화된 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 =O 및 =S를 포함한다.
예를 들어, 적합한 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 독립적으로 하기와 같다: =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 또는 -S(C(R* 2))2-3S-, 여기서 R* 의 각각의 독립 존재는 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는, C1-6　지방족, 및 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 미치환된 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "임의 치환된" 기의 인접한 치환가능한 탄소에 결합되는 적합한 2가 치환기는 -O(CR* 2)2-3O-를 포함하고, 여기서 R* 의 각각의 독립 존재는 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6　지방족, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 미치환된 5-6원 포화, 부분 불포화, 및 아릴 고리로부터 선택된다.
R* 의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2 이고, 여기서 각각의 R● 은 미치환되거나 또는 "할로"가 선행되는 경우에 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
일부 구현예에서, 치환가능한 질소 상에서 적합한 치환기는 독립적으로 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R†;이고, 여기서 각각의 R† 는 독립적으로 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 미치환된 -OPh, 또는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 미치환된 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기 정의와 무관하게, R† 의 2개 독립 존재는 그들의 개재 원자(들)와 함께 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 미치환된 3-12원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 단환식 또는 이환식 고리를 형성한다.
R† 의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -Rl, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2 이고, 여기서 각각의 R● 는 미치환되거나 또는 "할로"가 선행되는 경우에 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 및 황으로 독립적으로 선택되는 0-4 이종원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "부분 불포화"는 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 지칭한다. 용어 "부분 불포화"는 다수의 불포화 부위를 갖는 고리를 포괄하고자 하지만, 본 명세서에 정의되는 바와 같이, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하고자 의도하지 않는다.
"야생형"은 자연계에 존재하는 대로의 세포, 조성물, 조직, 또는 다른 생물학적 물질을 정의한다.
일부 구현예에서, 3-히드록시-프로파날 및 피루베이트는 하나 이상의 글리세롤, C5 당, C6 당, 포스포글리세레이트, 다른 탄소원, 해당 경로의 중간체, 및 이의 조합으로부터 제조된다. 일부 구현예에서, C5 당은 하나 이상의 자일로스, 자일룰로스, 리불로스, 아라비노스, 릭소스, 및 리보스를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어지고, C6 당은 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 프룩토스, 사이코스, 솔보스, 및 타가토스를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 다른 탄소원은 미생물에 대한 탄소원으로서 적합한 공급원료이고, 여기서 공급원료는 하나 이상의 아미노산, 지질, 옥수수대, 억새, 도시 폐기물, 에너지 수수, 사탕수수, 바가스, 전분 스트림, 덱스트로스 스트림, 포르메이트, 메탄올, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "C5 당"은 5개 탄소를 함유하는 당 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "C6 당"은 6개 탄소를 함유하는 당 분자를 지칭한다.
일부 구현예에서, 용어 "알돌 부가"는 피루베이트 분자가 CN+3 4-히드록시-2-케토-카르복실산 중간체를 생성시키기 위해 CN 알데히드의 알데히드 작용기와 반응하는 해당 에놀 또는 에놀레이트 이온 또는 시프 염기 또는 에나민을 형성하는 화학 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, CN 알데히드는 3-히드록시-프로파날이고 CN+3 4-히드록시-2-케토-카르복실산 중간체는 4,6-디히드록시-2-케토-헥산산이다.
일부 구현예에서, 용어 "알돌 축합"은 CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산을 생성시키기 위해 CN 알데히드의 알데히드 작용기와 반응하는 해당 에놀 또는 에놀레이트 이온 또는 시프 염기 또는 에나민을 형성하는 화학 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, CN 알데히드는 3-히드록시-프로파날이고 CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산은 6-히드록시-3,4-데히드로-2-케토-헥산산이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "용액"은 용매 및 용질, 예컨대 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 출발 물질을 함유하는 액상 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용매는 물이다. 일부 구현예에서, 용매는 유기 용매이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "효소 단계" 또는 "효소 반응"은 바람직한 효소 반응을 촉진하도록 선택된 효소에 의해 촉매되는 분자 반응을 지칭한다. 효소는 대형 생물학적 분자 및 고도의 선택적 촉매이다. 대부분의 효소는 단백질이지만, 일부 촉매성 RNA 분자가 확인되었다.
본 출원 전반에서, 효소 단계는 "단계 1", "단계 2" 등으로서 표시될 수 있고 이들 단계를 특이적으로 촉매하는 효소는 각각 "1", "2" 등으로 표시된다. 이러한 효소는 또한 "반응 특이적 효소"라고도 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "CoA" 또는 "조효소 A"는 그의 존재가 활성 효소 시스템을 형성하는 많은 효소의 활성에 요구되는 유기 보조인자 또는 보결분자단 (효소의 비단백질 부분)을 의미하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는, 배양물 또는 성장 조건에 대해서 사용될 때 용어 "실질적으로 혐기성"은 산소의 양이 액상 배지 중 용존 산소에 대한 포화의 약 10% 미만인 것을 의미하고자 한다. 이 용어는 또한 약 1% 미만의 산소 대기가 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀봉 챔버를 포함하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는, 본 개시의 미생물 유기체 또는 미생물에 대해서 사용될 때 용어 "비-천연 발생" 또는 "비-천연"은 미생물 유기체가 참조된 종의 야생형 균주를 포함하여, 참조된 종의 천연 발생 균주에서 정상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 유전자 변경을 갖는다는 것을 의미하고자 한다. 유전자 변경은 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입시키는 변형, 다른 핵산 부가, 핵산 결실, 및/또는 미생물 유기체의 유전자 물질의 다른 기능적 파괴를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형은 예를 들어, 참조된 종에 대한 이종성, 동종성 또는 이종성 및 동종성 폴리펩티드 둘 모두에 대한 코딩 영역 및 이의 기능적 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 변형은 예를 들어, 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키지 않는 비-코딩 조절 영역을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "외생성"은 참조된 분자 또는 참조된 활성이 숙주 미생물 유기체로 도입되는 것을 의미하고자 한다. 분자는 예를 들어, 코딩 핵산을 숙주 유전자 물질에 도입시켜서, 예컨대 숙주 염색체 또는 비-염색체 유전자 물질 예컨대 플라스미드에 통합시켜서, 도입될 수 있다. 그러므로, 코딩 핵산의 발현에 대해서 사용되는 이 용어는 발현가능한 형태의 코딩 핵산의 미생물 유기체로의 도입을 지칭한다. 효소 활성에 대해서 사용될 때, 이 용어는 숙주 기준 유기체에 도입되는 활성을 지칭한다. 공급원은 예를 들어, 숙주 미생물 유기체로 도입 후 참조된 활성을 발현하는 동종성 또는 이종성 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내생성"은 야생형 숙주에서 본래 또는 자연적으로 존재하는 참조된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 코딩 핵산의 발현에 대해서 사용될 때 이 용어는 야생형 미생물 내에 함유되는 코딩 핵산의 발현을 지칭한다.
용어 "이종성"은 참조된 종 이외의 공급원으로부터 유래되는 분자 또는 활성을 의미하는 반면 본 문맥에서 사용될 때 "동종성"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 따라서, 코딩 핵산의 외생성 발현은 이종성 또는 동종성 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 모두를 이용할 수 있다.
하나 초과의 외생성 핵산이 유기체 미생물에 포함될 때, 하나 초과의 외생성 핵산은 상기 논의된 바와 같은, 참조된 코딩 핵산 또는 효소 활성을 지칭한다는 것을 이해한다. 하나 초과의 외생성 핵산은 별도 핵산 분자, 폴리시스트론 핵산 분자, 또는 이의 조합 상에서 숙주 미생물 유기체로 도입될 수 있고, 여전히 하나 초과의 외생성 핵산으로서 간주될 수 있다는 것을 본 명세서에 개시된 바와 같이, 더욱 이해한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 미생물 유기체는 바람직한 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 둘 이상의 외생성 핵산을 발현하도록 조작될 수 있다. 바람직한 활성을 코딩하는 2종의 외생성 핵산이 숙주 미생물 유기체로 도입되는 경우에, 2종의 외생성 핵산은 단일 핵산으로서 도입될 수 있고, 예를 들어, 단일 플라스미드 상에서, 별도 플라스미드 상에서, 단일 부위 또는 다수 부위에서 숙주 염색체에 통합될 수 있고, 여전히 2종의 외생성 핵산으로서 간주될 수 있다는 것을 이해한다. 유사하게, 둘 초과의 외생성 핵산은 숙주 유기체로 임의의 바람직한 조합으로 도입될 수 있고, 예를 들어, 단일 플라스미드 상에, 별도 플라스미드 상에서, 단일 부위 또는 다수 부위에서 숙주 염색체로 통합될 수 있으며, 여전히 둘 이상의 외생성 핵산으로서, 예를 들어, 3종의 외생성 핵산으로서 간주될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 참조된 외생성 핵산 또는 효소 활성의 수는 코딩 핵산의 수 또는 효소 활성의 수를 지칭하나, 숙주 유기체로 도입된 별도 핵산의 수를 지칭하는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 코딩 핵산의 외생성 발현이 적용된다. 외생성 발현은 숙주에 대해 발현 및/또는 조절 엘리먼트를 맞춤 제작하는 능력 및 사용자에 의해 제어되는 바람직한 발현 수준을 획득하기 위한 응용성을 부여한다. 그러나, 내생성 발현은 또한 다른 구현예에서, 예컨대 유도성 프로모터 또는 다른 조절 엘리먼트에 연결될 때 유전자 프로모터의 유도 또는 음성 조절 이펙터를 제거하여 이용될 수 있다. 따라서, 천연 발생 유도성 프로모터를 갖는 내생성 유전자는 적절한 유도제를 제공하여 상향-조절될 수 있거나, 또는 내생성 유전자의 조절 영역은 유도성 조절 엘리먼트를 유입시키도록 조작될 수 있어서, 바람직한 시간에 내생성 유전자의 증가된 발현의 조절을 허용한다. 유사하게, 유도성 프로모터는 비-천연 발생 미생물 유기체로 도입된 외생성 유전자에 대한 조절 엘리먼트로서 포함될 수 있다.
당업자는 유전자 변경이 적합한 숙주 유기체 예컨대 이. 콜라이 및 그들의 해당 물질대사 반응 또는 바람직한 유전자 물질 예컨대 바람직한 생합성 경로에 대한 유전자에 대한 적합한 공급원 유기체에 대해 기술된다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 광범위하게 다양한 유기체의 완전한 게놈 시퀀싱 및 유전체학 분야의 높은 기술 수준을 고려하면, 당업자는 본 명세서에 제공된 교시 및 지침을 본질적으로 모든 다른 유기체에 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 예시된 이. 콜라이 물질대사 변경은 참조된 종 이외의 종으로부터의 동일하거나 또는 유사한 코딩 핵산을 유입시켜서 다른 종에 쉽게 적용할 수 있다. 이러한 유전자 변경은 예를 들어, 종 상동성, 일반적으로, 특히, 오솔로그, 파라로그 또는 비-오솔로그 유전자 치환의 유전자 변경을 포함한다.
경로 효소를 코딩하는 핵산의 공급원은 예를 들어, 코딩된 유전자 생성물이 참조된 반응을 촉매할 수 있는 임의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종은 제한없이, 고세균 및 진정세균을 포함하는 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물, 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한, 진핵생물을 포함하는, 원핵생물 및 진핵생물 유기체 둘 모두를 포함한다. 이러한 공급원의 예시적인 종은 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 크낙무씨이 (Pseudomonas knackmussii), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 세라티아 프로테아마쿨란스 (Serratia proteamaculans), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) sp. 2065, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus), 아시네토박터 (Acinetobacter) sp. ADP1, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 유박테리움 바르케리 (Eubacterium barkeri), 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스 (Peptostreptococcus asaccharolyticus), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 티로부티리쿰 (Clostridium tyrobutyricum), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum) (무렐라 써모아세티쿰 (Moorella thermoaceticum)), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 수스 스크로파 (Sus scrofa), 플라보박테리움 (Flavobacterium) sp, 아트로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens), 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum), 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 만헤이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 클로스트리듐 융달리이 (Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium 카르복시divorans), 지오바실러스 스테아로써모필루스 (Geobacillus stearothermophilus), 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아크로모박터 데니트리피칸스 (Achromobacter denitrificans), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 해모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 악시다미노코쿠스 퍼멘탄스 (Acidaminococcus fermentans), 클로스트리듐 (Clostridium) sp. M62/1, 푸소박테리움 누클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 을 비롯하여, 본 명세서에 개시되거나 또는 해당 유전자에 대한 공급원 유기체로서 이용가능한 다른 예시적인 종을 포함한다 (실시예 참조). 그러나, 이제 400 초과의 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물, 및 포유동물 게놈에 대해 입수가능한 완전 게놈 서열을 사용하여, 예를 들어, 기지 유전자의 상동성, 오솔로그, 파라로그 및 비-오솔로그 유전자 치환, 및 유기체 간 유전자 변경의 상호교환을 포함한, 관련되거나 또는 먼 종에서 하나 이상의 유전자에 대한, 필수 경로 효소를 코딩하는 유전자의 확인은 통상적이고 당분야에 충분히 공지되어 있다.
오솔로그는 종 분화에 의해서 공통 조상 유전자로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 지칭한다. 보통, 오솔로그는 진화 과정 동안 동일 기능을 보유한다. 오솔로그의 확인은 새롭게 시퀀싱된 게놈에서 유전자 기능의 신뢰할만한 예측에 결정적이다.
파라로그는 게놈 내 중복으로 관련된 유전자를 지칭한다. 오솔로그는 일반적으로 진화 과정에서 동일한 기능을 보유하지만, 파라로그는 이들이 본래의 것과 관련되더라도, 새로운 기능을 진화시킬 수 있다.
비오솔로그 유전자 치환은 상이한 종에서 참조된 유전자 기능을 대체할 수 있는 한 종으로부터의 비오솔로그 유전자이다. 치환은 예를 들어, 상이한 종에서 참조된 기능과 비교된 기원 종에서 실질적으로 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, 비오솔로그 유전자 치환은 참조된 기능을 코딩하는 기지 유전자와 구조적으로 관련된 것으로 확인가능할 수 있지만, 구조적으로 덜 관련있지만 기능적으로 유사한 유전자 및 그들의 해당 유전자 생성물은 그럼에도 불구하고 여전히 본 명세서에서 사용되는 용어의 의미 내에 속하게 될 것이다. 기능적 유사성은 예를 들어, 대체하고자 하는 기능을 코딩하는 유전자와 비교하여 비오솔로그 유전자 생성물의 활성 부위 또는 결합 영역 내에 적어도 일부 구조적 유사성을 요구한다. 그러므로, 비오솔로그 유전자는 예를 들어 파라로그 또는 비관련 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "미생물" 또는 "미생물 유기체" 또는 "미생물들"은 상호교환적으로 사용되고 외생성 또는 재조합 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA의 삽입을 통해서 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 살아있는 생물학적 및 단리된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 지칭한다. 임의의 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 미생물은 핵산의 서열로 형질전환된 이후에 여전히 살아있으면 본 개시에서 사용될 수 있다. 본 개시의 적합한 미생물은 방법에서 적어도 하나의 단계를 촉매할 수 있는 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 구성체를 발현할 수 있다. 미생물은 박테리아, 효모, 진균, 곰팡이, 및 고세균의 군으로부터 선택될 수 있다. 이들은 상업적으로 입수가능하다.
본 명세서에서 사용되는, "진균"은 진균계 내에서 분류되는 임의의 진핵생물 유기체를 지칭한다. 진균계 내 문은 아스코마이코타 (Ascomycota), 바시디오마이코타 (Basidiomycota), 블라스토클라디오마이코타 (Blastocladiomycota), 카이트리디오마이코타 (Chytridiomycota), 글로머로마이코타 (Glomeromycota), 미크로스포리디아 (Microsporidia), 및 네오칼리마스티고마이코타 (Neocallimastigomycota)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "효모"는 (예를 들어, 출아에 의해) 단일-세포 형태로 성장하는 진균을 지칭하는데 반해서, "곰팡이"는 다세포 균사 또는 균사체로 만들어진 필라멘트로 성장하는 진균을 지칭한다 (McGinnis, M.R. and Tyring, S.K. "Introduction to Mycology." Medical Microbiology. 4th ed. Galveston: Univ. of TX Medical Branch at Galveston, 1996).
일부 구현예에서, 미생물은 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 이사트첸키아 (Issatchenkia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 또는 야로위아 (Yarrowia) 종 유래이다.
일부 구현예에서, 미생물은 곰팡이 세포이다. 일부 구현예에서, 곰팡이 숙주 세포는 뉴로스포라 (Neurospora), 트리코더마 (Trichoderma), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리움 (Fusarium), 또는 크리소스포리움 (Chrysosporium) 종 유래이다.
일부 구현예에서, 미생물은 고세균이다. 일부 구현예에서, 적합한 고세균은 아카에오글로부스 (Archaeoglobus), 아에로피룸 (Aeropyrum), 할로박테리움 (Halobacterium), 피로바쿨룸 (Pyrobaculum), 피로코쿠스 (Pyrococcus), 술폴로부스 (Sulfolobus), 메타노코쿠스 (Methanococcus), 메타노스파에라 (Methanosphaera), 메타노피루스 (Methanopyrus), 메타노브레비박터 (Methanobrevibacter), 메타노칼도코쿠스 (Methanocaldococcus), 또는 메타노사르시나 (Methanosarcina) 종 유래이다.
용어 "박테리아"는 원핵생물 유기체의 계 또는 영역 내 임의 미생물을 지칭한다. 박테리아계 또는 영역 내 문은 악시도박테리아 (Acidobacteria), 악티노박테리아 (Actinobacteria), 악티노바실러스 (Actinobacillus), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 아나에로비오스피룰룸 (Anaerobiospirrulum), 아퀴피카에 (Aquificae), 아르마티모나데테스 (Armatimonadetes), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 버크홀데리아 (Burkholderia), 칼디세리카 (Caldiserica), 클라미디아에 (Chlamydiae), 클로로비 (Chlorobi), 클로렐라 (Chlorella), 클로로플렉시 (Chloroflexi), 크리시오게네테스 (Chrysiogenetes), 시트로박터 (Citrobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 시아노박테리아 (Cyanobacteria), 데페리박테레스 (Deferribacteres), 데이노코쿠스-써무스 (Deinococcus-thermus), 딕티오글로미 (Dictyoglomi), 엔테로박터 (Enterobacter), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 피브로박테레스 (Fibrobacteres), 피르미쿠테스 (Firmicutes), 푸소박테리아 (Fusobacteria), 지오바실러스 (Geobacillus), 겜마티모나데테스 (Gemmatimonadetes), 글루코노박터 (Gluconobacter), 할라나에로비움 (Halanaerobium), 클렙시엘라 (Klebsiella), 클루이베라 (Kluyvera), 락토바실러스 (Lactobacillus), 렌티스파에라에 (Lentisphaerae), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 니트로스피라 (Nitrospira), 파스퇴렐라세아에 (Pasteurellaceae), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테오박테리아 (Proteobacteria), 랄스토니아 (Ralstonia), 스키조키트리움 (Schizochytrium), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 시네르기스테테스 (Synergistetes), 테네리쿠테스 (Tenericutes), 써모아나에로박테리움 (Thermoanaerobacterium), 써모데술포박테리아 (Thermodesulfobacteria), 써모토가에 (Thermotogae), 베루코미크로비아 (Verrucomicrobia), 조벨렐라 (Zobellella), 및 자이모모나스 (Zymomonas)를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리아 미생물은 이. 콜라이 세포이다. 일부 구현예에서, 박테리아 미생물은 바실러스 (Bacillus) sp. 세포이다. 바실러스 종의 예는 제한없이, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 미코이데스 (Bacillus mycoides), 및 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)를 포함한다.
본 개시의 방법으로 제조된 카르복실산 화합물은 제한없이, 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 예컨대 소듐, 포타슘, 알칼리토 이온, 예컨대 칼슘, 마그네슘, 또는 알루미늄 이온을 포함한 반대 이온과 염을 형성할 수 있거나; 또는 유기 염기 예컨대 테트라알킬암모늄, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트리메틸아민, N-메틸글루카민 등과 배위결합될 수 있다. 산은 반응 조건 하에 존재하는 반대 이온 또는 유기 염기와 염을 형성할 수 있거나 또는 무기 또는 유기 염기와 반영하여 염으로 전환될 수 있다.
본 명세서의 임의의 카르복실산 함유 화합물은 임의의 이의 염 형태를 포함하여, 임의의 이의 중성 또는 이온화 형태의 화합물을 지칭하기 위해 전반에서 상호교환적으로 사용된, 산 또는 염기를 지칭한다. 특이적 형태는 pH에 의존적일 것임을 당업자는 이해한다.
화합물의 용매화물은 결정 격자 내부에서 용매의 하나 미만, 하나 또는 하나 초과의 분자와 결정화되는 화합물의 고체-형태이다. 용매화물, 예컨대 약학적으로 허용가능한 용매화물을 생성시키는데 사용될 수 있는 용매의 소수 예는 제한없이, 물, C1-C6 알콜 (예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 및 임의 치환될 수 있는) 일반적으로, 테트라히드로퓨란, 아세톤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 아세트산, 포름산, 및 이의 용매 혼합물을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 용매화물을 만드는 것을 보조할 수 있는 다른 이러한 생체적합성 용매는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가로, 다양한 유기 및 무기 산 및 염기는 바람직한 용매화물을 생성시키기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 산 및 염기는 당분야에 공지되어 있다. 용매가 물인 경우에, 용매화물은 수화물이라고 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물의 한 분자는 0.1 내지 5 분자의 용매, 예컨대 0.5 분자의 용매 (반용매화물, 예컨대 반수화물), 1 분자의 용매 (단일용매화물, 예컨대 단일수화물) 및 2 분자의 용매 (2용매화물, 예컨대 이수화물)와의 용매화물을 형성할 수 있다.
몇개의 이성질체 (예를 들어, 시스 및 트랜스 이성질체, R 및 S 이성질체, 또는 이의 조합)가 존재하는 화합물을 언급할 때, 원론적으로 화합물은 본 개시의 방법에서 사용할 수 있는 그 화합물의 모든 가능한 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 시스/트랜스 이성질체를 포함한다.
각 종의 경우에, 그 종에 속하는 임의 세포는 본 개시의 적합한 미생물로 간주된다. 임의 종의 숙주 세포는 자연계로부터 단리된 대로 존재할 수 있거나, 또는 임의 수의 유전자 변형 (예를 들어, 유전자 돌연변이, 결실, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드)을 함유할 수 있다.
용어 "재조합 핵산" 또는 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 본 명세서에서 사용되는 하기 중 적어도 하나가 참인 핵산의 중합체를 지칭한다: (a) 핵산의 서열이 소정 미생물에 대해 외래인 경우 (즉, 자연적으로 발견되지 않음); (b) 서열이 소정 미생물에서 자연적으로 발견될 수 있지만, 비자연적인 (예를 들어, 기대 초과) 양으로 발견될 수 있는 경우; 또는 (c) 핵산의 서열이 자연계에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 하위서열을 함유하는 경우. 예를 들어, (c)의 예와 관련하여, 재조합 핵산 서열은 새로운 기능성 핵산을 만들도록 배열된 미관련 유전자로부터의 둘 이상의 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩티드 또는 단백질 또는 효소는 하나 이상의 발현 벡터의 일부로서 유전자 물질에 의해 코딩될 수 있다. 발현 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드-코딩 핵산을 함유하고, 핵산(들)의 발현을 제어하는 임의의 바람직한 엘리먼트를 비롯하여, 소정 숙주 세포 내부에서 발현 벡터의 복제 및 유지를 가능하게 하는 임의의 엘리먼트를 더 함유할 수 있다. 모든 재조합 핵산은 단일 발현 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 그들은 다수 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은 숙주 유기체에서 기능하는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 본 명세서에 예시된 바와 같은 하나 이상의 경로-코딩 핵산을 포함하도록 구축될 수 있다. 제공되는 미생물 숙주 유기체에서 사용을 위해 적용가능한 발현 벡터는 예를 들어, 벡터를 포함한, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체, 및 숙주 염색체로 안정한 통합을 위해 작동가능한 선택 서열 또는 마커를 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 하나 이상의 선별 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자는 또한 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성, 상보성 영양요구성 결핍을 제공하거나, 또는 배양 배지에 없는 결정적 영양분을 공급하는 것이 포함될 수 있다. 발현 제어 서열은 당분야에 충분히 공지된 항상성 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 둘 이상의 외생성 코딩 핵산을 공-발현시키려고 할 때, 양쪽 핵산은 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별도 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현을 위해서, 코딩 핵산은 하나의 공통 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있거나 또는 상이한 발현 제어 서열, 예컨대 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 항상성 프로모터에 연결된다. 폴리뉴클레오티드가 작동적으로 연결되는 클로닝 부위 및 프로모터 둘 모두를 함유하는 벡터는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 이러한 벡터는 생체내 또는 시험관내에서 RNA를 전사시킬 수 있고, Stratagene (La Jolla, CA) 및 Promega Biotech (Madison, WI) 같은 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해서, 여분의, 잠재적으로 부적절한 선택적 번역 개시 코돈 또는 전사 또는 번역 수준에서 발현을 간섭할 수 있거나 또는 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거시키기 위해 클론의 5' 및/또는 3' 비번역 부분을 제거, 첨가, 또는 변경시키는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 공통 리보솜 결합 부위는 발현을 증강시키기 위해 출발 코돈의 바로 5'에 삽입될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바람직한 화합물의 합성을 위한 경로에 관여되는 외생성 핵산 서열은 제한없이, 접합, 전기영동, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염, 및 초음파 형질전환을 포함한 당분야에 충분히 공지된 기술을 사용해 숙주 세포로 안정하게 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 이. 콜라이 또는 다른 원핵생물 세포에서 외생성 발현을 위해서, 진핵생물 핵산의 유전자 또는 cDNA 중 일부 핵산 서열은 바람직하면, 원핵생물 숙주 세포로 형질전환 전에 제거될 수 있는, 표적화 신호 예컨대 N-말단 미토콘드리아 또는 다른 표적화 신호를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거는 이. 콜라이에서 증가된 발현을 초래하였다 (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 효모 또는 다른 진핵생물 세포에서 외생성 발현을 위해서, 유전자는 리더 서열의 첨가없이 시토졸에서 발현될 수 있거나, 또는 적합한 표적화 서열 예컨대 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호의 첨가를 통해서, 분비를 위해 표적화되거나, 또는 미토콘드리아 또는 다른 세포소기관으로 표적화될 수 있다. 표적화 서열을 제거 또는 포함시키기 위한 핵산 서열에 대한 적절한 변형이 바람직한 성질을 부여하도록 외생성 핵산 서열에 유입될 수 있다는 것을 이해한다. 더 나아가서, 유전자는 단백질의 최적 발현을 획득하기 위해 당분야에 충분히 공지된 기술을 사용해 코돈 최적화될 수 있다.
범위를 포함하여, 모든 수치 표시, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 0.1의 증분만큼 (+) 또는 (-)로 다양한 근사치이다. 항상 명확하게 명시하지 않지만, 모든 수치 표시는 용어 "약"이 선행된다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용되는, "약"은 10%를 더하거나 또는 뺀것을 의미할 것이다. 항상 분명하게 명시하지 않지만, 본 명세서에 기술된 시약은 단지 예시이고 이의 균등물은 당분야에 공지되어 있다는 것을 이해해야 한다.
"작동적으로 연결된"은 엘리먼트가 그들을 기능하게 허용하는 배열로 존재하는 병렬을 지칭한다.
용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지 (배양물) 상에서 또는 그 안에서 세포 또는 유기체의 시험관내 전파를 의미한다. 배양물 중에서 성장된 세포의 후손은 부모 세포와 (즉, 형태학적으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로) 완전히 동일하지 않을 수 있다는 것을 이해한다.
"유전자"는 전사되고 번역된 후에 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열은 그들이 회합된 유전자의 더 큰 단편 또는 전체-길이 코딩 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 더 큰 단편 서열을 단리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
용어 "발현하다"는 유전자 생성물의 생성을 의미한다. 용어 과발현은 정상 또는 대조군 세포의 것을 초과하여, 예를 들어, 대조군 샘플 또는 야생형 세포에서 검출되는 발현 수준에 비해 0.5배, 1.0배, 1.5배, 또는 대안적으로, 2배, 또는 대안적으로, 적어도 2.5배, 또는 대안적으로, 적어도 3.0배, 또는 대안적으로, 적어도 3.5배, 또는 대안적으로, 적어도 4.0배, 또는 대안적으로, 적어도 5배, 또는 대안적으로 10배 더 높게, 유전자로부터 전사되는 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 생성물의 생성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, "상동성"은 기준 서열 및 적어도 제2 서열의 단편 간 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 바람직하게, 기준 서열을 단일 제2 서열 또는 서열의 단편과 또는 서열의 데이터베이스와 비교하기 위한 BLAST 도구를 사용하여, 당분야에 공지된 임의 방법으로 확인할 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, BLAST는 동일성 및 유사성 백분율을 기반으로 서열을 비교할 것이다.
둘 이상의 핵산s 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개 서열은 2개 서열이 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사를 통해서 측정되는 지정된 영역, 또는 비교창 상에서 최적 상응도로 비교 및 정렬되었을 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (즉, 명시된 영역 상에서, 또는 명시되지 않은 경우, 전체 서열 상에서, 29% 동일성, 임의로 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성)을 가지면, "실질적으로 동일"하다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50 뉴클레오티드 (또는 10 아미노산) 길이인 영역, 또는 보다 바람직하게 100 내지 500 또는 1000 이상의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200 이상의 아미노산) 길이인 영역 상에서 존재한다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 임의의 2개 서열 간 서열 동일성 백분율의 결정은 수학 알고리즘을 사용해 수행될 수 있다. 이러한 수학 알고리즘의 비제한적인 예는 [Myers and Miller, CABIOS 4:11 17 (1988)]의 알고리즘; [Smith et al., Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 453 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘; [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448 (1988)]의 유사성 검색 방법; [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877 (1993)]의 알고리즘이다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요하면, 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용할 수 있거나, 또는 대안적인 매개변수를 지정할 수 있다. 다음으로 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대해 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 동일성에 대해 2개 서열을 비교할 때, 서열이 연속적일 필요는 없지만, 임의 갭은 전체 동일성 백분율을 감소시키는 패널티와 함께 수반될 것이다. blastn 경우에, 디폴트 매개변수는 갭 오프닝 패널티=5 및 갭 확장 패널티=2이다. blastp 경우에, 디폴트 매개변수는 Gap 오프닝 패널티=11 및 Gap 확장 패널티=1이다.
본 명세서에서 사용되는, "비교창"은 2개 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열을 동일한 수의 인접된 위치의 기준 서열과 비교할 수 있는, 제한없이, 20 내지 600, 일반적으로, 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150을 포함한 인접한 위치의 수의 어느 하나의 절편에 대한 기준을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, [Smith and Waterman (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman and Wunsch, J Mol Biol 48(3):443-453 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448 (1988)]의 유사성 검색 방법을 통해서, 이들 알고리즘 ([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터 구현에 의해서, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 [참조; 예를 들어, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)]를 통해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 2개 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로서, 각각 [Altschul et al., Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402 (1997)] 및 [Altschul et al., J. Mol Biol 215(3)-403-410 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물정보 센터를 통해 공공으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 데이터베이스 서열 중 동일 길이의 단어와 정렬했을 때 일부 양의 값의 한계치 점수와 일치하거나 또는 그를 만족하는, 질의 서열 중 짧은 단어 길이 W를 확인하여 고점수 서열쌍 (HSP)을 먼저 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃 단어 점수 한계치로서 지칭된다 (Altschul et al., 상동). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 씨드로서 작용된다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가되는 한 각 서열을 따라서 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우에, 매개변수 M (일치 잔기쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (불일치 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용해 계산된다. 아미노산 서열 경우에, 채점 매트릭스는 누적 점수를 계산하는데 사용된다. 각 방향으로 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 획득값으로부터 X 분량만큼 감소되는 경우; 하나 이상의 음의 채점 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 점수가 0 또는 그 이하로 가는 경우; 또는 양쪽 서열의 말단에 도달하는 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 알고리즘의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열 경우)은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 기대치 (E), 및 50의 BLOSUM62 채점 매트릭스 (참조: Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919 (1992)) 정렬 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개 서열 간 유사성의 통계 분석을 또한 수행한다 (참조: 예를 들어, Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877 (1993)). BLAST 알고리즘을 통해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간 일치가 우연하게 발생되는 확률의 표시를 제공하는, 최소 총합 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 총합 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게 약 0.001 미만이면 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상기 언급된 서열 동일성의 백분율 이외에, 2개 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 항체와 면역학적으로 교차-반응한다는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어, 2개 펩티드가 보존성 치환만이 상이한 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 2개 분자 또는 그들 상보체가 엄격 조건 하에서 서로 혼성화한다는 것이다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다는 것이다.
어구 "기능적으로 동등한 단백질"은 엄격 조건 하에서 예시된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 표준 또는 대조군 생물학적 활성과 비교하여 120% 이상, 또는 대안적으로 110% 이상, 또는 대안적으로 100% 이상, 또는 대안적으로, 90% 이상 또는 대안적으로 85% 이상 또는 대안적으로 80% 이상으로 생체내에서 유사하거나 또는 증강된 생물학적 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 개시의 범주 내에서 추가 구현예는 80% 초과, 또는 대안적으로, 85% 초과, 또는 대안적으로, 90% 초과, 또는 대안적으로, 95% 초과, 또는 대안적으로 97% 초과, 또는 대안적으로, 98% 또는 99% 초과의 서열 상동성을 갖는 것으로 확인된다. 상동성 백분율은 적절한 조건 하에서 실행되는 BLAST 같은 서열 비교 프로그램을 통해서 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로그램은 디폴트 매개변수 하에서 실행된다. 일부 구현예에서, 일정 효소 또는 단백질에 대한 기준은 이의 기능적으로 동등한 효소 또는 단백질을 포함한다.
세포의 개체군은 표현형 및/또는 유전자형이 동일 (클론)하거나 또는 동일하지 않은 하나 초과의 세포의 컬렉션을 의도한다. 세포의 실질적으로 균질한 개체군은 사전-선택된 마커를 통해 측정되는 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 동일한 표현형을 갖는 개체군이다.
효소가 효소 클래스 (EC)에 대해서 언급될 때, 효소 클래스는 효소가 분류되거나, 또는 국제 생화학 및 분자 생물학 연합의 명명 위원회가 제공하는 효소 명명법을 기반으로 분류될 수 있는 클래스이다. 특별한 클래스로 아직 분류되지 않았지만 그와 같이 분류될 수 있는 다른 적합한 효소가 또한 포함된다.
비-천연 발생 미생물 유기체
본 명세서에서 제공되는 비-천연 발생 미생물 유기체는 화합물 예컨대 2-케토 펜탄산, 2-케토 헥산산, 6-히드록시-2-케토-헥산산, 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1, 6-헥산디올, 또는 6-히드록시 헥산산을 생성시키기에 충분한 양으로 본 명세서에 기술된 생합성 경로에서 사용되는 효소 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 외생적으로 발현시키기 위해 본 명세서에서 예시된 바와 같은 당분야에 충분히 공지된 방법을 사용해 구축된다.
본 명세서에 기술된 바람직한 생성물을 생성할 수 있는 미생물 숙주의 성공적인 조작은 경로에서 다양한 단계를 촉매하기 위한 충분한 활성 및 특이성을 갖는 효소의 적절한 세트, 예를 들어 본 명세서의 실시예 및 문헌에 기술된 것들을 확인하는 단계를 포함한다. 외생성 DNA 서열로부터의 개별 효소 또는 단백질 활성은 또한 당분야에 충분히 공지된 방법을 사용해 어세이될 수 있다. 또한, 이들 효소는 바람직한 기질 특이성의 획득, 거울상 순수 또는 라세믹 생성물을 합성하도록 입체선택성의 제어, 반감기, 열안정성, 억제제/생성물 내성을 개선시키고 선택된 바람직한 미생물 생성 숙주에서 효소 발현 및 가용성의 개선을 통해서 거친 산업 과정 조건을 견디도록 효소의 안정화를 위해서, 현대 단백질 조작 접근법 (Protein Engineering Handbook; Lutz S., & Bornscheuer U.T. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: 2008; Vol. 1 & 2) 예컨대 유도 진화, 합리적 돌연변이유발법, 컴퓨터 디자인 (Zanghellini, A et al, 2008) 또는 이의 조합을 사용해 조작될 수 있다. 경로의 각 단계를 촉매할 수 있는 바람직한 효소가 특징규명되면, 이들 효소를 코딩하는 유전자는 선택 미생물에 클로닝될 것이고, 발효배양 조건은 최적화될 것이고 생성물 형성은 발효배양 이후에 모니터링될 것이다. 효소가 확인된 후에, 하나 이상의 효소에 해당하는 유전자가 미생물 숙주로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 특정 경로의 각 효소를 코딩하는 유전자는 미생물 숙주에 클로닝된다.
이러한 목적에 적합한 미생물, 및 벡터로 재조합/외생성 핵산/단백질을 도입시키는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 다양한 기술이 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates)]에 예시되어 있다. 미생물 숙주 세포로 발현 벡터를 전달하기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 특별한 방법 및 벡터는 바람직한 미생물 숙주의 종에 의존하여 상이할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 숙주 세포는 열충격, 칼슘 클로라이드 처리, 전기영동, 리포솜, 또는 파지 감염을 통해 형질전환될 수 있다. 효모 숙주 세포는 리튬 아세테이트 처리 (캐리어 DNA 및 PEG 처리를 더 포함할 수 있음) 또는 전기 영동을 통해서 형질전환될 수 있다. 이들 방법은 예시적인 목적을 위해 포함되고 제한적이거나 또는 포괄적인 것을 의도하는 방식이 아니다. 당분야에 충분히 공지된 수단을 통한 통상의 실험을 사용하여 특정 발현 벡터 또는 형질전환 방법이 소정 미생물 숙주에 적합한지 여부를 결정할 수 있다. 더 나아가서, 많은 상이한 미생물 숙주에 적합한 시약 및 벡터가 상업적으로 입수가능하고 당분야에 충분히 공지되어 있다.
효소의 구축, 발현 또는 과발현 및 비-천연 발생 미생물 숙주에서 발현 수준의 시험을 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, Baneyx F. eds. Horizon Bioscience, 2004, Norfolk, UK; and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)).
미생물의 발효배양을 수행하는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 다양한 기술은 [Biochemical Engineering, Clark et al., eds. (CRC press, 1997, 2nd edition)]에 예시되어 있다. 발효배양을 위한 특별한 방법은 바람직한 미생물 숙주의 종에 의존하여 상이할 수 있다. 전형적으로, 미생물은 회분식 또는 연속 발효배양 방식으로 탄소원과 함께 적절한 배지에서 성장된다. 이화산물 억제 또는 효소 활성을 조절하는 것으로 공지된 작용제의 사용을 사용하여 아디프산 또는 글루타르산 생성을 증강시킬 수 있다. 발효배양에 적합한 pH는 3-10이다. 발효배양은 미생물의 요건을 기반으로 호기성, 혐기성, 또는 무산소 조건 하에서 수행될 수 있다. 발효배양은 회분식, 유가-배양식, 또는 연속식 방식으로 수행될 수 있다. 발효배양은 또한 바람직하면 2개 시기로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 시기는 고성장 및 그러므로 고생산성을 허용하도록 호기성일 수 있고, 이후에 높은 카프로락톤 수율의 혐기성 시기가 후속될 수 있다.
탄소원은 예를 들어, 탄소 공급원을 비-천연 발생 미생물에게 공급할 수 있는 임의의 탄화수소 공급원을 포함할 수 있다. 이러한 공급원은 예를 들어, 당 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스 및 전분을 포함한다. 탄화수소의 다른 공급원은 예를 들어 재생가능한 공급원료 및 생물량을 포함한다. 본 개시의 방법에서 공급원료로서 사용할 수 있는 생물량의 예시적인 유형은 셀루로식 생물량, 헤미셀룰로식 생물량 및 리그닌 공급원로 또는 공급원료의 일부분을 포함한다. 이러한 생물량 공급원료는 예를 들어 탄소원으로서 유용한 탄수화물 기질, 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스 및 전분을 함유한다. 본 명세서에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 또한 상기 예시된 것 이외의 재생가능한 공급원료 및 생물량이 바람직한 화합물의 생성을 위한 본 개시의 미생물 유기체를 배양하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에 기술된 반응은 모니터링될 수 있고 발효배양 배지 중 출발 물질, 생성물 또는 중간체는 고압 액상 크로마토그래피 (HPLC) 분석, GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy) 및 LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy) 또는 당분야에 충분히 공지된 통상의 절차를 사용한 다른 적합한 분석 방법을 사용해 배지를 분석하여 확인할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 비-천연 발생 미생물 유기체는 본 개시의 생성물을 생성 및/또는 분비하도록 배양될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법으로 제조된 화합물은 생합성 또는 발효배양으로 제조된 유기 화합물의 단리를 위해 당분야에 일반적으로 공지된 방법으로 단리될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 결정화, 염 형성, 막증발, 반응성 추출, 추출 (액상-액상 및 2층), 흡착, 이온 교환, 투석, 증류, 가스 스트리핑, 및 막 기반 분류 (Roffler et al., Trends Biotechnolgy.2: 129-136 (1984))를 통해서 용액으로부터 단리될 수 있다. 1,5-펜탄디올은 증류, 추출 (액상-액상 및 2층), 막증발, 및 막 기반 분리 (Roffler et al., Trends Biotechnolgy.2: 129-136 (1984))를 사용해 용액으로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 바람직한 생성물의 생합성을 획득하기 위한 하나의 예시적인 성장 조건은 혐기성 배양 또는 발효배양 조건을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 개시의 비-천연 발생 미생물 유기체는 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건 하에서 유지될 수 있거나, 배양될 수 있거나 또는 발효배양될 수 있다. 간략하게, 혐기성 조건은 산소가 없는 환경을 의미한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들어, 배지 중 용존 산소 농도가 포화의 0 내지 105로 남아있도록 하는 배양, 회분식 발효배양 또는 연속 발효배양을 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 1% 미만의 산소 대기를 유지하는 밀봉된 챔버 내부에서 액상 배지 또는 고체 한천 상에서 성장하거나 또는 휴지된 세포를 포함한다. 산소의 백분율은 예를 들어, N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 가스 또는 가스들로 배양물을 살포하여 유지될 수 있다.
본 명세서에 기술된 배양 조건은 생성물을 제조하기 위해 규모를 확장할 수 있고 연속적으로 성장될 수 있다. 예시적인 성장 절차는 예를 들어 유가-배양화학식 발효배양 및 회분식 분리; 유가-배양식 발효배양 및 연속 분리, 또는 연속 발효배양 및 연속 분리를 포함한다. 모든 이들 과정은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 발효배양 절차는 상업적 분량으로 생합성 생성을 위해 특히 유용하다.
용어 "충분량으로 발현된 경로 효소"는 효소가 바람직한 경로 생성물의 검출을 허용하기에 충분한 양으로 발현된다는 것을 암시한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 알돌라제 히드라타제 효소를 코딩하는 제1 외생성 핵산을 포함하는 재조합 미생물 유기체를 제공하고, 재조합 미생물 유기체는 변형되지 않은 동일 미생물 유기체 또는 야생형과 비교하여 퀴논 옥시도리덕타제의 증가된 양을 발현하도록 더욱 변형되고, 임의로 미생물 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 클로스트리듐 (clostridium) 종, 또는 이. 콜라이 (E. coli)이다.
일부 구현예에서, 유기체는 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 제2 외생성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및/또는 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 또는 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 프로모터 또는 인핸서로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 프로모터이다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 인핸서이다.
일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 EC 번호 4.1.2.45, EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는다. 일부 구현예에서, 알돌라제 히드라타제 효소는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1, 또는 알돌-탈수 생성물의 형성을 촉진하는 이의 일부분 (예를 들어, 도메인, 아미노산 잔기의 세트 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있음) 등) 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각 동일 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각 그들 자신의 별도 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시킬 수 있다:
Figure pct00015
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 생성시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 미생물 유기체는 탄소원으로부터 피루베이트의 생성을 개선시키도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 탄소원은 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 재조합 미생물 유기체의 개체군을 제공한다. 일부 구현예에서, 개체군은 실질적으로 균질하다. 일부 구현예에서, 실질적으로 균질한은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 균질한 것을 의미한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 적합한 조건 하에서 본 명세서에 개시된 개체군을 배양하는 단계를 포함하는, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 배양물 또는 미생물 유기체로부터 단리시키는 단계를 더 포함한다.
일정 구현예의 상세한 설명
특히, 본 개시는 소정 폴리펩티드, 예를 들어, 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함하는 다양한 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드가 다양한 화합물을 효과적으로 생성시키는데 이용될 수 있다는 인식을 포괄한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 다양한 알데히드, 예를 들어, 이러한 폴리펩티드의 천연 및/또는 기지 알데히드 기질과 구조적으로 상이한, 본 명세서에 기술된 다양한 지방족 알데히드가 본 명세서에 기술된 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 사용하여 많은 생성물의 효과적 제조를 위해 이용될 수 있다는 것을 입증한다. 특히, 본 개시는 다양한 알돌-탈수 생성물의 생성이 단일 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드)에 의해 촉매될 수 있다는 것을 입증한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
일부 구현예에서, 알데히드는 지방족 알데히드이다. 일부 구현예에서, 알데히드의 -CHO 기는 예를 들어, 이중 결합, 삼중 결합, 또는 방향족 기에 접합되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드, 예를 들어, 본 명세서에 예시된 것들이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 피루베이트 및 지방족 알데히드를 히드라타제-알돌라제와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 알돌라제 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 예를 들어, EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34, 또는 EC 4.1.1.4를 갖는 효소이거나, 또는 그를 포함하거나, 또는 표 1 및 5-8로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예를 들어, 미생물 내에 있다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작된 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 수준 및/또는 활성을 발현한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알돌-탈수 생성물을 생성시키기 위한 증가된 속도 및/또는 수율을 제공한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알돌-탈수 생성물을 생성시키기 위한 증가된 기질 이용성을 제공한다.
일부 구현예에서, 피루베이트 및 지방족 알데히드의 알돌-탈수 생성물로의 전환은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 대체 경로를 통해서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 알돌 생성물로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 알데히드를 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
일부 구현예에서, 알데히드는 지방족 알데히드이다. 일부 구현예에서, 알데히드의 -CHO 기는 이중 결합, 삼중 결합 또는 방향족 기에 접합되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기의 베타-탄소에 부착된 히드록실 기를 포함하는 화합물이다.
본 개시의 다양한 방법은 생합성 폴리펩티드의 이용성을 포함한다. 일부 구현예에서, 특정 생성물, 예를 들어, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드, 환원 생성물 생합성 폴리펩티드 등과 함께 사용될 때, 생합성 폴리펩티드는 특정 생성물의 합성에 관여하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 특정 생성물과 함께 사용될 때 생합성 폴리펩티드는 특정 생성물의 형성을 촉매하는 효소이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 생합성 폴리펩티드는 자연계, 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 자연계에서 발견되는 특정 생성물에 대한 기준 생합성 폴리펩티드)에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 생합성 폴리펩티드는 적절한 기준 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 자연계에서 발견되고/되거나 본 명세서 (예를 들어, 하나 이상의 관련 표)에 표시) 또는 이의 일부분 (예를 들어, 관련 반응을 촉진하는 일부분 (예를 들어, 도메인 (예를 들어, 관련 촉매 도메인) 및/또는 (연속될 수 있거나 또는 이격될 수 있는) 아미노산 잔기의 세트)과 특징적 서열 엘리먼트 및/또는 전체 동일성 백분율을 공유한다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 알돌라제 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다. 본 개시를 읽는 당업자는 다양한 알돌라제 폴리펩티드가 본 개시에 따라서 이용될 수 있다는 것을 이해한다. 일부 구현예에서, 알돌라제 폴리펩티드는 US20170044551에 기술된 알돌라제이거나 또는 그를 포함하고, 이의 알돌라제는 참조로 본 명세서에 편입된다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알돌라제-히드라타제이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체 예컨대 미생물 중에 있다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작되거나 또는 외생성인 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드를 종종 더 높은 단백질 수준 및/또는 활성 수준으로 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 피루베이트 및 지방족 알데히드의 알돌 생성물로의 전환은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 방법은 배양물, 예를 들어, 박테리아 배양물에서 수행된다. 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체 예컨대 박테리아일 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물은 효소를 통해 촉매에 의해서, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서 알돌-탈수 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 전환은 알돌 생성물을 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 데히드라타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 히드라타제 또는 데히드라타제는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 히드라타제 및 데히드라타제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 알돌-탈수 생성물은 광범위한 생성물, 예컨대 중합체, 수지, 코팅 생성물 등을 제조하는데 이용될 수 있는, 다양한 생성물, 예를 들어, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 6HH, 아디프산 등을 제조하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물의 이용성은 하나 이상의 화학적 전환을 포함하고, 이의 각각은 임의로 유기체 중에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 효소)에 의해 독립적으로 촉매될 수 있거나, 또는 효소 이용없이 전통적인 화학적 과정을 통해서 수행될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 하나 이상 또는 전체 단계는 하나 이상의 유기체에서 수행될 수 있고, 이들 각각은 독립적으로 하나 이상의 유형의 유기체 (이들 각각은 독립적으로 그 자체 내에서 또는 배양물 (예를 들어, 공급 화합물, 다른 유기체가 생성한 화합물 등)로부터 생성되는 기질(들)을 사용해 하나 이상의 반응을 수행할 수 있음)를 포함하는 하나 이상의 배양물, 및/또는 유기체의 외부로부터 또는 그 자체 내에서 생성되는 기질(들)을 사용해 하나 이상의 반응을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상 또는 모든 생합성 폴리펩티드는 독립적으로 하나의 유기체, 예를 들어 임의 조작된 박테리아 중에 있다. 일부 구현예에서, 생성물을 생성시키기 위한 생합성 폴리펩티드의 세트의 하나 이상은 하나의 유기체, 예를 들어 임의로 조작된 박테리아에서 발현되고, 세트 중 다른 생합성 폴리펩티드 중 하나 이상은 하나 이상의 다른 유기체, 예를 들어 임의 조작된 박테리아에서 발현된다. 일부 구현예에서, 유기체, 예를 들어, 박테리아는 생합성 폴리펩티드의 하나 이상 또는 전부를 코딩하는 하나 이상의 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 제조 방법은 각각 독립적으로 하나 이상 또는 전부를 포함하고, 함께 모든, 필요한 생합성 폴리펩티드를 포함하는, 하나 이상의 박테리아를 포함하는 단일 배양물에서 수행되는 다수 단계의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성물의 제조는 각각 독립적으로 하나 이상 또는 전부를 포함하고, 함께 모든 필요한 생합성 폴리펩티드를 포함하는, 하나 이상의 박테리아를 각각 독립적으로 포함하는 둘 이상의 배양물에서 수행되는 다수 단계의 반응을 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물 중 이중 결합은 단일 결합으로 전환된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 알켄을 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알켄 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고,
알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어서 알켄 환원 생성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 알켄은 알돌-탈수 생성물이다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 알돌-탈수 생성물, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 2-옥소-3-에노산의 환원을 촉매하는 효소이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 본 명세서에 기술되니 바와 같은, 퀴논 옥시도리덕타제이다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 EC 1.6.5에 속한다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 EC 1.6.5.5에 속한다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 표 9로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예를 들어, 미생물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작된 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 수준 및/또는 활성을 발현한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알켄 환원 생성물을 생성시키기 위한 증가된 속도 및/또는 수율을 제공한다. 일부 구현예에서, 유기체는 알켄 환원 생성물을 생성시키기 위해 증가된 기질 이용성을 제공한다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 조작없이 내생적으로 유기체에 의해 코딩 및/또는 발현되는 효소이거나 또는 그를 포함한다.
본 개시를 읽은 당업자는 다양한 알데히드는 본 개시에 따라서 이용될 수 있다는 것을 이해한다. 일부 구현예에서, 알데히드는 히드라타제-알돌라제이거나 또는 그를 포함하는 생합성 폴리펩티드, 예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드의 천연 또는 기지 기질이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 천연 또는 기지 기질이 아니다. 예를 들어, 특히, 본 개시는 지방족 알데히드는 그의 천연 또는 기지 기질이 방향족이거나 또는 접합된 알데히드인 히드라타제-알돌라제를 사용한 생성물 제조에 이용될 수 있다는 것을 입증한다.
일부 구현예에서, 알데히드는 지방족 알데히드이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 하나 또는 2개 알파-수소를 갖는다. 일부 구현예에서, 알데히드는 하기 화학식 A-1의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-C(O)H,
A-1
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물은 하기 화학식 P-1 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-1
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 하기 화학식 P-2의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH=CH-C(O)-C(O)OH,
P-2
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C- , -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
일부 구현예에서, 화학식 P-2의 -CH=CH- 는 E 입체배열이다. 일부 구현예에서, 화학식 P-2의 -CH=CH- 는 Z 입체배열이다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 하기 화학식 P-3의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-3
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 여기서 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
일부 구현예에서, Ra 는 R"이다. 일부 구현예에서, Ra 는 -OR"이다.
일부 구현예에서, R"은 R'이다. 일부 구현예에서, R"은 --C(O)R'이다. 일부 구현예에서, R"은 --CO2R'이다. 일부 구현예에서, R"은 -SO2R'이다.
일부 구현예에서, R'은 수소이다. 일부 구현예에서, R'은 수소가 아니다.
일부 구현예에서, Ra 는 R'이다. 일부 구현예에서, Ra 는 -OR'이다. 일부 구현예에서, Ra 는 -H이다. 일부 구현예에서, Ra 는 -OH이다.
일부 구현예에서, L1 은 공유 결합이다. 일부 구현예에서, L1 은 공유 결합이 아니다.
일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 선형 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 미치환된다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 단일-치환된다. 일부 구현예에서, L1 은 치환된다. 일부 구현예에서, L1 은 미치환된다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L1 은 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다.
일부 구현예에서, L2 는 공유 결합이다. 일부 구현예에서, L2 는 공유 결합이 아니다.
일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 선형 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 미치환된다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 단일-치환된다. 일부 구현예에서, L2 는 치환된다. 일부 구현예에서, L2 는 미치환된다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2 는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다.
일부 구현예에서, L1 및 L2 중 적어도 하나는 공유 결합이 아니다.
일부 구현예에서, 알데히드는 CH3CHO 이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 CH3CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 CH3CH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 CH2OHCHO 이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 CH2OHCH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 CH2OHCH2CH2CHO 이다.
일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH3CH(OH)CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH3CH2CH(OH)CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH3CH2CH2CH(OH)CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH2OHCH(OH)CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH2OHCH2CH(OH)CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌 생성물은 CH2OHCH2CH2CH(OH)CH2C(O)COOH 이다.
일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH3CH=CHC(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH3CH2CH=CHC(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH3CH2CH2CH=CHC(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH2OHCH=CHC(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH2OHCH2CH=CHC(O)COOH. 일부 구현예에서, 알돌-탈수 생성물은 CH2OH CH2CH2CH=CHC(O)COOH.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH3CH2CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2C(O)COOH 이다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)COOH.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 카르보닐 환원 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물은 카르보닐 기를 포함하고, 카르보닐 기는 -CH(OH)- 로 전환된다. 일부 구현예에서, 방법은 알켄 환원 생성물을 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 카르보닐 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
알켄 환원 생성물은 카르보닐 기를 포함하고;
알켄 환원 생성물의 카르보닐 기는 -CH(OH)- 로 전환된다.
일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 리덕타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 케토 리덕타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 2-케토 산-2-리덕타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 본 명세서에 기술된 바와 같은 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제이다. 일부 구현예에서, 이러한 효소는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 효소는 참조로 본 명세서에 편입된다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물의 카르보닐 환원 생성물로의 전환은 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 잇고, 그들 생성물은 증가된 비율 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 하기 화학식 P-4의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH,
P-4
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH(OH)COOH 이다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH(OH)COOH 이다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH(OH)COOH 이다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH(OH)COOH 이다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH(OH)COOH 이다. 일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH(OH)COOH 이다.
일부 구현예에서, 카르보닐 환원 생성물은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통하거나, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, CoA 전달 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 하기 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA,
P-5
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 CoA (CoA = 조효소 A) 전달 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CoA 트랜스퍼라제, 예를 들어, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, CoA 트랜스퍼라제는 US20170044551에 기술된 것이고, 이의 CoA 트랜스퍼라제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-COA 이다.
일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 탈수 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 하기 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH=CH-C(O)-S-CoA
P-6
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 데히드라타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 데히드라타제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 데히드라타제는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 데히드라타제는 참조로 편입된다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH3CH2CH=CHC(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH3CH2CH2CH=CHC(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH=CHC(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH2OHCH2CH=CHC(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH2OHCH2CH2CH=CHC(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 탈수 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH=CHC(O)S-COA 이다.
일부 구현예에서, 탈수 생성물, 예를 들어, 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염은 환원 생성물, 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서 환원 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 하기 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA
P-7
각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 2,3-에노일-CoA 리덕타제, 2,3-데히드로-카르복실 CoA 2'3-리덕타제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 리덕타제는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 리덕타제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)S-CoA 이다. 일부 구현예에서, 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)S-COA 이다.
일부 구현예에서, 환원 생성물, 예를 들어, 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염은 CoA 전달 생성물, 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, CoA 전달 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 하기 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-8
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CoA 트랜스퍼라제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, CoA 트랜스퍼라제는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 CoA 트랜스퍼라제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, CoA 전달 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다.
일부 구현예에서, CoA 전달 생성물, 예를 들어, Ra 는 -OH 인, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염은 산화 생성물, 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 산화 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 하기 화학식 P-9의 화합물, 또는 이의 염이다:
H-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-9
상기 화학식에서, L2' 은 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-19 지방족 또는 C1-19 헤테로지방족이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 명세서에 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, L2' 은 공유 결합이다. 일부 구현예에서, L2' 은 공유 결합이 아니다. 일부 구현예에서, L1 및 L2' 중 적어도 하나는 공유 결합이 아니다.
일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 선형 C1-6 알킬렌이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 임의 치환된 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 미치환된다. 일부 구현예에서, -C(O)H에 결합된 -CH2- 는 단일-치환된다. 일부 구현예에서, L2' 은 치환된다. 일부 구현예에서, L2' 은 미치환된다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2CH2CH2CH2CH2- 이다. 일부 구현예에서, L2' 은 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- 이다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 산화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 전환된다. 일부 구현예에서, 산화 생성물 생합성 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 1차 알콜 데히드로게나제 예컨대 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 알콜 데히드로게나제는 US20170044551에 기술되어 있고, 이의 알콜 데히드로게나제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 산화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 전환된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 산화 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 산화 생성물은 HC(O)CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 HC(O)CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 HC(O)CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다.
일부 구현예에서, 산화 생성물, 예를 들어, 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염은효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 알데히드 산화 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 하기 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염이다:
HO-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-10
상기 화학식에서, 각각의 다른 변수는 독립적으로 본 명세서에 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 알데히드 데히드로게나제는 US20170044551에 기술되고, 이의 알데히드 데히드로게나제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 알데히드 산화 생성물은 HOC(O)CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 HOC(O)CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다. 일부 구현예에서, 산화 생성물은 HOC(O)CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH 이다.
일부 구현예에서, CoA 전달 생성물, 예를 들어, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염은 카르복실 환원 생성물, 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 카르복실 환원 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 하기 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H
P-9'
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 카르복실산 리덕타제 또는 알데히드 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제를 포함하거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 US20170044551에 기술된 카르복실산 리덕타제 또는 알데히드 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함하고, 이의 카르복실산 리덕타제 또는 알데히드 데히드로게나제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2C(O)H 이다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2C(O)H 이다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)H 이다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2C(O)H 이다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)H 이다. 일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)H 이다.
일부 구현예에서, 카르복실 환원 생성물, 예를 들어, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 알데히드 환원 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 하기 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH
P-10'
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 알데히드 리덕타제 또는 알콜 (예를 들어, 1차 알콜) 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 알데히드 리덕타제 또는 알콜 (예를 들어, 1차 알콜) 데히드로게나제는 US20170044551에 기술되고, 이의 리덕타제 및 데히드로게나제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2CH2OH 이다.
일부 구현예에서, 알켄 환원 생성물, 예를 들어, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 탈카르복실화 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 하기 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H
P-4'
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 데카르복실라제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 데카르복실라제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 2-케토-산 데카르복실라제이다. 일부 구현예에서, 데카르복실라제는 US20170044551에 기술되고, 이의 데카르복실라제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH3CH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH3CH2CH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH2OHCH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CHO 이다. 일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CHO 이다.
일부 구현예에서, 탈카르복실화 생성물, 예를 들어, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염은 효소에 의해 촉매되거나, 생합성을 통해서, 또는 효소 촉매작용없이 전통적인 유기 합성을 통해서, 알데히드 환원 생성물로 전환된다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 하기 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염이다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH
P-5'
상기 화학식에서, 각각의 변수는 독립적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 1차 알콜 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 US20170044551에 기술되고, 이의 1차 알콜 데히드로게나제는 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 전환은 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
많은 다른 생합성 폴리펩티드에 대한 것처럼, 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 예컨대 박테리아에 있을 수 있고/있거나, 조작될 수 있고/있거나, 증가된 단백질 및/또는 활성 수준으로 증가되게 발현될 수 있고, 그들 생성물은 증가된 속도 및/또는 수율 및/또는 기질 이용성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH3CH2CH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2OH 이다. 일부 구현예에서, 알데히드 환원 생성물은 CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2OH 이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산은 비천연 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산은 생산 유기체, 예를 들어 박테리아에서 발현을 위해 최적화된다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 다양한 기술은 생합성 활성을 위한 폴리펩티드의 활성을 평가하는데 이용가능하다. 예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 히드라타제-알돌라제) 또는 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 알돌-탈수 생성물의 환원을 위한 효소)의 활성을 평가하기 위한 다양한 기술은 실시예에 기술된다.
일부 구현예에서, 다양한 생합성 폴리펩티드, 예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 유기체, 많은 구현예에서, 미생물 예컨대 박테리아, 진균 등에 존재한다. 일부 구현예에서, 그들은 하나 이상의 재조합 핵산으로부터 발현된다. 일부 구현예에서, 다양한 형질전환이 생합성적으로, 예를 들어, 유기체, 예컨대 박테리아에서 수행된다. 일부 구현예에서, 유기체 (예를 들어, 미생물, 예컨대 박테리아)는 생합성 폴리펩티드, 예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 예컨대 히드라타제-알돌라제를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 유기체, 예를 들어, 알돌-탈수 생성물을 생성하도록 조작된 것들은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 예컨대 히드라타제-알돌라제 폴리펩티드의 조절된 수준, 전형적으로 증가된 수준 및/또는 활성을 발현한다.
일부 구현예에서, 유기체는 조작된 핵산을 포함하고/하거나, 조작된 생합성 폴리펩티드, 예를 들어, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드 (예를 들어, 다양한 히드라타제-알돌라제)를 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 기준 핵산과 비교하여 하나 이상의 서열 편차를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 핵산은 조작된 핵산이 도입되는 유기체 내에서의 해당 핵산이다. 일부 구현예에서, 기준 핵산은 천연 핵산이다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 기준 핵산, 예를 들어, 천연 핵산과 동일한 폴리펩티드 또는 이의 특징적 엘리먼트를 코딩한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 기준 핵산에 의해 코딩되는 것과 상이한 폴리펩티드 또는 이의 특징적 엘리먼트를 코딩한다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 (예를 들어, 자연계 등에서 발견되는, 기준 핵산에 의해 코딩되는) 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 편차를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 도입되는 유기체에 부재하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 상동성이고, 예를 들어, 기준 폴리펩티드 또는 이의 특징적인 엘리먼트와 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 95%, 99% 이상의 상동성을 공유한다. 일부 구현예에서, 특징적인 엘리먼트는 관련 반응을 촉매하는 도메인이다. 일부 구현예에서, 특징적 엘리먼트는 아미노산 잔기의 세트이다. 일부 구현예에서, 특징적 엘리먼트는 기질, 생성물, 보조인자 등과 접촉하고/하거나, 관련 반응을 촉진하는 아미노산 잔기의 세트이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 아미노산 잔기의 세트 내 잔기는 서열 중에서 서로 옆에 있을 수 있거나, 또는 이격될 수 있다. 일부 구현예에서, 세트 중 둘 이상의 아미노산 잔기는 공간적으로 서로와 밀접할 수 있고, 예를 들어 촉매 포켓에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 생합성 생성을 위해서, 유기체는 하나 이상의 생합성 폴리펩티드의 높은 수준 및/또는 활성을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 유기체는 바람직한 생성물을 생성시키기 위해 증가된 속도 및/또는 수율을 제공한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시는 높은 생성물 수율을 제공한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 포함하는 하나 또는 다수의 단계 과정의 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 일부 구현예에서, 제공된 기술은 바람직한 생성물을 위해, 기질, 예를 들어, 피루베이트의 높은 이용성을 제공한다. 일부 구현예에서, 바람직한 생성물에 대한 이용성 백분율은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이다.
당업자는 본 개시의 다양한 화합물, 예를 들어, 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염은 다양한 화합물, 물질, 및 생성물의 생성을 위한 재료로서 유용하다는 것을 이해한다. 예를 들어, 아디프산이 나일론 6,6, 폴리에스테르 폴리올, 폴리에스테르 수지, 가소제, 식품 및 다른 물질을 생성시키는데 사용될 수 있다. 1,5-펜탄디올은 다양한 폴리우레탄, 폴리에스테르 폴리올, 및 폴리에스테르를 제조하는데 사용될 수 있다. 1,6-헥산디올 (HDO)은 다양한 폴리에스테르를 제조하는데 사용될 수 있고, 이의 일부는 산업적 코팅 응용분야에 유용하다. HDO는 또한 특히 자동차 응용분야용 코팅재로서 사용될 수 있는, 폴리우레탄을 생성시키는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, HDO는 예를 들어, 엘라스토머 및 폴리우레탄 분산물 (예를 들어, 파케이 바닥마감 및 가죽 코팅용)에서 사용되는 마크로디올, 예를 들어, 아디페이트 에스테르 및 폴리카르보네이트 디올의 생성에 사용된다. 전통적인 화학 과정을 통하거나 또는 생합성 과정을 통하거나 또는 이의 조합을 통해서, 6-히드록시 헥산산은 환화되어서 ε-카프로락톤을 만들 수 있고 그 다음에 아미노화되어서 ε-카프로락탐을 만들 수 있다. 전통적인 화학 과정을 통해서 또는 생합성 과정을 통해서 또는 이의 조합을 통해서, 6-히드록시 헥산산은 아미노화되어 6-아미노 헥산산을 만들 수 있고 그 다음으로 환화되어서 ε-카프로락탐을 만들 수 있다. 특히, ε-카프로락탐은 많은 상이한 산업에서 광범위하게 사용되는 중합체인, 나일론6의 생성에 사용될 수 있다. ε-카프로락톤은 중합되어서 특수 폴리우레탄의 생성을 포함한 다양한 응용분야를 갖는 생분해성 폴리에스테르인, 폴리카프로락톤 (PCL)을 만들 수 있다. 다양한 2-케토카르복실산은 다양한 관련 화학물 및 약학물에 유용하다. 일부 구현예에서, 이러한 화학물 및 약학물, 또는 이의 중간체는 아미노산 또는 α-히드록시 카르복실산이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 화합물은 폴리에스테르, 폴리에스테르 폴리올, 폴리우레탄, 나일론 (예를 들어, 아디프산으로부터), 폴리카르보네이트 디올 (예를 들어, HDO 또는 1,5-펜탄디올 등으로부터), 디아크릴레이트 에스테르 (예를 들어, HDO 또는 1,5-펜탄디올 등으로부터), 디글리시딜 에테르 (예를 들어, HDO 또는 1,5-펜탄디올 등으로부터) 등을 제조하는데 이용된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 제공된 과정의 조제물, 예를 들어, 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염, 및 이러한 화합물로부터 제조된 다양한 화합물, 물질, 생성물 등의 조제물을 제공한다.
제공된 기술은 다수의 장점을 제공한다. 특히, 제공된 과정은 효율을 개선시킬 수 있고/있거나 오염을 감소시킬 수 있는, 재생가능한 자원으로부터의 하나 이상의 생합성 폴리펩티드 및/또는 물질을 이용한다. 일부 구현예에서, 본 개시 (예를 들어, 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염, 및 이러한 화합물로부터 제조된 다양한 화합물, 물질, 생성물 등)의 조제물은 화석 탄소원으로부터 제조된 것과 비교하여, 하나 이상의 동위원소, 예를 들어, 14C의 농축된 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 화석 탄소원을 사용한 조제물은 0 또는 실제로 0의 14C 수준을 갖는다. 화합물, 조성물, 조제물 생성물 등에서 다양한 원자의 동위원소 비율 및/또는 수준을 평가하기 위한 기술은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 본 개시에 따라서 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 동위원소 농축은 가속 질량 분광법 (AMS) 및/또는 안정한 동위원소 비율 질량 분광법 (SIRMS), 및/또는 핵자기 공명을 통한 부위-특이적 자연 동위원소 분획법 (SNIF-NMR) 같은 기술을 사용한 질량 분광법으로 쉽게 평가할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 제공된 방법은 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 포함하는 시스템에서 시험관내에서 수행될 수 있다. 많은 구현예에서, 제공된 기술은 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 발현하는, 유기체, 예를 들어, 미생물, 예컨대 박테리아를 사용해 수행된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 발현하는 유기체, 예를 들어, 박테리아를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 유기체는 조작된다. 일부 구현예에서, 이러한 유기체는 하나 이상의 생합성 폴리펩티드의 단백질 및/또는 활성의 증가된 수준을 발현하도록 조작 및/또는 배양된다. 일부 구현예에서, 이러한 유기체는 보다 효율적으로 바람직한 생성물을 생성시키기 위해 탄소원을 이용하도록 조작 및/또는 배양된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 지방족 알데히드의 알돌 생성물을 생성하는 유기체로서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작된다. 일부 구현예에서, 유기체는 박테리아이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 알데히드의 알돌-탈수 생성물을 생성하는 유기체로서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 및 이의 조합의 증가된 발현 또는 활성을 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 알데히드의 알돌-탈수 생성물을 생성하는 유기체를 제공하고, 미생물은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작된다. 일부 구현예에서, 유기체는 박테리아이다. 일부 구현예에서, 알데히드는 지방족 알데히드이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 알켄 환원 생성물을 생성하는 유기체로서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 알데히드로부터 알켄 환원 생성물을 생성하는 유기체로서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 구현예에서, 유기체는 조작된다. 일부 구현예에서, 유기체는 박테리아이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유기체의 배양물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 박테리아의 배양물을 제공한다. 일부 구현예에서, 배양물은 하나 이상의 생합성 폴리펩티드의 하나 이상의 생성물, 예를 들어, 하나 이상의 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염을 포함한다.
당분자가 이해하는 바와 같이, 피루베이트는 피루브산 또는 이의 염으로서 제공할 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염, 또는 화합물 또는 염의 용매화물을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00016
상기 화학식에서, R은 CH2OH, CH3 또는 H다.
방법은 효소적 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은
Figure pct00017
의 CN 알데히드 (상기 화학식에서, R은 CH2OH, CH3 또는 H임), 및 피루베이트를, (a) EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 히드라타제-알돌라제 (본 명세서에서 Ads-Hyd로서 지칭)에 의해 촉매되는 알돌 축합 반응을 통해서 CN 알데히드 및 피루베이트를 CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산 중간체로 전환시키고; 그 다음으로 (b) EC 번호 1.6.5. (예를 들어, EC 번호 1.6.5.5.)를 갖는 옥시도리덕타제를 사용하여, CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산을 CN+3 2-케토-카르복실산 (즉, 화학식 I의 화합물), 또는 이의 염, 또는 와합물의 용매화물 또는 염으로 전환시키는, 조건 하에 용매 중에서 배합 또는 인큐베이션시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 방법은
Figure pct00018
의 CN 알데히드 (상기 화학식에서, R은 CH2OH, CH3 또는 H임), 및 피루베이트를, (a) EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 히드라타제-알돌라제 (본 명세서에서 Ads-Hyd로 지칭)에 의해 촉매되는 알돌 부가 반응을 통해서 CN 알데히드 및 피루베이트를 먼저 CN+3 4-히드록시-2-케토-카르복실산 중간체로 전환시키고; 다음으로 (b) 히드라타제-알돌라제를 사용하여 4-히드록시-2-케토-카르복실산을 CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산으로 전환시키고; 그 다음으로 (c) EC 번호 1.6.5. (예를 들어, EC 번호 1.6.5.5.)를 갖는 옥시도리덕타제를 사용하여, CN+3 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산을 CN+3 2-케토-카르복실산 (즉, 화학식 I의 화합물), 또는 이의 염, 또는 화합물 또는 염의 용매화물으로 전환시키는 조건 하에 용매 중에서, 배합 또는 인큐베이션시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 및 6-히드록시 헥산산으로부터 선택되는 화합물을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 히드라타제-알돌라제, 및 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 번호 1.6.5.5)를 갖는 옥시도리덕타제의 조합을 사용하여 3-히드록시-프로파날 및 피루베이트를 6-히드록시-2-케토 카르복실산 중간체로 전환시키는 단계; 및 b) 효소적 단계를 통해서 6-히드록시-2-케토 카르복실산 중간체를 화합물로 전환시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45를 갖는 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.34를 갖는 트랜스-2'-카르복시벤잘피루베이트 히드라타제-알돌라제이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 아세토아세테이트 데카르복실라제이다.
일부 구현예에서, 미생물은 화학식 I의 화합물, 또는 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 및 6-히드록시 헥산산, 또는 이의 염, 또는 화합물 또는 염의 용매화물로부터 선택되는 화합물의 조제물을 위한 숙주로서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는, "숙주"는 세포 또는 미생물의 내부 (예를 들어, 출발 물질(들)을 흡수하고, 임의로 생성물(들)을 분비시켜서) 또는 외부 (예를 들어, 효소를 분비시켜서)에서 반응을 촉매할 수 있는 하나 이상의 효소를 생성시킬 수 있는 세포 또는 미생물을 지칭한다.
일부 구현예에서, 방법은 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 및 6-히드록시 헥산산 또는 이의 염, 또는 화합물 또는 염의 용매화물로부터 선택되는 화합물을 용액, 배양물, 및/또는 숙주 세포로부터 단리시키는 단계를 더 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법의 조건은 성분을 약 10 내지 약 200℃, 또는 대안적으로 적어도 (모든 온도는 섭씨도로 제공) 10, 15, 20, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 또는 190℃, 또는 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 또는 25℃ 미만 (10℃의 온도 하한치)의 온도에서 인큐베이션 또는 접촉시키는 단계를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 역시 또한 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 조건은 대안적으로 약 2 내지 약 12의 인큐베이션 용액의 pH로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, pH는 적어도 2, 또는 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 또는 9 내지 약 12이다. 일부 구현예에서, pH는 12, 11, 10, 9, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 또는 4 미만이고 pH의 하한치는 2 초과이다.
일부 구현예에서, 조건은 약 0.1 μM 내지 약 5 M의 농도로 존재하는 피루베이트 및 CN 알데히드의 몰 농도를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또는 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 농도는 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500 μM 또는 1 M 이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 500 μM, 200 μM, 100 μM, 또는 10 μM 미만이다. 피루베이트 및 CN 의 농도는 독립적으로 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있고 인큐베이션의 다른 조건에 따라 가변적일 것이다.
일부 구현예에서, 조건은 클래스 I/II 피루베이트 의존적 알돌라제, 히드라타제-알돌라제, 데히드라타제, 퀴논 옥시도리덕타제, 에노일-CoA 리덕타제, 1차 알콜 데히드로게나제, 케토-산 데카르복실라제, 조효소 A 트랜스퍼라제, 및 카르복실산 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 생성시키는 비-천연 미생물의 존재를 포함한다. 각각의 이들 효소는 반응 특이적 효소이다.
일부 구현예에서, 미생물 또는 숙주는 야생형 대응체를 초과하는 양으로 효소를 발현하거나 또는 효소를 과발현하도록 유전자 조작된다. 효소 또는 발현 생성물의 발현 수준을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, PCR에 의한다.
일부 구현예에서, CN 알데히드는 3-히드록시-프로파날이다.
일부 구현예에서, 방법은 3-히드록시-프로파날 및 피루베이트를 글리세롤, C5 당, C6 당, 포스포-글리세레이트, 다른 탄소원, 해당 경로의 중간체, 프로파노에이트 물질대사의 중간체, 또는 이의 조합으로 제조하는 단계를 더 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 3-히드록시-프로파날은 글리세롤의 탈수를 통해서 수득된다.
일부 구현예에서, C5 당은 하나 이상의 자일로스, 자일룰로스, 리불로스, 아라비노스, 릭소스, 및 리보스를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, C6 당은 하나 이상의 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 갈락토스, 프룩토스, 사이코스, 솔보스, 및 타가토스를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 다른 탄소원은 미생물에 대한 탄소원으로서 적합한 공급원료이고, 여기서 공급원료는 아미노산, 지질, 옥수수대, 억새, 도시 폐기물, 에너지 수수, 사탕수수, 바가스, 전분 스트림, 덱스트로스 스트림, 메탄올, 포르메이트, 또는 이의 조합을 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 역시 또한 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 미생물은 1,5-펜탄디올, 아디프산, 1,6-헥산디올, 또는 6-히드록시 헥산산의 제조를 위한 숙주로서 사용된다.
일부 구현예에서, 미생물은 C5 당, C6 당, 글리세롤, 다른 탄소원, 또는 이의 조합을 피루베이트로 전환시키는 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 미생물은 증강된 당 흡수, 예를 들어, C5 당 흡수, 동시 C6/C5 당 흡수, 동시 C6 당/글리세롤 흡수, 동시 C5 당/글리세롤 흡수, 또는 이의 조합을 위해 조작된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00019
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 피루베이트 및
Figure pct00020
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
다른 양태에서, 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00021
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00022
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00023
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00024
를 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00025
상기 식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00026
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고; 피루베이트 및
Figure pct00027
는 히드라타제-알돌라제에 의해 단독으로 촉매되는 알돌 축합 반응을 겪어서 2-옥소-3-에노산을 생성하고, 2-옥소-3-에노산은 퀴논 옥시도리덕타제에 의해 단독으로 촉매되는 환원을 겪어서 2-케토 카르복실산을 생성시킨다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00028
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00029
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행되고; 피루베이트 및
Figure pct00030
은 히드라타제-알돌라제에 의해 단독으로 촉매되는 알돌 축합 반응을 겪어서 2-옥소-3-에노산을 생성시키고, 2-옥소-3-에노산은 퀴논 옥시도리덕타제에 의해 단독으로 촉매되는 환원을 겪어서 2-케토 카르복실산을 생성시킨다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00031
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00032
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00033
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00034
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제를 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00035
상기 식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00036
를 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00037
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서, 피루베이트 및
Figure pct00038
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고; 피루베이트 및
Figure pct00039
는 히드라타제-알돌라제에 의해 단독으로 촉매되는 알돌 축합 반응을 겪어서 2-옥소-3-에노산을 생성시키고, 2-옥소-3-에노산은 퀴논 옥시도리덕타제에 의해 단독으로 촉매되는 환원을 겪어서 2-케토 카르복실산을 생성시킨다.
다른 양태에서, 본 명세서는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
Figure pct00040
상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH이다.
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 피루베이트 및
Figure pct00041
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현되고, 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행되고, 피루베이트 및
Figure pct00042
는 히드라타제-알돌라제에 의해 단독으로 촉매되는 알돌 축합 반응을 겪어서 2-옥소-3-에노산을 생성시키고, 2-옥소-3-에노산은 퀴논 옥시도리덕타제에 의해 단독으로 촉매되는 환원을 겪어서 2-케토 카르복실산을 생성시킨다.
일부 구현예에서,
Figure pct00043
는 3-히드록시-프로파날이다. 일부 구현예에서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수를 통해 생성된다.
일부 구현예에서, 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법은 2-케토 카르복실산을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00044
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00045
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00046
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00047
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00048
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00049
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 아디프산 (AA)을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00050
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 명세서는 아디프산 (AA)을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00051
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45를 갖는 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.34를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 Genbank 또는 RefSeq 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 Genbank 또는 RefSeq 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, A0A370X7D8, WP_028222253, F2J6L6, A0A0N0L9F6, A0A1G9YWG7, A0A2U1BT09, A0A244DHE8, WP_107818191, A0A023WZF9, PYN48855, A0A421PAQ6, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5.5를 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. P28304, P40783, Q0K2I0, A0A1Z1SRY9, P43903, I7G8G0, 또는 Q142L2, ALK19324.1, A0A1G9R408, G4Q8R5, ANA98723.1, K0EUQ3, A0A061CRS8, Q9A212, A0A1I6RWW2, WP_026197277.1, Q5NKZ3, WP_012333034.1, 또는 WP_136898000.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현되는 하나 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현되는 하나 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현되는 둘 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물에 의해 발현되는 둘 이상의 외생성 유전자에 의해 발현된다. 하나 이상의 외생성 유전자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 이상의 외생성 유전자를 포함한다. 둘 이상의 외생성 유전자는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 이상의 외생성 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 EC 번호 4.1.1.1; EC 번호 4.1.1.2; EC 번호 4.1.1.3; EC 번호 4.1.1.4; EC 번호 4.1.1.5; EC 번호 4.1.1.6; EC 번호 4.1.1.7; EC 번호 4.1.1.11; EC 번호 4.1.1.12; EC 번호 4.1.1.15; EC 번호 4.1.1.16; EC 번호 4.1.1.17; EC 번호 4.1.1.18; EC 번호 4.1.1.19; EC 번호 4.1.1.20; EC 번호 4.1.1.34; EC 번호 4.1.1.35; EC 번호 4.1.1.40; EC 번호 4.1.1.54; EC 번호 4.1.1.56; EC 번호 4.1.1.71; EC 번호 4.1.1.72; EC 번호 4.1.1.73; EC 번호 4.1.1.74; EC 번호 4.1.1.75; 또는 EC 번호 4.1.1.77 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 2-케토-산-데카르복실라제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.61을 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. NP_417279.1, NP_349892.1, NP_349891.1, BAB12273.1, L21902.1, Q94B07, AAB03015.1, NP_014032.1, NP_ 013892.1, NP_015019.1, NP_010996.2, ABX39192.1, XP_001210625.1, ABO67118, ABO68223, BAE77068.1, 또는 CAA47743.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. NP_417279.1, NP_349892.1, NP_349891.1, BAB12273.1, L21902.1, Q94B07, AAB03015.1, NP_014032.1, NP_ 013892.1, NP_015019.1, NP_010996.2, ABX39192.1, XP_001210625.1, ABO67118, ABO68223, BAE77068.1, 또는 CAA47743.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소이다. 일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 Uniprot ID No. A0A286PH18 하에 확인되는 효소이고; 퀴논 옥시도리덕타제는 Uniprot ID No. P28304 하에 확인되는 효소이고; 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4 하에 확인되는 효소이고; 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다. 일부 구현예에서, 히드라타제-알돌라제는 Uniprot ID No. A0A286PH18 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 퀴논 옥시도리덕타제는 Uniprot ID No. P28304 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 EC 번호 1.2.99.6을 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 EC 번호 1.1.1을 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1 , BAL51292.1 , Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC6409 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC6409 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A0C7GD16, A0A175L1W4, 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694.1, WP_036338301.1, WP_007472106.1, 또는 A0QWI7 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. D6Z860, YP_001705436.1, ANO06407.1, AAR91681.1, AHH98121.1, ANB00612.1, ANO04655.1, A0R484, AFP42026.1, GAJ86510.1, YP_001704097.1, ANA99315.1, GAJ83027.1, ANA98925.1, ANA98924.1, ANO04656.1, YP_001703694 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. WP_003431407.1, BAL51292.1, Q5FTU6, AKC64094.1, WP_002876862.1, AGP69017.1, WP_003640741.1, AKC64095.1, 및 AKC64094.1 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93, A0A2X3BTQ9, A0A0C7GD16, 또는 A0A175L1W4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6, EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.258을 갖는 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 EC 번호 1.2.1.63을 갖는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot ID No. Q5FTU6 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 Uniprot ID No. Q7WVD0 또는 Q84H78 하에 확인되는 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 Uniprot ID No. Q9R2F4 하에 확인되는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 Uniprot ID No. Q5FTU6 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 Uniprot ID No. Q5U924, Q5U925, 및 Q5U923; 또는 A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 Uniprot ID No. Q73Q47 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 Uniprot ID No. T4VW93 또는 A0A2X3BTQ9 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 Uniprot ID No. Q7WVD0 또는 Q84H78 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 Uniprot ID No. Q9R2F4 하에 확인되는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 것으로 확인된 효소이고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소이다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 것으로 확인된 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지고; 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소와 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함한다. 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 하나의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 2종의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 3종의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 4종의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 5종의 비-천연 발생 미생물 유기체의 존재 하에서 수행된다.
본 출원 전반에서 다양한 공개물이 참조되었다. 이들 공개물 중 GenBank 등록 번호(들) 또는 Uniprot ID 번호(들) 또는 RefSeq ID 번호를 포함하여, 그들 전체로 이들 공개물의 개시는 본 개시가 속하는 분야의 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해서 본 출원에서 참조로 편입된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 예로서 하기 구현예를 제공한다:
1. 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법:
Figure pct00052
(상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH임);
방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 피루베이트 및
Figure pct00053
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하고; 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
2. 구현예 1의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
3. 구현예 1의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
4. 구현예 1의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
5. 구현예 1의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
6. 구현예 1의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
7. 구현예 1-6 중 어느 하나의 방법에 있어서,
Figure pct00054
는 3-히드록시-프로파날이다.
8. 구현예 7의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수를 통해서 생성된다.
9. 구현예 1-8 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토 카르복실산을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
10. 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 제조하기 위한 방법으로서,
Figure pct00055
(상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH임),
방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 피루베이트 및
Figure pct00056
를 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계를 포함하고, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
11. 구현예 10의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
12. 구현예 10의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
13. 구현예 10의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
14. 구현예 10의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
15. 구현예 10의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되고, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
16. 구현예 10-15 중 어느 하나의 방법에 있어서,
Figure pct00057
는 3-히드록시-프로파날이다.
17. 구현예 16의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
18. 구현예 10-17 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토 카르복실산을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
19. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다.
20. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
21. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
22. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
23. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
24. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
25. 구현예 1-18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5-8로부터 선택되는 효소이다.
26. 구현예 1-25 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)를 갖는 효소이다.
27. 구현예 1-25 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
28. 구현예 1-25 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
29. 구현예 1-25 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
30. 구현예 1-25 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
31. 구현예 1-30 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
32. 구현예 31의 방법에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
33. 구현예 1-32 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
34. 구현예 1-11 중 어느 하나의 방법에 있어서, R은 CH2OH 이다.
35. 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00058
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
36. 구현예 35의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
37. 구현예 35의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
38. 구현예 35의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
39. 구현예 35의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
40. 구현예 35의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
41. 구현예 35-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
42. 구현예 35-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
43. 구현예 35-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
44. 구현예 35-43 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1,5-펜탄디올을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
45. 1,5-펜탄디올을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00059
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 2-케토-산-데카르복실라제와 접촉시켜서 5-히드록시-펜타날을 생성시키는 단계; 및
5-히드록시-펜타날을 1차 알콜 데히드로게나제와 접촉시켜서 1,5-펜탄디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
46. 구현예 45의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
47. 구현예 45의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
48. 구현예 45의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
49. 구현예 45의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
50. 구현예 45의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
51. 구현예 45-50 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
52. 구현예 45-50 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
53. 구현예 45-50 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제 및 1차 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
54. 구현예 45-53 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1,5-펜탄디올을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
55. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다.
56. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
57. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
58. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
59. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
60. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
61. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 표 1, 5-8로부터 선택되는 효소이다.
62. 구현예 35-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)를 갖는 효소이다.
63. 구현예 35-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
64. 구현예 35-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
65. 구현예 35-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
66. 구현예 35-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
67. 구현예 35-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제는 EC 번호 4.1.1.1; EC 번호 4.1.1.2; EC 번호 4.1.1.3; EC 번호 4.1.1.4; EC 번호 4.1.1.5; EC 번호 4.1.1.6; EC 번호 4.1.1.7; EC 번호 4.1.1.11; EC 번호 4.1.1.12; EC 번호 4.1.1.15; EC 번호 4.1.1.16; EC 번호 4.1.1.17; EC 번호 4.1.1.18; EC 번호 4.1.1.19; EC 번호 4.1.1.20; EC 번호 4.1.1.34; EC 번호 4.1.1.35; EC 번호 4.1.1.40; EC 번호 4.1.1.54; EC 번호 4.1.1.56; EC 번호 4.1.1.71; EC 번호 4.1.1.72; EC 번호 4.1.1.73; EC 번호 4.1.1.74; EC 번호 4.1.1.75; 또는 EC 번호 4.1.1.77을 갖는 효소이다.
68. 구현예 35-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
69. 구현예 35-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
70. 구현예 35-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
71. 구현예 35-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 2-케토-산-데카르복실라제는 Uniprot ID No. Q6QBS4, A7M7D6, 또는 P20906 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
72. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.61을 갖는 효소이다.
73. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 Uniprot 또는 GenBank ID No. NP_417279.1, NP_349892.1, NP_349891.1, BAB12273.1, L21902.1, Q94B07, AAB03015.1, NP_014032.1, NP_ 013892.1, NP_015019.1, NP_010996.2, ABX39192.1, XP_001210625.1, ABO67118, ABO68223, BAE77068.1, 또는 CAA47743.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
74. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소이다.
75. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
76. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
77. 구현예 35-71 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, 또는 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
78. 구현예 35-54 중 어느 하나의 방법에 있어서,
히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 효소이고;
퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 효소이고;
2-케토-산-데카르복실라제는 SEQ ID NO:83의 서열을 포함하는 효소이고;
1차 알콜 데히드로게나제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
79. 구현예 35-78 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제, 퀴논 옥시도리덕타제, 2-케토-산-데카르복실라제, 및 1차 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
80. 구현예 79의 방법에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
81. 구현예 35-80 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
82. 구현예 35-81 중 어느 하나의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
83. 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00060
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
84. 구현예 83의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
85. 구현예 83의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
86. 구현예 83의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
87. 구현예 83의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
88. 구현예 83의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
89. 구현예 83-88 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
90. 구현예 83-88 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
91. 구현예 83-88 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
92. 구현예 83-91 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1,6-헥산디올을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
93. 1,6-헥산디올을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00061
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사날을 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사날을 6-히드록시헥사날 1-리덕타제와 접촉시켜서 1,6-헥산디올을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
94. 구현예 93의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
95. 구현예 93의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
96. 구현예 93의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
97. 구현예 93의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
98. 구현예 93의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
99. 구현예 93-98 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
100. 구현예 93-98 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
101. 구현예 93-98 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제 중 하나 이상은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
102. 구현예 93-101 중 어느 하나의 방법에 있어서, 1,6-헥산디올을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
103. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다.
104. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
105. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
106. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
107. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
108. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
109. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 표 1 및 5-8로부터 선택되는 효소이다.
110. 구현예 83-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)를 갖는 효소이다.
111. 구현예 83-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
112. 구현예 83-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
113. 구현예 83-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
114. 구현예 83-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
115. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6 , EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110을 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 EC 번호 1.2.99.6을 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 EC 번호 1.1.1을 갖는 효소이다.
116. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
117. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
118. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
119. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
120. 구현예 83-119 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제, 및 6-히드록시헥사날 1-리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
121. 구현예 120,의 방법에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
122. 구현예 83-121 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
123. 구현예 83-122 중 어느 하나의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
124. 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00062
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
125. 구현예 124의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
126. 구현예 124의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
127. 구현예 124의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
128. 구현예 124의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
129. 구현예 124의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
130. 구현예 124-129 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
131. 구현예 124-129 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
132. 구현예 124-129 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제 중 하나 이상은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
133. 구현예 124-132 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-헥사노에이트를 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
134. 6-히드록시-헥사노에이트를 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00063
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계; 및
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
135. 구현예 134의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
136. 구현예 134의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
137. 구현예 134의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
138. 구현예 134의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
139. 구현예 134의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
140. 구현예 134-139 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
141. 구현예 134-139 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
142. 구현예 134-139 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제 중 하나 이상은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
143. 구현예 134-142 중어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-헥사노에이트를 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 포함한다.
115. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6 , EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110을 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 EC 번호 1.2.99.6을 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 EC 번호 1.1.1을 갖는 효소이다.
116. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소이다.
117. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
118. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
119. 구현예 83-102 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제는 SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:68의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사날 1-리덕타제는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
156. 구현예 124-143 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6 , EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110을 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이다.
157. 구현예 124-143 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이다.
158. 구현예 124-143 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
159. 구현예 124-143 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
160. 구현예 124-143 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
161. 구현예 124-160 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 및 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
162. 구현예 161의 방법에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
163. 구현예 124-162 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
164. 구현예 124-163 중 어느 하나의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
165. 아디프산을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00064
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
166. 구현예 165의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
167. 구현예 165의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
168. 구현예 165의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
169. 구현예 165의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
170. 구현예 165의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
171. 구현예 165-170 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
172. 구현예 165-170 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
173. 구현예 165-170 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 중 하나 이상은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
174. 구현예 165-173 중 어느 하나의 방법에 있어서, 아디프산을 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
175. 아디프산을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날을 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제와 접촉시켜서 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성시키는 단계:
Figure pct00065
(상기 화학식에서, R은 CH2OH임);
2-케토 카르복실산을 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노에이트를 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제와 접촉시켜서 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA를 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제와 접촉시켜서 6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-2,3-데히드로-헥사노일-CoA를 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노일-CoA를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노일-CoA를 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제와 접촉시켜서 6-히드록시-헥사노에이트를 생성시키는 단계;
6-히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제와 접촉시켜서 6-옥소-헥사노에이트를 생성시키는 단계; 및
6-옥소-헥사노에이트를 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제와 접촉시켜서 아디프산을 생성시키는 단계를 포함하고,
여기서 방법은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물 중에서 수행된다.
176. 구현예 175의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
177. 구현예 175의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 적어도 하나는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
178. 구현예 175의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
179. 구현예 175의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
180. 구현예 175의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
181. 구현예 175-180 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 발현된다.
182. 구현예 175-180 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현된다.
183. 구현예 175-180 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 중 하나 이상은 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 과발현된다.
184. 구현예 175-183 중 어느 하나의 방법에 있어서, 아디프산을 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체 또는 둘 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체를 포함하는 배양물로부터 분리시키는 단계를 더 포함한다.
185. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는 효소이다.
186. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 GenBank, RefSeq, 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인되는 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
187. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
188. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
189. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
190. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
191. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서, 히드라타제-알돌라제는 표 1 및 5-8로부터 선택되는 효소이다.
192. 구현예 165-191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)를 갖는 효소이다.
193. 구현예 165-191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
194. 구현예 165-191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
195. 구현예 165-191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
196. 구현예 165-191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
197. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 EC 번호 1.1.99.6 , EC 번호 1.1.1.169, EC 번호 1.1.1.215, EC 번호 1.1.1.28, 또는 EC 번호 1.1.1.110을 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 EC 번호 4.2.1.167을 갖는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 EC 번호 1.3.1.44를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 EC 번호 2.8.3, EC 번호 2.8.3.1, 또는 EC 번호 2.8.3.12를 갖는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 EC 번호 1.1.1.258을 갖는 효소이고;
6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 EC 번호 1.2.1.63을 갖는 효소이다.
198. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소이고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소이고;
6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 것으로 확인된 효소이고;
6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소이다.
199. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 가지고;
6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
200. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 가지고;
6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
201. 구현예 165-184 중 어느 하나의 방법에 있어서,
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, 또는 SEQ ID NO:105의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제는 SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:63; 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, 및 SEQ ID NO:64의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제는 SEQ ID NO:65의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제는 SEQ ID NO:71 또는 SEQ ID NO:72의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 가지고;
6-옥소-헥사노에이트 옥시다제는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
202. 구현예 165-201 중 어느 하나의 방법에 있어서, 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트-2-리덕타제, 2,6-디히드록시-헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제, 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 2-데히드라타제, 2,3-데히드로-헥사노일-CoA 2,3-리덕타제, 6-히드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라제, 6-히드록시헥사노에이트 데히드로게나제, 및 6-옥소-헥사노에이트 옥시다제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
203. 구현예 202의 방법에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
204. 구현예 165-203 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트는 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 탄소원으로부터 생성된다.
205. 구현예 165-204 중 어느 하나의 방법에 있어서, 3-히드록시-프로파날은 하나 이상의 비-천연 발생 미생물 유기체에 의해 외생적으로 발현되는 글리세롤 데히드라타제 효소에 의한 글리세롤의 탈수에 의해 생성된다.
206. 알돌라제 히드라타제 효소를 코딩하는 제1 외생성 핵산을 포함하는 재조합 미생물 유기체로서, 재조합 미생물 유기체는 변형되지 않은 동일 미생물 유기체 또는 야생형과 비교하여 퀴논 옥시도리덕타제의 증가된 양을 발현하도록 더 변형되고, 임의로 미생물 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰, 클로스트리듐 종, 또는 이. 콜라이이다.
207. 구현예 206의 재조합 미생물에 있어서, 유기체는 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 제2 외생성 핵산을 포함한다.
208. 구현예 207의 재조합 미생물에 있어서, 제1 및/또는 제2 외생성 핵산은 제2 외생성 핵산의 발현을 구동하는 조절 엘리먼트를 더 포함한다.
209. 구현예 208의 재조합 미생물에 있어서, 조절 엘리먼트는 프로모터 또는 인핸서로부터 선택된다.
210. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34 또는 EC 번호 4.1.1.4를 갖는다.
211. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 Genbank 또는 RefSeq 또는 Uniprot ID No. D7C0E5, P0A144, Q79EM8, A0A0N0AHI8, A0A0N1FRY3, M3DYR1, W7SU48, A0A286PH18, Q9X9Q6, Q9WXH7, A4XDS1, F2J6N9, A0A063BFL5, Q9ZHH6, A0A0C1K853, WP_034398482, PYK12191, WP_115478033, WP_028222253, WP_013654807, WP_059403060, WP_092508530, WP_116642627, WP_009770659, WP_107818191, WP_003292061, PYN48855, WP_122212965, WP_028217297, WP_034507049, KMK64081.1, WP_070028041.1, 또는 KZL92449.1 하에 확인된 효소의 군으로부터 선택되는 효소이다.
212. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소이다.
213. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
214. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
215. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 또는 SEQ ID NO:86의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
216. 구현예 206-209 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 알돌라제 히드라타제 효소는 표 1, 5-8로부터 선택되는 효소이다.
217. 구현예 206-216 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각이 벡터에 함유된다.
218. 구현예 217의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각 동일한 벡터에 함유된다.
219. 구현예 218의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 제1 외생성 핵산 및 제2 외생성 핵산은 각각이 그들 자신의 별도 벡터에 함유된다.
220. 구현예 217-219 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 벡터는 플라스미드이다.
221. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 EC 번호 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)를 갖는 효소이다.
222. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소이다.
223. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 50% 동일성을 갖는다.
224. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
225. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 퀴논 옥시도리덕타제는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 또는 SEQ ID NO:97의 서열을 포함하는 효소와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
226. 구현예 206-220 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 히드라타제-알돌라제 효소 및 퀴논 옥시도리덕타제 중 하나 이상은 하나 이상의 단백질 태그를 더 포함한다.
227. 구현예 226의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 단백질 태그는 폴리히스티딘 태그, GST 태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그), HA 태그 (헤마글루티닌 태그), FLAG 태그, Myc 태그, 말토스 결합 단백질 태그, 키틴 결합 단백질 태그, 및 형광 태그로부터 선택된다.
228. 구현예 206-227 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 재조합 미생물 유기체는 하기 화학식의 2-케토 카르복실산을 생성할 수 있다:
Figure pct00066
(상기 화학식에서, R은 H, CH3, 또는 CH2OH임).
229. 구현예 206-228 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 재조합 미생물 유기체는 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 생성시킬 수 있다.
230. 구현예 206-229 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 재조합 미생물 유기체는 탄소원으로부터 피루베이트의 생성을 개선시키도록 유전자 변형된다.
231. 구현예 230의 재조합 미생물 유기체에 있어서, 탄소원은 글리세롤, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 및 전분, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
232. 구현예 206-231 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체의 개체군.
233. 구현예 232의 개체군에 있어서, 실질적으로 균질하다.
234. 적합한 조건 하에서 구현예 232 또는 구현예 233의 개체군을 배양하는 단계를 포함하는, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 제조하는 방법.
235. 구현예 234의 방법에 있어서, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 또는 6-히드록시 헥사노에이트를 배양물 또는 미생물 유기체로부터 단리시키는 단계를 더 포함한다.
236. 구현예 206-231 중 어느 하나의 재조합 미생물 유기체를 포함하는 배양물.
237. 구현예 232 또는 구현예 233의 개체군을 포함하는 배양물.
238. 피루베이트 및 알데히드를 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
알돌 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기의 베타-탄소에 부착된 히드록실 기를 포함하는 화합물이다.
239. 구현예 238의 방법에 있어서, 알데히드의 -CHO 기는 이중 결합, 삼중 결합 또는 방향족 기에 접합되지 않는다.
240. 피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기의 베타-탄소에 부착되는 히드록실 기를 포함하는 화합물이다.
241. 구현예 238-240 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 알돌라제이거나 또는 그를 포함한다.
242. 구현예 238-241 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재한다.
243. 구현예 242의 방법에 있어서, 미생물은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
244. 구현예 242-243 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
245. 구현예 242-244 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 조작된 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다.
246. 구현예 238-245 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트 및 지방족 알데히드의 알돌 생성물로의 전환은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
247. 구현예 238-246 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 배양물 중에서 수행된다.
248. 구현예 238-247 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌 생성물을 알돌-탈수 생성물로 전환시키는 단계를 포함하고, 알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
249. 구현예 248의 방법에 있어서, 전환은 알돌 생성물을 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
250. 구현예 248-249 중 어느 하나의 방법에 있어서, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재한다.
251. 구현예 250의 방법에 있어서, 미생물은 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
252. 구현예 250-251 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
253. 구현예 250-252 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 조작된 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다.
254. 구현예 248-253 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌 생성물의 알돌-탈수 생성물로의 전환은 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
255. 구현예 248-254 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 배양물 중에서 수행된다.
256. 구현예 249의 방법에 있어서, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 데히드라타제이다.
257. 피루베이트 및 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
258. 구현예 257의 방법에 있어서, 알데히드의 -CHO 기는 이중 결합, 삼중 결합 또는 방향족 기에 접합되지 않는다.
259. 피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
260. 구현예 257-259 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제이거나 또는 그를 포함한다.
261. 구현예 260의 방법에 있어서, 피루베이트 및 지방족 알데히드를 히드라타제-알돌라제와 접촉시키는 단계는 알돌-탈수 생성물을 생성시킨다.
262. 구현예 257-259 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34, 또는 EC 4.1.1.4를 갖는 효소이거나 또는 그를 포함하거나, 또는 표 1 및 5-8로부터 선택된다.
263. 구현예 257-259 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 구현예 262의 효소와 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 95%, 99% 이상의 상동성을 공유하는 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다.
264. 구현예 257-259 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 알돌라제이거나 또는 그를 포함한다.
265. 구현예 257-264 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재한다.
266. 구현예 265의 방법에 있어서, 미생물은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
267. 구현예 265-266 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
268. 구현예 265-267 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 조작된 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다.
269. 구현예 257-268 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피루베이트 및 지방족 알데히드의 알돌-탈수 생성물로의 전환은 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
270. 구현예 257-269 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 배양물 중에서 수행된다.
271. 알켄을 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알켄 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고,
알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어서 알켄 환원 생성물을 제공한다.
272. 구현예 271의 방법에 있어서, 알켄은 구현예 257-270 중 어느 하나의 알돌-탈수 생성물이다.
273. 구현예 271-272 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 2-옥소-3-에노산 또는 이의 염의 환원을 촉매하는 효소이거나 또는 그를 포함한다.
274. 구현예 271-272 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 EC 1.6.5에 속하는 효소이거나 또는 그를 포함한다.
275. 구현예 271-272 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 EC 1.6.5.5에 속하는 효소이거나 또는 그를 포함하거나, 또는 표 9로부터 선택된다.
276. 구현예 271-272 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 구현예 274-275 중 어느 하나의 효소와 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 95%, 99% 이상의 상동성을 공유하는 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다.
277. 구현예 271-276 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재한다.
278. 구현예 277의 방법에 있어서, 미생물은 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
279. 구현예 277-278 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
280. 구현예 277-279 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 조작된 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다.
281. 구현예 271-280 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄의 알켄 환원 생성물로의 전환은 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
282. 구현예 271-281 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 배양물 중에서 수행된다.
283. 구현예 238-270 중 어느 하나의 방법에 있어서, 구현예 271-282 중 어느 하나의 방법을 포함한다.
284. 구현예 238-283 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알데히드는 하기 화학식 A-1의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-C(O)H
A-1
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원가를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
285. 구현예 238-256 및 284 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌 생성물은 화학식 P-1의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-1
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
286. 구현예 257-285 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물은 하기 화학식 P-2의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH=CH-C(O)-C(O)OH,
P-2
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
287. 구현예 286의 방법에 있어서, -CH=CH- 는 E 입체배열이다.
288. 구현예 286의 방법에 있어서, -CH=CH- 는 Z 입체배열이다.
289. 구현예 271-288 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물은 하기 화학식 P-3의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH,
P-3
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
290. 구현예 238-284 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물을 하기 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
HO-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-10
291. 구현예 238-284 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물을 하기 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH,
P-10'
292. 구현예 283-291 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물을 카르보닐 환원 생성물로 전환시키는 단계를 포함하고,
알켄 환원 생성물은 카르보닐 기를 포함하고;
알켄 환원 생성물의 카르보닐 기는 -CH(OH)- 로 전환된다.
293. 구현예 283-291 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물을 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드과 접촉시켜서 카르보닐 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
알켄 환원 생성물은 카르보닐 기를 포함하고;
알켄 환원 생성물의 카르보닐 기는 -CH(OH)- 로 전환된다.
294. 구현예 293의 방법에 있어서, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 케토 리덕타제 또는 2-케토 산 -2-리덕타제이거나 또는 그를 포함한다.
295. 구현예 293-294 중 어느 하나의 방법에 있어서, 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재한다.
296. 구현예 295의 방법에 있어서, 미생물은 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
297. 구현예 295-296 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
298. 구현예 295-297 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 조작된 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드를 발현한다.
299. 구현예 290-298 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물의 카르보닐 환원 생성물로의 전환은 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드에 의해 촉매된다.
300. 구현예 290-299 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 배양물 중에서 수행된다.
301. 구현예 290-300 중 어느 하나의 방법에 있어서, 카르보닐 환원 생성물은 하기 화학식 P-4의 구조 또는 이의 염을 갖는다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH
P-4
상기 화학식에서,
Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환되고;
-Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이다.
302. 구현예 238-301 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-4의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA
P-5
303. 구현예 302의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-4의 화합물 또는 이의 염을 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
304. 구현예 238-303 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH=CH-C(O)-S-CoA
P-6
305. 구현예 304의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염을 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
306. 구현예 238-305 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA
P-7
307. 구현예 306의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염을 2,3-에노일-CoA 리덕타제이거나 또는 그를 포함하는 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
308. 구현예 238-307 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-8
309. 구현예 308의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염을 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
310. 구현예 238-309 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 (식에서, L2 는 -CH2-L2'- 임), 또는 이의 염을 하기 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
H-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-9
상기 화학식에서,
L2' 은 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-19 지방족 또는 C1-19 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O-에 의해 치환된다.
311. 구현예 310의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 알콜 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함하는 산화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
312. 구현예 238-311 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
HO-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
P-10
313. 구현예 312의 방법에 있어서, 전환은 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
314. 구현예 238-312 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H
P-9'
315. 구현예 314의 방법에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
316. 구현예 238-315 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염을 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH
P-10'
317. 구현예 316의 방법에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 리덕타제 또는 1차 알콜 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함하는 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
318. 구현예 238-290 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH
P-5'
319. 구현예 238-290 또는 318 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H
P-4'
320. 구현예 319의 방법에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
321. 구현예 238-290 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염을 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다:
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH
P-5'
322. 구현예 321의 방법에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
323. 구현예 301-322 중 어느 하나의 방법에 있어서, 하나 이상의 각각의 전환은 독립적으로 화합물을 적합한 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
324. 구현예 323의 방법에 있어서, 하나 이상 또는 모든 생합성 폴리펩티드는 독립적으로 미생물 중에 존재한다.
325. 구현예 324의 방법에 있어서, 미생물은 하나 이상 또는 모든 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 외생성 핵산을 함유하도록 조작된다.
326. 구현예 324-325 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 미생물은 하나 이상 또는 모든 생합성 폴리펩티드의 조절된 수준을 발현한다.
327. 구현예 324-326 중 어느 하나의 구현예의 방법에 있어서, 하나 이상 또는 모든 생합성 폴리펩티드는 독립적으로 조작된다.
328. 구현예 324-326 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적합한 생합성 폴리펩티드는 해당 전환을 촉매한다.
329. 구현예 285-328 중 어느 하나의 방법에 있어서, Ra 는 -H 이다.
330. 구현예 285-328 중 어느 하나의 방법에 있어서, Ra 는 -OH 이다.
331. 구현예 285-330 중 어느 하나의 방법에 있어서, L1 은 임의 치환된 C1-6 알킬렌이다.
332. 구현예 285-330 중 어느 하나의 방법에 있어서, L1 은 미치환된 C1-6 알킬렌이다.
333. 구현예 331-332 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2- 이다.
334. 구현예 331-332 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2- 이다.
335. 구현예 331-332 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2CH2- 이다.
336. 구현예 285-330 중 어느 하나의 방법에 있어서, L1 은 공유 결합이다.
337. 구현예 285-336 중 어느 하나의 방법에 있어서, L2 는 공유 결합이다.
338. 구현예 285-336 중 어느 하나의 방법에 있어서, L2 는 임의 치환된 C1-6 알킬렌이다.
339. 구현예 285-336 중 어느 하나의 방법에 있어서, L2 는 미치환된 C1-6 알킬렌이다.
340. 구현예 338-339 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2- 이다.
341. 구현예 338-339 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2- 이다.
342. 구현예 338-339 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2CH2- 이다.
343. 구현예 284의 방법에 있어서, 지방족 알데히드는 HO-CH2-CH2-CHO 이다.
344. 구현예 285 또는 343의 방법에 있어서, 알돌 생성물은 HO-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-C(O)-COOH 또는 이의 염이다.
345. 구현예 286 및 343-344 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알돌-탈수 생성물은 HO-CH2-CH2-CH=CH-C(O)-COOH 또는 이의 염이다.
346. 구현예 289 및 343-345 중 어느 하나의 방법에 있어서, 알켄 환원 생성물은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-COOH 또는 이의 염이다.
347. 구현예 301 및 343-346 중 어느 하나의 방법에 있어서, 카르보닐 환원 생성물은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-COOH 또는 이의 염이다.
348. 구현예 302 및 343-347 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-CO-S-CoA 또는 이의 염이다.
349. 구현예 303 및 343-348 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CO-S-CoA 또는 이의 염이다.
350. 구현예 305 및 343-349 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-S-CoA 또는 이의 염이다.
351. 구현예 308 및 343-350 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염이다.
352. 구현예 310 및 343-351 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염은 H-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염이다.
353. 구현예 312 및 343-352 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염은 HO-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염이다.
354. 구현예 310 및 343-351 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H 또는 이의 염이다.
355. 구현예 312 및 343-351 및 354 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH 또는 이의 염이다.
356. 구현예 317 및 343-346 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H 또는 이의 염이다.
357. 구현예 317 및 343-346 및 356 중 어느 하나의 방법에 있어서, 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH 또는 이의 염이다.
358. 구현예 238-357 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미생물은 접촉 단계에서 둘 이상의 생합성 폴리펩티드를 포함한다.
359. 구현예 238-358 중 어느 하나의 방법에 있어서, 한 유형의 미생물 중에서 하나 이상의 접촉 및/또는 전환 단계, 및 다른 유형의 미생물 중에서 하나 이상의 다른 접촉 및/또는 전환 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
360. 구현예 238-359 중 어느 하나의 방법에 있어서, 한 배양물 중에서 하나 이상의 접촉 및/또는 전환 단계, 및 다른 배양물 중에서 하나 이상의 다른 접촉 및/또는 전환 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
361. 구현예 238-359 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단일 배양물 중에서 접촉 및/또는 전환 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
362. 구현예 238-361 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미생물은 접촉 단계에서 언급된 모든 생합성 폴리펩티드를 포함한다.
363. 구현예 362의 방법에 있어서, 단일 배양물 중에서 접촉 및/또는 전환 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
364. 전술한 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생성물은 약 또는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L의 배양물로 생성된다.
365. 전술한 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 바람직한 생성물에 대한 피루베이트 이용성은 약 또는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이다.
366. 전술한 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 조제물.
367. 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염의 조제물, 또는 전술한 구현예 중 어느 하나의 방법으로 제조된 조제물로서, 조제물은 화합물의 기준 조제물에서 관찰된 것에 비해 14C 동위원소에 대해 농축되고, 기준 조제물은 화석 탄소원을 사용해 제조된다.
368. 폴리에스테르, 폴리에스테르 폴리올, 폴리우레탄, 나일론 6, 나일론 6,6, 폴리카르보네이트 디올, 디아크릴레이트 에스테르, 또는 디글리시딜 에테르의 조제물로서, 조제물은 전술한 구현예 중 어느 하나의 방법으로 제조된 조제물을 사용해 제조된다.
369. 구현예 368의 조제물에 있어서, 조제물은 화합물의 기준 조제물에서 관찰된 것에 비해서 14C 동위원소에 대해 농축되고, 기준 조제물은 화석 탄소원을 사용해 제조된다.
370. 전술한 구현예 중 어느 하나의 하나 이상의 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
371. 구현예 370의 핵산에 있어서, 핵산은 동일한 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 천연 핵산과 상이하다.
372. 구현예 370 또는 371의 핵산에 있어서, 핵산은 미생물에서 발현을 위해 최적화된다.
373. 지방족 알데히드의 알돌 생성물을 생성시키는 조작된 미생물로서, 미생물은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하고,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기의 베타-탄소에 부착된 히드록실 기를 포함하는 화합물이다.
374. 구현예 373의 미생물에 있어서, 지방족 알데히드는 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된다.
375. 구현예 373의 미생물에 있어서, 알돌 생성물은 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된다.
376. 지방족 알데히드의 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 조작된 미생물로서, 미생물은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 또는 이의 임의 조합의 증가된 발현 또는 활성을 포함하고,
지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물이다.
377. 구현예 376의 미생물에 있어서, 지방족 알데히드는 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된다.
378. 구현예 376의 미생물에 있어서, 알돌-탈수 생성물은 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된다.
379. 알켄 환원 생성물을 생성시키는 조작된 미생물로서, 미생물은 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하고,
알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고,
알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어 알켄 환원 생성물을 제공한다.
380. 구현예 379의 미생물에 있어서, 알켄은 구현예 271-363 중 어느 하나에 기술된다.
381. 구현예 379의 미생물에 있어서, 알켄 환원 생성물은 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된다.
382. 구현예 373-381 중 어느 하나의 미생물에 있어서, 구현예 271-363 중 어느 하나의 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 더 포함한다.
383. 구현예 238-382 중 어느 하나의 미생물, 및 독립적으로 식 P-1 내지 P-10, P-9', P-10', P-4' 또는 P-5'의 하나 이상의 화합물, 또는 이의 염을 포함하는 배양물.
384. 구현예 383의 배양물에 있어서, 하나 이상의 화합물은 독립적으로 생합성 폴리펩티드(들)의 증가된 발현 또는 활성이 없는 비슷한 미생물의 기준 배양물과 비교하여 더 높은 수준이다.
385. 구현예 383-384 중 어느 하나의 배양물에 있어서, 식 P-1 내지 P-10, P-9', P-10', P-4' 또는 P-5'의 화합물의 각각, 또는 이의 염은 독립적으로 구현예 238-363 중 어느 하나에 기술된 바와 같다.
386. 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법, 조제물, 화합물, 유기체, 미생물, 배양물, 또는 생성물.
실시예
하기 실시예는 개시된 대상 주제에 따라 방법 및 결과를 예시하기 위해 하기에 기재된다. 이들 실시예는 본 명세서에 개시된 대상 주제의 모든 양태를 포괄하려는 의도는 아니지만, 그 보다는 소정 대표적인 방법 및 결과를 예시하려는 것이다. 이들 실시예는 당업자에게 자명한 본 명세서에 기술된 대상 주제의 균등물 및 변이를 배제하려는 의도가 아니다. 실시예 전반에서, 효소 또는 단백질의 서열은 그들의 Uniprot ID 또는 그들의 GenBank 등록 번호 (GenBank ID 또는 GenBank 등록 No.라고 지칭) 또는 그들의 RefSeq ID를 통해서 확인된다. Uniprot ID의 경우에, 서열은 최초 (인용가능) 등록 번호로 표시된다. RefSeq 단백질 기록은 NCBI 데이터베이스 내 비-중복 단백질 서열을 나타낸다. 비-중복 단백질 기록은 상이한 균주 또는 종에서 1회 또는 다수회 관찰된 하나의 정확한 서열을 나타낸다.
실시예 1: 지방족 알데히드를 사용하는 알돌-탈수 생성물 생합성을 촉매하는 효소.
본 명세서에서 누적하여 히드라타제-알돌라제 또는 Ads-Hyd로서 지칭되는, 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 (EC 4.1.2.45)1-5 또는 4-(2-카르복시페닐)-2-옥소부트-3-에노에이트 알돌라제 (E.C. 4.1.2.34; 트랜스-2'-카르복시벤잘피루베이트 히드라타제-알돌라제라고도 함)6 는 지방족 알데히드1-6, 특히 알데히드 기 옆에 임의의 불포화가 없는 것들5 에 대해 임의의 알돌 부가 또는 알돌 축합 활성을 보유한다는 것은 이전에 입증되지 않았다. 대신에, 이들 효소의 알돌 축합 활성은 이전에 기질에 제한적이었고, 여기서 새롭게 형성된 불포화는 알데히드 기질1-5 내에 존재하는 불포화에 대한 접합을 통해서 안정화될 수 있다. 이러한 알데히드 기질의 예는 방향족 접합된 알데히드 예컨대 벤즈알데히드 또는 알케날 (즉, C2 및 C3 사이에 이중 결합을 갖는 지방족 알데히드)을 포함한다. 이들 히드라타제-알돌라제는 수많은 지방족 알데히드, 예를 들어, 상이한 탄소 길이 및 상이한 기능성의 선형 알데히드를 기질로서 이용할 수 있고, 임의의 이론에 국한하고자 하는 의도없이, 해당 4-히드록시-2-케토-카르복실산 및 3,4-데히드로-2-케토-카르복실산을 각각 생성물로서 제공하기 위해 도너 (친핵성)로서 피루베이트와 알돌 부가 및 알돌 축합 반응 둘 모두의 수행을 통해, 알돌-탈수 생성물을 제공할 수 있다는 것을 예상치 않게 발견하였다. 대표적인 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제 (예를 들어, 표 1에 등재된 Ads-Hyd 2 & 9) 및 트랜스-2'-카르복시벤잘피루베이트 히드라타제-알돌라제 (예를 들어, 표 1에 등재된 Ads-Hyd 3)에 대한 결과는 알돌-탈수 활성 (알돌 부가 및 알돌 축합)에 대해 표 1에 요약되어 있고, 피루베이트는 도너로서 사용되고 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 및 3-히드록시-프로파날은 억셉터 알데히드로서 사용된다.
Figure pct00067
Figure pct00068
표 1의 효소의 서브세트에 의한 상이한 탄소 길이 및 기능성의 지방족 비접합 알데히드에 대한 알돌 부가 및 알돌 축합 활성은 표 2에 요약되고, 이러한 반응에 적합한 비접합 알데히드 기질의 다재다능성을 더욱 입증한다.
Figure pct00069
특히, 기술은 예를 들어, 기질, 예를 들어, 피루베이트의 생성물의 생성 속도, 수율, 및/또는 이용성의 관점에서, 높은 효율을 제공한다. 일부 구현예에서, 생합성 폴리펩티드는 관련 기준 생합성 폴리펩티드와 비교하여, 적합한 조건 하에서 비슷한 생성물의 생성으로 측정하여, 약 50%, 100%, 또는 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100배 이상 활성이 있다. 일부 구현예에서, 본 개시는 기질, 예를 들어, 피루베이트의 고도로 효율적인 이용성을 제공한다. 일부 구현예에서, 기질, 예를 들어, 피루베이트의 이용성은 약 또는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이다. 일부 구현예에서, 배양물 중 바람직한 생성물 농도는 생성 시간 (예를 들어, 90분)의 기간 이후에 약 또는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 g/L 이다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 예를 들어, 표 3은 해당 반응을 촉매하는 것으로 이전에 알려진 알돌라제와 비교하여 제공된 기술의 효율을 극적으로 개선시켰다는 것을 입증한다: 표 3의 대표적인 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타제-알돌라제는 시험된 기질에 대한 알돌 부가 활성의 관점에서 다른 알돌라제를 능가한다 (예를 들어, >5배 활성). 특히, 표 4는 Ads-Hyd 효소가 비교 알돌라제와 비교하여 기질 피루베이트의 고도의 효율적인 이용성을 비롯하여 개선된 생성물 수율을 제공할 수 있다는 것을 입증하였다. 이것은 피루베이트가 중심 대사산물이고 미생물 내에서 다른 반응에 의해 소모될 수 있므로 특히 주목할만하다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드를 포함하는 제공된 기술은 생체내에서 바람직한 생성물 수율을 개선시키는데 핵심적인, 비바람직한 반응에 의한 생체내 피루베이트 소모를 효율적으로 최소화시킬 수 있다.
Figure pct00070
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소수의 히드라타제-알돌라제가 EC 4.1.2.45 또는 EC 4.1.2.34에 속하는 것으로 분류되었지만 (표 5 참조), 표 1에 보고된 대부분의 효소 서열 및 상동성 검색으로 확인된 서열 (BLAST 사용; 표 6-8 참조)은 EC 번호를 지정하지 않았다. 추가로, 이들 효소는 또한 문헌 또는 데이터베이스 (예를 들어, Uniprot)에서 이들 다른 클래스의 효소와 유사성에 기인하여 아세토아세테이트 데카르복실라제 또는 디히드로디피콜리네이트 신써타제 또는 단순히 알돌라제로서 주석이 달렸다. 예를 들어, Ads-Hyd 8 효소는 히드라타제-알돌라제로서 주석이 달리지 않고, 히드라타제-알돌라제로서 기능할 때 아세토아세테이트 데카르복실라제인 것으로 주석이 달린다 (이 서열에 대한 Uniprot 페이지 참조) (표 1 참조). 유사하게, Ads-Hyd 11-13 효소는 디히드로디피콜리네이트 신써타제로서 주석이 달렸었지만, 그들은 히드라타제-알돌라제로서 기능한다 (표 1 참조). 많은 히드라타제-알돌라제 효소 서열은 공공 데이터베이스에서 아세토아세테이트 데카르복실라제 또는 디히드로디피콜리네이트 신써타제 또는 알돌라제에 속하는 것으로 주석 달리거나 또는 추론되거나 또는 그렇게 될것이며 EC 4.1.2.45 또는 EC 4.1.2.34에 속하는 것으로 분류되지 않는다는 것이 예상된다. 따라서, 히드라타제-알돌라제 효소 서열을 확인하기 위해서, 히드라타제-알돌라제 서열에 대한 상동성-기반 검색이 수행되었고, 최종 효소는 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 그들 활성에 관해 이후에 검증되었다. (a) EC 4.1.2.34에 속하는 하나의 서열 (Ads-Hyd 3; 표 8의 결과); (b) EC 4.1.2.34 및 EC 4.1.2.45에 속하는 효소와 극도로 낮은 상동성을 갖는 미지정된 효소에 속하는 하나의 서열 (Ads-Hyd 8; 표 6의 결과) 및 (c) EC 4.1.2.34 및 EC 4.1.2.45에 속하는 효소와 중간도 상동성을 보이는 미지정 효소에 속하는 하나의 서열 (Ads-Hyd 10; 표 7의 결과)을 사용하는 예시적인, 상동성-기반 검색은 >500 효소를 밝혀주었고, 이의 일부는 하기 표에 열거되어 있으며, 이들 중 많은 것들이 시험 시에 알돌 부가 및 축합에 대해 활성이 있는 것으로 확인되었다 (표 1의 데이터). 예를 들어, 표 6에서 확인된 13개 서열 (표 1의 서열에 대한 데이터와 표 6의 밑줄표시된 서열 참조), 및 표 7에서 확인된 11개 서열 (표 1의 서열에 대한 데이터와 표 7의 밑줄표시된 서열 참조)은 기능성 Ads-Hyd 효소로서 확인되었다. 특히, 본 개시는 E.C 4.1.1.4에 속하는 것으로 분류되고 아세테토아세테이트 데카르복실라제로서 주석이 달린, Ads-Hyd 112는 또한 수많은 상이한 알데히드에 의해 알돌 부가 및 알돌 축합 반응을 촉매하는 것으로 확인되었다는 것이 입증되었다 (표 2). 일부 구현예에서, 아세토아세테이트 데카르복실라제로서 주석달린 효소뿐만 아니라 E.C 4.1.1.4에 속하는 것들은 역시 알돌 축합 및 부가 반응을 촉매하는데 유용하다. EC 4.1.2.34에 속하는 Ads-Hyd 3, EC 4.1.2.45에 속하는 Ads-Hyd 2, 및 Ads-Hyd 8 효소에 대해서 각각 35% (표 1의 Ads-Hyd 68), 38% (표 1의 Ads-Hyd 3) 및 49% (표 1의 Ads-Hyd 93) 만큼 낮은 범위의 동일성을 갖는 효소들이 히드라타제-알돌라제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
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클로닝, 및 발현: 이종성 알돌라제 히드라타제 효소를 코딩하는 DNA는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈-최적화되었고 상업적 DNA 합성 회사가 합성하였다. 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각의 유전자는 pB11 골격 플라스미드의 T7 RNA 중합효소 프로모터의 하류 및 T7 종결자 서열의 상류에 클로닝되었다. 추가로, 선택된 알데히드가 3-히드록시-프로피온알데히드인 실험 경우에, B12-의존적 효소 (하기와 같은 5종 유전자를 포함하는 락토코쿠스 류테리 (Lactococcus reuteri) 글리세롤 데히드라타제: pduC [Uniprot ID No. A5VMB2]; pduD [Uniprot ID No. A5VMB1]; pduE [Uniprot ID No. A5VMB0]; pduG [Uniprot ID No. A5VMA9]; 및 pduH [Uniprot ID No. A5VMA8])인 글리세롤 데히드라타제 효소는 또한 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 3-히드록시-프로피온알데히드를 생성시킬 수 있도록 제2의 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 플라스미드는 이. 콜라이 BL21*(DE3)ΔldhA를 형질전환시켰다. 각 클론에 대한 출발 배양물을 1 g/L D-글루코스 및 적절한 항생제가 존재하는 5 mL 2xYT 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현을 위한 세포 배양물은 96웰 플레이트 중 2 mL 성장 배지에서 수행하였다. 복합 (2xYT) 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 100 mg/L 철 암모늄 시트레이트가 보충되었다. 유도-전 성장은 호기성 조건 하에 30℃에서 2시간 동안 수행하였다. 재조합 단백질 발현은 250 μM IPTG로 0.2-0.4의 OD600에서 유도시켰다. 유도-후 발현은 30-180분 동안 30℃에 호기성 조건 하에서 수행한 이후에 0-60분 동안 혐기성 조건 하에서 수행하였다.
효소 어세이: 발현 후에, 세포를 회수하였고 반응을 위한 기질과 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 0.4 mL의 신선한 배지 (OD600 ∼30)에 재현탁시켰다. 활성 결정을 위해서, 피루베이트 (10 - 20 g/L)는 5 - 40 g/L 알데히드 (예를 들어, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드, 2-히드록시-아세트알데히드, 또는 4-히드록시-부티르알데히드)와 12시간 동안 호기적으로 인큐베이션시켰다. 3-히드록시-프로파날을 사용해 활성 결정을 위해, 발현 후 세포를 회수하였고 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)와 10-20 g/L 글루코스, 5-10 g/L 글리세롤, 및 10 g/L 피루베이트를 함유하는 0.4 mL의 신선한 배지 (OD600 ∼30)에 15시간 동안 혐기성 조건 하에 재현탁시켰다. 반응 믹스는 또한 10 μM 비타민 B12 및 1 g/L 글루타티온이 보충되었다. 실온에서 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC로 분석하였다.
생성물의 분석: 등용매 HPLC를 주로 사용하여 효소 생성물, 알돌 부가 생성물 (4-히드록시-2-케토-카르복실산), 알돌 축합 생성물 (3,4-데히드로-2-케토-카르복실산)의 생성을 검출하고 정량하였다. 한 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.05% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 이의 후자는 210 nm 및 260 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 추가로, 알돌 부가 및 알돌 축합 생성물은 HPLC를 통해 이전에 확인된 개별 피크의 질량을 측정하여, LC-MS를 통해서도 확인하였다 (본 명세서에 데이터 미포함).
실시예 2: 알돌-탈수 생성물의 환원을 촉매하는 효소.
본 명세서에서 입증되는 바와 같이, 활성화된 이중 결합, 즉, 카르보닐 또는 카르복실레이트 기 옆의 이중 결합의 환원은 효소에 의해 촉매될 수 있다. 알돌-탈수 생성물, 예를 들어, 2-옥소-3-에노산은 효소를 사용해 더 환원되어서 해당 2-옥소-카르복실산을 제공할 수 있다. 퀴논의 환원을 위해 NADH 및/또는 NADPH를 이용하는 EC 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)에 속하는 옥시도리덕타제는 이러한 반응을 촉매할 수 있다는 것을 예상치않게 발견하였다. 예를 들어, Ads-Hyd 효소 (실시예 1 참조)가 실시예 1에 기술된 바와 같이 2-케토-카르복실산의 생성을 위한 이. 콜라이 BL21 또는 이. 콜라이 MG1655 균주에서 재조합적으로 발현되었을 때, Ads-Hyd 효소 생성물 (즉, 2-옥소-3-에노산)의 일부분이 해당 2-케토-카르복실산으로 전환되었다는 것을 발견하였다. 이것은 이들 이. 콜라이 균주 내에서 일부 천연적으로 발현된 효소 또는 효소들이 2-옥소-3-에노산의 환원의 수행을 담당하였다는 가능성을 야기하였다. 이들 균주 내에서 활성화된 이중 결합의 환원을 생각한대로 수행할 수 있는 기지 옥시도리덕타제 (즉, EC 1.3.- 내지 EC 1.6.-)의 조사가 수행되었다. 17종의 이러한 유망한 효소가 각각 이. 콜라이 MG1655 및 이. 콜라이 BL21 내에서 확인되었다. 이들 숙주 둘 모두에서 이들 효소 각각에 대한 녹아웃 균주는 당분야에 공지된 방법을 사용해 제조되었다. 이후에 각각의 이러한 녹아웃 균주는 상기 기술된 방법을 사용하고 재조합적으로 발현된 Ads-Hyd 효소를 사용해 2-옥소-3-에노산 및 2-케토-카르복실산의 이의 생성물 둘 모두를 생성시키는 이의 능력에 대해 시험되었다. 이것은 qorA 유전자 또는 퀴논 옥시도리덕타제-1의 녹아웃이 2-옥소-3-에노산의 생성을 초래하였지만 2-케토-카르복실산은 그렇지 않았다는 확인을 이끌었다. 이것은 qorA에 의해 코딩되는 효소가 아마도 이 반응을 천연적으로 수행하는 것을 담당하였음을 확인하였다. 이후에, N-말단 His6 태그화 QorA 효소를 과발현시키고 정제하였으며, 실제로 바람직한 반응을 수행하는데 활성이 있었다는 것을 확인하였다 (도 6). 이것은 EC 1.6.5 (예를 들어, EC 1.6.5.5)에 속하는 이. 콜라이 유래의 퀴논 옥시도리덕타제 효소가 환형 구조인, 그들 천연 기질과 매우 상이한 기질에 대해 기능할 수 있다는 것을 분명하게 최초로 확인하였다. 더 나아가서, 이 효소는 생물생성 동안 호기성 및 혐기성 조건 하에 이러한 효소를 이용할 수 있으므로, 매우 유리한, 반응 동안 보조인자로서 NADH 및 NADPH 둘 모두를 이용할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 6).
EC 1.6.5에 속하는 다양한 생합성 폴리펩티드는 본 개시에 따라서, 예를 들어, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드로서 및/또는 알돌-탈수 생성물의 환원을 위해서, 이용될 수 있다. 예를 들어, EC 1.6.5.5의 다수의 퀴논 옥시도리덕타제는 이. 콜라이 Qor-1 효소와 그의 동일성이 37-90% 범위인 18종 효소 (표 9 참조)를 포함하여, 본 개시에 따라서 그들 활성에 대해 평가되었다. 선택된 모든 효소는 적어도 하나의 기질에 대해 활성인 것으로 확인되었고 (표 9), 이러한 반응을 수행하기 위해 이러한 클래스의 효소의 일반성을 더욱 확인하였다.
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다른 환원 생성물 생합성 폴리펩티드, 예를 들어, EC 1.6.5의 다양한 하위클래스에 속하는 것들, 예컨대 EC 1.6.5.5에 속하는 다양한 퀴논 옥시도리덕타제 효소가 또한 이러한 반응을 수행할 수 있다.
클로닝 및 발현: 표 5에 표시된 이종성 알돌라제 히드라타제 (Ads-Hyd 1) 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소를 코딩하는 DNA는 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고 상업적 DNA 합성 회사가 합성하였다. 시험관내 활성 측정을 위해서, N-말단 His6 태그가 Qor-1 효소에 부가되었다. 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각의 유전자는 단일 pB11 골격 플라스미드의 T7 RNA 중합효소 프로모터의 하류 및 T7 종결자 서열의 상류에 클로닝되었다. 추가로, 선택된 알데히드가 3-히드록시-프로피온알데히드인 실험의 경우에, B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소 (하기와 같은 5종 유전자를 포함하는 락토코쿠스 류테리 글리세롤 데히드라타제: pduC [Uniprot ID No. A5VMB2]; pduD [Uniprot ID No. A5VMB1]; pduE [Uniprot ID No. A5VMB0]; pduG [Uniprot ID No. A5VMA9]; 및 pduH [Uniprot ID No. A5VMA8])를 또한 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 3-히드록시-프로피온알데히드를 생성시킬 수 있도로 제2의 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 플라스미드로 이. 콜라이 BL21*(DE3) ΔldhA ΔqorA를 형질전환시켰다. 재조합 단백질 발현은 실시예 1에서 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 시험관내 연구를 위해서, Qor-1 효소는 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도시켰다. 유도-후 발현은 180분 동안 30℃에 호기성 조건 하에서 수행하였다. 유도 후에, 효소는 당분야의 표준 방법을 사용하여 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
효소 어세이: 상이한 퀴논 옥시도리덕타제의 생체내 활성 측정의 실시예 1과 동일하다. 도 6에 표시된 시험관내 활성 측정을 위해서, Qor-1 효소 (0.3 mg/mL)는 ∼10 mM의 6-히드록시-3,4-데히드로-2-옥소헥사노에이트 (자가 합성), 0.5 mM의 NADH 또는 NADPH와 100 mM pH 7 포스페이트 완충제 중에서 인큐베이션시켰다.
생성물의 분석: 실시예 1에 기술된 등용매 HPLC 방법을 사용하여 효소 생성물, 즉, 2-케토-카르복실산의 생성을 검출 및 정량하였다. 시험관내 활성 측정을 위해서, 340 nm에서의 흡광도 감소를 사용하여 NADH 또는 NADPH 보조인자의 고갈 및 그에 따른 Qor-1 활성을 측정하였다.
실시예 3: 피루베이트 및 지방족 알데히드로부터 2-케토-카르복실산의 생성을 위한 2-효소 시스템.
광범위한 2-케토 산의 생성을 위해 퀴논 옥시도리덕타제 효소와 조합한 알돌라제-히드라타제 효소(들)의 사용이 조사되었다. 이러한 조합은 수많은 산업적으로 바람직한 생성물 예컨대 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 아디프산, 카프로락탐, 카프로락톤, 6-히드록시 헥산산, 6-아미노 카프로산, 아미노산, 및 많은 상이한 지방 분자의 생성을 위한 전구체인 광범위 2-케토 산의 생성을 가능하게 한다. 알돌라제-히드라타제 효소 및 옥시도리덕타제의 수많은 상이한 조합이 상이한 2-케토 산의 생성에 활성인 것으로 확인되었다 (표 10). 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 제공된 기술은 높은 생성물 농도, 예를 들어, 약 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000 mM을 제공할 수 있다.
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다양한 생합성 폴리펩티드, 특히 EC 1.6.5에 속하는 것들은 환원에 이용될 수 있다. 예를 들어, EC 1.6.5.5에 속하는 퀴논 옥시도리덕타제는 전자 캐리어 활성에 관여되는 것으로 보고되어 있고, 그들이 예를 들어 포유동물, 진균, 및 박테리아에 존재한다고 보고되어 있으므로 편재성 효소로 보고되어 있다 (Brenda.org에서 이러한 EC 클래스에 대한 등재 참조). 다양한 숙주 전반에서 이들 효소의 천연 발현 수준이 공지되어 있지 않지만, 효소의 이러한 클래스의 발현 수준이 천연적으로 미생물 숙주가 대면하게 되는 산화 스트레스에 의해 영향받을 수 있다는 것은 이전에 상정되었었다. 이. 콜라이 (MG1655 및 BL 21 균주) QorA 유전자 (Qor-1)는 특히 실시예 2에 기술된 조건 하에서, 천연적으로 발현되는 것으로 발견되었다. Ads-Hyd 효소 (예를 들어, Ads-Hyd 8)가 이. 콜라이에서 과발현될 때 이. 콜라이에서 Qor-1의 천연 효소 수준이더라도 2-케토산의 생성에 충분할 수 있다고 입증되었다. 예를 들어, Ads-Hyd 8이 이. 콜라이 BL 21*(DE3) ΔldhA에서 발현될 때, 그 결과로 ∼3 mM의 6-히드록시 2-케토 헥사노에이트가 생성되었다. 그러나, Ads-Hyd 8이외에도, 플라스미드로부터 Qor-1의 과발현은 ∼2x 개선된 생성 (∼5.8 mM 6-히드록시 2-케토 헥사노에이트)을 야기시켰다. 이 결과를 기반으로, 시험관내 동역학 데이터를 내부에서 수집하였고, 전형적인 효소 수준이 이. 콜라이에서 발견되었으며, 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 이들 조건 하에 발현되는 Qor-1 효소의 천연량은 <100 μM이고, 아마도 0.1-100 μM 범위일 것으로 추정된다.
알돌 부가, 탈수, 및 후속 환원이 3종의 별도 효소에 의해 수행되는, 3-효소 시스템과 비교하여, 2-효소 시스템을 사용하여 제공되는 기술은 중요한 개선을 제공하였는데, 예를 들어, (1) 3종 효소보다는 오직 2종 효소가 발현되는 것이 필요하고 - 따라서 반응이 생체 내에서 수행될 때 요구되는 촉매를 감소시키고, 단백질 생성을 위한 세포 자원을 감소시키며, (2) 알돌 부가 및 축합 반응 둘 모두를 단일 생합성 폴리펩티드가 수행하여서, 반응 평형이 과정을 통해서 실현가능한 전체 수율쪽으로 호의적일 수 있는, 바람직한 생성물의 생성 방향쪽으로 이동된다.
클로닝, 및 발현: 표 5에 표시된 이종성 알돌라제 히드라타제 및 퀴논 옥시도리덕타제 효소를 코딩하는 DNA는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었고 상업적 DNA 합성 회사에서 합성하였다. 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각의 유전자는 2종의 상용성 플라스미드 상에서 T7 RNA 중합효소 프로모터의 하류 및 T7 종결자 서열의 상류에 클로닝되었다. 추가로, 선택된 알데히드가 3-히드록시-프로피온알데히드인 실험에서, B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소 (하기와 같은 5종 유전자를 포함하는 락토모쿠스 류테리 글리세롤 데히드라타제: pduC [Uniprot ID No. A5VMB2]; pduD [Uniprot ID No. A5VMB1]; pduE [Uniprot ID No. A5VMB0]; pduG [Uniprot ID No. A5VMA9]; 및 pduH [Uniprot ID No. A5VMA8])를 또한 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 3-히드록시-프로피온알데히드를 생성시킬 수 있도록 제3 상용성 플라스미드에 클로닝하였다. 플라스미드로 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC ΔpoxB ΔpflB ΔackA-pta ΔyqhD, ΔadhP, ΔeutG, ΔgldA, ΔyiaY, ΔfucO를 형질전환시켰다. 재조합 단백질 발현은 실시예 1에서 상기 기술된 바와 같이 수행되었다.
효소 어세이: 실시예 1과 동일하다.
생성물의 분석: 실시예 1에 기술된 등용매 HPLC 방법을 사용하여 효소 생성물, 즉, 2-케토-카르복실산의 생성을 검출하고 정량하였다.
실시예 4: 1,5-펜탄디올의 생성을 위한 생합성 경로
이 실시예는 1,5-펜탄디올을 피루베이트 및 3-히드록시-프로피온알데히드로부터 생성하기 위한 생합성 경로를 기술한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 피루베이트 및 3-히드록시-프로피온알데히드로부터의 생합성 경로는 5개 반응을 포함한다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로피온알데히드를 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로 전환시키는 단계를 포함하는, 처음 3개 반응은 실시예 3에 기술되어 있다. 경로의 나머지 2개 단계로부터의 양쪽 기지의 효소는 하기에 기술된다. 특히, 효소는 생체내에서 완전한 경로를 입증하는 단계를 포함하는, 모든 5개 반응에 대해 검증되었다 (실시예 5 참조).
단계 1-3: 피루베이트 및 3-히드록시-프로피온알데히드의 6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트로의 전환. 상세 사항은 실시예 3을 참조한다.
단계 4: 6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트의 5-히드록시-펜타날로의 전환. 예시적인 효소는 표 11에 표시되어 있다. 2-케토-산 데카르복실라제 (EC 4.1.1.7)는 (Cn) 2-케토 산의 티아민 디포스페이트 (TPP) 의존적 탈카르복실화를 촉매하여 해당 (Cn-1) 알데히드를 제공한다. 피루베이트에 대한 활성이 최소이거나 또는 전혀없는 장쇄 2-옥소-산에 대한 고-활성을 보유하는 효소는 피루베이트와 교차-반응성이 이 경로의 수율에 극적으로 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하다. 지. 모빌리스 (Z. mobilis) 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)는 피루베이트에 대한 이의 활성에서 극적 감소 (>2000배)와 함께 장쇄 2-옥소-산에 대한 증가된 효율을 위해 이의 활성 부위를 유의하게 변형시키기 위해 돌연변이되었다 (I472A/I476F).7 지. 모빌리스 PDC 돌연변이체 I472A/I476F는 또한 바람직한 기질과 구조적으로 유사한 2-옥소-헥사노에이트에 대해 탁월한 동역학적 성질을 보인다. 이 단계를 촉매하기 위한 다른 유망한 효소 후보는 엘. 락티스 (L. lactis) 분지쇄 케토-산 데카르복실라제 KdcA (케토산 데카르복실라제), 및 피. 푸티다 (P. putida) 벤조일 포르메이트 데카르복실라제 (BFD) 돌연변이체 A460I이다.8-10 슈도모나스 푸티다 (pseudomonas putida) BFD 및 엘. 락티스 (l. lactis) KdcA는 탈카르복실화를 위한 피루베이트와 비교하여 장쇄 2-옥소-산에 대해 >50 내지 500배 선택성을 보인다. 특히, 엘. 락티스 KdcA는 2-옥소-헥산산에 대해 특이적 활성을 가지고 C3 및 C4 위치 상에서의 치환을 견딜 수 있다. 이러한 효소는 탈카르복실화 반응을 촉매하는데 활성인 것으로 확인되었다 (표 14).
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다른 EC 번호를 갖는 데카르복실라제는 또한 이 반응을 수행하는데 적합하다. 대표적인 목록은 표 12에 표시된다.
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Figure pct00106
단계 5: 5-히드록시-펜트알데히드의 1,5-펜탄디올로의 전환. 1차 알콜 데히드로게나제는 1차 알콜로 알데히드의 NAD(P)H-의존적 환원을 촉매한다.
많은 1차 알콜 데히드로게나제가 문헌에 공지되어 있고, 이 단계를 촉매하는 예시적인 후보는 하기에 기술되고 하기 표 13에 표시된다. AdhE, adhP, eutG, yiaY, yqhD, fucO, 및 yjgB를 포함하는, 다수의 이. 콜라이 알콜-알데히드 데히드로게나제가 공지되어 있다.11 최근에, 44종 알데히드 리덕타제가 이. 콜라이에서 확인되었다. 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum) 유래의 부탄올 데히드로게나제12 는 이들 전환을 촉매하는데 흥미롭다. 다수의 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 알콜 데히드로게나제는 ADH2-6을 포함하여 광범위한 상이한 알데히드를 환원시키는 것으로 확인되었다. 특히 흥미로운 것은 장쇄 알칸-분해 균주 지오바실러스 써보데니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) NG80-2로부터의 2종 알킬 알콜 데히드로게나제 (ADH) 유전자13로부터의 ADHI-ADHII이다. 다른 잡다한 ADH는 중간쇄 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 AlrA를 포함한다.14 또한 흥미로운 것은 에이. 탈리아나 (A. thaliana)15, 이. 콜라이 (yihu)16, 및 역시 씨. 엘루이베리 (C. Eluyveri)에서 발견된 4-옥소 부티레이트의 환원을 촉매하는 4-히드록시 부티레이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.61)이다.17 에이. 탈리아나 효소를 비롯하여 에이. 테루스 (A. terrus) 효소 (표 13의 ATEG)는 글루타레이트 세미알데히드를 환원시킬 수 있다 (WO 2010/068953A2, WO 2010/068953A2). 수많은 알콜 데히드로게나제가 이 반응을 수행하는데 흥미롭지만, 5-히드록시 펜타날의 환원을 위한 이의 높은 활성 수준에 기인하여 특히 흥미로운 특이적 효소는 레이프소니아 (Leifsonia) sp. S749 (GenBank ID No. AB213459.1)로부터의 알콜 데히드로게나제이다. 이 효소 및 4종의 다른 알콜 데히드로게나제가 이 반응을 수행하는 것으로 검증되었다 (표 14).
Figure pct00107
Figure pct00108
클로닝, 및 발현: 하기 표 14에 표시된 이종성 2-케토 산 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제 효소를 코딩하는 DNA는 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고 합성되었다. 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각의 유전자는 단일 플라스미드 상에서 T7 RNA 중합효소 프로모터의 하류 및 T7 종결자 서열의 상류에 클로닝되었다. 플라스미드로 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC를 형질전환시켰다. 재조합 단백질 발현은 실시예 1에서 상기 기술된 바와 같이 수행되었다.
Figure pct00109
Figure pct00110
활성 어세이: 외부로부터 공급된 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로부터 1,5-펜탄디올의 생성의 관찰은 2-케토 산 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제 효소의 성공적인 활성을 의미하였다. 따라서 발현 후, 세포를 회수하였고 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)와 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (∼5 g/L) 및 10 g/L 글루코스를 함유하는 0.4 mL의 신선한 배지 (OD600 ∼30)에 15시간 동안 혐기성 조건 하에서 재현탁시켰다. 실온에서 인큐베이션 이후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하였으며 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로부터 1,5-펜탄디올의 형성에 대해 HPLC를 통해 분석하였다.
1,5-펜탄디올 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 1,5-펜탄디올을 검출하고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.05% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행되었고, 후자를 사용해 210 및 260 nm에서 신호를 측정하였다. HPLC 결과는 1,5-펜탄디올의 생성을 보여주었고; 소정 조제물의 결과는 표 14에 표시하였다.
실시예 5: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해 상이한 탄소원으로부터 1,5-펜탄디올의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용
일부 구현예에서, 본 개시는 1,5-펜탄디올을 생성하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 글리세롤이 탄소원으로서 이용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상, 또는 모든, 생합성 단계가 하나의 유기체 (예를 들어, 박테리아) 및 배양물 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다.
도 2에 도시되고 또한 실시예 4에 기술된 물질대사 경로를 사용하여, 이들 탄소원으로부터 유래된 물질대사 전구체 피루베이트 및 3-히드록시-프로피온알데히드를 통해서 글리세롤 및/또는 글루코스같은 탄소원으로부터 1,5-펜탄디올의 생성을 조작하기 위한 예시적인 유기체로서 이. 콜라이를 사용하였다. 바람직한 탄소원 (예를 들어, 글리세롤 및/또는 글루코스)으로부터 이러한 경로를 통해서 1,5-펜탄디올을 제조할 수 있는 이. 콜라이를 생성시키기 위해서, 이 경로의 각각의 개별 효소 및 3-히드록시-프로피온알데히드 생성에 필요한 다른 효소를 코딩하는 핵산은 이. 콜라이에 대해 코돈-최적화되었고 상업적으로 합성하였거나 또는 이. 콜라이 게놈 DNA를 사용한 PCR 증폭을 통해 수득되었다. 유전자를 플라스미드로 클로닝하였고, 이로 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 모든 경로 효소의 생체내 발현 결과로 1,5-펜탄디올이 생성되었다.
1,5-펜탄디올 경로 유전자의 클로닝: 1,5-펜탄디올 경로의 이종성 효소를 코딩하는 DNA는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈-최적화되었고 상업적 DNA 합성 회사 (예를 들어, Twist Biosciences)가 합성하였다. 1,5-펜탄디올 경로의 천연 효소를 코딩하는 DNA는 PCR을 통해 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각의 유전자는 T7 RNA 중합효소 프로모터의 하류 및 종결자 서열의 상류에 클로닝하였다. 유전자에 대한 발현 카세트를 보유하는 상용성 플라스미드는 마커 및 레플리콘의 하기 조합 중 하나를 함유하였다: (1) 클로람페니콜 마커 + P15A 레플리콘, (2) 암피실린 마커 + ColE1 레플리콘, 및 (3) 카나마이신 마커 + COLA 레플리콘. 사용된 유전자의 예는 다음을 포함한다: Ads-Hyd 8 (Uniprot ID No. A0A286PH18), Qor-1 (Uniprot ID No. P28304), 6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트 데카르복실라제 (Uniprot ID No. Q6QBS4), 5-히드록시-펜타날 1-리덕타제라고도 하는 1차 알콜 데히드로게나제 (GenBank ID No. AB213459.1). 추가로, 비타민 B12-독립적인 글리세롤 데히드라타제 효소 (예를 들어, 하기 2개 서브유닛을 포함하는 클로스트리듐 부티리쿰 글리세롤 데히드라타제: DhaB1 [Uniprot ID No. Q8GEZ8]; DhaB2 [Uniprot ID No. Q8GEZ7]) 또는 B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소 (하기와 같은 5종 유전자를 포함하는 락토코쿠스 류테리 글리세롤 데히드라타제: pduC [Uniprot ID No. A5VMB2]; pduD [Uniprot ID No. A5VMB1]; pduE [Uniprot ID No. A5VMB0]; pduG [Uniprot ID No. A5VMA9]; 및 pduH [Uniprot ID No. A5VMA8])를 또한 이러한 효소를 사용해 글리세롤로부터 만들 수 있는 1,5-펜탄디올 경로 전구체인 3-히드록시-프로피온알데히드를 생성할 수 있도록 클로닝하였다. 락토코쿠스 류테리 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 모든 5종 유전자는 단일 유전자 오페론으로서 클로닝하였다.
1,5-펜탄디올의 생성을 위한 균주(들)의 구축: 이. 콜라이 균주 BL21* (DE3) ΔldhA 가 1,5-펜탄디올 경로 효소의 시험을 위한 배경 균주로서 사용되었다. 경로 효소를 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드는 이. 콜라이의 형질전환과 연관된 표준 전기영동 방법을 사용해 형질전환시켰다.
1,5-펜탄디올의 생성: 하기 발현 균주는 이. 콜라이로 하기 플라스미드를 순차적으로 형질전환시킨 후에 수득되었다.
균주 PeDO1: 플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 1 (글리세롤 데히드라타제 - DhaB1), 유전자 2 (글리세롤 데히드라타제 - DhaB2), 유전자 3 (Qor 1). 플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1 (6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트 데카르복실라제), 유전자 2 (Ads-Hyd 8). 플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 1 (5-히드록시-펜타날 1-리덕타제).
균주 PeDO2: 플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 1 (글리세롤 데히드라타제 - DhaB1), 유전자 2 (글리세롤 데히드라타제 - DhaB2), 유전자 3 (Qor 1). 플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1 (6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트 데카르복실라제), 유전자 2 (Ads-Hyd 8).
균주 PeDO3: 플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 1 (글리세롤 데히드라타제 - pduCDEGH). 플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1 (6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트 데카르복실라제), 유전자 2 (Ads-Hyd 8), 유전자 3 (5-히드록시-펜타날 1-리덕타제). 플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 1 (Qor 1).
균주 PeDO4: 플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 1 (글리세롤 데히드라타제 - pduCDEGH). 플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1 (6-히드록시-2-옥소-헥사노에이트 데카르복실라제), 유전자 2 (Ads-Hyd 8). 플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 1 (5-히드록시-펜타날 1-리덕타제).
균주 PeDO1 및 PeDO2의 배양: 출발 배양물은 5 mL 2xYT 배지와 1 g/L D-글루코스 및 적절한 항생제를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 1,5-펜탄디올 경로 효소를 위한 세포 배양은 40 mL 성장 배지 중에서 125 mL 배플드 플라스크를 사용하여 수행하였다. 복합 (2xYT) 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 100 mg/L 철 암모늄 시트레이트를 보충하였다. 유도-전 성장은 호기성 조건 하에 30℃에서 2시간 동안 수행하였다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었다. 유도-후 발현은 30분 동안 30℃에서 호기성 조건 하에 수행되었다. 다음으로 세포 배양물을 100 mL 유리병으로 옮겼고, L-시스테인-HCl-단일수화물을 성장 배지에 첨가하였고 (1 g/L 최농 농도), 병을 혐기성 글로브 박스 (Coy Laboratory) 내에서 밀봉하였다. 이어서 배양물은 유리병에서 2시간 동안 30℃에서 혐기성 조건 하에 성장시켰다. 이후에, 세포를 회수하였고 8 g/L 글루코스, 4 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 0.4 mL 신선한 배지 (OD600 ∼30)에 재현탁시켰다. 24시간 동안 실온에 혐기성 조건 하에서 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
균주 PeDO3 및 PeDO4의 배양: 생성 배지는 하기 조성을 함유한다: 1X MOPS 최소 배지, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 글리세롤, 20 g/L 글루코스, 및 10 μM의 시아노코발라민 (pH7.2). 1X MOPS 최소 배지는 40 mM MOPS, 4 mM 트리신, 0.01 mM FeSO4, 9.5 mM NH4Cl, 0.276 mM K2SO4, 0.5 μM CaCl2, 0.525 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 2.92E-7 mM (NH4)2MoO4, 4.0E-5 mM H3BO3, 3.02E-6 mM CoCl2, 9.62E-7 mM CuSO4, 8.08E-6 mM MnCl2, 9.74E-7 mM ZnSO4, 및 1.32 mM K2PO4 로 구성된다. 씨드 배양물은 10 mL 2xYT 배지 및 적절한 항생제를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 1,5-펜탄디올 생성을 위한 세포 배양물은 마개 존재의 125 mL 플라스크 중 적절한 항생제와 10 mL 생성 배지를 사용해 제조하였고, 1 mL의 씨드 배양물을 접종하여 세포가 유도 전 2시간 동안 37℃에서 성장될 수 있게 하였다. 2시간 후에, 세포 배양물은 0.1 mM IPTG로 유도시켰고 배양물이 생성을 시작하도록 26℃로 옮겼다. 12시간마다 호기적으로 샘플을 채취하였고 마지막 샘플은 72시간에 채취하였으며, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
1,5-펜탄디올 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 1,5-펜탄디올을 검출하고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.05% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자를 사용하여 210 nm 및 260 nm에서 신호를 측정하였다. HPLC 결과는 800 mg/L (균주 PeDO1), 400 mg/L (PeDO2), 212 mg/L (PeDO3), 및 41 mg/L (PeDO4)의 최종 역가에서 분명한 1,5-펜탄디올 생성을 보였다.
1,5-펜탄디올 생성을 위한 추가 작업예:
상기 기술된 균주를 사용한 1,5-펜탄디올을생성의 성공을 기반으로, 1,5-펜탄디올의 생성에 대해 실시예 2 및 3에서 확인된 대체 퀴논 옥시도리덕타제의 사용을 평가하였다. 간략하게, 상기 기술된 실시예에서 균주 PeDO3의 플라스미드 조합이 사용되었고, 플라스미드 3은 상이한 Qor 효소 즉 Qor-1 (Uniprot ID No. P28304), Qor-2 (Uniprot ID No. P40783), 및 Qor-5 (Uniprot ID No. P43903)를 함유하였다. 균주 구축, 생성, 및 분석 방법은 상기 기술된 것과 동일하였다. 균주 PeDO5 (Qor-1 함유), 균주 PeDO6 (Qor-2 함유), 및 균주 PeDO6 (Qor-5 함유)는 상기 기술된 생성 조건 하에서 각각 ∼2 g/L, 2.2 g/L 및 2.4 g/L 1,5-펜탄디올의 생성을 이끌었다.
실시예 6: 6-히드록시-헥사노에이트 중간체로부터 1,6-헥산디올의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용
일부 구현예에서, 본 개시는 6HH 및 HDO를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 6-히드록시-헥사노에이트 (6HH) 중간체로부터 1,6-헥산디올의 생성을 위한 생합성 경로는 도 3에 도시된다. 6HH로부터 1,6-헥산디올의 생성을 검증하기 위해 이러한 경로의 각 단계에 대한 상이한 효소의 사용을 도입시키는 실시예는 하기에 표시된다. 6HH 중간체로부터 1,6-헥산디올 생합성 경로의 각 단계를 수행하는데 사용된 그들이 유전자 및 그들이 코딩한 해당 효소의 예는 하기 표 15에 표시된다. 여기서의 각 효소는 동일한 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다.
Figure pct00111
유전자 1에 의해 코딩되는, 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제라고 명명된 효소에 의해 촉매되는 반응: 6-히드록시-헥사노에이트 --> 6-히드록시-헥사날. 유전자 2에 의해 코딩되는 효소: 6-히드록시헥사노에이트 1-리덕타제 활성제. 유전자 3에 의해 코딩되는, 6-히드록시헥사날 1-리덕타제로 명명된 효소에 의해 촉매되는 반응: 6-히드록시-헥사날 --> 1,6-헥산디올
(i) HDO 생성을 위한 플라스미드의 제조:
HDO 생성 경로 유전자는 하기 표시된 2개 플라스미드에 클로닝하였다. 합성 유전자는 상업적 판매사로부터 수득하였고, 각 유전자는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 각 유전자는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 그 자신의 T7 프로모터 및 종결자 하에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이는 1,6-헥산디올 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용되었다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 MG1655 (DE3) Δrne131, ΔldhA에서 모든 2개 플라스미드의 공-형질전환 이후에 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1. 플라스미드 2 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 2, 및 유전자 3
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 HDO 생성 분석:
출발 배양물은 적절한 항생제가 존재하는 10 mL LB를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 HDO 생성을 위한 세포 배양물은 유리병을 사용하여 100 mL 부피로 수행하였다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 수행하였다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용하여 유도하였다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건하에서 60-90분 동안 이후에 혐기성 조건에서 2-3시간 동안 수행하였다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, ∼10 g/L 글루코스, 6-히드록시-헥사노에이트 (∼5 g/L), 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 ∼40의 OD600에서 0.5 mL 부피 중에 재현탁시켰다. 실온에서 24시간 동안 인큐베이션 이후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하였으며 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출하였고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 표 15에서 모든 실시예의 경우에서 0.1 내지 2.5 g/L의 1,6-헥산디올의 생성을 보여주었다.
실시예 7: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 1,6-헥산디올의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 6HH 및 HDO를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 1,6-헥산디올의 생성을 위한 생합성 경로는 도 3에 도시된다. 이 경로를 통한 1,6-헥산디올의 생성을 검증하기 위해서 각 단계에 대한 상이한 효소의 사용을 도입시킨 실시예가 하기에 표시된다. 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 1,6-헥산디올 생합성 경로의 각 단계를 수행하기 위해 사용된 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예는 하기 표 16에 표시된다. 그에서의 각 효소는 동일한 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다. 추가로, 하기 실시예는 CoA-전달 반응 및 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 탈수 반응 둘 모두를 수행하기 위한 다수 효소의 확인을 강조한다.
(i) HDO 생성을 위한 플라스미드의 제조:
Figure pct00112
Figure pct00113
HDO 생성 경로 유전자는 하기 표시된 2개의 별도 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 각각의 플라스미드는 표시된 바와 같이, 상이한 복제 기원 및 항생제 마커를 가졌다. 합성 유전자는 상업적 판매처로부터 수득하였고, 각각의 유전자는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 각각의 유전자는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 이 자신의 T7 프로모터 및 종결자 하에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이는 1,6-헥산디올 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용하였다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA에 모든 3종 플라스미드를 공-형질전환시킨 후에 수득되었다.
플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 10, 유전자 9,
플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1, 유전자 2, 유전자 3, 및 유전자 4
플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 11.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 HDO 생성 분석:
출발 배양물은 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 HDO 생성을 위한 세포 배양물은 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지가 사용되었고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도하였다. 유도-후 발현은 30℃에서 호기성 조건 하에 60-90분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 수행하였다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, ∼10 g/L 글루코스, 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (∼5 g/L), 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 ∼40의 OD600에서 0.5 mL 부피에 재현탁하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하였고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출 및 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 각각 표 16의 실시예 7A-7E의 경우에 700 mg/L, 1.2 g/L, 1.1 g/L, 1.1 g/L, 및 1 g/L의 1,6-헥산디올의 생성을 확인하였다.
실시예 8: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해 상이한 탄소원으로부터 1,6-헥산디올의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 6HH 및 HDO를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 탄소원으로서 글리세롤을 사용해 HDO를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 생성은 하나의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각 생합성 폴리펩티드의 상이한 세트를 발현하는 둘 이상의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 단일 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각 독립적으로 하나 이상의 생합성 반응을 수행하는, 둘 이상의 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양물은 HDO 생성을 위한 둘 이상 또는 모든 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해서 1,6-헥산디올의 생성을 위한 생합성 경로가 도 3에 도시된다. 이 경로를 통한 1,6-헥산디올의 생성을 위해 알돌라제-히드라타제 기반 2 효소 시스템의 사용을 도입시킨 실시예 (8a 및 8b)가 하기에 표시된다. 비타민 B12-독립적인 글리세롤 데히드라타제 효소 또는 B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소는 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 만들어질 수 있는 3-히드록시-프로피온알데히드 - 1,6-헥산디올 경로 전구체를 생성할 수 있도록 클로닝될 수 있다. B12-의존적 글리세롤 데히드라타제가 본 명세서에서 사용되었다. 1,6-헥산디올 생합성 경로를 비롯하여 3-히드록시-프로피온알데히드의 생성의 각 단계를 수행하기 위해 사용된 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예는 표 17에 표시된다. 본 명세서의 각 효소는 동일한 E.C 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다는 것을 유의하는 것이 중요하다.
Figure pct00114
Figure pct00115
실시예 8a: 단일 이. 콜라이 균주에서 1,6-헥산디올 (HDO)의 생성
(i) HDO 생성을 위한 플라스미드의 제조:
HDO 생성 경로 유전자는 하기 표시된 3종의 별도 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 각각의 플라스미드는 표시된 대로 상이한 복제 기원 및 항생제 마커를 가졌다. 합성 유전자는 상업적 판매처로부터 수득하였고, 각 유전자는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 각 유전자는 표준 분자 생물학을 사용해 그 자신의 T7 프로모터 및 종결자 하에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이는1,6-헥산디올 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용되었다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA에서 모든 3종 플라스미드를 공-형질전환 후 수득되었다.
플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 12, 유전자 13, 유전자 2, 유전자 10
플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 3, 유전자 4, 유전자 1, 및 유전자 9
플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 11.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 HDO 생성 분석:
출발 배양물은 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 HDO 생성을 위한 세포 배양은 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 60-90분 동안 그 이후에 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 수행하였다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 ∼40의 OD600에서 0.5 mL 부피로 재현탁되었다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출 및 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 25-100 mg/L의 1,6-헥산디올의 생성을 보여주었다. 경로의 특별한 단계를 수행하기 위해 이전에 검증된 대체 효소가 이러한 방법론을 사용하여 HDO 생성에 사용될 수 있다는 것을 예시하기 위해서, 유전자 5-7가 각각 Uniport IDs A0A2X3BK09, A0A2X3BU19, 및 A0A1V9IXA9에 의해 코딩되는 것인 대체 HDO 생성 균주를 상기 방법을 사용해 구축하고 평가하였다. 이러한 생성 균주는 >10 mg/L의 1,6-헥산디올의 생성을 이끌었다.
실시예 8b: 2종 이. 콜라이 균주에서 1,6-헥산디올 (HDO)의 생성
(i) HDO 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조
플라스미드로부터 발현된 HDO 생성 경로 유전자의 수를 최소화시키기 위해서, 이. 콜라이 발현 균주는 소정 경로 유전자가 게놈에 통합된 것으로 구축하였다. 특히, arsB 위치에 HDO 경로 유전자 (유전자 12, 유전자 13)를 함유하는 HDO 생성 균주 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA는 각 유전자의 발현이 그 자신의 T7 프로모터에 의해 제어된다. 나머지 HDO 생성 경로 유전자는 상기 실시예에 기술된 기술을 사용하여 하기 도시된 4종의 별도 플라스미드에 클로닝하였다. 유전자의 동일성은 실시예 8a에 기술되었다. 2종의 이. 콜라이 기반 발현 균주를 구축하였다. 발현 균주 1은 이. 콜라이에 플라스미드 1 및 플라스미드 2의 공-형질전환 후에 수득되었고, 발현 균주 2는 이. 콜라이에 플라스미드 3 및 플라스미드 4의 공-형질전환 후에 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 4, 유전자 3, 및 유전자 1.
플라스미드 2 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 2.
플라스미드 3 (RSF 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 4, 및 유전자 11.
플라스미드 4 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 9 및 유전자 10.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 HDO 생성 분석:
출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대한 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 HDO 생성을 위한 세포 배양은 별도로 각 발현 균주에 대한 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분을 보충하였다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 30분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 이후에, 양쪽 발현 균주로부터의 세포는 동일한 양으로 혼합하였고, 이후에 그들을 회수하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 재현탁하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출 및 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 100-550 mg/L의 1,6-헥산디올의 생성을 보여주었다.
실시예 9: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 6-히드록시헥사노에이트의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용
일부 구현예에서, 본 개시는 6HH를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 생성은 하나의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각이 생합성 폴리펩티드의 상이한 세트를 발현하는 둘 이상의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 단일 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각 독립적으로 하나 이상의 생합성 반응을 수행하는, 둘 이상의 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양물은 6HH 생성을 위해 둘 이상 또는 모든 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L의 6HH이다. 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 6-히드록시헥사노에이트 (6HH)의 생성을 위한 생합성 경로는 도 4에 도시된다. 이러한 경로를 통해 6HH의 생성을 검증하기 위한 이 경로의 각 단계에 대한 상이한 효소의 사용을 도입시킨 실시예가 하기에 표시된다. 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 6HH 생합성 경로의 각 단계를 수행하는데 사용되는 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예가 표 18에 표시된다. 여기서 각각의 효소는 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다. 추가로, 하기 실시예는 CoA-전달 반응 및 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 탈수 반응 둘 모두를 수행하기 위한 다수 효소의 확인을 강조한다.
(i) 6HH 생성을 위한 플라스미드의 제조:
6HH 생성 경로 유전자는 하기 표시된 2종의 별도의 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 각각의 플라스미드는 표시된 바와 같은, 상이한 복제 기원 및 항생제 마커를 가졌다. 합성 유전자는 상업적 판매처로부터 수득하였고, 각 유전자는 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 각 유전자는 표준 분자 생물학 방법을 사용해 그 자신의 T7 프로모터 및 종결자 하에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이가 6HH 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용되었다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA에서 모든 3종 플라스미드의 공-형질전환 후 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1, 유전자 2, 및 유전자 3 (오직 실시예 6 및 7)
플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 4, 유전자 5, 유전자 6, 및 유전자 7.
Figure pct00116
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 6HH 생성 분석:
출발 배양물은 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 6HH 생성을 위한 세포 배양은 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도하였다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 60-90분 동안 그 이후에 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 수행하였다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 ∼10 g/L 글루코스, 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (5-10 g/L), 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 재현탁되었다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출 및 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 표 18의 실시예 9A-9G의 균주로부터 ∼0.4-5 g/L 의 6HH의 생성을 확인하였다.
실시예 10: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해 상이한 탄소원으로부터 6-히드록시헥산산 (6HH)의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용
일부 구현예에서, 본 개시는 6HH를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 탄소원으로서 글리세롤을 사용해 6HH를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 생성은 하나의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각이 생합성 폴리펩티드의 상이한 세트를 발현하는 둘 이상의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 단일 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각 독립적으로 하나 이상의 생합성 반응을 수행하는, 둘 이상의 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양물은 6HH 생성을 위한 둘 이상 또는 모든 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통한 6HH의 생성을 위한 생합성 경로는 도 4에 도시된다. 이 경로를 통해 6HH의 생성을 위한 알돌라제-히드라타제 기반 2 효소 시스템의 사용을 도입한 실시예가 하기에 표시된다. 비타민 B12-독립적인 글리세롤 데히드라타제 효소 또는 B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소는 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 만들 수 있는 3-히드록시-프로피온알데히드 - 6HH 경로 전구체를 생성시킬 수 있도록 클로닝될 수 있다. 양쪽 유형의 글리세롤 데히드라타제가 본 명세서에서 사용되었지만, 표 19에 표시된 등재물들은 B12-독립적 글리세롤 데히드라타제 효소를 사용하는 실시예에 집중한다. 여기서 각 효소는 6HH를 산출하기 위해 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있고, 표 19의 실시예 10B 및 10C는 CoA-전달 반응 및 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 탈수 반응 둘 모두를 촉매하는 효소가 동종 효소로 대체되었다는 이러한 점을 입증한다.
(i) 6HH 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조:
플라스미드로부터 발현되는 6HH 생성 경로 유전자의 수를 최소화하기 위해서, 이. 콜라이 발현 균주는 소정 경로 유전자가 게놈에 통합된 것으로 구축하였다. 특히, 6HH 생성 균주 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA는 arsB 위치에 6HH 경로 유전자 (유전자 12, 유전자 13)를 함유하고 각 유전자의 발현은 그 자신이 T7 프로모터에 의해 제어된다. 나머지 6HH 생성 경로 유전자는 상기 실시예에 기술된 기술을 사용해 하기 표시된 2종 별도 플라스미드에 클로닝되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 4, 유전자 3, 및 유전자 1.
플라스미드 2 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 2.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 6HH 생성 분석:
출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대해 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 HDO 생성을 위한 세포 배양은 별도로 각 발현 균주에 대한 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에 30분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지에 재현탁시켰다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
Figure pct00117
Figure pct00118
(iii) 6HH 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 HDO를 검출 및 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 표 19의 실시예 10A-10C의 균주로부터 ∼50-800 mg/L의 6HH의 생성을 보여주었다. 대안적인 실시예는 B12-의존적인 글리세롤 데히드라타제 pduCDEGH (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커를 갖는 제3 플라스미드 상의 단일 유전자 오페론으로서 코딩됨)가 B12-독립적 글리세롤 데히드라타제 대신에 사용되었고, 경로의 효소의 나머지는 실시예 10A와 동일하였다. 이러한 시스템은 또한 실시예 5에서 B12-의존적 효소를 함유하는 균주 PeDO3 및 PeDO4에 대해 기술된 배양 조건을 사용해 ∼350 mg/L의 6HH의 생성을 이끌었다.
실시예 11: 6-히드록시-헥사노에이트 (6HH) 중간체로부터 아디프산 (AA)의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 AA를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-헥사노에이트 중간체를 통해서 AA의 생성을 위한 생합성 경로는 도 5에 도시된다. 표 20은 6HH의 AA로의 전환을 가능하게 하는 효소의 예를 표시한다. 여기서 각 효소가 AA를 산출하기 위해 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다는 것을 유의하는 것이 중요하다.
Figure pct00119
(i) 6HH로부터 AA 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조: AA 생성 경로 유전자는 이전 실시예에 기술된 기술을 사용해 하기 표시된 단일 플라스에 클로닝되었다. BL21*(DE3) Δldh, -ΔadhE, ΔfrdA가 생성 균주로서 사용되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1, 및 유전자 2.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 AA 생성 분석: 출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대한 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장되었다. 발현 및 AA 생성을 위한 세포 배양은 별도로 각 발현 균주에 대해 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 30-120분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며,0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 5-10 g/L 글루코스, 5 g/L 6HH, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지에 재현탁되었다. 3시간 동안 실온에서 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) AA 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용해 AA를 검출하고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 표 20의 실시예 11A 및 11B에 대해 500 - 1500 mg/L의 AA의 생성을 보여주었다.
실시예 12: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 아디프산 (AA)의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 6H2KH로부터 AA를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통한 AA의 생성을 위한 생합성 경로는 도 5에 도시된다. 이러한 경로를 통한 AA의 생성을 검증하기 위해 이 경로의 각 단계에 대한 상이한 효소의 사용을 도입한 실시예가 하기에 표시된다. 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 AA 생합성 경로의 각 단계를 수행하기 위해 사용되는 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예는 하기 표 21에 표시된다. 여기서 각각의 효소는 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다. 표 21의 실시예 12A 및 12B는 이 경로를 통한 AA의 성공적인 생성이 가능하도록 CoA-전달 반응 및 2,6-디히드록시-헥사노일-CoA 탈수 반응 둘 모두를 수행하기 위한 다수 효소의 확인을 강조한다.
(i) 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로부터 AA 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조: AA 생성 경로 유전자는 하기 표시된 2종의 별도 상용성 플라스미드에 클로닝되었다. 각각의 플라스미드는 표시된 바와 같이, 상이한 복제 기원 및 항생제 마커를 가졌다. 합성 유전자는 상업적 판매처로부터 수득되었고, 각 유전자는 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 각 유전자는 표준 분자 생물학 방법을 사용해 그 자신의 T7 프로모터 및 종결자 하에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이는 6HH 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용되었다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC에서 양쪽 플라스미드의 공-형질전환 후에 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 3, 유전자 4, 유전자 9, 및 유전자 10
플라스미드 3 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 및 유전자 8
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 AA 생성 분석: (실시예 11에서 사용된 6HH 대신) 10 g/L의 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트를 기질로서 사용한 것을 제외하고 실시예 11과 동일하였다.
(iii) AA 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용해 상기 기술된 대로 AA를 검출 및 정량하였다. 결과는 표 21의 실시예 12A-12C에 대해 100 - 800 mg/L의 AA의 생성을 보여주었다.
Figure pct00120
Figure pct00121
실시예 13: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해 상이한 탄소원으로부터 아디프산 (AA)의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용
일부 구현예에서, 본 개시는 AA를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 3HPA 및 피루베이트를 사용해 AA를 생성하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 탄소원으로서 글리세롤을 사용해 AA를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 생성은 하나의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각이 생합성 폴리펩티드의 상이한 세트를 발현하는 둘 이상의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 단일 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각 독립적으로 하나 이상의 생합성 반응을 수행하는 둘 이상의 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양물은 AA 생성을 위해 둘 이상 또는 모든 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해 AA의 생성을 위한 생합성 경로는 도 5에 도시된다. 이 경로를 통해 AA의 생성을 위한 알돌라제-히드라타제-기반 2-효소 시스템의 사용을 도입한 실시예가 하기에 표시된다. 비타민 B12-독립적인 글리세롤 데히드라타제 효소 또는 B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소는 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 만들어질 수 있는 3-히드록시-프로피온알데히드 - 6HH 경로 전구체를 생성시킬 수 있도록 클로닝될 수 있다. B12-의존적 글리세롤 데히드라타제는 본 명세서에서 사용되었다. AA 생합성 경로를 비롯하여 3-히드록시-프로피온알데히드의 생성의 각 단계를 수행하는데 사용된 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예는 표 22에 표시된다. 여기서 각각의 효소는 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다.
Figure pct00122
Figure pct00123
(i) AA 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조:
플라스미드로부터 발현되는 AA 생성 경로 유전자의 수를 최소화하기 위해서, 이. 콜라이 발현 균주는 소정 경로 유전자를 게놈에 통합시킨 것을 구축하였다. 특히, AA 생성 균주 BL21*(DE3) Δldh, ΔadhE, ΔfrdA는 arsB 위치에 경로 유전자 (유전자 12, 유전자 13)를 함유하였고 각 유전자의 발현은 이의 자체 T7 프로모터에 의해 제어된다. 2종의 이. 콜라이 기반 발현 균주를 구축하였다. 발현 균주 1은 이. 콜라이에 플라스미드 1 및 플라스미드 2의 공-형질전환 이후에 수득되었고, 발현 균주 2는 이. 콜라이에 플라스미드 3을 형질전환 후 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 4, 유전자 3, 및 유전자 1.
플라스미드 2 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 2.
플라스미드 3 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 9, 유전자 10, 및 유전자 3.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 AA 생성 분석:
출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대한 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장되었다. 발현 및 AA 생성을 위한 세포 배양은 별도로 각 발현 균주에 대해 유리병을 사용해 100 mL 부피에서 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분을 보충하였다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에서 호기성 조건 하에 30분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 재현탁하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) AA 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용해 AA를 검출하고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기) 및 UV 검출기를 사용해 수행하였고, 후자는 전형적으로 210 nm, 260 nm, 및 280 nm에서 신호를 측정하는데 사용되었다. 결과는 20 - 350 mg/L의 AA의 생성을 보여주었다.
실시예 14: 6-히드록시헥사노에이트의 다수-균주 및 다수-포트 생성.
일부 구현예에서, 생성물 예를 들어, 6HH의 생성은 한 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 둘 이상의 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 균주는 함께 생성에서 이용되는 모든 생합성 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 한 균주에서 생합성 폴리펩티드의 생성물은 다른 균주의 생합성 폴리펩티드의 기질이다. 일부 구현예에서, 한 균주의 둘 이상의 생합성 폴리펩티드의 생성물은 독립적으로 하나 이상의 다른 균주에서 둘 이상의 생합성 폴리펩티드의 기질이다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L의 6-히드록시헥사노에이트이다.
상기 실시예 10은 단일 이. 콜라이 균주에서 6HH의 생성을 기술하고, 피루베이트 및 3-히드록시 프로파날의 전환 (및 글리세롤로부터 이의 생성)에 필요한 모든 생합성 경로 효소는 단일 이. 콜라이 균주 내에서 동시에 모두 발현된다. 일부 구현예에서, 전체 생합성 경로가 모듈이라고 불리는 더 작은 섹션으로 분할되고, 각각의 모듈은 그 자신의 고유한 이. 콜라이 균주에서 발현되는 생합성 경로의 일련의 순차적 효소를 포함하는 것인, 다수균주 접근법을 추구하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 전체 6HH 생합성 경로를 2개 모듈로 분할하는 것이 실현가능하였음을 입증하였다. 특히, 단일 이. 콜라이 균주에서 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 - 6HH 생합성 경로의 중간체의 생성을 허용하는, 제1 모듈의 구축은 상기 실시예 3에 기술되고, 피루베이트 및 3-히드록시 프로파날의 전환 (및 글리세롤로부터 이의 생성)에 필요한 모든 효소는 단일 이. 콜라이 균주 내에서 동시에 모두 발현되었다. 제2 (별도) 이. 콜라이 균주에서 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로부터 6HH의 생성을 허용하는, 제2 모듈의 구축은 상기 9에 기술되고, 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트의 6HH로의 전환에 필요한 모든 효소는 이러한 단일 이. 콜라이 균주 내에서 동시에 모두 발현된다. 양쪽 모듈의 사용은 2종의 별도의 이. 콜라이 균주에서 6HH의 생성을 위한 완전한 생합성 경로를 유도한다. 이러한 다수균주 접근법은 다수의 이유로 유리할 수 있는데, 예컨대 제한없이, a) 이들같은 대규모 생합성 경로를 개발하기 위한 플라스미드의 구축 및 시험은 거대 라이브러리를 생성시킬 수 있고, 기능성 (또는 최고) 유전자 구성체를 스크리닝하는 통상의 무차별 방법은 비효율적이고 값비쌀 수 있고; b) 효소 발현는 경로에 걸쳐 단순화되고 균형잡힐 수 있어서 실질적으로 더 빠른 개발 사이클을 초래할 수 있고; c) 각각의 별도 모듈에 대한 이. 콜라이 균주의 유전 배경은 산화환원 반응을 적합화하도록 조율할 수 있고 다른 것들은 각 모듈에 대한 생성을 최대화하는 것을 필요로 한다 (단일 균주 최적화가 전체 경로에 효율적이지 않을 수 있기 때문). 하기 표 23에 요약된 결과는 동시에 (즉, 1-포트) 또는 순차적 생성 방법론을 통해서 6HH의 생성을 위한 이러한 다수-균주 접근법의 성공적인 사용을 입증한다.
Figure pct00124
(i) 6HH 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조:
전체 6HH 생합성 경로는 상기 기술된 바와 같이 2종의 이. 콜라이 균주 (또는 모듈)로 분할되었다. 2종의 이. 콜라이 기반 발현 균주를 구축하였다. 발현 균주 1은 플라스미드 1, 및 플라스미드 2를 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC ΔpoxB ΔpflB ΔackA-pta ΔyqhD, ΔadhP, ΔeutG, ΔgldA, ΔyiaY, ΔfucO에 공-형질전환 후 수득되었고; 발현 균주 2는 플라스미드 3 및 4를 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC에 형질전환 후 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1, 유전자 2, 및 유전자 1.
플라스미드 2 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 9.
플라스미드 3 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 4.
플라스미드 4 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 3.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 6HH 생성 분석:
출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대해 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 6HH 생성을 위한 세포 배양는 별도로 각 발현 균주에 대해 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행되었다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 30분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 이후에, 양쪽 발현 균주로부터의 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 재현탁시켰다. 실시예 14A 경우에, 양쪽 균주로부터 동일 수의 세포를 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 배지에 재현탁시켰다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다. 실시예 14B 경우에, 발현 균주 1로부터의 세포는 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 배지에 현탁시켰다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하였고 발현 균주 2로부터의 세포와 혼합하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) 6HH 생성의 HPLC 분석: 이것은 이전에 언급된 대로 수행되었다. 결과는 350 - 1100 mg/L의 6HH의 생성을 보여주었다.
실시예 15: 1,6-헥산디올의 다수-균주 및 다수-포트 생성.
일부 구현예에서, 본 개시는 HDO를 제조하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 3HPA 및 피루베이트로부터 HDO를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 탄소원으로서 글리세롤을 사용해 HDO를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 생성은 하나의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각이 생합성 폴리펩티드의 상이한 세트를 발현하는 둘 이상의 유기체에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 단일 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생성은 각각이 독립적으로 하나 이상의 생합성 반응을 수행하는, 둘 이상의 박테리아 균주에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양물은 HDO 생성을 위해 둘 이상 또는 모든 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다. 상기 실시예 8은 단일 또는 이중 이. 콜라이에서 HDO의 생성을 기술하고, 피루베이트 및 3-히드록시 프로파날의 전환 (및 글리세롤로부터 이의 생성)에 필요한 모든 생합성 경로 효소는 단일 이. 콜라이 균주 또는 2종의 별도 이. 콜라이 균주에서 동시에 모두 발현된다. 이러한 다수-균주 접근법은 실시예 14에 언급된 다수 이유로 유리할 수 있다. 표 24에 요약된 결과는 동시에 (즉, 1-포트) 또는 순차적 생성 방법론을 통해서 HDO의 생성을 위한 이러한 다수-균주 접근법의 다른 성공적 사용을 입증한다.
Figure pct00125
Figure pct00126
(i) HDO 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조:
전체 HDO 생합성 경로는 상기 기술된 바와 같은 2종의 이. 콜라이 균주 (또는 모듈)로 분할되었다. 2종의 이. 콜라이 기반 발현 균주를 구축하였다. 발현 균주 1은 플라스미드 1, 및 플라스미드 2를 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC ΔpoxB ΔpflB ΔackA-pta ΔyqhD, ΔadhP, ΔeutG, ΔgldA, ΔyiaY, ΔfucO에 공-형질전환 후에 수득하였고; 발현 균주 2는 플라스미드 3 및 4를 이. 콜라이 MG1655 (DE3) rne131 ΔldhA ΔadhE ΔfrdBC에 형질전환 후 수득되었다.
플라스미드 1 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 1, 유전자 2, 및 유전자 1.
플라스미드 2 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 12.
플라스미드 3 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 3, 유전자 9, 유전자 4, 유전자 11, 및 유전자 10.
플라스미드 4 (P15A 레플리콘, 클로람페니콜 마커): 유전자 5, 유전자 6, 유전자 7, 유전자 8, 및 유전자 4.
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 HDO 생성 분석:
출발 배양물은 별도로 각 발현 균주에 대해 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 6HH 생성을 위한 세포 배양은 별도로 각 발현 균주에 대해 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행하였다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분을 보충하였다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 각 발현 균주에 대해 별도로 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도되었고, 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 30분 동안에 이어서 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 별도로 각 발현 균주에 대해 수행되었다. 이후에, 양쪽 발현 균주로부터의 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 재현탁되었다. 실시예 15A의 경우, 양쪽 균주로부터의 동일 수의 세포를 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 배지에 재현탁하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다. 실시예 15B 경우에, 발현 균주 1로부터의 세포는 5-20 g/L 글루코스, 2.5-5 g/L 글리세롤, 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 배지에 현탁하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하였고 발현 균주 2로부터의 세포와 혼합하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) HDO 생성의 HPLC 분석: 이것은 이전에 언급된 바와 같이 수행되었다. 결과는 400 - 800 mg/L의 HDO의 생성을 보여주었다.
실시예 16: 글리세롤로부터 3-히드록시-프로파날의 합성
3-히드록시-프로파날은 글리세롤로부터 글리세롤 데히드라타제를 사용해 합성하였다. 글리세롤 데히드라타제는 재활성화 단백질의 존재 하에서 조효소 B12-의존적 또는 조효소 B12-독립적 방식으로 탈수를 촉매할 수 있다. 조효소 B12-의존적 데히드라타제는 3개 서브유닛: 대형 또는 "α" 서브유닛, 중간형 또는 "β" 서브유닛, 및 소형 또는 "γ" 서브유닛으로 구성된다. 이들 서브유닛은 α2β2γ2 구조로 조립되어 아포효소를 형성한다. 조효소 B12 (활성 보조인자 종)는 아포효소에 결합하여 촉매적으로 활성인 할로효소를 형성한다. 조효소 B12는 촉매반응이 일어나는 라디칼 기전에 관여되므로 촉매 활성에 필요하다. 생화학적으로, 조효소 B12-의존적 글리세롤 및 조효소 B12-의존적 디올 데히드라타제 둘 모두는 글리세롤 및 다른 기질에 의한 기전-기반 자살 불활성화를 겪는 것으로 공지되어 있다 (Daniel et al., FEMS Microbiology Reviews 22:553-566 (1999); Seifert, et al., Eur. J. Biochem. 268:2369-2378 (2001)). 불활성화는 데히드라타제 활성화를 복원하기 위해 데히드라타제 재활성화 인자에 의존하여 극복할 수 있다 (Toraya and Mori (J. Biol. Chem. 274:3372 (1999); 및 Tobimatsu et al. (J. Bacteria 181:4110 (1999)). 데히드라타제 재활성화 및 조효소 B12 재생 과정 둘 모두는 ATP를 요구한다. 글리세롤 데히드라타제, 디올 데히드라타제 및 재활성화 인자의 소수예가 하기에 표시된다. 당업자는 시트로박터 프룬디이 (Citrobacter freundii), 락토코쿠스 류테리 (Lactococcus reuteri), 클로스트리듐 파스퇴리아눔 (Clostridium pasteurianum), 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 케이. 뉴모니아에 (K. pneumoniae) 또는 그들 균주의 글리세롤 데히드라타제; 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca) 또는 케이. 뉴모니아에 (K. pneumoniae)의 디올 데히드라타제; 및 하기 표 25에 열거된 E.C. 군에 속하는 다른 데히드라타제 효소 또는 이들 서열의 동종 효소가 또한 이 단계를 수행하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 효소의 돌연변이체 (미국 특허 제8445659호 및 제7410754호)는 또한 과정의 효율을 증가시키기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있다. 특히, 조효소 B12-독립적-데히드라타제 (Raynaud, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5010-5015 (2003))는 비타민-B12의 고비용으로 인해 산업적 과정에 호의적이다.
Figure pct00127
Figure pct00128
실시예 17: 피루베이트의 합성.
당의 피루베이트로의 전환.
해당과정을 통한 당의 피루베이트로의 전환은 매우 충분히 공지되어 있다. 해당과정에서, 글루코스의 각 몰은 2몰의 ATP, 2몰의 NAD(P)H 형태의 환원 균등물, 및 2몰의 피루베이트를 제공한다.
글리세롤의 피루베이트로의 전환.
글리세롤은 혐기적 및 미세-호기적으로 해당작용 중간체로 전환될 수 있다. 혐기적으로, 글리세롤은 디히드록시아세톤으로 탈수소화되고, (포스포에놀 피루베이트 또는 ATP를 사용한) 인산화 이후에, 디히드록시아세톤 포스페이트 해당작용 경로 중간체로 전환된다 (Dharmadi, et al., Biotechnol. Bioeng. 94:821-829 (2006)). 글리세롤 전환을 위한 호흡 경로는 (ATP에 의한) 글리세롤의 인산화 이후 산화 (전자 억셉터로서 퀴논)되어 해당작용을 통해 피루베이트로 전환될 수 있는 디히드록시아세톤 포스페이트를 제공하는 것을 포함한다 (Booth IR. Glycerol and methylglyoxal metabolism. Neidhardt FC, et al., editors. In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology (web edition). 2005, Washington, DC, ASM Press; Durnin et al., Biotechnol Bioeng. 103(1):148-161 (2009)).
실시예 18: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 2,6-디히드록시-헥사노에이트의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트로부터 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 소정 실시예를 하기에 기술한다.
2,6-디히드록시-헥사노에이트 (6H2HH)를 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체로부터 생성시키기 위한 생합성 경로는 도 4에 도시된다. 6H2KH를 6H2HH로 환원을 위한 상이한 2-케토 리덕타제 효소 즉 6-히드록시-2-옥소헥사노에이트 2-리덕타제의 사용을 도입한 실시예가 하기에 표시된다. 이 단계에 사용된 유전자 및 그들이 코딩하는 해당 효소의 예는 표 26에 표시된다. 여기서 각 효소는 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다.
(i) 6H2HH 생성을 위한 플라스미드의 제조:
6-히드록시-2-옥소헥사노에이트 2-리덕타제를 코딩하는 유전자는 표준 분자 생물학 방법을 사용해 발현이 T7 프로모터에 의해 구동되는 플라스미드에 클로닝되었다. 에스케리치아 콜라이는 6H2HH 생성을 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용되었다. 발현 균주는 전기적격성 이. 콜라이 BL21*(DE3) Δldh에서 모든 3종 플라스미드를 공-형질전환 후 수득되었다.
Figure pct00129
Figure pct00130
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 6H2HH 생성 분석:
출발 배양물은 적절한 항생제와 10 mL LB 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 성장시켰다. 발현 및 6H2HH 생성을 위한 세포 배양은 유리병을 사용해 100 mL 부피로 수행하였다. 복합 성장 배지를 사용하였고 2 g/L D-글루코스, 0.5 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 및 효소 발현에 중요한 다른 기질/영양분이 보충되었다. 유도-전 성장은 ∼2시간 동안 호기성 조건 하에 30℃에서 수행되었다. 재조합 단백질 발현은 0.2-0.4의 OD600에서 250 μM IPTG를 사용해 유도하였다. 유도-후 발현은 30℃에 호기성 조건 하에서 60-90분 동안 그 이후에 2-3시간 동안 혐기성 조건에서 수행하였다. 이후에, 세포를 수확하였고, 농축하였으며, 0.5 mL 부피로 ∼40의 OD600에서 ∼10 g/L 글루코스, 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 (5-10 g/L), 및 15 g/L 포타슘 포스페이트 완충제 (pH 7.2)를 함유하는 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) 6H2HH 생성의 HPLC 분석: 등용매 HPLC를 사용하여 6H2HH를 검출하고 정량하였다. 방법은 Bio-Rad Aminex HPX-87 컬럼, 0.7 mL/분의 0.5% 포름산 (또는 5 mM 황산)을 35℃에서 적용하였다. 검출은 RID (굴절률 검출기)를 사용해 수행하였다. 결과는 표 26의 실시예 1-9의 모든 균주로부터 6H2HH의 생성을 확인하였다.
실시예 19: 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통한 상이한 탄소원으로부터 2,6-디히드록시-섹사노에이트의 생성을 위한 미생물 유기체의 제조 및 사용.
일부 구현예에서, 본 개시는 다양한 탄소원으로부터 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 소정 실시예가 하기에 기술된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 피루베이트 및 3HPA로부터 2,6-디히드록시-헥사노에이트를 생성시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 수율은 약 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg/L 이거나, 또는 약 또는 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.7, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 250, 또는 300 g/L 이다.
피루베이트 및 3-히드록시-프로파날로부터 6-히드록시-2-케토-헥사노에이트 중간체를 통해서 6H2HH의 생성을 위한 생합성 경로는 도 4에 도시된다. 이러한 경로를 통해 6H2HH의 생성을 위한 알돌라제-히드라타제 기반 2 효소 시스템의 사용을 도입시킨 실시예가 하기에 표시된다. 비타민 B12-독립적인 글리세롤 데히드라타제 효소 또는 B12-의존적 효소인 글리세롤 데히드라타제 효소는 이 효소를 사용해 글리세롤로부터 만들 수 있는 3-히드록시-프로피온알데히드 - 6H2HH 경로 전구체를 생성할 수 있도록 클로닝될 수 있다. 글리세롤 데히드라타제의 2가지 유형이 본 명세서에서 사용될 수 있지만, 하기 표시된 실시예는 12-의존적 글리세롤 데히드라타제 효소를 사용한다. 여기서 각각의 효소는 6H2HH를 산출하기 위해 동일 E.C. 클래스에 속하는 동종 효소로 대체될 수 있다.
(i) 6H2HH 생성을 위한 플라스미드 및 균주의 제조: MG1655(DE3)　Δrne131, ΔldhA, Δ[frdB, frdC], ΔadhE, ΔpoxB, ΔpflB, Δ[ackA, pta] 가 하기 플라스미드 조합을 갖는 균주로서 사용되었다: 플라스미드 1 (COLA 레플리콘, 카나마이신 마커): 유전자 1 (글리세롤 데히드라타제 - pduCDEGH). 플라스미드 2 (ColE1 레플리콘, 암피실린 마커): 유전자 2 (Ads-Hyd 8), 유전자 2 (Qor-1), 및 유전자 3 (6-히드록시-2-옥소헥사노에이트 2-리덕타제 - Q5FTU6).
(ii) 세포 배양, 단백질 발현, 및 6H2HH 생성 분석:
세포 배양 (적절한 항생제 존재), 및 단백질 발현은 3-히드록시 프로파날에 대해 실시예 1에 기술된 것과 유사하였다. 24시간 동안 실온에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하였고, 상청액을 여과하고 HPLC를 통해 분석하였다.
(iii) 6H2HH 생성의 HPLC 분석: 분석읜 실시예 18에 언급된 대로 수행되었다. 균주는 이들 조건 하에서 > 1 g/L의 6H2HH를 생성시킬 수 있었다.
균등물
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 제공되는 모든 뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 표시된다.
본 명세서에서 예시적으로 기술되는 구현예는 본 명세서에 특별히 개시하지 않은 임의 구성요소 또는 구성요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 제한없이 광범위하게 판독되어야 한다. 추가로, 본 명세서에서 적용되는 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되었고, 이러한 용어 및 발현의 사용이 표시되고 기술된 특징의 임의 균등물 또는 이의 일부를 배제하려는 의도가 아니지만, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능하다는 것을 인식한다.
본 기술이 상기 양태와 함께 기술되었지만, 전술한 설명 및 실시예는 본 기술의 범주를 예시하려는 의도이고 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 기술의 범주 내에서 다른 양태, 장점, 및 변형은 본 기술이 속하는 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
참조문헌
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
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Gly Ala Thr Ala Ser Ser Ala Gly Gln Arg Ile 145 150 155 160 Ala Glu Ala Lys Ile Thr Leu Glu Gln Pro Val Pro Asp Pro Ala Ala 165 170 175 Leu Met Ser Arg Pro Val Ile Asn Leu Arg His Phe Pro Arg Leu Ala 180 185 190 Ala Gly Gln His Asp Gln Pro Ala Val His Glu Leu Val Met Ser Val 195 200 205 Leu Asp Asp Thr Ala Val Ser Asp Ala Trp Val Gly Thr Ala Asp Leu 210 215 220 Ala Phe Leu Pro Ala His Gly Glu Glu Leu Ala Asp Leu Pro Val Arg 225 230 235 240 Arg Thr Gly Lys Gly Phe His Phe Asp Leu Ala Tyr Thr Val Thr Asp 245 250 255 Leu Met Thr Leu Ala Asp His Ser Ala 260 265 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 2 Met Ser Asn Lys Ile Met Lys Thr Ser Arg Leu Thr Ala Glu Asp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Ala Trp Thr Ile Met Pro Thr Pro Ser Thr Pro Asp Ala Ser 20 25 30 Asp Trp Arg Ser Thr Ala Thr Val Asp Leu Glu Glu Thr Ala Arg Ile 35 40 45 Val Glu Glu Leu Ile Ala Ala Gly Val Asn Gly Ile Leu Ser Met Gly 50 55 60 Thr Phe Gly Glu Cys Ala Thr Leu Thr Trp Asp Glu Lys Arg Asp Tyr 65 70 75 80 Val Ser Thr Ile Val Glu Thr Ile Arg Gly Arg Val Pro Tyr Phe Cys 85 90 95 Gly Thr Thr Ala Leu Asn Thr Arg Glu Val Ile Arg Gln Thr Arg Glu 100 105 110 Leu Ile Asp Ile Gly Ala Asn Gly Thr Met Leu Gly Val Pro Met Trp 115 120 125 Val Lys Met Asp Leu Pro Thr Ala Val Gln Phe Tyr Arg Asp Val Ala 130 135 140 Asp Ala Val Pro Glu Ala Ala Ile Ala Ile Tyr Ala Asn Pro Glu Ala 145 150 155 160 Phe Lys Phe Asp Phe Pro Arg Pro Phe Trp Ala Glu Met Ser Lys Ile 165 170 175 Pro Gln Val Val Thr Ala Lys Tyr Leu Gly Ile Gly Met Leu Asp Leu 180 185 190 Asp Leu Arg Leu Ala Pro Asn Ile Arg Phe Leu Pro His Glu Asp Asp 195 200 205 Tyr Tyr Ala Ala Ala Arg Ile Asn Pro Glu Arg Ile Thr Ala Phe Trp 210 215 220 Ser Ser Gly Ala Met Cys Gly Pro Ala Thr Ala Ile Met Leu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Val Val Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asp Trp Ala Lys Ala Lys Ala 245 250 255 Ile Ser Asp Asp Met Arg Ala Ala Asp Ser Thr Leu Phe Pro Arg Gly 260 265 270 Asp Phe Ser Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Ile Gly Leu Glu Lys Ala Arg 275 280 285 Met Asp Ala Ala Gly Trp Leu Lys Ala Gly Pro Cys Arg Pro Pro Tyr 290 295 300 Asn Leu Val Pro Glu Asp Tyr Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ser Gly Lys 305 310 315 320 Ala Trp Ala Ala Leu His Ala Lys Tyr Ser Asn Glu Leu Lys 325 330 <210> 3 <211> 332 <212> PRT <213> Nocardioides sp. <400> 3 Met Thr Ser Pro Ala Val Thr Ser Ala Asp Ile Thr Gly Leu Val Gly 1 5 10 15 Ile Val Pro Thr Pro Ser Lys Pro Gly Ser Glu Ala Pro Asp Ala Val 20 25 30 Asp Thr Val Asp Leu Asp Glu Thr Ala Arg Met Val Glu Leu Ile Val 35 40 45 Ala Ser Gly Val Asp Val Leu Leu Thr Asn Gly Thr Phe Gly Glu Val 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Tyr Glu Glu Leu Leu Ala Phe Asn Asp Thr Val Ile 65 70 75 80 Arg Thr Val Ala Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Gly Ala Ser Thr Leu 85 90 95 Asn Thr Arg Asp Thr Ile Ala Arg Ser Leu Ala Leu Met Gly Leu Gly 100 105 110 Ala Asn Gly Leu Phe Val Gly Arg Pro Met Trp Leu Pro Leu Asp Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Val Ser Tyr Tyr Ala Ala Val Cys Asp Ala Val Pro Ala 130 135 140 Ala Ala Val Val Val Tyr Asp Asn Thr Gly Val Phe Lys Gly Lys Ile 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Burkholderia sp. <400> 13 Met Ile His Pro Lys Leu Arg Ile Asp Ala Ser Gly Ile Asn Gly Leu 1 5 10 15 Trp Pro Ile Leu Pro Thr Pro Ala Lys Pro Asn Ala Ser Asp Trp Arg 20 25 30 Glu Arg Ser Thr Val Asp Leu Asp Glu Thr Ala Arg Ile Val Glu Ser 35 40 45 Leu Ile Asp Ala Gly Val Asp Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Tyr Gly 50 55 60 Glu Ala His Ser Leu Leu Trp Glu Glu Lys Lys Ala Phe Val Gly Cys 65 70 75 80 Val Leu Glu Thr Ile Arg Gly Arg Ile Pro Phe Phe Thr Gly Thr Thr 85 90 95 Ala Leu Asn Thr Arg Glu Val Val Glu Gln Thr Arg Ala Met His Asp 100 105 110 Met Gly Val Ser Gly Thr Met Leu Gly Val Pro Met Trp Cys Lys Thr 115 120 125 Asp Leu Ala Thr Ala Val Gln Phe Phe Arg Asp Val Thr Glu Ala Cys 130 135 140 Pro Asp Thr Ala Leu Ala Ile Tyr Ala Asn Thr Glu Ala Phe Lys Phe 145 150 155 160 Glu Phe Pro Arg Pro Phe Trp Ala Glu Ile Gly Lys Met Pro Gln Ala 165 170 175 Val Ala Cys Lys Tyr Leu Gly Ile Gly Met Leu Ala Val Asp Leu Glu 180 185 190 Leu Ala Pro Asn Met Arg Phe Leu Pro Asn Glu Gln Asp Tyr Tyr Ala 195 200 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reuteri <400> 80 Met Met Ser Glu Val Asp Asp Leu Val Ala Lys Ile Met Ala Gln Met 1 5 10 15 Gly Asn Ser Ser Ser Ala Asn Ser Ser Thr Gly Thr Ser Thr Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Lys Glu Met Thr Ala Asp Asp Tyr Pro Leu Tyr Gln Lys His 35 40 45 Arg Asp Leu Val Lys Thr Pro Lys Gly His Asn Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Leu Gln Lys Val Val Asn Asn Gln Val Asp Pro Lys Glu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Thr Pro Glu Ala Leu Lys Leu Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Ala Gly 85 90 95 Arg Pro Ala Ile Gln Lys Asn Leu Gln Arg Ala Ala Glu Leu Thr Arg 100 105 110 Val Pro Asp Glu Arg Val Leu Glu Met Tyr Asp Ala Leu Arg Pro Phe 115 120 125 Arg Ser Thr Lys Gln Glu Leu Leu Asn Ile Ala Lys Glu Leu Arg Asp 130 135 140 Lys Tyr Asp Ala Asn Val Cys Ala Ala Trp Phe Glu Glu Ala Ala Asp 145 150 155 160 Tyr Tyr Glu Ser Arg Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asn 165 170 <210> 81 <211> 616 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <400> 81 Met Ala Thr Glu Lys Val Ile Gly Val Asp Ile Gly Asn Ser Ser Thr 1 5 10 15 Glu Val Ala Leu Ala Asp Val Ser Asp 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Glu Phe Gly Pro Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Gly Tyr Asp Gly 35 40 45 Val Val Ile Gln Gln His Gly Ala Ile Pro Glu Glu Met Val Tyr Gln 50 55 60 Lys Leu Lys Ala Phe Gly Ile Lys Gln Leu Thr Leu Arg Ile Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Asp Ile Val Asn Leu Asp Ala Ala Thr Ala Asn Gly Leu Val Val 85 90 95 Thr Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Arg Ser Val Ser Glu Leu Val Leu 100 105 110 Ala Gln Val Met Arg Leu Ile Arg His Leu Gly Glu Ala Ser Ala Arg 115 120 125 Glu Ala Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Leu Glu Ala Pro Glu Ile 130 135 140 His Asn Leu Thr Val Gly Ile Ile Gly Ala Gly Lys Ile Gly Ser Ala 145 150 155 160 Val Ala Arg Ile Phe Arg Ala Leu Gly Ala Thr Val Ile Val Ser Asp 165 170 175 Pro Val Lys Arg Pro Glu Leu Ala Asp Thr Val Ser Tyr Val Asp Leu 180 185 190 Asn Thr Leu Leu Thr Thr Ser Asp Val Val Thr Val His Thr Pro Leu 195 200 205 Asp Gly Leu Thr Thr His Leu Ile Asp Ala Asp Ala Leu Arg Lys Met 210 215 220 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Ile Asn Ala Ala Arg Gly Pro Ile Val Asp 225 230 235 240 Thr Glu Ala Leu Ile Lys Ala Leu Asn Asp His Thr Ile Ala Gly Ala 245 250 255 Ala Leu Asp Thr Ile Glu Gly Glu Ala Gly Ile Phe Gly Glu Asp Arg 260 265 270 Ser Gln Thr Leu Val Asp Asn Gln Thr Leu Glu Thr Leu Lys Ala Met 275 280 285 Pro Asn Val Glu Ile Ser Pro His Ile Gly Phe Tyr Thr Asp Ala Ala 290 295 300 Val Lys Asn Met Ile Asp Ile Ser Leu Asp Asp Val Lys Thr Ile Leu 305 310 315 320 Glu Gly Gly Lys Ser Ala His Gln Val Asn 325 330 <210> 103 <211> 332 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Lactobacillaceae family sequence <400> 103 Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe 1 5 10 15 Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro 20 25 30 Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Val Tyr Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys 50 55 60 Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val 65 70 75 80 Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser 85 90 95 Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr 100 105 110 Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu 115 120 125 Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn 130 135 140 Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala 145 150 155 160 Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val 165 170 175 Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala 195 200 205 Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met 210 215 220 Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp 225 230 235 240 Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala 245 250 255 Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu 260 265 270 Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg 275 280 285 Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala 290 295 300 Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile 305 310 315 320 Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp 325 330 <210> 104 <211> 331 <212> PRT <213> Clostridium sporogenes <400> 104 Met Lys Ile Leu Ala Tyr Cys Val Arg Pro Asp Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 Lys Asn Phe Ser Glu Lys Tyr Gly His Thr Val Asp Leu Ile Pro Asp 20 25 30 Ser Phe Gly Pro Ser Val Ala His Leu Ala Lys Gly Tyr Asp Gly Ile 35 40 45 Ser Ile Leu Gly Asn Asp Thr Cys Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile 50 55 60 Lys Asp Cys Gly Ile Lys Tyr Leu Ala Thr Arg Thr Ala Gly Val Asn 65 70 75 80 Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Lys Glu Phe Gly Ile Asn Val Ala Asn 85 90 95 Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ser Val Ser Glu Phe Thr Val Gly Leu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Thr Arg Lys Ile Pro Phe Ala Leu Lys Arg Val Glu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Ala Leu Gly Gly Leu Ile Gly Val Glu Leu Arg Asn 130 135 140 Leu Thr Leu Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Glu Gly Phe Ser Gly Phe Gly Met Lys Lys Met Ile Gly Tyr Asp Ile 165 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Leu Glu Glu Asn Lys 245 250 255 Ile Ala Gly Ala Ala Leu Asp Thr Phe Glu Asn Glu Gly Leu Phe Leu 260 265 270 Asn Lys Val Ile Asp Pro Thr Lys Ile Pro Asp Pro Gln Leu Asp Lys 275 280 285 Leu Leu Lys Met Asp Gln Val Leu Ile Thr His His Val Gly Phe Phe 290 295 300 Thr Thr Thr Ala Val Gln Asn Met Val Asp Thr Ser Leu Asp Ser Val 305 310 315 320 Met Glu Val Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Lys Ala Asn 325 330 <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 106 His His His His His His 1 5

Claims (73)

  1. 피루베이트 및 지방족 알데히드를 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알돌-탈수 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
    지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
    알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기와 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 히드라타제-알돌라제이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 EC 번호 4.1.2.45 또는 EC 번호 4.1.2.34, 또는 EC 4.1.1.4를 갖는 효소이거나 또는 그를 포함하거나, 또는 표 1 및 5-8로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드는 미생물 중에 존재하는 것인 방법.
  5. 알켄을 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시켜서 알켄 환원 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
    알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고;
    알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어 알켄 환원 생성물을 제공하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 알켄은 제1항의 알돌-탈수 생성물인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드는 EC 1.6.5에 속하는 효소이거나 또는 그를 포함하거나, 또는 표 9로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 지방족 알데히드는 하기 화학식 A-1의 구조 또는 이의 염을 갖는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-C(O)H,
    A-1
    (상기 화학식에서,
    Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
    L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
    -Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
    각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
    R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
    둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리임).
  9. 제8항에 있어서, 알돌-탈수 생성물은 하기 화학식 P-2의 구조 또는 이의 염을 갖는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH=CH-C(O)-C(O)OH,
    P-2
    (상기 화학식에서,
    Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
    L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
    -Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
    각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R'이고;
    R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
    둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리임).
  10. 제9항에 있어서, -CH=CH- 는 E 입체배열인 방법.
  11. 제9항에 있어서, -CH=CH- 는 Z 입체배열인 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알켄 환원 생성물은 하기 화학식 P-3의 구조 또는 이의 염을 갖는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH,
    P-3
    (상기 화학식에서,
    Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
    L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
    -Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
    각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
    R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
    둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리임).
  13. 제5항에 있어서, 알켄 환원 생성물을 하기 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    HO-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH
    P-10
  14. 제5항에 있어서, 알켄 환원 생성물을 하기 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH
    P-10'
  15. 제12항에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-4의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH,
    P-4
    (상기 화학식에서,
    Ra 는 R" 또는 -OR"이고,
    L1 및 L2 의 각각은 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-20 지방족 또는 C1-20 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환되고;
    -Cy- 는 2가, 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리이고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리이고;
    각각의 R" 은 독립적으로 -R', -C(O)R', -CO2R', 또는 -SO2R' 이고;
    R' 은 수소, 또는 C1-10 지방족, 1-5 이종원자를 갖는 C1-10 헤테로지방족, 6-10원 아릴 고리, 1-5 이종원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴 고리, 및 1-5 이종원자를 갖는 3-10원 헤테로시클릭 고리로부터 선택되는 임의 치환된 기이거나, 또는
    둘 이상의 R' 기는 그들의 개재 원자와 함께 개재 원자 이외에도, 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환된 3-20원 단환식, 이환식 또는 다환식 고리를 형성하고, 각각의 단환식 고리는 독립적으로 0-5 이종원자를 갖는 임의 치환, 포화, 부분 포화 또는 방향족 3-20원 고리임).
  16. 제15항에 있어서, 전환은 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 카르보닐 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 화학식 P-4의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA
    P-5
  18. 제17항에 있어서, 전환은 화학식 P-4의 화합물 또는 이의 염을 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH=CH-C(O)-S-CoA
    P-6
  20. 제19항에 있어서, 전환은 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염을 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA,
    P-7
  22. 제21항에 있어서, 전환은 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염을 2,3-에노일-CoA 리덕타제이거나 또는 그를 포함하는 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH,
    P-8
  24. 제23항에 있어서, 전환은 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염을 CoA 전달 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 (식에서, L2 는 -CH2-L2'-임) 또는 이의 염을 하기 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    H-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH,
    P-9
    (상기 화학식에서,
    L2' 은 공유 결합, 또는 2가, 임의 치환된, 선형 또는 분지형 C1-19 지방족 또는 C1-19 헤테로지방족이고, 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의로 독립적으로 -C≡C-, -C(R")2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R")-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR")-, -C(O)N(R")-, -N(R")C(O)N(R")-, -N(R")C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R")-, -C(O)S-, 또는 -C(O)O- 에 의해 치환됨).
  26. 제25항에 있어서, 전환은 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 알콜 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함하는 산화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    HO-C(O)-L2'-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH,
    P-10
  28. 제27항에 있어서, 전환은 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 산화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H,
    P-9'
  30. 제29항에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염을 카르복실 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH,
    P-10'
  32. 제31항에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 리덕타제 또는 1차 알콜 데히드로게나제이거나 또는 그를 포함하는 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제12항에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H
    P-4'
  34. 제33항에 있어서, 화학식 P-3의 화합물 또는 이의 염을 탈카르복실화 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH,
    P-5'
  36. 제35항에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염을 알데히드 환원 생성물 생합성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, Ra 는 -H인 방법.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, Ra 는 -OH인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, L1 은 임의 치환된 C1-6 알킬렌인 방법.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, L1 은 미치환된 C1-6 알킬렌인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 알킬렌은 -CH2- 인 방법.
  42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2- 인 방법.
  43. 제39항 또는 제40항에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2CH2- 인 방법.
  44. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, L1 은 공유 결합인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, L2 는 공유 결합인 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, L2 는 임의 치환된 C1-6 알킬렌인 방법.
  47. 제1항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, L2 는 미치환된 C1-6 알킬렌인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 알킬렌은 -CH2- 인 방법.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2- 인 방법.
  50. 제46항 또는 제47항에 있어서, 알킬렌은 -CH2CH2CH2- 인 방법.
  51. 제8항에 있어서, 지방족 알데히드는 HO-CH2-CH2-CHO 인 방법.
  52. 제9항에 있어서, 알돌-탈수 생성물은 HO-CH2-CH2-CH=CH-C(O)-COOH 또는 이의 염인 방법.
  53. 제12항에 있어서, 알켄 환원 생성물은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-COOH 또는 이의 염인 방법.
  54. 제15항에 있어서, 카르보닐 환원 생성물은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-COOH 또는 이의 염인 방법.
  55. 제16항에 있어서, 화학식 P-5의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-CO-S-CoA 또는 이의 염인 방법.
  56. 제18항에 있어서, 화학식 P-6의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CO-S-CoA 또는 이의 염인 방법.
  57. 제20항에 있어서, 화학식 P-7의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-S-CoA 또는 이의 염인 방법.
  58. 제23항에 있어서, 화학식 P-8의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염인 방법.
  59. 제25항에 있어서, 화학식 P-9의 화합물 또는 이의 염은 H-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염인 방법.
  60. 제27항에 있어서, 화학식 P-10의 화합물 또는 이의 염은 HO-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH 또는 이의 염인 방법.
  61. 제25항에 있어서, 화학식 P-9'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H 또는 이의 염인 방법.
  62. 제27항에 있어서, 화학식 P-10'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH 또는 이의 염인 방법.
  63. 제32항에 있어서, 화학식 P-4'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H 또는 이의 염인 방법.
  64. 제32항에 있어서, 화학식 P-5'의 화합물 또는 이의 염은 HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH 또는 이의 염인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 조제물.
  66. 화학식 P-1, P-2, P-3, P-4, P-4', P-5, P-5', P-6, P-7, P-8, P-9, P-9', P-10, 또는 P-10'의 화합물, 또는 이의 염의 조제물, 또는 제1항 내지 64항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 조제물로서, 조제물은 화합물의 기준 조제물에서 관찰된 것에 비해 14C 동위원소에 대해 농축되고, 기준 조제물은 화석 탄소원을 사용해 제조된 것인 조제물.
  67. 폴리에스테르, 폴리에스테르 폴리올, 폴리우레탄, 나일론 6, 나일론 6,6, 폴리카르보네이트 디올, 디아크릴레이트 에스테르, 또는 디글리시딜 에테르의 조제물로서, 조제물은 제1항 내지 제64항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 조제물을 사용하여 제조된 것인 조제물.
  68. 제67항에 있어서, 조제물은 화합물의 기준 조제물에서 관찰된 것에 비해 14C 동위원소에 대해 농축되고, 기준 조제물은 화석 탄소원을 사용해 제조된 것인 조제물.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 하나의 항의 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  70. 지방족 알데히드의 알돌-탈수 생성물을 생성하는 조작된 미생물로서, 미생물은 알돌 생성물 생합성 폴리펩티드, 알돌-탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 탈수 생성물 생합성 폴리펩티드, 또는 이의 임의 조합의 증가된 발현 또는 활성을 포함하고,
    지방족 알데히드의 카르보닐 기는 알케닐, 알키닐, 또는 방향족 기에 접합되지 않고;
    알돌-탈수 생성물은 알데히드 또는 케톤 기 및 알데히드 또는 케톤 기에 접합된 이중 결합을 포함하는 화합물인, 조작된 미생물.
  71. 알켄 환원 생성물을 생성하는 조작된 미생물로서, 미생물은 알켄 환원 생성물 생합성 폴리펩티드의 증가된 발현 또는 활성을 포함하고,
    알켄은 카르보닐 기에 접합된 이중 결합을 포함하고;
    알켄 중 카르보닐 기에 접합된 이중 결합은 단일 결합으로 환원되어 알켄 환원 생성물을 제공하는 것인, 조작된 미생물.
  72. 독립적으로 화학식 P-1 내지 P-10, P-9', P-10', P-4' 또는 P-5'의 하나 이상의 화합물, 또는 이의 염을 포함하는, 제70항 또는 제71항의 미생물을 포함하는, 배양물.
  73. 구현예 1-386 중 어느 하나의 방법, 조제물, 핵산, 미생물, 또는 배양물.
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