CN114026246A - 从可再生来源生产化学品 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于制备多种化合物例如1,5‑戊二醇、己二酸、1,6‑己二醇、6‑羟基己酸和2‑酮羧酸的生物合成多肽、方法和非天然存在的微生物等。

Description

从可再生来源生产化学品
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月25日提交的美国临时申请号62/838,793,以及2019年6月28日提交的美国专利申请号62/868,824的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开一般性地涉及制备工业上可用的化学品的组合物和方法。
背景技术
己二酸(AA)是一种广泛使用的化学品，2012年的需求量估计为230万公吨(IHSChemical,Process Economics Program Report:Bio-Based Adipic Acid(Dec.2012))。它与六亚甲基二胺(HMDA)一起用于生产尼龙6,6、聚酯树脂、增塑剂、食品和其他材料。因此，非常需要使用可再生资源以高产率制备己二酸的方法。
1,5-戊二醇是聚氨酯和聚酯(PDL)的主要成分。1,6-己二醇(HDO)是一种具有末端羟基的直链二醇。它用于工业涂料应用的聚酯、汽车应用的双组分聚氨酯涂料。它还用于生产大分子二醇，例如用于弹性体的己二酸酯和聚碳酸酯二醇，和用于镶木地板和皮革涂料的聚氨酯分散体。
6-羟基己酸(6HH)可以环化生成ε-己内酯，然后其可以胺化生成ε-己内酰胺。ε-己内酰胺用于生产尼龙6，这是一种在许多不同行业中广泛使用的聚合物。ε-己内酯经过聚合使聚己内酯(PCL)成为一种生物可降解的聚酯，可用于生产专用的聚氨酯。
2-酮羧酸是用于制备许多工业相关化学品和药物的可用中间体。它们是生产氨基酸以及工业上可用的α-羟基羧酸的前体。
发明内容
其中，本公开涵盖认识到某些生物合成肽，例如多种酶，在许多实施方案中，可用于从结构上与其天然和/或表征的底物不同的底物有效地制备多种化合物。在一些实施方案中，本公开提供了用于利用一种或更多种这样的酶制备多种化合物的技术(例如，酶、核酸、生物体、培养物等)。
例如，在一些实施方案中，本公开提供了羟醛脱水产物生物合成多肽，例如多种水合酶-醛缩酶，可以有效地用于从脂肪族醛而不是它们的典型芳族醛底物制备多种化合物。在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
使丙酮酸和脂肪族醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触以产生羟醛脱水产物，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与所述醛基团或所述酮基团共轭的双键的化合物。
在一些实施方案中，醛，例如脂肪族醛，具有式A-1的结构：
Ra-L2-L1-C(O)H，
A-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地单取代的-CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2-。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物具有式P-2的结构：
Ra-L2-L1-CH＝CH-C(O)-C(O)OH，
P-2
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
如本文所述，羟醛脱水产物，例如式P-2化合物或其盐，在一些实施方案中，可以通过一种或更多种生物合成过程进一步加工以提供多种产物，例如1，5-戊二醇、HDO、6HH、己二酸等(例如，参见图2至5)和由其制成的多种产物，包括由其制成的多种聚合物产物。
在一些实施方案中，如本文所示，羟醛脱水产物，例如式P-2化合物或其盐也可以由羟醛产物，例如式P-1化合物：
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-1
或其盐制备，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，通过使羟醛产物与脱水产物生物合成多肽接触来制造羟醛脱水产物。
在一些实施方案中，通过使合适的底物与羟醛产物生物合成多肽接触来制造羟醛产物。
在一些实施方案中，本公开表明了多种烯烃还原产物生物合成多肽可用于从其天然或非天然底物制造多种化合物。在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
使烯烃与烯烃还原产物生物合成多肽接触以产生烯烃还原产物，其中：
所述烯烃包含与羰基共轭的双键；并且
将所述烯烃中与羰基共轭的双键还原为单键以提供烯烃还原产物。
在一些实施方案中，烯烃是羟醛脱水产物，例如式P-2或其盐之一。在一些实施方案中，烯烃还原产物具有式P-3的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-3
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
其中，本文公开了用于使用可再生资源制备2-酮羧酸、1，5-戊二醇、己二酸、1，6-己二醇和6-羟基己酸的酶、方法和重组微生物。
在一方面中，本文提供了产生下式2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000041
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括或基本上由以下组成：使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000042
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶在包含一种或更多种非天然存在的微生物的培养物或生物体中接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物表达。
在另一方面中，本文提供了产生下式2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000043
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括或基本上由以下组成：使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000051
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶在包含两种或更多种非天然存在的微生物的培养物或生物体中接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物表达。
在另一方面中，本文提供了用于产生1,5-戊二醇的方法，所述方法包括或基本上由以下组成：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000052
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生1,5-戊二醇，其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生1,5-戊二醇的方法，所述方法包括或基本上由以下组成：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000053
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生1,5-戊二醇，其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括：使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000061
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使6-羟基己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生1,6-己二醇，其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括：使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000062
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使6-羟基己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生1,6-己二醇，其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000071
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000081
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生己二酸的方法，所述方法包括：使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000082
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生己二酸，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文提供了用于产生己二酸的方法，所述方法包括：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000091
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生己二酸，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号4.1.2.45、EC编号4.1.2.34或EC编号4.1.1.4的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或UniprotID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1、或KZL92449.1.
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号4.1.2.45、EC编号4.1.2.34或EC编号4.1.1.4的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或UniprotID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1、或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot IDNo.鉴定的酶的组的酶或者其促进羟醛脱水产物形成的一部分(例如，结构域、一组氨基酸残基(可以是连续的或分开的)等)具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1、或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自表1和5至8的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自表1和5至8的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0、或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1、或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶与选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0、或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1、或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、或SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、或SEQ ID NO:97。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由一种或更多种非天然存在的微生物表达的一种或更多种外源基因表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达并且醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由由两种或更多种非天然存在的微生物表达的一种或更多种外源基因表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由两种或更多种非天然存在的微生物外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达并且醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，用于产生2-酮羧酸的方法还包括以下或基本上由以下组成：从一种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离2-酮羧酸。在一些实施方案中，该方法还包括以下或基本上由以下组成：将2-酮羧酸与两种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶是选自以以下EC编号鉴定的酶的组的酶：EC编号4.1.1.1；EC编号4.1.1.2；EC编号4.1.1.3；EC编号4.1.1.4；EC编号4.1.1.5；EC编号4.1.1.6；EC编号4.1.1.7；EC编号4.1.1.11；EC编号4.1.1.12；EC编号4.1.1.15；EC编号4.1.1.16；EC编号4.1.1.17；EC编号4.1.1.18；EC编号4.1.1.19；EC编号4.1.1.20；EC编号4.1.1.34；EC编号4.1.1.35；EC编号4.1.1.40；EC编号4.1.1.54；EC编号4.1.1.56；EC编号4.1.1.71；EC编号4.1.1.72；EC编号4.1.1.73；EC编号4.1.1.74；EC编号4.1.1.75；或EC编号4.1.1.77。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶是选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶与选自以Uniprot IDNo.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是EC编号为1.1.1.61的酶。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：NP_417279.1、NP_349892.1、NP_349891.1、BAB12273.1、L21902.1、Q94B07、AAB03015.1、NP_014032.1、NP_013892.1、NP_015019.1、NP_010996.2、ABX39192.1、XP_001210625.1、ABO67118、ABO68223、BAE77068.1或CAA47743.1。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶与选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：NP_417279.1、NP_349892.1、NP_349891.1、BAB12273.1、L21902.1、Q94B07、AAB03015.1、NP_014032.1、NP_013892.1、NP_015019.1、NP_010996.2、ABX39192.1、XP_001210625.1、ABO67118、ABO68223、BAE77068.1或CAA47743.1。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是包含SEQID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶与包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是以Uniprot ID No.A0A286PH18鉴定的酶；醌氧化还原酶是以Uniprot ID No.P28304鉴定的酶；2-酮酸脱羧酶是以Uniprot IDNo.Q6QBS4鉴定的酶；并且伯醇脱氢酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是包含SEQ IDNO:8的序列的酶；醌氧化还原酶是包含SEQ ID NO:45的序列的酶；2-酮酸脱羧酶是包含SEQID NO:83的序列的酶；并且伯醇脱氢酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶、醌氧化还原酶、2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，用于产生1,5-戊二醇的方法还包括以下或基本上由以下组成：将1,5-戊二醇与一种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。在一些实施方案中，该方法还包括以下或基本上由以下组成：将1,5-戊二醇与两种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以以下EC编号鉴定的酶的组的酶：EC编号1.1.99.6、EC编号1.1.1.169、EC编号1.1.1.215、EC编号1.1.1.28，或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是选自以以下EC编号鉴定的酶的组的酶：EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12的酶；6-羟基己酸1-还原酶是EC编号为1.2.99.6的酶；并且6-羟基己醛1-还原酶是EC编号为1.1.1的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：WP_003431407.1,BAL51292.1,Q5FTU6,AKC64094.1,WP_002876862.1,AGP69017.1,WP_003640741.1,AKC64095.1和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是选自以Uniprot ID No.T4VW93鉴定的酶的组的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是选自以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923鉴定的酶的组的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93鉴定的酶；6-羟基己酸1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的序列或SEQ ID NO:60、SEQID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ IDNO:65的序列的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；6-羟基己酸1-还原酶是包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶；并且6-羟基己醛1-还原酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、和SEQ ID NO:63的序列或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；并且6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925,和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot IDNo.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；6-羟基己酸1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank IDNo鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1、和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酸1-还原酶与以以下Uniprot或GenBank ID No鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶与以以下Uniprot或GenBank ID No鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，产生1,6-己二醇的方法还包括以下或基本上由以下组成：将1,6-己二醇与一种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。在一些实施方案中，该方法还包括以下或基本上由以下组成：将1,6-己二醇与两种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和6-羟基己酰基-CoA转移酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和6-羟基己酰基-CoA转移酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和6-羟基己酰基-CoA转移酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和6-羟基己酰基-CoA转移酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶选自以以下EC编号鉴定的酶的组：EC编号1.1.99.6、EC编号1.1.1.169、EC编号1.1.1.215、EC编号1.1.1.28，或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1、和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot IDNo.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1、和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和6-羟基己酰基-CoA转移酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，用于产生6-羟基-己酸的方法还包括以下或基本上由以下组成：使6-羟基-己酸与一种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。在一些实施方案中，该方法还包括以下或基本上由以下组成：使6-羟基-己酸与两种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶选自以以下EC编号鉴定的酶的组：EC编号1.1.99.6,EC编号1.1.1.169,EC编号1.1.1.215,EC编号1.1.1.28或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号2.8.3、EC编号2.8.3.1或EC编号2.8.3.12的酶；6-羟基己酸脱氢酶是EC编号为1.1.1.258的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是EC编号为1.2.1.63的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以Uniprot或GenBankID No.WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC6409鉴定的酶的组的酶；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以UniprotID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot IDNo.Q5U924、Q5U925和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；6-羟基己酸脱氢酶是以Uniprot IDNo.Q7WVD0或Q84H78鉴定的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是以Uniprot ID No.Q9R2F4鉴定的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1、和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923；或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酸脱氢酶与以Uniprot ID No.Q7WVD0或Q84H78鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；并且6-氧代-己酸氧化酶与以Uniprot IDNo.Q9R2F4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含以下的序列的酶：SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶；6-羟基己酸脱氢酶是经鉴定的包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是包含SEQ ID NO:75的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；6-羟基己酸脱氢酶与经鉴定的包含SEQ ID NO:71和SEQ IDNO:72的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性；并且6-氧代-己酸氧化酶与包含SEQ ID NO:75的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，其中6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，产生己二酸的方法还包括以下或基本上由以下组成：将己二酸与一种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物分离。在一些实施方案中，该方法还包括以下或基本上由以下组成：将己二酸与两种或更多种非天然存在的微生物生物体或者包含两种或更多种非天然存在的微生物的培养物分离。
在一些实施方案中，丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。在一些实施方案中，
Figure BDA0003417244850000251
是3-羟基-丙醛。在一些实施方案中，3-羟基-丙醛通过由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
在另一方面中，本文提供了包含编码醛缩酶水合酶的第一外源核酸的重组微生物生物体，其中重组微生物生物体被进一步修饰以表达与野生型或未经修饰的相同微生物生物体相比增加量的醌氧化还原酶，并且可选地其中所述微生物生物体是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、梭菌属物种或大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方案中，生物体包含编码醌氧化还原酶的第二外源核酸。在一些实施方案中，第一和/或第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。或者，第一和第二核酸处于同一启动子调节元件的控制之下。在一些实施方案中，调节元件选自启动子或增强子。在一些实施方案中，醛缩酶水合酶具有EC编号4.1.2.45或EC编号4.1.2.34或EC编号4.1.1.4。在一些实施方案中，醛缩酶水合酶是选自以以下Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，醛缩酶水合酶是选自以以下Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，醛缩酶水合酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在载体例如质粒或病毒载体中。在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在同一载体中。在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在它们自己的单独载体中。在一些实施方案中，载体是质粒。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96或SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，重组微生物生物体能够产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000271
其中R是H、CH3或CH2OH。在一些实施方案中，重组微生物生物体能够产生1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。在一些实施方案中，重组微生物生物体被遗传修饰以提高丙酮酸从碳源的产生。在一些实施方案中，碳源选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉，或其组合。
在另一方面中，本文提供了包含本文公开的重组微生物生物体的培养物。
在另一方面中，本文提供了如本文公开的重组微生物生物体的群体。在一些实施方案中，群体基本上是同质的。
在另一方面中，本文提供包含本文公开的群体的培养物。
在另一方面中，本文提供了用于产生1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸的方法，其包括在促进如本文公开的外源核酸的表达的情况下培养如本文公开的群体或微生物。在一方面中，与野生型或未经修饰的对应微生物生物体相比，外源核酸过表达。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物或微生物生物体中分离1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。
附图说明
图1示出了从丙酮酸和醛产生2-酮羧酸的双酶生物合成途径作为实例。羟醛脱水产物(例如，本文所述的羟醛缩合产物)可由单一酶(例如，羟醛脱水产物生物合成多肽，例如水合酶-醛缩酶(在一些实施方案中，称为Ads-Hyd)通过，不打算受理论限制，如所描述的步骤1和2来产生。如本领域技术人员将理解的，所示羟醛缩合产物中的双键可以作为E或Z存在。在许多实施方案中，如所示的步骤3可以由氧化还原酶催化，氧化还原酶例如属于EC1.6.5(例如EC 1.6.5.5)的一种，其利用NADH和/或NADPH来还原醌。如本文所述，可以利用多种醛。例如，在一些实施方案中所示的醛中，R是H、CH3、CH2CH3、OH、CH2OH或CH2CH2OH。
图2示出了通过6-羟基-2-酮-己酸(6H2KH)中间体产生1,5-戊二醇的生物合成途径。如本文所用，3HPA是指3-羟基-丙醛；6H4H2KH是指4,6-二羟基-2-酮-己酸；6H3(E)2KH是指6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸；并且5HPeA是指5-羟基-戊醛。出于说明目的，NADH被描述为该途径的许多还原步骤的辅助因子。NADPH或NADH都可能是辅助因子。
图3示出了通过6-羟基-2-酮-己酸(6H2KH)中间体产生1,6-己二醇的生物合成途径。如本文所用，3HPA是指3-羟基-丙醛；6H4H2KH是指4,6-二羟基-2-酮-己酸；6H3(E)2KH是指6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸；6H2HH是指2,6-二羟基-己酸；6HH-CoA是指6-羟基-己酰基-CoA；6HH是指6-羟基己酸；6H2HH-CoA是指2,6-二羟基-己酰基-CoA；并且6HHA是指6-羟基己醛。NADPH或NADH都可能是辅助因子。步骤5和8由单一CoA转移酶催化。出于说明目的，6HH-CoA被描述为步骤5反应的供体，6H2HH被描述为受体。其他CoA酯或羧酸可以在体内作为这种酶的供体和受体。
图4示出了通过6-羟基-2-酮-己酸(6H2KH)中间体产生6-羟基己酸的生物合成途径。如本文所用，3HPA是指3-羟基-丙醛；6H4H2KH是指4,6-二羟基-2-酮-己酸；6H3(E)2KH是指6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸；6H2HH是指2,6-二羟基-己酸；6HH-CoA是指6-羟基-己酰基-CoA；6HH是指6-羟基己酸；6H2HH-CoA是指2,6-二羟基-己酰基-CoA。NADPH或NADH都可能是辅助因子。步骤5和8由单一CoA转移酶催化。出于说明目的，6HH-CoA被描述为步骤5反应的供体，6H2HH被描述为受体。其他CoA酯或羧酸可以在体内作为这种酶的供体和受体。
图5示出了通过6-羟基-2-酮-己酸(6H2KH)中间体产生己二酸的生物合成途径。如本文所用，3HPA是指3-羟基-丙醛；6H4H2KH是指4,6-二羟基-2-酮-己酸；6H3(E)2KH是指6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸；6H2HH是指2,6-二羟基己酸；6HH-CoA是指6-羟基-己酰基-CoA；6HH是指6-羟基己酸；6H2HH-CoA是指2,6-二羟基-己酰基-CoA；6KHA是指6-氧代-己酸。NADPH或NADH都可能是辅助因子。步骤5和8由单一CoA转移酶催化。出于说明目的，6HH-CoA被描述为步骤5反应的供体，6H2HH被描述为受体。其他CoA酯或羧酸可以在体内作为这种酶的供体和受体。
图6示出了在辅因子NADH和NADPH的情况下醌氧化还原酶-1(Qor-1)使6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸还原为6-羟基-2-酮-己酸的活性。
具体实施方式
定义
如本文所用，某些术语可具有以下定义的含义。如本文所用，单数形式包括单数和复数参考，除非上下文另有明确指示。
如本文所用，术语“包括”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于限定组合物和方法时，“基本上由……组成”应意味着排除对组合物或方法具有任何重要意义的其他元素。“由...组成”应指在要求保护的组合物和主要方法步骤中排除多于微量元素的其他成分。由这些过渡术语中的每一个限定的方面在本公开的范围内。因此，旨在该方法和组合物可以包括附加的步骤和组分(包括)；或替代地包括不具有重要意义的步骤和组合物(基本上由...组成)或替代地，仅意在所述方法步骤或组合物(由...组成)。
如本文所用，术语“羟醛脱水产物生物合成多肽”是指参与如本文所述的羟醛脱水产物合成的多肽。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽可以是或包含如本文所述的醛缩酶多肽、水合酶、水合酶-醛缩酶多肽(例如，水合酶-醛缩酶)。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽可以是或包含如本文所述的水合酶-醛缩酶多肽(例如，水合酶-醛缩酶)。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽具有在自然界中，例如在微生物中(例如，在自然界中发现的参考羟醛脱水生物合成多肽中)发现的氨基酸序列。或者或另外，在一些实施方案中，羟醛脱水生物合成多肽与合适的参考羟醛脱水生物合成多肽(例如，如在自然界中发现的和/或在本文中(例如，在一个或更多个相关表(例如，表1和5-8)中)所呈现的)或其一部分(例如，促进相关反应的氨基酸残基(其可以是连续的或分离的)的一部分(例如，结构域(例如，相关催化结构域)和/或组)共享特征序列元件和/或整体百分比同一性。
如本文所用，“羟醛脱水产物”是指包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是式P-2化合物或其盐。
如本文所用，术语“羟醛产物”是指包含醛基团或酮基团和与醛或酮的羰基的β-碳连接的羟基的化合物。在一些实施方案中，羟醛产物是羟醛反应的产物。在一些实施方案中，羟醛产物具有结构式P-1或其盐。
如本文所用，术语“羟醛产物生物合成多肽”是指参与如本文所述的羟醛产物合成的多肽。在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽可以是或包含如本文所述的醛缩酶多肽、水合酶-醛缩酶多肽(例如，水合酶-醛缩酶)。在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽是或包含如本文所述的醛缩酶多肽。在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽具有在自然界中，例如在微生物中(例如，在自然界中发现的参考羟醛生物合成多肽中)发现的氨基酸序列。或者或另外，在一些实施方案中，羟醛生物合成多肽与合适的参考羟醛生物合成多肽((例如，如在自然界中发现的和/或在本文中(例如，在一个或更多个相关表中)所呈现的)或其一部分(例如，促进相关反应的氨基酸残基(其可以是连续的或分离的)的一部分(例如，结构域(例如，相关催化结构域)和/或组)共享特征序列元件和/或整体百分比同一性。
如本文所用，术语“烯烃还原产物生物合成多肽”是指参与如本文所述将双键转化为单键(并形成烯烃还原产物)的多肽。在一些实施方案中，烯烃还原产物生物合成多肽可以是或包含如本文所述的醌氧化还原酶。在一些实施方案中，烯烃还原产物生物合成多肽具有在自然界中，例如在微生物中(例如，在自然界中发现的参考烯烃还原生物合成多肽中)发现的氨基酸序列。或者或另外，在一些实施方案中，羟醛生物合成多肽与合适的参考羟醛生物合成多肽((例如，如在自然界中发现的和/或在本文中(例如，在一个或更多个相关表中)所呈现的)或其一部分(例如，促进相关反应的氨基酸残基(其可以是连续的或分离的)的一部分(例如，结构域(例如，相关催化结构域)和/或组)共享特征序列元件和/或整体百分比同一性。
如本文所用，术语“脂肪族”是指直链(即，未支链的)或支链的、被取代的或未被取代的烃链，其是完全饱和的，或其含有一个或更多个不饱和单元；或者被取代或未被取代的单环、双环或多环烃环(其是完全饱和的，或者其含有一个或更多个不饱和单元(但非芳族)，或者它们的组合。在一些实施方案中，脂肪族基团包含1至50个脂肪族碳原子。在一些实施方案中，脂肪族基团包含1至20个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至10个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至9个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至8个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至7个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至6个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1至5个脂肪族碳原子，而在另一些实施方案中，脂肪族基团包含1、2、3或4个脂肪族碳原子。合适的脂肪族基团包括但不限于直链或支链的、被取代或未被取代的烷基、烯基、炔基，及其杂化物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
如本文所用，术语“烷基”以其在本领域中的普通含义给出并且可以包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)基、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在一些实施方案中，烷基具有1至100个碳原子。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有约1至20个碳原子(例如，对于直链，C1-C20；对于支链，C2-C20)，或者约1至10个。在一些实施方案中，环烷基环在其环结构中具有约3至10个碳原子，其中这样的环为单环、双环或多环，并且或者在环结构中具有约5、6或7个碳原子。在一些实施方案中，烷基可以是低级烷基，其中低级烷基包含1至4个碳原子(例如，对于直链低级烷基，C1-C4)。
如本文所用，单独使用或作为较大部分的一部分例如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中使用的术语“芳基”，是指具有总共五至三十个环成员的单环、双环或多环环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳族的。在一些实施方案中，芳基是具有总共五至十四个环成员的单环、双环或多环环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，并且其中该系统中的每个环包含3至7个环成员。在一些实施方案中，芳基是联芳基。术语“芳基”可以与术语“芳环”互换使用。在本公开的某些实施方案中，“芳基”是指芳环系统，其包括但不限于苯基、联苯基、萘基、联萘、蒽基等，其可以带有一个或更多个取代基。如本文所用，其中芳环与一个或更多个非芳环稠合的基团，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘啶基、菲啶基或四氢萘基等，也在术语“芳基”的范围内。
如本文所用，术语“脂环族”、“碳环”、“碳环基”、“碳环基团”和“碳环”可互换使用，是指饱和或部分不饱和但非芳族的环状脂肪族单环、双环或多环环系统，如本文所述，除非另有说明，否则其具有3至30个环成员。脂环族基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基、降冰片基、金刚烷基和环辛二烯基。在一些实施方案中，脂环族基团具有3至6个碳。在一些实施方案中，脂环族基团是饱和的并且是环烷基。术语“脂环族”还可包括与一个或更多个芳族或非芳族环稠合的脂肪族环，例如十氢萘基或四氢萘基。在一些实施方案中，脂环族基团是双环的。在一些实施方案中，脂环族基团是三环的。在一些实施方案中，脂环族基团是多环的。在一些实施方案中，“脂环族”是指C3-C6单环烃，或C8-C10双环或多环烃，其完全饱和或其包含一个或更多个不饱和单元，但其不是芳族的，其与分子的其余部分有单一连接点，或者C9-C16多环烃，其是完全饱和的或包含一个或更多个不饱和单元但非芳族，其与分子的其余部分有单一连接点。
如本文所用，术语“杂脂肪族”以其在本领域中的普通含义给出并且指如本文所述的脂肪族基团，其中一个或更多个碳原子独立地被一个或更多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)取代。在一些实施方案中，一个或更多个选自C、CH、CH2和CH3的单元独立地被一个或更多个杂原子(包括其氧化和/或被取代形式)取代。在一些实施方案中，杂脂肪族基团是杂烷基。在一些实施方案中，杂脂肪族基团是杂烯基。
如本文所用，术语“杂烷基”以其在本领域中的普通含义给出并且指如本文所述的烷基，其中一个或更多个碳原子独立地被一个或更多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)取代。杂烷基的实例包括但不限于烷氧基、聚(乙二醇)-、烷基取代的氨基、四氢呋喃基、哌啶基、吗啉基等。
如本文所用，单独使用或作为较大部分例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”，是指具有总共五至三十个环成员的单环、双环或多环环系统，其中系统中的至少一个环是芳族的并且至少一个芳族环原子是杂原子。在一些实施方案中，杂芳基是具有5至10个环原子(即，单环、双环或多环)，在一些实施方案中为5、6、9或10个环原子的基团。在一些实施方案中，杂芳基具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子；并且除了碳原子外，还具有一至五个杂原子。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、
Figure BDA0003417244850000321
唑基、异
Figure BDA0003417244850000322
唑基、
Figure BDA0003417244850000323
二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。在一些实施方案中，杂芳基是杂二芳基，例如联吡啶基等。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳环稠合至一个或更多个芳基、脂环族或杂环基环的基团，其中连接基团或连接点位于杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩
Figure BDA0003417244850000331
嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-
Figure BDA0003417244850000332
嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环、双环或多环。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳族”互换使用，这些术语中的任何一个都包括可选地被取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地被可选地取代。
如本文所用，术语“杂原子”是指不是碳或氢的原子。在一些实施方案中，杂原子是硼、氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的氧化形式；氮、磷、硫、氧的带电荷形式(例如季铵化形式、如在亚胺基中的形式)等)。在一些实施方案中，杂原子是氧、硫或氮。
如本文所用，如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环”可互换使用并指单环、双环或多环环部分(例如，3至30元)，其是饱和或部分不饱和的并具有一个或更多个杂原子环原子。在一些实施方案中，杂环基是稳定的5至7元单环或7至10元双环杂环部分，其是饱和的或部分不饱和的，并且除了碳原子外，还具有一个或更多个，优选一至四个如上所限定的杂原子。当用于指代杂环的环原子时，术语“氮”包括被取代的氮。例如，在具有0至3个选自氧、硫和氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)，或+NR(如在N-取代的吡咯烷基中)。杂环可以在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基相连，并且任何环原子均可以可选地被取代。这样的饱和或部分不饱和杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、
Figure BDA0003417244850000333
唑烷基、哌嗪基、二
Figure BDA0003417244850000334
烷基、二氧杂环戊烷基、二氮杂
Figure BDA0003417244850000335
基、氧氮杂
Figure BDA0003417244850000336
基、硫氮杂
Figure BDA0003417244850000337
基、吗啉基、和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团”、“杂环部分”和“杂环基团”在本文中可互换使用，并且还包括其中杂环基环与一个或更多个芳基、杂芳基或脂环族环稠合的基团，例如二氢吲哚基、3H-吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基。杂环基可以是单环、双环或多环。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地可选地被取代。
可选地被取代的：如本文所述，本公开的化学实体，例如多种化合物，可包含可选地被取代的和/或被取代的部分。一般而言，术语“被取代”意指指定部分的一个或更多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“可选地被取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中多于一个位置可以被多于一个选自特定基团的取代基取代时，该取代基可以在每个位置相同或不同。在一些实施方案中，可选地被取代的基团是被取代的。在一些实施方案中，可选地被取代的基团是未被取代的。本公开设想的取代基的组合优选是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定的”是指当经受允许其产生、检测以及在某些实施方案中回收、纯化和用于本文中公开的一种或更多种目的的条件时基本上不改变的化合物。某些取代基描述如下。
可取代原子上，例如合适的碳原子上的合适的单价取代基，独立地是卤素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O(CH2)0-4Ro、-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0-4Ph，其可被Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可被Ro取代；-CH＝CHPh，其可被Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可被Ro取代；
-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SRo，-SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-Si(Ro)3；-OSi(Ro)3；-B(Ro)2；-OB(Ro)2；-OB(ORo)2；-P(Ro)2；-P(ORo)2；-P(Ro)(ORo)；-OP(Ro)2；-OP(ORo)2；-OP(Ro)(ORo)；-P(O)(Ro)2；-P(O)(ORo)2；-OP(O)(Ro)2；-OP(O)(ORo)2；-OP(O)(ORo)(SRo)；-SP(O)(Ro)2；-SP(O)(ORo)2；-N(Ro)P(O)(Ro)2；-N(Ro)P(O)(ORo)2；-P(Ro)2[B(Ro)3]；-P(ORo)2[B(Ro)3]；-OP(Ro)2[B(Ro)3]；-OP(ORo)2[B(Ro)3]；
-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(Ro)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中每个Ro可以如本文所定义被取代并且独立地是氢、C1-20脂肪族、具有1至5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的C1-20杂脂肪族、-CH2-(C6-14芳基)、-O(CH2)0-1(C6-14芳基)、-CH2-(5至14元杂芳基环)，具有0至5个独立选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5至20元单环、双环或多环的饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管有上述定义，两个独立出现的Ro，连同它们的中间原子一起，形成具有0至5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的5至20元单环、双环或多环的饱和、部分不饱和或芳基环，它们可以如下限定被取代。
Ro(或通过将两个独立出现的Ro连同它们的中间原子一起形成的环)上合适的单价取代基，独立地是卤素、
-(CH2)0-2R·，-（卤素R·)，-(CH2)0-2OH，-(CH2)0-2OR·，-(CH2)0-2CH(OR·)2；-O（卤素R·)，-CN，-N3，-(CH2)0-2C(O)R·，-(CH2)0-2C(O)OH，-(CH2)0-2C(O)OR·，-(CH2)0-2SR·，-(CH2)0- 2SH，-(CH2)0-2NH2，-(CH2)0-2NHR·，-(CH2)0-2NR· 2，-NO2，-SiR· 3，-OSiR· 3，-C(O)SR·，-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR·，或SSR·，其中每个R·均是未被取代的或在带有前缀“卤素”的情况下仅被一个或更多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph和具有0至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。Ro的饱和碳原子上合适的二价取代基包括＝O和＝S。
合适的二价取代基，例如在合适的碳原子上的合适的二价取代基，独立地是以下：＝O，＝s，＝NNR* 2，＝NNHC(O)R*，＝NNHC(O)OR*，＝NNHS(O)2R*，＝NR*，＝NOR*，-O(C(R* 2))2- 3O-，或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每个独立出现的R*选自氢；C1-6脂肪族，其可以如下限定地被取代；以及具有0至4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的未被取代的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。与“可选地被取代的”基团的邻位可取代碳结合的合适的二价取代基包括：-O(CR*2)2-3O-，其中每个独立出现的R*选自氢；C1-6脂肪族，其可以如下限定地被取代；以及具有0至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未被取代的5至6元饱和、部分不饱和和芳基环。
R*的脂肪族基团上合适的取代基独立地为卤素、-R·，-(卤素R·)，-OH，-OR·，-O(卤素R·)，-CN，-C(O)OH，-C(O)OR·，-NH2，-NHR·，-NR· 2，或-NO2其中每个R·均是未被取代的或在带有前缀“卤素”的情况下仅被一个或更多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。
在一些实施方案中，可取代的氮上的合适取代基独立地是
Figure BDA0003417244850000361
其中每个
Figure BDA0003417244850000362
独立地是氢；C1-6脂肪族，其可以如下限定地被取代；未被取代的-OPh；或具有0至4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的未被取代的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管有上述限定，两个独立出现的
Figure BDA0003417244850000363
连同它们的中间原子一起形成具有0至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未被取代的3至12元饱和、部分不饱和或芳基的单环或双环。
Figure BDA0003417244850000364
的脂肪族基团上合适的取代基独立地为卤素-R·，-(卤素R·)，-OH，-OR·，-O(卤素R·)，-CN，-C(O)OH，-C(O)OR·，-NH2，-NHR·，-NR· 2，或-NO2，其中每个R·均是未被取代的或在带有前缀“卤素”的情况下仅被一个或更多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。
如本文所用，术语“部分不饱和”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和”旨在包括具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文定义的芳基或杂芳基部分。
“野生型”定义了存在于自然界中的细胞、组合物、组织或其他生物材料。
在一些实施方案中，3-羟基-丙醛和丙酮酸由甘油、C5糖、C6糖、磷酸甘油酸酯、其他碳源、糖酵解途径的中间体及其组合中的一种或更多种制备。在一些实施方案中，C5糖包含以下中的一种或更多种，或可选地基本上由以下中的一种或更多种组成，或还进一步由以下中的一种或更多种组成：木糖、木酮糖、核酮糖、阿拉伯糖、来苏糖和核糖，并且C6糖包含以下，或可选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖。在一些实施方案中，其他碳源是适合作为微生物碳源的原料，其中所述原料包含以下中的一种或更多种，或可选地基本上由以下中的一种或更多种组成，或还进一步由以下中的一种或更多种组成：氨基酸、脂质、玉米秸、芒属(miscanthus)、城市废物、能源甘蔗、糖甘蔗、甘蔗渣、淀粉流、右旋糖流、甲酸、甲醇及其组合。
如本文所用，术语“C5糖”是指含有5个碳的糖分子。
如本文所用，术语“C6糖”是指含有6个碳的糖分子。
在一些实施方案中，术语“羟醛加成”是指这样的化学反应，其中丙酮酸分子形成相应的烯醇或烯醇化物离子或席夫碱(Schiff’s base)或烯胺，其与CN醛的醛官能团反应以生成CN+3 4-羟基-2-酮-羧酸中间体。在一些实施方案中，CN醛是3-羟基-丙醛，CN+3 4-羟基-2-酮-羧酸中间体是4,6-二羟基-2-酮-己酸。
在一些实施方案中，术语“羟醛缩合”是指这样的化学反应，其中丙酮酸分子形成相应的烯醇或烯醇化物离子或席夫碱或烯胺，其与CN醛的醛官能团反应以生成CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸。在一些实施方案中，CN醛是3-羟基-丙醛，CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸是6-羟基-3,4-脱氢-2-酮-己酸。
如本文所用，术语“溶液”是指液体组合物，其包含溶剂和溶质，例如本文所述方法中使用的起始材料。在一些实施方案中，溶剂是水。在一些实施方案中，溶剂是有机溶剂。
如本文所用，术语“酶促步骤”或“酶促反应”是指由被选择以促进所需酶促反应的酶催化的分子反应。酶是生物大分子和高选择性催化剂。大多数酶是蛋白质，但已经鉴定了一些催化性RNA分子。
在整个申请中，酶促步骤可分别表示为“步骤1”、“步骤2”等，并且特异性催化这些步骤的酶分别表示为“1”、“2”等。这种酶也称为“反应特异性酶”。
如本文所用，术语“CoA”或“CoA”旨在表示其存在是许多酶的活性形成活性酶体系所需的有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)。
如本文所用，术语“基本上厌氧的”当用于提及培养或生长条件时旨在表示氧的量小于液体培养基中溶解氧的饱和度的约10％。该术语还旨在包括维持在低于约1％氧气的气氛中的液体或固体介质的密封室。
如本文所用，术语“非天然存在的”或“非天然的”当用于指本公开的微生物生物体或微生物时旨在表示该微生物生物体具有至少一种基因改变，该改变不是通常在参考物种的天然菌株(包括参考物种的野生型菌株)中发现的。遗传改变包括，例如，但不限于，引入编码多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物生物体遗传物质的其他功能破坏。这样的修饰包括，例如，但不限于，编码区及其功能片段，针对参考物种的异源、同源或异源和同源多肽。另外的修饰包括例如但不限于非编码调节区，其中的修饰改变基因或操纵子的表达。
如本文所用，“外源的”旨在表示将所述参考分子或所述活性引入宿主微生物生物体中。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质，例如质粒，来引入分子。因此，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指将编码核酸以可表达的形式引入微生物生物体中。当用于提及酶活性时，该术语是指引入到宿主参考生物体中的活性。来源可以是例如同源或异源编码核酸，其在引入宿主微生物生物体后表达参考活性。因此，术语“内源的”是指原始或天然存在于野生型宿主中的参考分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在野生型微生物中的编码核酸的表达。
术语“异源的”是指源自参考物种之外的来源的分子或活性，而在本文中使用时，“同源的”是指源自宿主微生物生物体的分子或活性。因此，编码核酸的外源表达可利用异源或同源编码核酸之一或两者。
应理解，当微生物生物体中包含多于一种外源核酸时，多于一种外源核酸是指所提及的编码核酸或酶活性，如上文所讨论。还应理解，如本文所公开的，可以针对单独的核酸分子、多顺反子核酸分子或其组合将多于一种外源核酸引入宿主微生物生物体中，并且仍被视为多于一种外源核酸。例如，如本文所公开的，微生物生物体可以被工程化以表达两种或更多种编码所需途径酶或蛋白质的外源核酸。在将编码所需活性的两种外源核酸引入宿主微生物生物体中的情况下，应当理解，这两种外源核酸可以作为单一核酸(例如，在单个质粒上，在单独的质粒上)引入，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然被认为是两个外源核酸。类似地，应当理解，可以将两种以上的外源核酸以任何所需的组合(例如，在单个质粒上，在单独的质粒上)引入宿主生物体中，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍被认为是两种或更多种外源核酸，例如三种外源核酸。因此，提及的外源核酸或酶活性的量是指编码核酸的量或酶活性的量，而不是引入宿主生物体的单独核酸的量。
在一些实施方案中，使用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主和应用定制表达和/或调节元件的能力，以实现由用户控制的所需表达水平。然而，内源表达也可用于另一些实施方案，例如通过去除负调节效应子或当与诱导型启动子或其他调节元件连接时基因启动子的诱导。因此，可以通过提供合适的诱导剂来上调具有天然存在的诱导型启动子的内源基因，或者可以对于内源基因的调节区进行工程化以并入诱导型调节元件，从而允许调节内源基因在所需的时间的提高的表达。类似地，可以包括诱导型启动子作为引入非天然存在的微生物生物体中的外源基因的调节元件。
本领域技术人员将理解，参照合适的宿主生物体例如大肠杆菌及其相应的代谢反应或用于所需遗传物质(例如用于所需生物合成途径的基因)的合适来源生物体，来描述遗传改变。然而，考虑到多种生物体的完整基因组测序和基因组学领域的高水平技术，本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他生物体。例如，本文中例证的大肠杆菌代谢改变可以通过并入来自参考物种之外的物种的相同或类似的编码核酸而容易地应用于其他物种。这样的遗传改变包括例如物种同源物的遗传改变，一般而言，特别是直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因替代。
编码途径酶的核酸来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化参考反应的任何物种。这样的物种包括原核和真核生物体二者，包括但不限于细菌，包括古细菌和真细菌，以及真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人。这样的来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、变型斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、链霉菌属2065、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、裸藻(Euglena gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、不动杆菌属ADP1、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、巴克真杆菌(Eubacterium barkeri)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcusasaccharolyticus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、梭状芽孢杆菌(Clostridium thermoaceticum)(穆尔氏菌thermoaceticum)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、小家鼠、野猪(Susscrofa)、黄杆菌属、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、Clostridiumcarboxydivorans、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、梭菌属M62/1、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)以及本文公开的或可用作相应基因的源生物体的其他示例性物种(参见实施例)。然而，由于目前已有超过400个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组的完整基因组序列，鉴定编码必需途径酶的基因，对于相关或远缘物种中的一个或更多个基因，包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因替代，以及生物体之间遗传改变的交换是常规和本领域公知的。
直系同源物是指通过物种形成从共同祖先基因进化而来的不同物种中的基因。通常，直系同源物在进化过程中保留相同的功能。直系同源物的鉴定对于可靠预测新测序基因组中的基因功能至关重要。
旁系同源物是指通过基因组内的复制相关的基因。虽然直系同源物在进化过程中通常保留相同的功能，但旁系同源物可以进化出新的功能，即使这些功能与原始功能有关。
非直系同源基因替代是来自一个物种的非直系同源基因，其可以替代不同物种中的参考基因功能。替代包括，例如，与不同物种中的参考功能相比，能够在来源物种中执行基本相同或相似的功能。尽管一般而言，非直系同源基因替代将被识别为与编码参考功能的已知基因在结构上相关，但结构相关性较低但功能相似的基因及其相应的基因产物仍将落入本文所用术语的含义内。例如，功能相似性要求非直系同源基因产物的活性位点或结合区与编码寻求被取代的功能的基因相比至少具有某种结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或无关基因。
如本文所用，术语“微生物”或“微生物生物体”或“微生物”可互换使用，是指可通过插入外源或重组核酸(例如DNA或RNA)来转化或转染的活的生物和分离的原核或真核细胞。任何合适的原核或真核微生物均可用于本公开，只要其在用核酸序列转化后仍保持活力即可。本公开的合适的微生物是能够表达一种或更多种核酸构建体的微生物，所述核酸构建体编码一种或更多种重组蛋白，所述重组蛋白可以催化方法中的至少一个步骤。微生物可以选自细菌、酵母、真菌、霉菌和古细菌。这些是可商购的。
如本文所用，“真菌”是指分类在真菌界内的任何真核生物体。真菌界内的门包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、微孢子菌门(Microsporidia)和新鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)。如本文所用，“酵母”是指以单一细胞形式(例如通过出芽)生长的真菌，而“霉菌”是指在由多细胞菌丝(hypha)或菌丝体(mycelia)制成的丝(filament)中生长的真菌(McGinnis,M.R.and Tyring,S.K.“Introduction toMycology.”Medical Microbiology.4th ed.Galveston:Univ.of TX Medical Branch atGalveston,1996)。
在一些实施方案中，微生物是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞来自念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)物种。
在一些实施方案中，微生物是霉菌细胞。在一些实施方案中，霉菌宿主细胞来自脉孢菌属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)或金孢属(Chrysosporium)物种。
在一些实施方案中，微生物是古细菌。在一些实施方案中，合适的古细菌来自古生球菌属(Archaeoglobus)、气火菌属(Aeropyrum)、盐杆菌属(Halobacterium)、火杆菌属(Pyrobaculum)、火球菌属(Pyrococcus)、硫叶菌属(Sulfolobus)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷球菌(Methanocaldococcus)或甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)物种。
术语“细菌”是指原核生物体领域或界内的任何微生物。细菌域或界内的门包括酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、放线杆菌(Actinobacillus)、土壤杆菌(Agrobacterium)、厌氧螺菌(Anaerobiospirrulum)、产水菌门(Aquificae)、装甲菌门(Armatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、小球藻(Chlorella)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、梭菌(Clostridium)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、肠杆菌(Enterobacter)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽孢杆菌(Geobacillus)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、盐厌氧菌(Halanaerobium)、克雷伯菌(Klebsiella)、克鲁沃菌(Kluyvera)、乳杆菌(Lactobacillus)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、甲基杆菌(Methylobacterium)、硝化螺旋菌(Nitrospira)、巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、浮霉菌门(Planctomycetes)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、变形菌门(Proteobacteria)、罗尔斯通菌(Ralstonia)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、螺旋体门(Spirochaetes)、链霉菌(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、软壁菌门(Tenericutes)、热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、卓贝尔氏菌(Zobellella)和发酵单胞菌(Zymomonas)。在一些实施方案中，细菌微生物是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细菌微生物是芽孢杆菌属细胞。芽孢杆菌物种的实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
通过本公开的方法制备的羧酸化合物可以与反荷离子形成盐，所述反荷离子包括但不限于金属离子，例如碱金属离子，例如钠、钾、碱土金属离子，例如钙、镁或铝离子；或与有机碱例如四烷基铵、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等配位。酸可以与反应条件中存在的反离子或有机碱形成盐，或者可以通过与无机或有机碱反应转化为盐。
本文中的任何含羧酸的化合物被称为酸或盐，其自始至终可互换使用以指代以其任何中性或离子化形式中的任一种的化合物，包括其任何盐形式。技术人员理解，具体形式将取决于pH。
化合物的溶剂合物是化合物的固体形式其在晶格中结晶时含有少于一个、一个或多于一个溶剂分子。可用于产生溶剂合物(例如可药用溶剂合物)的溶剂的一些实例包括但不限于水、通常的C1-C6醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇，并且可以可选地被取代)、四氢呋喃、丙酮、乙二醇、丙二醇、乙酸、甲酸，及其溶剂混合物。可有助于制备可药用溶剂合物的其他这样的生物相容性溶剂是本领域公知的。此外，可以添加多种有机和无机酸和碱以产生所需的溶剂合物。这种酸和碱是本领域已知的。当溶剂为水时，溶剂合物可称为水合物。在一些实施方案中，一分子化合物可与0.1至5分子溶剂形成溶剂合物，例如与0.5分子溶剂(半溶剂合物，如半水合物)、一分子溶剂(单溶剂合物，例如一水合物)和2分子溶剂(二溶剂合物，例如二水合物)形成溶剂合物。
当提及存在多种异构体(例如，顺式和反式异构体，以及R和S异构体，或其组合)的化合物时，该化合物原则上包括该化合物的可用于本公开的方法中的所有可能的对映体、非对映体和顺式/反式异构体。
对于每个物种，属于该物种的任何细胞都被认为是本公开的合适微生物。任何物种的宿主细胞都可能存在，因为它是从自然界中分离出来的，或者它可能包含任何数量的遗传修饰(例如，一串突变、缺失或重组多核苷酸)。
如本文所用，术语“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指核酸的聚合物，其中至少以下一项是符合的：(a)核酸序列对于给定的微生物是外源的(即，不天然存在于其中)；(b)该序列可能天然存在于给定微生物中，但是以非天然(例如，大于预期)的量存在；(c)核酸序列包含两个或更多个在自然界中彼此不具有同一关系的子序列。例如，对于情况(c)，重组核酸序列将具有两个或更多个来自无关基因的序列，它们被排列以产生新的功能性核酸。
在一些实施方案中，本公开的重组多肽或蛋白质或酶可由作为一种或更多种表达载体的一部分的遗传物质编码。表达载体包含一种或更多种多肽编码核酸，并且它可以还包含控制核酸表达的任何所需元件，以及能够使表达载体在给定的宿主细胞内复制和维持的任何元件。所有重组核酸可以存在于单个表达载体上，或者它们可以由多个表达载体编码。
可以构建一种或更多种表达载体以包括一种或更多种如本文所例举的途径编码核酸，所述核酸与在宿主生物体中具有功能的表达控制序列可操作地连接。适用于所提供的微生物宿主生物体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标志物。此外，表达载体可以包括一种或更多种可选择标志物基因和合适的表达控制序列。还可以包括可选择标志物基因，例如，提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷或提供不在培养基中的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当共表达两种或多种外源编码核酸时，可以将两种核酸插入例如单个表达载体或单独的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以与一种共同的表达控制序列可操作地连接或与不同的表达控制序列，例如一种诱导型启动子和一种组成型启动子连接。本领域公知这样的载体，所述载体包含启动子和克隆位点二者，多核苷酸与其可操作地连接。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以从诸如Stratagene(La Jolla,CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)等来源商购获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5’和/或3’非翻译部分，以消除额外的、潜在的不合适的替代翻译起始密码子或其他可能干扰在转录或翻译水平上的表达的序列。或者，可以将共有核糖体结合位点紧接着插入起始密码子的5’以增强表达。
使用本领域公知的技术，包括但不限于缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化，可以将本文所述的所需化合物的合成途径中涉及的外源核酸序列稳定地或瞬时地引入宿主细胞中。对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号，例如N端线粒体或其他靶向信号，在转化到原核宿主细胞中之前可以将其去除(如果需要的话)。例如，去除线粒体前导序列导致在大肠杆菌中的表达增加(Hoffmeister等，J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达，基因可以在不添加前导序列的情况下在胞质中表达，或者可以通过添加合适的靶向序列(例如适合宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号)靶向线粒体或其他细胞器，或靶向用于分泌。应理解，可以将针对核酸序列的用于去除或包括靶向序列的适当修饰并入外源核酸序列中以赋予所需特性。此外，可以使用本领域公知的技术对基因进行密码子优化以实现蛋白质的优化表达。
所有包括范围的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，其变化(+)或(-)的增量为0.1。应当理解，尽管并不总是明确说明，但所有数字名称前都有术语“约”。如本文所用，“约”将表示多至正负10％。还应理解，虽然并不总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示例性的并且其等同物在本领域中是已知的。
“可操作地连接”是指并置，其中元件处于允许它们发挥作用的布置中。
术语“培养”是指细胞或生物体在多种培养基(培养物)上或中的体外增殖。应当理解，培养中生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同(即，在形态学、遗传学或表型上)。
“基因”是指包含至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能够编码特定多肽或蛋白质。本文所述的任何多核苷酸序列均可用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
术语“表达”是指基因产物的产生。术语过表达是指从基因转录的mRNA或由该基因编码的蛋白质产物的产量多于正常或对照细胞，例如是在对照样品或野生型细胞中检测到的表达水平的0.5倍、1.0倍、1.5倍或作为替选地2倍，或作为替选地，至少2.5倍，或作为替选地，至少3.0倍，或作为替选地，至少3.5倍，或作为替选地，至少4.0倍，或作为替选地，至少5倍，或作为替选地10倍。
如本文所用，“同源性”是指参考序列与第二序列的至少一个片段之间的序列相似性。同源物可以通过本领域已知的任何方法来鉴定，优选地，通过使用BLAST工具将参考序列与单个第二序列或序列的片段比较或与序列的数据库比较。如下所述，BLAST将基于同一性和相似性百分比来比较序列。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个相同的序列或子序列。如使用以下序列比较算法之一或通过手动校准和目视检查测量的，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时，如果两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上，或者如果未指定的话，在整个序列上，29％的同一性，可选地30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。可选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。例如，可以使用数学算法来确定任意两个序列之间的序列同一性百分比。这样的数学算法的非限制性示例是Myers和Miller，CABIOS 4:11 17(1988)的算法；Smith等，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443 453(1970)的同源比对算法；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444 2448(1988)的搜索相似性方法；Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873 5877(1993)的算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。当比较两个序列的同一性时，序列不一定是连续的，但任何空位都会带来罚分，从而降低整体的同一性百分比。对于blastn，默认参数是空位产生罚分＝5和空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认参数是空位产生罚分＝11和空位延伸罚分＝1。
如本文所用，“比较窗”包括对包括但不限于20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150的数量的连续位置中的任一个的区段的提及，其中在两个序列最佳比对后，可以将序列与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith和Waterman(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,J Mol Biol 48(3):443-453(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过手动比对和目视检查[参见，例如，Brent等，(2003)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou Ed)]。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别在Altschul等，Nucleic Acids Res25(17):3389-3402(1997)和Altschul等，J.Mol Biol 215(3)-403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词比对时，这些词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻域词命中(hit)充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。单词命中沿着每个序列在两个方向上扩展，只要累积比对分数可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。在以下情况下，单词命中在每个方向的扩展将停止：累积比对分数从其最大实现值下降了量X；由于一个或更多个负评分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用词长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的字长为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc Natl Acad SciUSA89(22):10915-10919(1992)))比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。
除了上面提到的序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，多肽通常与第二多肽基本相同，例如，其中两种肽仅在保守取代上不同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交。两个核酸序列基本相同的另一个指示是相同的引物可用于扩增序列。
短语“功能上等同的蛋白质”是指在严格条件下与示例性多核苷酸杂交并且在体内表现出与标准或对照生物活性相比相似或增强的生物活性，例如超过120％，或作为替选地超过110％，或作为替选地超过100％，或作为替选地超过90％，或作为替选地超过85％，或作为替选地超过80％。本公开范围内的其他实施例通过具有超过80％，或作为替选地超过85％，或作为替选地超过90％，或作为替选地超过95％，或作为替选地超过97％，或作为替选地超过98％或99％的序列同源性来鉴定。百分比同源性可以通过在适当条件下运行的序列比较程序，例如BLAST来确定。在一些实施方案中，程序在默认参数下运行。在一些实施方案中，提及某种酶或蛋白质包括其功能等效的酶或蛋白质。
细胞群意在表型和/或基因型相同(克隆)或不同的多于一个细胞的集合。基本上同质的细胞群是具有至少70％，或作为替选地至少75％，或作为替选地至少80％，或作为替选地至少85％，或作为替选地至少90％，或作为替选地至少95％，或作为替选地至少98％同一性的表型，如通过预选标志物所测量的。
当参考酶类(EC)而提及酶时，酶类是根据国际生物化学和分子生物学命名委员会提供的酶命名法对酶进行分类的或可以根据其进行分类的。还包括尚未归入特定类别但可以如此归类的其他合适的酶。
非天然存在的微生物
本文提供的非天然存在的微生物使用本领域公知的方法构建，如本文所例证的，以外源性表达至少一种编码本文所述生物合成途径中使用的酶或蛋白质的核酸，其量足以产生化合物例如2-酮戊酸、2-酮己酸、6-羟基-2-酮-己酸、1,5-戊二醇、己二酸、1,6-己二醇或6-羟基己酸。
能够产生本文描述的所需产物的微生物宿主的成功改造涉及鉴定具有足够活性和特异性以催化途径中的各个步骤的合适酶的组，例如本文实施例和文献中描述的那些。也可以使用本领域公知的方法测定来自外源DNA序列的单个酶或蛋白质活性。此外，这些酶可以使用现代蛋白质工程化方法(Protein Engineering Handbook；Lutz S.,&Bornscheuer U.T.Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA:2008；Vol.1&2)例如定向进化、合理诱变、计算设计(Zanghelini,A et al,2008)或其组合进行工程化，用于实现所需的底物特异性，控制立体选择性以合成对映纯或外消旋产物，通过提高半衰期、热稳定性、抑制剂/产物耐受性来稳定酶以承受恶劣的工业过程条件，以及改善酶在期望的所选择的微生物产生宿主中的表达和溶解性。一旦能够催化该途径的每个步骤的所需酶被表征，则编码这些酶的基因将被克隆到所选择的微生物中，发酵条件将被优化并且在发酵后产物形成将被监测。酶被鉴定后，对应于一种或更多种酶的基因被克隆到微生物宿主中。在一些实施方案中，将编码本文所述特定途径的每种酶的基因克隆到微生物宿主中。
将重组/外源核酸/蛋白质引入微生物中的方法和适用于该目的的载体是本领域公知的。例如，多种技术在Ausubel等编辑的Current Protocols in Molecular Biology(Wiley&Sons，New York，1988年，每季度更新一次)中进行了说明。用于将表达载体转移到微生物宿主细胞中的方法是本领域公知的。具体方法和载体可能因所需微生物宿主的种类而异。例如，细菌宿主细胞可以通过热休克、氯化钙处理、电穿孔、脂质体或噬菌体感染来转化。酵母宿主细胞可以通过乙酸锂处理(可进一步包括载体DNA和PEG处理)或电穿孔来转化。包括这些方法是为了举例说明目的，决不是限制性的或综合性的。通过本领域公知的方式进行的常规实验可用于确定特定的表达载体或转化方法是否适合给定的微生物宿主。此外，适用于许多不同微生物宿主的试剂和载体是可商购的并且是本领域公知的。
在非天然存在的微生物宿主中构建、表达或过表达酶以及在非天然存在的微生物宿主中测试表达水平的方法是本领域公知的(Protein Expression Technologies:Current Status and Future Trends,Baneyx F.编辑.Horizon Bioscience,2004,Norfolk,UK；和Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；以及Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。
用于进行微生物发酵的方法是本领域公知的。例如，多种技术在Clark等编辑的Biochemistry Engineering(CRC出版社，1997年，第2版)中进行了说明。发酵的具体方法可能因所需微生物宿主的种类而异。通常，微生物与碳源一起以分批或连续发酵模式在合适的培养基中生长。已知调节分解代谢物抑制或酶活性的试剂的使用可用于增强己二酸或戊二酸的产生。发酵的合适pH值在3至10之间。发酵可基于微生物的需要在好氧、厌氧或缺氧条件下进行。发酵可以以分批、补料分批或连续方式进行。如果需要的话，发酵也可以分两个阶段进行。例如，第一阶段可以是好氧的，以实现高生长和高产生力，然后是高己内酯产量的厌氧阶段。
碳源可以包括，例如，可以为非天然存在的微生物提供碳源的任何碳水化合物源。这样的来源包括例如糖类，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。碳水化合物的其他来源包括例如可再生原料和生物质。可用作本公开的方法中的原料的示例性生物质类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料，或原料的一部分。这样的生物质原料包含例如可用作碳源的碳水化合物底物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，除了上面举例说明的那些之外的可再生原料和生物质也可用于培养本公开的微生物生物体以产生所需化合物。
可以通过使用高压液相色谱(HPLC)分析、GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质谱)或使用本领域公知的常规程序的其他合适的分析方法来分析培养基从而监测本文所述的反应并且鉴定发酵培养基中的起始材料、产物或中间体。
可以培养本文所述的任何非天然存在的微生物生物体以产生和/或分泌本公开的产物。
通过本文所述的方法制备的化合物可以通过本领域公知的用于分离通过生物合成或发酵制备的有机化合物的方法来分离。例如，可以通过结晶、成盐、渗透蒸发、反应萃取、萃取(液-液和两相)、吸附、离子交换、透析、蒸馏、气提和基于膜的分离(Roffler等，Trends Biotechnolgy.2：129-136(1984))将化合物从溶液中分离。可以使用蒸馏、萃取(液-液和两相)、渗透蒸发和基于膜的分离(Roffler等，Trends Biotechnolgy.2：129-136(1984))从溶液中分离1,5-戊二醇。
如本文所述，用于实现所需产物的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，本公开的非天然存在的微生物可以在厌氧或基本厌氧条件下维持、培养或发酵。简而言之，厌氧条件是指没有氧气的环境。基本厌氧条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在0至10％的饱和度之间。基本厌氧条件还包括使细胞在保持低于1％的氧气气氛的密封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静息。氧的百分比可以通过例如用N2/CO2混合物或其他合适的非氧气体鼓泡培养物来保持。
本文所述的培养条件可以按比例放大并连续生长以产生产物。示例性的生长程序包括，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法都是本领域公知的。发酵程序特别可用于以商业量的生物合成产生。
术语“以足够量表达的途径酶”意味着该酶以足以允许检测所需途径产物的量表达。
在另一方面中，本文提供包含编码醛缩酶水合酶的第一外源核酸的重组微生物生物体，其中所述重组微生物生物体还被修饰以表达与野生型或未经修饰的相同微生物生物体相比提高量的醌氧化还原酶，并且可选地其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、梭菌属物种或大肠杆菌。
在一些实施方案中，生物体包含编码醌氧化还原酶的第二外源核酸。在一些实施方案中，第一外源核酸和/或第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。在一些实施方案中，第一外源核酸或第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。在一些实施方案中，第一外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。在一些实施方案中，第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。在一些实施方案中，调节元件选自启动子或增强子。在一些实施方案中，调节元件是启动子。在一些实施方案中，调节元件是增强子。
在一些实施方案中，醛缩酶水合酶具有EC编号4.1.2.45、EC编号4.1.2.34或EC编号4.1.1.4。在一些实施方案中，醛缩酶水合酶是选自以以下Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot IDNo.鉴定的酶的组的酶或其促进醛醇脱水产物形成的一部分(例如，结构域、一组氨基酸残基(可以是连续的或分开的)等)具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自表1、5、6、7和8的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自表1、5、6、7和8的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在载体中。在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在同一载体中。在一些实施方案中，第一外源核酸和第二外源核酸各自包含在它们自己的单独载体中。在一些实施方案中，载体是质粒。在一些实施方案中，载体是病毒载体。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQID NO:97。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶与选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot IDNo.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，重组微生物能够产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000531
其中R是H、CH3或CH2OH。
在一些实施方案中，重组微生物生物体能够产生1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。
在一些实施方案中，重组微生物经遗传修饰以提高从碳源产生丙酮酸。在一些实施方案中，碳源选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉，或其组合。
在另一方面中，本文提供了本文所公开的重组微生物生物体的群体。在一些实施方案中，群体基本上是同质的。在一些实施方案中，基本上同质是指至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同质。
在另一方面中，本文提供产生1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸的方法，其包括在合适的条件下培养本文公开的群体。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物或微生物生物体中分离1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。
某些实施方案的详细描述
除其他外，本公开包括认识到某些多肽，例如，作为或包含水合酶-醛缩酶多肽的多种羟醛脱水产物生物合成多肽，可用于有效产生多种化合物。在一些实施方案中，本公开表明了在结构上不同于这样的多肽的天然和/或已知醛底物的多种醛，例如本文所述的多种脂肪族醛，可用于使用本文所述的羟醛脱水产物生物合成多肽来有效制造许多产物。其中，本公开表明了多种羟醛脱水产物的产生可由单一羟醛脱水产物生物合成多肽(例如，如本文所述的多种水合酶-醛缩酶多肽)催化。
在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
使丙酮酸和醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触，从而产生羟醛脱水产物，其中：
羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
在一些实施方案中，醛是脂肪族醛。在一些实施方案中，醛的-CHO基团不与例如双键、三键或芳族基团共轭。
在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
使丙酮酸和脂肪族醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触，从而产生羟醛脱水产物，其中：
脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；和
羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含水合酶-醛缩酶多肽，例如，本文例证的那些。在一些实施方案中，提供的方法包括使丙酮酸和脂肪族醛与水合酶-醛缩酶接触以产生羟醛脱水产物。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽包含醛缩酶多肽。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽包含水合酶多肽。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽包含水合酶-醛缩酶多肽。在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽是水合酶-醛缩酶多肽。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶多肽是或包含如本文所述的水合酶-醛缩酶，例如具有EC编号4.1.2.45或EC编号4.1.2.34或EC 4.1.1.4，或选自表1和5至8的酶。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物生物合成多肽在生物体例如微生物内。在一些实施方案中，生物体表达工程化羟醛脱水产物生物合成多肽。在一些实施方案中，生物体表达提高的羟醛脱水产物生物合成多肽的水平和/或活性。在一些实施方案中，生物体提供提高的用于产生羟醛脱水产物的速率和/或产率。在一些实施方案中，生物体提供提高的用于产生羟醛脱水产物的底物利用。
在一些实施方案中，丙酮酸和脂肪族醛向羟醛脱水产物的转化由羟醛脱水产物生物合成多肽催化。
在一些实施方案中，可以通过替代途径提供羟醛脱水产物。在一些实施方案中，羟醛脱水产物由羟醛产物产生。
在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
将丙酮酸和醛与羟醛产物生物合成多肽接触以产生羟醛产物，其中：
羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
在一些实施方案中，醛是脂肪族醛。在一些实施方案中，醛的-CHO基团不与双键、三键或芳族基团共轭。
在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
将丙酮酸和脂肪族醛与羟醛产物生物合成多肽接触以产生羟醛产物，其中：
脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；和
羟醛产物是包含醛基团或酮基团和与醛或酮羰基的β-碳相连的羟基的化合物。
本公开的多种方法包括利用生物合成多肽。在一些实施方案中，生物合成多肽当与特定产物例如羟醛产物生物合成多肽、还原产物生物合成多肽等一起使用时，是指参与特定产物合成的多肽。在一些实施方案中，当与特定产物一起使用时，生物合成多肽是或包含催化特定产物形成的酶。在一些实施方案中，生物合成多肽具有在自然界中，例如在微生物中(例如，在自然界中发现的特定产物的参考生物合成多肽中)发现的氨基酸序列。或者或另外，在一些实施方案中，生物合成多肽与合适的参考生物合成多肽(例如，如在自然界中发现的和/或在本文中(例如，在一个或更多个相关表中)呈现的或其一部分(例如，促进相关反应的氨基酸残基(其可以是连续的或分离的)的一部分(例如，结构域(例如，相关催化结构域)和/或组)共享特征序列元件和/或整体百分比同一性。
在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽是或包含醛缩酶多肽。阅读本公开的本领域技术人员理解可以根据本公开利用多种醛缩酶多肽。在一些实施方案中，醛缩酶多肽是或包含在描述于US20170044551中的醛缩酶，其醛缩酶通过引用并入本文。
在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽是或包含如本文所述的醛缩酶-水合酶。
在一些实施方案中，羟醛产物生物合成多肽存在于生物体例如微生物中。在一些实施方案中，生物体被工程化以表达工程化的或外源性的羟醛产物生物合成多肽，通常以更高的蛋白质水平和/或活性水平表达。在一些实施方案中，丙酮酸和脂肪族醛向羟醛产物的转化由羟醛产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，方法在培养物例如细菌培养物中进行。至于其他生物合成多肽，羟醛产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将羟醛产物转化为羟醛脱水产物。在一些实施方案中，转化包括使羟醛产物与脱水产物生物合成多肽接触，从而产生羟醛脱水产物。在一些实施方案中，脱水产物生物合成多肽是或包含水合酶。在一些实施方案中，脱水产物生物合成多肽是或包含脱水酶。在一些实施方案中，水合酶或脱水酶描述于US20170044551中，该水合酶和脱水酶通过引用并入本文。至于其他生物合成多肽，脱水产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
如本领域技术人员所理解的，羟醛脱水产物可用于制造多种产物，例如1,5-戊二醇、1,6-己二醇、6HH、己二酸等，其可用于制造范围广泛的产物，例如聚合物、树脂、涂层产物等。在一些实施方案中，羟醛脱水产物的利用包括一种或更多种化学转化，其中每一种都可以独立地由多肽(例如本文描述的酶)可选地在生物体中催化，或通过传统的化学过程而不使用酶进行。如本领域技术人员所理解的，一个或更多个或所有步骤可以在一种或更多种生物体中进行，每种生物体可以使用在其自身内或从生物体外部产生的底物，和/或一种或更多种独立包含一种或更多种类型的生物体的培养物(每种生物体可以使用自身或培养物中产生的底物(例如，饲料化合物、由另一种产生的化合物)独立地进行一种或更多种反应)，来独立地进行一个或更多个反应。在一些实施方案中，一种或更多种或所有生物合成多肽独立地存在于一种生物体，例如可选地工程化的细菌中。在一些实施方案中，用于产生产物的一组生物合成多肽中的一个或更多个在一种生物体，例如可选地工程化的细菌中表达，并且该组中的一个或更多个其他生物合成多肽在一种或更多种其他生物体例如可选地工程化的细菌中表达。在一些实施方案中，生物体例如细菌被工程化以包含编码一种或更多种或所有生物合成多肽的一种或更多种外源核酸。在一些实施方案中，产物的制造包括在包含一种或更多种细菌的单一培养物中进行的多个反应步骤，每种细菌各自独立地包含一种或更多种或全部所需的生物合成多肽，并且共同包含全部所需的生物合成多肽。在一些实施方案中，产物的制造包括在两种或更多种培养物中进行的多个反应步骤，每种培养物各自独立地包含一种或更多种细菌，各自独立地包含一种或更多种或全部所需的生物合成多肽，并且共同包含全部所需的生物合成多肽。
例如，在一些实施方案中，羟醛脱水产物中的双键被转化为单键。
在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括：
使烯烃与烯烃还原产物生物合成多肽接触以产生烯烃还原产物，其中：
烯烃包含与羰基共轭的双键；和
烯烃中与羰基共轭的双键被还原为单键以提供烯烃还原产物。
在一些实施方案中，烯烃是羟醛脱水产物。
在一些实施方案中，烯烃还原产物生物合成多肽是或包含催化羟醛脱水产物(例如，2-氧代-3-烯酸)还原的酶，如本文所述。在一些实施方案中，这种酶是本文所述的醌氧化还原酶。在一些实施方案中，这种酶属于EC 1.6.5。在一些实施方案中，这种酶属于EC1.6.5.5。在一些实施方案中，这样的酶选自表9。
在一些实施方案中，烯烃还原产物生物合成多肽在生物体例如微生物内。在一些实施方案中，生物体表达工程化的烯烃还原产物生物合成多肽。在一些实施方案中，生物体表达提高的烯烃还原产物生物合成多肽的水平和/或活性。在一些实施方案中，生物体提供用于产生烯烃还原产物的提高的速率和/或产率。在一些实施方案中，生物体提供提高的用于产生烯烃还原产物的底物利用。
在一些实施方案中，烯烃还原产物生物合成多肽是或包含由生物体内源性编码和/或表达的酶，无需工程化。
阅读本公开的本领域技术人员理解可根据本公开使用多种醛。在一些实施方案中，醛是生物合成多肽的天然或已知底物，例如羟醛脱水产物生物合成多肽，其是或包含水合酶-醛缩酶。在一些实施方案中，醛不是天然或已知的底物。例如，除其他外，本公开表明脂肪族醛可用于使用水合酶-醛缩酶的产物制造，水合酶-醛缩酶的天然或已知底物是芳族醛或共轭醛。
在一些实施方案中，醛是脂肪族醛。在一些实施方案中，醛具有一个或两个α-氢。在一些实施方案中，醛具有式A-1的结构：
Ra-L2-L1-C(O)H，
A-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-c≡c-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
在一些实施方案中，羟醛产物具有式P-1的结构：
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)--C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物具有式P-2的结构：
Ra-L2-L1-CH＝CH-C(O)-C(O)OH，
P-2
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
在一些实施方案中，式P-2中的-CH＝CH-呈E构型。在一些实施方案中，式P-2中的-CH＝CH-呈Z构型。
在一些实施方案中，烯烃还原产物具有式P-3的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-3
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)--C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
在一些实施方案中，Ra是R”。在一些实施方案中，Ra是-OR”。
在一些实施方案中，R”是R’。在一些实施方案中，R”是-C(O)R’。在一些实施方案中，R”是-CO2R’。在一些实施方案中，R”是-SO2R’。
在一些实施方案中，R’是氢。在一些实施方案中，R’不是氢。
在一些实施方案中，Ra是R’。在一些实施方案中，Ra是-OR’。在一些实施方案中，Ra是-H。在一些实施方案中，Ra是-OH。
在一些实施方案中，L1是共价键。在一些实施方案中，L1不是共价键。
在一些实施方案中，L1是可选地被取代的C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的直链C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-未被取代。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-是单取代的。在一些实施方案中，L1被取代。在一些实施方案中，L1是未被取代的。在一些实施方案中，L1是-CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
在一些实施方案中，L2是共价键。在一些实施方案中，L2不是共价键。
在一些实施方案中，L2是可选地被取代的C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的直链C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2-。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-未被取代。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-是单取代的。在一些实施方案中，L2被取代。在一些实施方案中，L2是未被取代的。在一些实施方案中，L2是-CH2-。在一些实施方案中，L2是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2是-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
在一些实施方案中，L1和L2中的至少一个不是共价键。
在一些实施方案中，醛是CH3CHO。在一些实施方案中，醛是CH3CH2CHO。在一些实施方案中，醛是CH3CH2CH2CHO。在一些实施方案中，醛是CH2OHCHO。在一些实施方案中，醛是CH2OHCH2CHO。在一些实施方案中，醛是CH2OHCH2CH2CHO。
在一些实施方案中，羟醛产物是CH3CH(OH)CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛产物是CH3CH2CH(OH)CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛产物是CH3CH2CH2CH(OH)CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛产物是CH2OHCH(OH)CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛产物是CH2OHCH2CH(OH)CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛产物是CH2OHCH2CH2CH(OH)CH2C(O)COOH。
在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH3CH＝CHC(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH3CH2CH＝CHC(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH3CH2CH2CH＝CHC(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH2OHCH＝CHC(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH2OHCH2CH＝CHC(O)COOH。在一些实施方案中，羟醛脱水产物是CH2OHCH2CH2CH＝CHC(O)COOH。
在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH3CH2CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH3CH2CH2CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH2OHCH2CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH2OHCH2CH2CH2C(O)COOH。在一些实施方案中，烯烃还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)COOH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将烯烃还原产物转化为羰基还原产物。在一些实施方案中，烯烃还原产物包含羰基，并且羰基被转化为-CH(OH)-。在一些实施方案中，方法包括使烯烃还原产物与羰基还原产物生物合成多肽接触以产生羰基还原产物，其中：
烯烃还原产物包含羰基；和
烯烃还原产物的羰基转化为-CH(OH)-。
在一些实施方案中，羰基还原产物生物合成多肽是或包含还原酶。在一些实施方案中，羰基还原产物生物合成多肽是或包含如本文所述的酮基还原酶。在一些实施方案中，羰基还原产物生物合成多肽是或包含如本文所述的2-酮酸-2-还原酶。在一些实施方案中，这样的酶是如本文所述的6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶。在一些实施方案中，这样的酶描述于US20170044551中，该酶通过引用并入本文。
在一些实施方案中，烯烃还原产物向羰基还原产物的转化由羰基还原产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，羰基还原产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，羰基还原产物具有式P-4的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH，
P-4
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，羰基还原产物是CH3CH2CH2CH(OH)COOH。在一些实施方案中，羰基还原产物是CH3CH2CH2CH2CH(OH)COOH。在一些实施方案中，羰基还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH(OH)COOH。在一些实施方案中，羰基还原产物是CH2OHCH2CH2CH(OH)COOH。在一些实施方案中，羰基还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH(OH)COOH。在一些实施方案中，羰基还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH(OH)COOH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将羰基还原产物转化为CoA转移产物。在一些实施方案中，CoA转移产物是式P-5化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA，
P-5
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由CoA(CoA＝辅酶A)转移产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，CoA转移产物生物合成多肽是或包含如本文所述的CoA转移酶，例如2，6-二羟基-己酸CoA-转移酶。在一些实施方案中，CoA转移酶是描述于US20170044551中的一种CoA转移酶，该CoA转移酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由CoA转移产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，CoA转移产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH(OH)C(O)S-CoA。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-COA。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-COA。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH(OH)C(O)S-COA。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-COA。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH(OH)C(O)S-COA。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将CoA转移产物转化为脱水产物。在一些实施方案中，脱水产物是式P-6化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH＝CH-C(O)-S-CoA，
P-6
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由脱水产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，脱水产物生物合成多肽是或包含如本文所述的脱水酶。在一些实施方案中，脱水酶是或包含如本文所述的2，6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶。在一些实施方案中，脱水酶描述于US20170044551中，该脱水酶通过引用并入。
在一些实施方案中，这种转化由脱水产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，脱水产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，脱水产物是CH3CH2CH＝CHC(O)S-CoA。在一些实施方案中，脱水产物是CH3CH2CH2CH＝CHC(O)S-COA。在一些实施方案中，脱水产物是CH3CH2CH2CH2CH＝CHC(O)S-COA。在一些实施方案中，脱水产物是CH2OHCH2CH＝CHC(O)S-COA。在一些实施方案中，脱水产物是CH2OHCH2CH2CH＝CHC(O)S-COA。在一些实施方案中，脱水产物是CH2OHCH2CH2CH2CH＝CHC(O)S-COA。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将脱水产物，例如将式P-6化合物或其盐转化为还原产物。在一些实施方案中，还原产物是式P-7化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA，
P-7
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由还原产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，还原产物生物合成多肽是或包含2，3-烯酰基-CoA还原酶、2，3-脱氢-羧基CoA 2’3-还原酶，例如如本文所述的2，3-脱氢-己酰基-CoA 2，3-还原酶。在一些实施方案中，合适的还原酶描述于US20170044551中，该还原酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由还原产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，还原产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，还原产物是CH3CH2CH2CH2C(O)S-CoA。在一些实施方案中，还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2C(O)S-COA。在一些实施方案中，还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)S-COA。在一些实施方案中，还原产物是CH2OHCH2CH2CH2C(O)S-COA。在一些实施方案中，还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)S-COA。在一些实施方案中，还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)S-COA。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将还原产物，例如式P-7化合物或其盐转化为CoA转移产物。在一些实施方案中，CoA转移产物是式P-8化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-8
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由CoA转移产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，CoA转移产物生物合成多肽是或包含如本文所述的CoA转移酶，例如，如本文所述的6-羟基己酰基-CoA转移酶。在一些实施方案中，CoA转移酶描述于US20170044551中，该CoA转移酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由CoA转移产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，CoA转移产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，CoA转移产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将CoA转移产物，例如式P-8化合物或其盐，其中Ra是-OH，转化为氧化产物。在一些实施方案中，氧化产物是式P-9化合物：
H-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-9
或其盐，其中L2’是共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-19脂肪族或C1-19杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，or-C(O)O-，并且每个其他变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，L2’是共价键。在一些实施方案中，L2’不是共价键。在一些实施方案中，L1和L2’中的至少一个不是共价键。
在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的直链C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2-。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是可选地被取代的-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-未被取代。在一些实施方案中，与-C(O)H键合的-CH2-是单取代的。在一些实施方案中，L2’被取代。在一些实施方案中，L2’是未被取代的。在一些实施方案中，L2’是-CH2-。在一些实施方案中，L2’是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是-CH2CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L2’是-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
在一些实施方案中，这种转化由氧化产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，氧化产物生物合成多肽是或包含醇脱氢酶，例如伯醇脱氢酶，例如如本文所述的6-羟基己酸脱氢酶。在一些实施方案中，醇脱氢酶描述于US20170044551中，该醇脱氢酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由氧化产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，氧化产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，氧化产物是HC(O)CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，氧化产物是HC(O)CH2CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，氧化产物是HC(O)CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将氧化产物，例如式P-9化合物或其盐转化为醛氧化产物。在一些实施方案中，氧化产物是式P-10化合物：
HO-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-10
或其盐，其中每个其他变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由醛氧化产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，醛氧化产物生物合成多肽是或包含醛脱氢酶，例如如本文所述的6-羟基己酸脱氢酶。在一些实施方案中，醛脱氢酶描述于US20170044551中，该醛脱氢酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由醛氧化产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，醛氧化产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，醛氧化产物是HOC(O)CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，氧化产物是HOC(O)CH2CH2CH2CH2C(O)OH。在一些实施方案中，氧化产物是HOC(O)CH2CH2CH2CH2CH2C(O)OH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将CoA转移产物，例如式P-8化合物或其盐转化为羧基还原产物。在一些实施方案中，羧基还原产物是式P-9’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H，
P-9’
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由羧基还原产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，羧基还原产物生物合成多肽是或包含如本文所述的羧酸还原酶或醛脱氢酶。在一些实施方案中，羧基还原产物生物合成多肽是或包含6-羟基己酸1-还原酶。在一些实施方案中，羧基还原产物生物合成多肽是或包含描述于US20170044551中的羧酸还原酶或醛脱氢酶，该羧酸还原酶或醛脱氢酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由羧基还原产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，羧基还原产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，羧基还原产物是CH3CH2CH2CH2C(O)H。在一些实施方案中，羧基还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2C(O)H。在一些实施方案中，羧基还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2C(O)H。在一些实施方案中，羧基还原产物是CH2OHCH2CH2CH2C(O)H。在一些实施方案中，羧基还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2C(O)H。在一些实施方案中，羧基还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2C(O)H。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将羧基还原产物，例如式P-9’化合物或其盐转化为醛还原产物。在一些实施方案中，醛还原产物是式P-10’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH，
P-10’
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由醛还原产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，醛还原产物生物合成多肽是或包含如本文所述的醛还原酶或醇(例如伯醇)脱氢酶。在一些实施方案中，醛还原酶或醇(例如伯醇)脱氢酶描述于US20170044551中，该还原酶和脱氢酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由醛还原产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，醛还原产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2CH2OH。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将烯烃还原产物，例如式P-3化合物或其盐转化为脱羧产物。在一些实施方案中，脱羧产物是式P-4’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H，
P-4’
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由脱羧产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，脱羧产物生物合成多肽是或包含如本文所述的脱羧酶。在一些实施方案中，脱羧酶是如本文所述的2-酮酸脱羧酶。在一些实施方案中，脱羧酶描述于US20170044551中，该脱羧酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由脱羧产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，脱羧产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，脱羧产物是CH3CH2CH2CHO。在一些实施方案中，脱羧产物是CH3CH2CH2CH2CHO。在一些实施方案中，脱羧产物是CH3CH2CH2CH2CH2CHO。在一些实施方案中，脱羧产物是CH2OHCH2CH2CHO。在一些实施方案中，脱羧产物是CH2OHCH2CH2CH2CHO。在一些实施方案中，脱羧产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CHO。
在一些实施方案中，通过酶催化、通过生物合成或通过没有酶催化的传统有机合成，将脱羧产物，例如式P-4’化合物或其盐转化为醛还原产物。在一些实施方案中，醛还原产物是式P-5’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH，
P-5’
或其盐，其中每个变量独立地如本文所述。
在一些实施方案中，这种转化由醛还原产物生物合成多肽催化。在一些实施方案中，醛还原产物生物合成多肽是或包含如本文所述的伯醇脱氢酶。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶描述于US20170044551中，该伯醇脱氢酶通过引用并入本文。在一些实施方案中，这种转化由醛还原产物生物合成多肽催化。
对于许多其他生物合成多肽，醛还原产物生物合成多肽可以在生物体例如细菌中，可以被工程化，和/或可以在提高的蛋白质和/或活性水平下以提高的方式表达，并且它们的产物可以以提高的速率和/或产量和/或底物利用率产生。
在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH3CH2CH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2OH。在一些实施方案中，醛还原产物是CH2OHCH2CH2CH2CH2CH2OH。
在一些实施方案中，本公开提供了编码一种或更多种生物合成多肽的核酸。在一些实施方案中，这样的核酸包含非天然序列。在一些实施方案中，这样的核酸被优化用于在产生生物体例如细菌中表达。
如本文所表明的，多种技术可用于评估多肽的生物合成活性的活性。例如，在实施例中描述了用于评估羟醛脱水产物生物合成多肽(例如，水合酶-醛缩酶)或烯烃还原产物生物合成多肽(例如，用于减少羟醛脱水产物的酶)的活性的多种技术。
在一些实施方案中，多种生物合成多肽，例如羟醛脱水产物生物合成多肽，在生物体中，在许多实施方案中，微生物例如细菌、真菌等。在一些实施方案中，它们从一种或更多种重组核酸中表达。在一些实施方案中，多种转化以生物合成方式进行，例如在生物体例如细菌中进行。在一些实施方案中，生物体(例如，微生物，例如细菌)被工程化以包含编码生物合成多肽(例如羟醛脱水产物生物合成多肽，例如水合酶-醛缩酶)的外源核酸。
在一些实施方案中，生物体，例如那些被设计用于产生羟醛脱水产物的生物体，表达经调节水平的，通常提高水平和/或活性的羟醛脱水产物生物合成多肽例如水合酶-醛缩酶多肽。
在一些实施方案中，生物体包含工程化核酸和/或表达工程化生物合成多肽，例如羟醛脱水产物生物合成多肽(例如，多种水合酶-醛缩酶)。在一些实施方案中，工程化核酸与参考核酸相比包含一个或更多个序列差异。在一些实施方案中，参考核酸是引入工程化核酸的生物体中的相应核酸。在一些实施方案中，参考核酸是天然核酸。在一些实施方案中，工程化核酸编码与参考核酸(例如天然核酸)相同的多肽或其特征元件。在一些实施方案中，工程化核酸编码与作为参考核酸编码的多肽或其特征元件不同的多肽或其特征元件。在一些实施方案中，工程化改造的多肽与参考多肽(例如，由参考核酸编码，在自然界中发现等)相比包含一个或更多个差异。在一些实施方案中，工程化多肽包含一个或更多个与参照多肽不同的氨基酸残基。在一些实施方案中，工程化多肽是在其被引入的生物体中不存在的多肽。在一些实施方案中，工程化多肽与参考多肽同源，例如，与参考多肽或其特征元件共享10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、95％、99％或更高的同源性。在一些实施方案中，特征元素是催化相关反应的域。在一些实施方案中，特征元件是一组氨基酸残基。在一些实施方案中，特征元件是与底物、产物、辅因子等形成接触和/或促进相关反应的一组氨基酸残基。如本领域技术人员所理解的，一组氨基酸残基中的残基在序列上可以彼此相邻，或者可以分开。在一些实施方案中，一组中的两个或更多个氨基酸残基可以在空间上彼此靠近，例如在催化口袋中。
在一些实施方案中，对于生物合成生产，生物体可以表达高水平和/或活性的一种或更多种生物合成多肽。在一些实施方案中，生物体提供了提高的速率和/或产率以生产期望的产物。
如本文中所述，在一些实施方案中，本公开提供了高的产物产率。在一些实施方案中，产率，例如涉及一种或更多种生物合成多肽的一步或多步过程的产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。在一些实施方案中，所提供的技术为期望的产物提供了底物例如丙酮酸的高利用率。在一些实施方案中，对于期望的产物，利用率百分比为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
本领域技术人员理解本公开的多种化合物，例如式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’的化合物或其盐，可用作产生多种化合物、材料和产物的原料。例如，己二酸可用于生产尼龙6,6、聚酯多元醇、聚酯树脂、增塑剂、食品和其他材料。1,5-戊二醇可用于制造多种聚氨酯、聚酯多元醇和聚酯。1,6-己二醇(HDO)可用于制造多种聚酯，其中一些可用于工业涂料应用。HDO还可用于产生聚氨酯，聚氨酯尤其可用作汽车应用的涂料。在一些实施方案中，HDO用于产生大分子二醇，例如用于例如弹性体和聚氨酯分散体(例如，用于镶木地板和皮革涂料)的己二酸酯和聚碳酸酯二醇。通过传统的化学或生物合成过程或其组合，6-羟基己酸可以环化生成ε-己内酯，然后其可以胺化生成ε-己内酰胺。通过传统的化学或生物合成过程或其组合，6-羟基己酸可以胺化为6-氨基己酸，然后其可以环化为ε-己内酰胺。ε-己内酰胺，尤其可用于产生尼龙6，这是一种在许多不同行业中广泛使用的聚合物。ε-己内酯可以聚合，使聚己内酯(PCL)成为一种生物可降解的聚酯，具有多种应用，包括产生专用的聚氨酯。多种2-酮羧酸可用于多种工业相关化学品和药物。在一些实施方案中，这样的化学品和药物或其中间体是氨基酸或α-羟基羧酸。在一些实施方案中，本公开的化合物用于制造聚酯、聚酯多元醇、聚氨酯、尼龙(例如，从己二酸)、聚碳酸酯二醇(例如，从HDO或1,5-戊二醇等)、二丙烯酸酯(例如从HDO或1,5-戊二醇等)、二缩水甘油醚(例如从HDO或1,5-戊二醇等)等。
在一些实施方案中，本公开提供了所提供的方法的制备，例如式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’化合物或其盐，以及从这样的化合物制备的多种化合物、材料、产物等的制备。
所提供的技术提供了许多优点。其中，所提供的方法利用一种或更多种生物合成多肽和/或来自可再生资源的材料，其可以提高效率和/或减少污染。在一些实施方案中，本公开的制剂(例如，式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’化合物或其盐，以及从这样的化合物制备的多种化合物、材料、产物等)与从化石碳源制备的那些相比包含富集水平的一种或更多种同位素(例如14C)。在一些实施方案中，使用化石碳源的制剂具有0或几乎为0的14C水平。用于评估化合物、组合物、制备产物等中多种原子的同位素比率和/或水平的技术是本领域技术人员公知的，并且可以根据本公开使用。例如，在一些实施方案中，同位素富集可以通过质谱法使用诸如加速质谱法(acceleratedmass spectrometry，AMS)和/或稳定同位素比质谱法(Stable Isotope Ratio MassSpectrometry，SIRMS)的技术和/或通过核磁共振定点自然同位素分馏(Site-SpecificNatural Isotopic Fractionation by Nuclear Magnetic Resonance，SNIF-NMR)容易地评估。
如本领域技术人员所理解的，所提供的方法可以在包含一种或更多种生物合成多肽的系统中在体外进行。在许多实施方案中，所提供的技术使用表达一种或更多种生物合成多肽的生物体(例如微生物，例如细菌)进行。在一些实施方案中，本公开提供了表达一种或更多种如本文中所述的生物合成多肽的生物体，例如细菌。在一些实施方案中，这样的生物体被工程化。在一些实施方案中，这样的生物体被工程化和/或培养以表达提高水平的蛋白质和/或提高活性的一种或更多种生物合成多肽。在一些实施方案中，这样的生物体被工程化和/或培养以利用碳源来更有效地产生所期望的产物。
在一些实施方案中，本公开提供了产生脂肪族醛的羟醛产物的生物体，该微生物包含羟醛产物生物合成多肽的提高的表达或活性。在一些实施方案中，生物体被工程化。在一些实施方案中，生物体是细菌。
在一些实施方案中，本公开提供了产生醛的羟醛脱水产物的生物体，该微生物包含羟醛产物生物合成多肽、羟醛脱水产物生物合成多肽、脱水产物生物合成多肽、及其组合的提高的表达或活性。在一些实施方案中，本公开提供了产生醛的羟醛脱水产物的生物体，该微生物包含羟醛脱水产物生物合成多肽的提高的表达或活性。在一些实施方案中，生物体被工程化。在一些实施方案中，生物体是细菌。在一些实施方案中，醛是脂肪族醛。
在一些实施方案中，本公开提供了产生烯烃还原产物的生物体，该微生物包含烯烃还原产物生物合成多肽的提高的表达或活性。在一些实施方案中，本公开提供了从丙酮酸和醛产生烯烃还原产物的生物体，该微生物包含烯烃还原产物生物合成多肽的提高的表达或活性。在一些实施方案中，生物体被工程化。在一些实施方案中，生物体是细菌。
在一些实施方案中，本公开提供了如本文中所述的生物体的培养物。在一些实施方案中，本公开提供了细菌的培养物。在一些实施方案中，培养物包含一种或更多种生物合成多肽的一种或更多种产物，例如一种或更多种式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’的化合物或其盐。
如本领域技术人员所理解的，丙酮酸可以作为丙酮酸或其盐提供。
在一个方面中，本文中提供了用于制备式I化合物或其盐、或者化合物或盐的溶剂合物的方法：
Figure BDA0003417244850000761
其中R为CH2OH、CH3或H，其中所述方法包括酶促步骤。
在一些实施方案中，该方法包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还另外由以下组成：在一定条件下在溶液中组合或孵育式
Figure BDA0003417244850000762
的CN醛(其中R是CH2OH、CH3或H)和丙酮酸，使得A)通过由EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的水合酶-醛缩酶(在本文中称为Ads-Hyd)催化的羟醛缩合，将CN醛和丙酮酸转化为CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸中间体；然后(b)使用EC编号为1.6.5.(例如，EC编号1.6.5.5.)的氧化还原酶将CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸转化为CN+3 2-酮羧酸(即式I的化合物)，或其盐，或者化合物或盐的溶剂合物。
在一些实施方案中，该方法包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：在一定条件下在溶液中组合或孵育式
Figure BDA0003417244850000763
的CN醛(其中R是CH2OH、CH3或H)和丙酮酸，使得A)首先通过由EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的水合酶-醛缩酶(在本文中称为Ads-Hyd)催化的羟醛加成，将CN醛和丙酮酸转化为CN+3 4-羟基-2-酮羧酸中间体；然后(b)使用水合酶-醛缩酶将4-羟基-2-酮羧酸转化为CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸；然后(c)使用EC编号为1.6.5.(例如，EC编号1.6.5.5.)的氧化还原酶将CN+3 3,4-脱氢-2-酮-羧酸转化为CN+3 2-酮羧酸(即式I的化合物)，或其盐，或者化合物或盐的溶剂合物。
在另一方面中，本文中提供了用于制备选自1,5-戊二醇、己二酸、1,6-己二醇和6-羟基己酸的化合物的方法，所述方法包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：a)使用EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的水合酶-醛缩酶和EC编号为1.6.5(例如，EC编号1.6.5.5)的氧化还原酶的组合将3-羟基-丙醛和丙酮酸转化为6-羟基-2-酮羧酸中间体；以及b)通过酶促步骤将6-羟基-2-酮羧酸中间体转化为所述化合物。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45的反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.34的反式-2’-羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.1.4的乙酰乙酸脱羧酶。
在一些实施方案中，微生物用作用于制备式I化合物或选自1,5-戊二醇、己二酸、1,6-己二醇和6-羟基己酸的化合物、或其盐、或者化合物或盐的溶剂合物的宿主。如本文所用，“宿主”是指可产生一种或更多种酶的细胞或微生物，所述酶能够在细胞或微生物的内部(通过例如摄取起始材料并可选地分泌产物)或外部(通过例如分泌酶)催化反应。
在一些实施方案中，该方法还包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：从溶液、培养物和/或宿主细胞中分离选自1,5-戊二醇、己二酸、1,6-己二醇和6-羟基己酸的化合物或其盐、或者化合物或盐的溶剂合物。
在一些实施方案中，本文中公开的方法的条件包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：在约10至约200℃的温度下，或作为替选地至少(所提供的所有温度均为摄氏温度)10、15、20、25、28、29、30、31、32、33、34、35、37、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190℃，或不高于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28或25℃(温度下限为10℃)下孵育或接触组分。在一些实施方案中，条件或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：孵育溶液的pH为约2至约12。在一些实施方案中，pH为至少2、或3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8或9，高达约12。在一些实施方案中，pH不高于12、11、10、9、8、7.5、7、6.5、6、5.5或4，pH下限不低于2。
在一些实施方案中，条件包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：丙酮酸和CN醛的摩尔浓度以约0.1μM至约5M的浓度存在。在一些实施方案中，浓度是至少约0.1、0.5、1、10、100、500μM或1M。在一些实施方案中，浓度不高于约4M、3M、2M、1M、500μM、200μM、100μM，或10μM。丙酮酸和CN的浓度可以独立地相同或不同，并且会随着孵育的其他条件而变化。
在一些实施方案中，所述条件包括产生选自以下的一种或更多种酶的非天然微生物的存在：I/II类丙酮酸依赖性醛缩酶、水合酶-醛缩酶、脱水酶、醌氧化还原酶、烯酰基-CoA还原酶、伯醇脱氢酶、酮酸脱羧酶、辅酶A转移酶和羧酸还原酶。这些酶中的每一种都是反应特异性酶。
在一些实施方案中，微生物或宿主被遗传工程化以过表达酶或以大于野生型对应物的量表达酶。确定酶或表达产物的表达水平的方法是本领域已知的，例如通过PCR。
在一些实施方案中，CN醛是3-羟基-丙醛。
在一些实施方案中，该方法还包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：从甘油、C5糖、C6糖、磷酸甘油酯、其他碳源、糖酵解途径中间体、丙酸代谢中间体、或其组合制备3-羟基-丙醛和丙酮酸。
在一些实施方案中，3-羟基-丙醛通过甘油脱水获得。
在一些实施方案中，C5糖包括以下中的一种或更多种，或作为替选地基本上由以下中的一种或更多种组成，或还进一步由以下中的一种或更多种组成：木糖、木酮糖、核酮糖、阿拉伯糖、来苏糖和核糖。
在一些实施方案中，C6糖包括以下中的一种或更多种，或作为替选地基本上由以下中的一种或更多种组成，或还进一步由以下中的一种或更多种组成：阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、半乳糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖。
在一些实施方案中，其他碳源是适合作为微生物碳源的原料，其中所述原料包括以下，或作为替选地基本上由以下组成，或还进一步由以下组成：氨基酸、脂质、玉米秸、芒属、城市废物、能源甘蔗、糖甘蔗、甘蔗渣、淀粉流、右旋糖流、甲醇、甲酸、或其组合。
在一些实施方案中，微生物用作用于制备1,5-戊二醇、己二酸、1,6-己二醇或6-羟基己酸的宿主。
在一些实施方案中，微生物具有将C5糖、C6糖、甘油、其他碳源或其组合转化为丙酮酸的能力。
在一些实施方案中，微生物被工程化用于增强糖摄取，例如C5糖摄取、同时的C6/C5糖摄取、同时的C6糖/甘油摄取、同时的C5糖/甘油摄取或其组合。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000791
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000792
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000793
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000801
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在一种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000802
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000803
与反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在一种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000804
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000805
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达；并且其中丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000811
进行仅由水合酶-醛缩酶催化的羟醛缩合反应以产生2-氧代-3-烯酸，并且2-氧代-3-烯酸进行仅由醌氧化还原酶催化的反应以产生2-酮羧酸。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000812
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000813
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在一种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行；并且其中丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000814
进行仅由水合酶-醛缩酶催化的羟醛缩合反应以产生2-氧代-3-烯酸，并且2-氧代-3-烯酸进行仅由醌氧化还原酶催化的反应以产生2-酮羧酸。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000815
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000821
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000822
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000823
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在两种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000824
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000825
与反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在两种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000831
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000832
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达；并且其中丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000833
进行仅由水合酶-醛缩酶催化的羟醛缩合反应以产生2-氧代-3-烯酸，并且2-氧代-3-烯酸进行仅由醌氧化还原酶催化的反应以产生2-酮羧酸。
在另一方面中，本文中提供了用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850000834
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000835
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生2-酮羧酸；其中水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达，并且所述方法在两种或更多种非天然存在的微生物生物体存在下进行；并且其中丙酮酸和
Figure BDA0003417244850000841
进行仅由水合酶-醛缩酶催化的羟醛缩合反应以产生2-氧代-3-烯酸，并且2-氧代-3-烯酸进行仅由醌氧化还原酶催化的反应以产生2-酮羧酸。
在一些实施方案中，
Figure BDA0003417244850000842
是3-羟基-丙醛。在一些实施方案中，3-羟基-丙醛通过由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
在一些实施方案中，用于产生2-酮羧酸的方法还包括从一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离2-酮羧酸。
在另一方面中，本文中提供了用于产生1,5-戊二醇的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000843
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生1,5-戊二醇，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生1,5-戊二醇的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000851
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生1,5-戊二醇，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000852
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使6-羟基己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生1,6-己二醇，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000861
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基-己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使6-羟基-己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生1,6-己二醇，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000862
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000871
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生己二酸(AA)的方法，所述方法包括使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000881
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生己二酸，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在另一方面中，本文中提供了用于产生己二酸(AA)的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850000891
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生己二酸，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45的反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.34的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.1.4的酶。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank或RefSeq或Uniprot IDNo鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自以以下Genbank或RefSeq或Uniprot IDNo.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、A0A370X7D8、WP_028222253、F2J6L6、A0A0N0L9F6、A0A1G9YWG7、A0A2U1BT09、A0A244DHE8、WP_107818191、A0A023WZF9、PYN48855、A0A421PAQ6、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是选自表1、5、6、7和8的酶。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与选自表1、5、6、7和8的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5.5的酶。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQID NO:97。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶与选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot IDNo.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：P28304、P40783、Q0K2I0、A0A1Z1SRY9、P43903、I7G8G0或Q142L2、ALK19324.1、A0A1G9R408、G4Q8R5、ANA98723.1、K0EUQ3、A0A061CRS8、Q9A212、A0A1I6RWW2、WP_026197277.1、Q5NKZ3、WP_012333034.1或WP_136898000.1。在一些实施方案中，醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由一种或更多种非天然存在的微生物表达的一种或更多种外源基因表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由两种或更多种非天然存在的微生物表达的一种或更多种外源基因表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由一种或更多种非天然存在的微生物表达的两种或更多种外源基因表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的至少一种由两种或更多种非天然存在的微生物表达的两种或更多种外源基因表达。一种或更多种外源基因包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多种外源基因。两种或更多种外源基因包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多种外源基因。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。在一些实施方案中，醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达并且醌氧化还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达并且醌氧化还原酶由两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶是选自以以下EC编号鉴定的酶的组的酶：EC编号4.1.1.1；EC编号4.1.1.2；EC编号4.1.1.3；EC编号4.1.1.4；EC编号4.1.1.5；EC编号4.1.1.6；EC编号4.1.1.7；EC编号4.1.1.11；EC编号4.1.1.12；EC编号4.1.1.15；EC编号4.1.1.16；EC编号4.1.1.17；EC编号4.1.1.18；EC编号4.1.1.19；EC编号4.1.1.20；EC编号4.1.1.34；EC编号4.1.1.35；EC编号4.1.1.40；EC编号4.1.1.54；EC编号4.1.1.56；EC编号4.1.1.71；EC编号4.1.1.72；EC编号4.1.1.73；EC编号4.1.1.74；EC编号4.1.1.75；或EC编号4.1.1.77。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶是选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶。在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶与选自以Uniprot IDNo.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，2-酮酸脱羧酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是EC编号为1.1.1.61的酶。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：NP_417279.1、NP_349892.1、NP_349891.1、BAB12273.1、L21902.1、Q94B07、AAB03015.1、NP_014032.1、NP_013892.1、NP_015019.1、NP_010996.2、ABX39192.1、XP_001210625.1、ABO67118、ABO68223、BAE77068.1或CAA47743.1。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶与选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：NP_417279.1、NP_349892.1、NP_349891.1、BAB12273.1、L21902.1、Q94B07、AAB03015.1、NP_014032.1、NP_013892.1、NP_015019.1、NP_010996.2、ABX39192.1、XP_001210625.1、ABO67118、ABO68223、BAE77068.1或CAA47743.1。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶是包含SEQID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶。在一些实施方案中，伯醇脱氢酶与包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，伯醇脱氢酶还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶是以Uniprot ID No.A0A286PH18鉴定的酶；醌氧化还原酶是以Uniprot ID No.P28304鉴定的酶；2-酮酸脱羧酶是以Uniprot IDNo.Q6QBS4鉴定的酶；并且伯醇脱氢酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。在一些实施方案中，水合酶-醛缩酶与以UniprotID No.A0A286PH18鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；醌氧化还原酶与以Uniprot ID No.P28304鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2-酮酸脱羧酶与以Uniprot ID No.Q6QBS4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且伯醇脱氢酶与以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
在一些实施方案中，其中6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、2、3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶选自以以下EC编号鉴定的酶的组：EC编号1.1.99.6、EC编号1.1.1.169、EC编号1.1.1.215、EC编号1.1.1.28或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；6-羟基己酸1-还原酶是EC编号为1.2.99.6的酶；并且6-羟基己醛1-还原酶是EC编号为1.1.1的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC6409；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot IDNo.T4VW93鉴定的酶；6-羟基己酸1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC6409；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或0A2X3BTQ9鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot IDNo.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；6-羟基己酸1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank IDNo.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶是以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A0C7GD16、A0A175L1W4或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酸1-还原酶与以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694.1、WP_036338301.1、WP_007472106.1或A0QWI7；并且6-羟基己醛1-还原酶与以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：D6Z860、YP_001705436.1、ANO06407.1、AAR91681.1、AHH98121.1、ANB00612.1、ANO04655.1、A0R484、AFP42026.1、GAJ86510.1、YP_001704097.1、ANA99315.1、GAJ83027.1、ANA98925.1、ANA98924.1、ANO04656.1、YP_001703694。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含以下的序列的酶：SEQID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:60、SEQID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ IDNO:65的序列的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；6-羟基己酸1-还原酶是包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶；并且6-羟基己醛1-还原酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸1-还原酶和6-羟基己醛1-还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶选自以以下鉴定的酶的组：EC编号1.1.99.6、EC编号1.1.1.169、EC编号1.1.1.215、EC编号1.1.1.28或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot IDNo.Q73Q47鉴定的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以以下Uniprot或GenBankID No.鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：WP_003431407.1、BAL51292.1、Q5FTU6、AKC64094.1、WP_002876862.1、AGP69017.1、WP_003640741.1、AKC64095.1和AKC64094.1；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93、A0A2X3BTQ9、A0A0C7GD16或A0A175L1W4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含以下的序列的酶：SEQID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:60、SEQID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ IDNO:65的序列的酶；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含以下的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶选自以以下EC编号鉴定的酶的组：EC编号1.1.99.6、EC编号1.1.1.169、EC编号1.1.1.215、EC编号1.1.1.28或EC编号1.1.1.110；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；6-羟基己酸脱氢酶是EC编号为1.1.1.258的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是EC编号为1.2.1.63的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是以Uniprot ID No.Q5FTU6鉴定的酶；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶；6-羟基己酸脱氢酶是以Uniprot ID No.Q7WVD0或Q84H78鉴定的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是以Uniprot ID No.Q9R2F4鉴定的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与以Uniprot ID No.Q5FTU6鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与以Uniprot ID No.Q5U924、Q5U925和Q5U923或A0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与以Uniprot ID No.Q73Q47鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与以Uniprot ID No.T4VW93或A0A2X3BTQ9鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酸脱氢酶与以Uniprot ID No.Q7WVD0或Q84H78鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且6-氧代-己酸氧化酶与以Uniprot ID No.Q9R2F4鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53的序列的酶；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63或SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶；6-羟基己酸脱氢酶是包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的经鉴定的酶；并且6-氧代-己酸氧化酶是包含SEQ ID NO:75的序列的酶。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；6-羟基己酸脱氢酶与包含SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的序列的经鉴定的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性；并且6-氧代-己酸氧化酶与包含SEQ ID NO:75的序列的酶具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性。
在一些实施方案中，6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、6-羟基己酰基-CoA转移酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代-己酸氧化酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。在一些实施方案中，蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签
在一些实施方案中，丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
在一些实施方案中，3-羟基-丙醛通过由一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
一种或更多种非天然存在的微生物生物体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多种非天然存在的微生物生物体。两种或更多种非天然存在的微生物生物体包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多种非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中，本文中公开的方法在一种非天然存在的微生物生物体的存在下进行。在一些实施方案中，本文中公开的方法在两种非天然存在的微生物生物体的存在下进行。在一些实施方案中，本文中公开的方法在三种非天然存在的微生物生物体的存在下进行。在一些实施方案中，本文中公开的方法在四种非天然存在的微生物生物体的存在下进行。在一些实施方案中，本文中公开的方法在五种非天然存在的微生物生物体的存在下进行。
在本申请通篇，引用了多种出版物。这些出版物的全部公开内容，包括这些出版物中的GenBank登录号或Uniprot ID号或RefSeq ID号在此通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本公开所涉及的现有技术的状态。
在一些实施方案中，本发明提供了以下实施方案作为实例：
1.用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850001041
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850001042
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生所述2-酮羧酸；其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
2.实施方案1所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
3.实施方案1所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
4.实施方案1所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
5.实施方案1所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
6.实施方案1所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达，并且所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
7.实施方案1-6中任一项所述的方法，其中
Figure BDA0003417244850001043
为3-羟基-丙醛。
8.实施方案7所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
9.实施方案1-8中任一项所述的方法，其还包括从所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述2-酮羧酸。
10.用于产生下式的2-酮羧酸的方法：
Figure BDA0003417244850001051
其中R是H、CH3或CH2OH；
所述方法包括在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中使丙酮酸和
Figure BDA0003417244850001052
与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生所述2-酮羧酸；其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
11.实施方案10所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
12.实施方案10所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
13.实施方案10所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
14.实施方案10所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
15.实施方案10所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达，并且所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
16.实施方案10-15中任一项所述的方法，其中
Figure BDA0003417244850001053
为3-羟基-丙醛。
17.实施方案16所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
18.实施方案10-17中任一项所述的方法，其还包括从所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述2-酮羧酸。
19.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的酶。
20.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。
21.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
22.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
23.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
24.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
25.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自表1、5至8的酶。
26.实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5(例如，EC1.6.5.5)的酶。
27.实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
28.实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
29.实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
30.实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
31.实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
32.实施方案31所述的方法，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
33.实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
34.实施方案1-11中任一项所述的方法，其中R是CH2OH。
35.用于产生1，5-戊二醇的方法，所述方法包括：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001081
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使所述5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生1,5-戊二醇，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
36.实施方案35所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
37.实施方案35所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
38.实施方案35所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
39.实施方案35所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
40.实施方案35所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
41.实施方案35-40中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物表达。
42.实施方案35-40中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
43.实施方案35-40中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶中的一种或更多种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
44.实施方案35-43中任一项所述的方法，其还包括从所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述1,5-戊二醇。
45.用于产生1,5-戊二醇的方法，所述方法包括：
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001101
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与2-酮酸脱羧酶接触以产生5-羟基-戊醛；以及
使所述5-羟基-戊醛与伯醇脱氢酶接触以产生所述1,5-戊二醇，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
46.实施方案45所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
47.实施方案45所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
48.实施方案45所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
49.实施方案45所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
50.实施方案45所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
51.实施方案45-50中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
52.实施方案45-50中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
53.实施方案45-50中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶和所述伯醇脱氢酶中的一种或更多种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
54.实施方案45-53中任一项所述的方法，其还包括从所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述1,5-戊二醇。
55.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的酶。
56.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。
57.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
58.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
59.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
60.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
61.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自表1、5至8的酶。
62.实施方案35-61中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5(例如，EC 1.6.5.5)的酶。
63.实施方案35-61中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
64.实施方案35-61中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
65.实施方案35-61中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
66.实施方案35-61中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
67.实施方案35-66中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶是具有以下EC编号的酶：EC编号4.1.1.1；EC编号4.1.1.2；EC编号4.1.1.3；EC编号4.1.1.4；EC编号4.1.1.5；EC编号4.1.1.6；EC编号4.1.1.7；EC编号4.1.1.11；EC编号4.1.1.12；EC编号4.1.1.15；EC编号4.1.1.16；EC编号4.1.1.17；EC编号4.1.1.18；EC编号4.1.1.19；EC编号4.1.1.20；EC编号4.1.1.34；EC编号4.1.1.35；EC编号4.1.1.40；EC编号4.1.1.54；EC编号4.1.1.56；EC编号4.1.1.71；EC编号4.1.1.72；EC编号4.1.1.73；EC编号4.1.1.74；EC编号4.1.1.75或EC编号4.1.1.77。
68.实施方案35-66中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶是选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶。
69.实施方案35-66中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶与选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶具有至少50％同一性。
70.实施方案35-66中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶与选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶具有至少70％同一性。
71.实施方案35-66中任一项所述的方法，其中所述2-酮酸脱羧酶与选自以Uniprot ID No.Q6QBS4、A7M7D6或P20906鉴定的酶的组的酶具有至少90％同一性。
72.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶是EC编号为1.1.1.61的酶。
73.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶是选自以以下Uniprot或GenBank ID No.鉴定的酶的组的酶：NP_417279.1、NP_349892.1、NP_349891.1、BAB12273.1、L21902.1、Q94B07、AAB03015.1、NP_014032.1、NP_013892.1、NP_015019.1、NP_010996.2、ABX39192.1、XP_001210625.1、ABO67118、ABO68223、BAE77068.1或CAA47743.1。
74.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶是包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶。
75.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶与包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶具有至少50％同一性。
76.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶与包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶具有至少70％同一性。
77.实施方案35-71中任一项所述的方法，其中所述伯醇脱氢酶与包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的序列的酶具有至少90％同一性。
78.实施方案35-54中任一项所述的方法，其中
所述水合酶-醛缩酶是包含SEQ ID NO:8的序列的酶；
所述醌氧化还原酶是包含SEQ ID NO:45的序列的酶；
所述2-酮酸脱羧酶是包含SEQ ID NO:83的序列的酶；并且
所述伯醇脱氢酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
79.实施方案35-78中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶、醌氧化还原酶、2-酮酸脱羧酶和伯醇脱氢酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
80.实施方案79所述的方法，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
81.实施方案35-80中任一项所述的方法，其中所述丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
82.实施方案35-81中任一项所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
83.用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001151
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使所述6-羟基-己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使所述6-羟基-己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生1,6-己二醇，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
84.实施方案83所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
85.实施方案83所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
86.实施方案83所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
87.实施方案83所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
88.实施方案83所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
89.实施方案83-88中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
90.实施方案83-88中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
91.实施方案83-88中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶中的一种或更多种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
92.实施方案83-91中任一项所述的方法，其还包括从所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述1,6-己二醇。
93.用于产生1,6-己二醇的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001171
其中R是CH2OH；
使2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使所述6-羟基-己酸与6-羟基己酸1-还原酶接触以产生6-羟基-己醛；以及
使所述6-羟基-己醛与6-羟基己醛1-还原酶接触以产生所述1,6-己二醇，
其中所述方法在包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
94.实施方案93所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
95.实施方案93所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
96.实施方案93所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
97.实施方案93所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
98.实施方案93所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
99.实施方案93-98中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
100.实施方案93-98中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
101.实施方案93-98中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶中的一种或更多种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
102.实施方案93-101中任一项所述的方法，其还包括从所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述1,6-己二醇。
103.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的酶。
104.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。
105.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
106.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
107.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
108.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4：SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
109.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自表1和5至8的酶。
110.实施方案83-109中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5(例如，EC1.6.5.5)的酶。
111.实施方案83-109中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
112.实施方案83-109中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
113.实施方案83-109中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
114.实施方案83-109中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
115.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是EC编号为1.1.99.6、EC编号为1.1.1.169、EC编号为1.1.1.215、EC编号为1.1.1.28或EC编号为1.1.1.110的酶；
所述2，6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述2，6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；
所述2，3-脱氢-己酰基-CoA 2，3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述6-羟基己酸1-还原酶是EC编号为1.2.99.6的酶；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶是EC编号为1.1.1的酶。
116.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105的序列的酶；
所述2，6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57或SEQ ID NO：58的序列的酶；
所述2，6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64的序列的酶；
所述2，3-脱氢-己酰基-CoA 2，3-还原酶是包含SEQ ID NO：65的序列的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述6-羟基己酸1-还原酶是包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
117.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少50％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少50％同一性。
118.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少70％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少70％同一性。
119.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少90％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少90％同一性。
120.实施方案83-119中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸1-还原酶和所述6-羟基己醛1-还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
121.实施方案120所述的方法，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
122.实施方案83-121中任一项所述的方法，其中所述丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
123.实施方案83-122中任一项所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
124.用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001241
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生所述6-羟基-己酸；
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
125.实施方案124所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
126.实施方案124所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
127.实施方案124所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
128.实施方案124所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
129.实施方案124所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
130.实施方案124-129中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
131.实施方案124-129中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
132.实施方案124-129中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶中的一种或更多种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
133.实施方案124-132中任一项所述的方法，其还包括从所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述6-羟基-己酸。
134.用于产生6-羟基-己酸的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001261
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；以及
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生所述6-羟基-己酸；以及
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
135.实施方案134所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
136.实施方案134所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
137.实施方案134所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
138.实施方案134所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
139.实施方案134所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
140.实施方案134-139中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
141.实施方案134-139中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
142.实施方案134-139中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶中的一种或更多种由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
143.实施方案134-142中任一项所述的方法，其还包括从所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述6-羟基-己酸。
115.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是EC编号为1.1.99.6、EC编号为1.1.1.169、EC编号为1.1.1.215、EC编号为1.1.1.28或EC编号为1.1.1.110的酶；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述6-羟基己酸1-还原酶是EC编号为1.2.99.6的酶；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶是EC编号为1.1.1的酶。
116.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述6-羟基己酸1-还原酶是包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶是包含SEQ ID NO:70的序列的酶。
117.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少50％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少50％同一性。
118.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少70％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少70％同一性。
119.实施方案83-102中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酸1-还原酶与包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列的酶具有至少90％同一性；并且
所述6-羟基己醛1-还原酶与包含SEQ ID NO:70的序列的酶具有至少90％同一性。
156.实施方案124-143中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是EC编号为1.1.99.6、EC编号为1.1.1.169、EC编号为1.1.1.215、EC编号为1.1.1.28或EC编号为1.1.1.110的酶；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；并且
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶。
157.实施方案124-143中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；并且
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶。
158.实施方案124-143中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少50％同一性；并且
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性。
159.实施方案124-143中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少70％同一性；并且
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性。
160.实施方案124-143中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少90％同一性；并且
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性。
161.实施方案124-160中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶和所述6-羟基己酰基-CoA转移酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
162.实施方案161所述的方法，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
163.实施方案124-162中任一项所述的方法，其中所述丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
164.实施方案124-163中任一项所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
165.用于产生己二酸的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001331
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使所述6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使所述6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生所述己二酸，
其中所述方法在包含一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
166.实施方案165所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
167.实施方案165所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
168.实施方案165所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
169.实施方案165所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
170.实施方案165所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
171.实施方案165-170中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
172.实施方案165-170中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
173.实施方案165-170中任一项所述的方法，其中6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶中的一种或更多种由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
174.实施方案165-173中任一项所述的方法，其还包括从所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述己二酸。
175.用于产生己二酸的方法，所述方法包括
使丙酮酸和3-羟基-丙醛与水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶接触以产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001341
其中R是CH2OH；
使所述2-酮羧酸与6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶接触以产生2,6-二羟基-己酸；
使所述2,6-二羟基-己酸与2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶接触以产生2,6-二羟基-己酰基-CoA；
使所述2,6-二羟基-己酰基-CoA与2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶接触以产生6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-2,3-脱氢-己酰基-CoA与2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶接触以产生6-羟基-己酰基-CoA；
使所述6-羟基-己酰基-CoA与6-羟基己酰基-CoA转移酶接触以产生6-羟基-己酸；
使所述6-羟基-己酸与6-羟基己酸脱氢酶接触以产生6-氧代-己酸；以及
使所述6-氧代-己酸与6-氧代-己酸氧化酶接触以产生所述己二酸，
其中所述方法在包含两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中进行。
176.实施方案175所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
177.实施方案175所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶和所述醌氧化还原酶中的至少一种由两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
178.实施方案175所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
179.实施方案175所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
180.实施方案175所述的方法，其中所述醌氧化还原酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体过表达。
181.实施方案175-180中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体表达。
182.实施方案175-180中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶由所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达。
183.实施方案175-180中任一项所述的方法，其中6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2，6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2，6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2，3-脱氢-己酰基-CoA 2，3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶、所述6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶中的一种或更多种由所述两种或更多种非天然存在的微生物过表达。
184.实施方案175-183中任一项所述的方法，其还包括从所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体或包含所述两种或更多种非天然存在的微生物生物体的培养物中分离所述己二酸。
185.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4的酶。
186.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自以以下GenBank、RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。
187.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
188.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
189.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
190.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
191.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中所述水合酶-醛缩酶是选自表1和5至8的酶。
192.实施方案165-191中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5(例如，EC1.6.5.5)的酶。
193.实施方案165-191中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
194，实施方案165-191中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
195.实施方案165-191中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：417，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
196.实施方案165-191中任一项所述的方法，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
197.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是EC编号为1.1.99.6、EC编号为1.1.1.169、EC编号为1.1.1.215、EC编号为1.1.1.28或EC编号为1.1.1.110的酶；
所述2，6-二羟基-己酸CoA-转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述2，6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是EC编号为4.2.1.167的酶；
所述2，3-脱氢-己酰基-CoA 2，3-还原酶是EC编号为1.3.1.44的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是EC编号为2.8.3、EC编号为2.8.3.1或EC编号为2.8.3.12的酶；
所述6-羟基己酸脱氢酶是EC编号为1.1.1.258的酶；并且
所述6-氧代-己酸氧化酶是EC编号为1.2.1.63的酶。
198.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶是包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶是包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA2,3-还原酶是包含SEQ ID NO:65的序列的酶；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶是包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶；
所述6-羟基己酸脱氢酶是包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的经鉴定的酶；并且
所述6-氧代-己酸氧化酶是包含SEQ ID NO:75的序列的酶。
199.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少50％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少50％同一性；
所述6-羟基己酸脱氢酶与包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的酶具有至少50％同一性；并且
所述6-氧代-己酸氧化酶与包含SEQ ID NO:75的序列的酶具有至少50％同一性。
200.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少70％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少70％同一性；
所述6-羟基己酸脱氢酶与包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的酶具有至少70％同一性；并且
所述6-氧代-己酸氧化酶与包含SEQ ID NO:75的序列的酶具有至少70％同一性。
201.实施方案165-184中任一项所述的方法，其中
所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶与包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶与包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63；或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的序列的酶具有至少90％同一性；
所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶与包含SEQ ID NO:65的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酰基-CoA转移酶与包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的序列的酶具有至少90％同一性；
所述6-羟基己酸脱氢酶与包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的序列的酶具有至少90％同一性；并且
所述6-氧代-己酸氧化酶与包含SEQ ID NO:75的序列的酶具有至少90％同一性。
202.实施方案165-201中任一项所述的方法，其中所述6-羟基-2-氧代己酸-2-还原酶、所述2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶、所述2,6-二羟基-己酰基-CoA 2-脱水酶、所述2,3-脱氢-己酰基-CoA 2,3-还原酶、所述6-羟基己酰基-CoA转移酶,6-羟基己酸脱氢酶和所述6-氧代-己酸氧化酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
203.实施方案202所述的方法，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
204.实施方案165-203中任一项所述的方法，其中所述丙酮酸由选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合的碳源产生。
205.实施方案165-204中任一项所述的方法，其中所述3-羟基-丙醛通过由所述一种或更多种非天然存在的微生物生物体外源表达的甘油脱水酶使甘油脱水而产生。
206.重组微生物生物体，其包含编码醛缩酶水合酶的第一外源核酸，其中所述重组微生物生物体被进一步修饰以表达与野生型或未经修饰的相同微生物生物体相比增加量的醌氧化还原酶，并且可选地其中所述微生物生物体是谷氨酸棒状杆菌、梭菌属物种或大肠杆菌。
207.实施方案206所述的重组微生物，其中所述生物体包含编码醌氧化还原酶的第二外源核酸。
208.实施方案207所述的重组微生物，其中第一和/或第二外源核酸还包含驱动第二外源核酸表达的调节元件。
209.实施方案208所述的重组微生物，其中所述调节元件选自启动子或增强子。
210.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4。
211.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶是选自以以下Genbank或RefSeq或Uniprot ID No.鉴定的酶的组的酶：D7C0E5、P0A144、Q79EM8、A0A0N0AHI8、A0A0N1FRY3、M3DYR1、W7SU48、A0A286PH18、Q9X9Q6、Q9WXH7、A4XDS1、F2J6N9、A0A063BFL5、Q9ZHH6、A0A0C1K853、WP_034398482、PYK12191、WP_115478033、WP_028222253、WP_013654807、WP_059403060、WP_092508530、WP_116642627、WP_009770659、WP_107818191、WP_003292061、PYN48855、WP_122212965、WP_028217297、WP_034507049、KMK64081.1、WP_070028041.1或KZL92449.1。
212.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
213.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
214.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：2I，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
215.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，或SEQ ID NO：86。
216.实施方案206-209中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醛缩酶水合酶为选自表1、5至8的酶。
217.实施方案206-216中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述第一外源核酸和所述第二外源核酸各自包含在载体中。
218.实施方案217所述的重组微生物生物体，其中所述第一外源核酸和所述第二外源核酸各自包含在同一载体中。
219.实施方案218所述的重组微生物生物体，其中所述第一外源核酸和所述第二外源核酸各自包含在它们自己的单独载体中。
220.实施方案217-219中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述载体是质粒。
221.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醌氧化还原酶是EC编号为1.6.5(例如，EC1.6.5.5)的酶。
222.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醌氧化还原酶是包含以下的序列的酶：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
223.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少50％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
224.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少70％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
225.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述醌氧化还原酶与包含以下的序列的酶具有至少90％同一性：
SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQID NO：96，或SEQ ID NO：97。
226.实施方案206-220中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述水合酶-醛缩酶和醌氧化还原酶中的一种或更多种还包含一种或更多种蛋白质标签。
227.实施方案226所述的重组微生物生物体，其中所述蛋白质标签选自多组氨酸标签、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、HA标签(血凝素标签)、FLAG标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
228.实施方案206-227中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述重组微生物生物体能够产生下式的2-酮羧酸：
Figure BDA0003417244850001451
其中R是H、CH3或CH2OH。
229.实施方案206-228中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述重组微生物生物体能够产生1，5-戊二醇、1，6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。
230.实施方案206-229中任一项所述的重组微生物生物体，其中所述重组微生物生物体被遗传修饰以提高丙酮酸从碳源的产生。
231.实施方案230所述的重组微生物生物体，其中所述碳源选自甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉或其组合。
232.实施方案206-231中任一项所述的重组微生物生物体的群体。
233.实施方案232所述的群体，其基本上是同质的。
234.用于产生1，5-戊二醇、1，6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸的方法，其包括在适当条件下培养实施方案232或实施方案233所述的群体。
235.实施方案234所述的方法，其还包括从培养物或所述微生物生物体中分离1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸或6-羟基己酸。
236.培养物，其包含实施方案206-231中任一项所述的重组微生物生物体。
237.培养物，其包含实施方案232或实施方案233所述的群体。
238.方法，其包括：
使丙酮酸和醛与羟醛产物生物合成多肽接触以产生羟醛产物，其中：
所述羟醛产物是包含醛基团或酮基团和与醛或酮的羰基的β-碳连接的羟基的化合物。
239.实施方案238所述的方法，其中醛的-CHO基团不与双键、三键或芳基共轭。
240.方法，其包括：
使丙酮酸和脂肪族醛与羟醛产物生物合成多肽接触以产生羟醛产物，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛产物是包含醛基团或酮基团和与醛或酮的羰基的β-碳连接的羟基的化合物。
241.实施方案238-240中任一项所述的方法，其中所述羟醛产物生物合成多肽是或包含醛缩酶。
242.实施方案238-241中任一项所述的方法，其中所述羟醛产物生物合成多肽在微生物中。
243.实施方案242所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码羟醛产物生物合成多肽的外源核酸。
244.实施方案242-243中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的羟醛产物生物合成多肽。
245.实施方案242-244中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经工程化的羟醛产物生物合成多肽。
246.实施方案238-245中任一项所述的方法，其中丙酮酸和脂肪族醛转化为羟醛产物是由羟醛产物生物合成多肽催化的。
247.实施方案238-246中任一项所述的方法，其中所述方法在培养物中进行。
248.实施方案238-247中任一项所述的方法，其包括将羟醛产物转化为羟醛脱水产物，其中所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
249.实施方案248所述的方法，其中所述转化包括使羟醛产物与脱水产物生物合成多肽接触以产生羟醛脱水产物。
250.实施方案248-249中任一项所述的方法，其中所述脱水产物生物合成多肽在微生物中。
251.实施方案250所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码脱水产物生物合成多肽的外源核酸。
252.实施方案250-251中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的脱水产物生物合成多肽。
253.实施方案250-252中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经工程化的脱水产物生物合成多肽。
254.实施方案248-253中任一项所述的方法，其中羟醛产物转化为羟醛脱水产物是由脱水产物生物合成多肽催化的。
255.实施方案248-254中任一项所述的方法，其中所述方法在培养物中进行。
256.实施方案249所述的方法，其中脱水产物生物合成多肽是脱水酶。
257.方法，其包括：
使丙酮酸和醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触以产生羟醛脱水产物，其中：
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
258.实施方案257所述的方法，其中醛的-CHO基团不与双键、三键或芳基共轭。
259.方法，其包括：
使丙酮酸和脂肪族醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触以产生羟醛脱水产物，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与醛基团或酮基团共轭的双键的化合物。
260.实施方案257-259中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含水合酶-醛缩酶。
261.实施方案260所述的方法，其中使丙酮酸和脂肪族醛与水合酶-醛缩酶接触产生了羟醛脱水产物。
262.实施方案257-259中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含EC编号为4.1.2.45或EC编号为4.1.2.34或EC编号为4.1.1.4或从表1和5至8中选择的酶。
263.实施方案257-259中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含与实施方案262所述的酶享有10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、95％、99％或更多同源性的多肽。
264.实施方案257-259中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含醛缩酶。
265.实施方案257-264中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽在微生物中。
266.实施方案265所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码羟醛脱水产物生物合成多肽的外源核酸。
267.实施方案265-266中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的羟醛脱水产物生物合成多肽。
268.实施方案265-267中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经工程化的羟醛脱水产物生物合成多肽。
269.实施方案257-268中任一项所述的方法，其中丙酮酸和脂肪族醛转化为羟醛脱水产物是由羟醛脱水产物生物合成多肽催化的。
270.实施方案257-269中任一项所述的方法，其中所述方法在培养物中进行。
271.方法，其包括：
使烯烃与烯烃还原产物生物合成多肽接触以产生烯烃还原产物，其中：
所述烯烃包含与羰基共轭的双键；并且
将所述烯烃中与羰基共轭的双键还原为单键以提供烯烃还原产物。
272.实施方案271所述的方法，其中所述烯烃为实施方案257-270中任一项所述的羟醛脱水产物。
273.实施方案271-272中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物生物合成多肽是或包含催化2-氧代-3-烯酸或其盐还原的酶。
274.实施方案271-272中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物生物合成多肽是或包含属于EC 1.6.5的酶。
275.实施方案271-272中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物生物合成多肽是或包含属于EC 1.6.5.5或选自表9的酶。
276.实施方案271-272中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物生物合成多肽是或包含与实施方案274-275中任一项所述的酶享有10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、95％、99％或更多同源性的多肽。
277.实施方案271-276中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物生物合成多肽在微生物中。
278.实施方案277所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码烯烃还原产物生物合成多肽的外源核酸。
279.实施方案277-278中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的烯烃还原产物生物合成多肽。
280.实施方案277-279中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经工程化的烯烃还原产物生物合成多肽。
281.实施方案271-280中任一项所述的方法，其中烯烃转化为烯烃还原产物是由烯烃还原产物生物合成多肽催化的。
282.实施方案271-281中任一项所述的方法，其中所述方法在培养物中进行。
283.实施方案238-270中任一项所述的方法，其包括实施方案271-282中任一项所述的方法。
284.实施方案238-283中任一项所述的方法，其中所述醛具有其式A-1的结构：
Ra-L2-L1-C(O)H，
A-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
285.实施方案238-256和284中任一项所述的方法，其中所述羟醛产物具有式P-1的结构：
Ra-L2-L1-CH(OH)-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
286.实施方案257-285中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物具有式P-2的结构：
Ra-L2-L1-CH＝CH-C(O)-C(O)OH，
P-2
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
287.实施方案286所述的方法，其中-CH＝CH-为E构型。
288.实施方案286所述的方法，其中-CH＝CH-为Z构型。
289.实施方案271-288中任一项所述的方法，其中所述烯烃还原产物具有式P-3的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-3
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
290.实施方案238-284中任一项所述的方法，其包括将烯烃还原产物转化为式P-10的化合物：
HO-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-10
或其盐。
291.实施方案238-284中任一项所述的方法，其包括将烯烃还原产物转化为式P-10’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH，
P-10’
或其盐。
292.实施方案238-291中任一项所述的方法，其包括将烯烃还原产物转化为羰基还原产物，其中：
所述烯烃还原产物包含羰基；并且
所述烯烃还原产物的羰基转化为-CH(OH)-。
293.实施方案238-291中任一项所述的方法，其包括使烯烃还原产物与羰基还原产物生物合成多肽接触以产生羰基还原产物，其中：
所述烯烃还原产物包含羰基；并且
所述烯烃还原产物的羰基转化为-CH(OH)-。
294.实施方案293所述的方法，其中所述羰基还原产物生物合成多肽是或包含酮还原酶或2-酮酸-2-还原酶。
295.实施方案293-294中任一项所述的方法，其中所述羰基还原产物生物合成多肽在微生物中。
296.实施方案295所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码羰基还原产物生物合成多肽的外源核酸。
297.实施方案295-296中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的羰基还原产物生物合成多肽。
298.实施方案295-297中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经工程化的羰基还原产物生物合成多肽。
299.实施方案290-298中任一项所述的方法，其中烯烃还原产物转化为羰基还原产物是由羰基还原产物生物合成多肽催化的。
300.实施方案290-299中任一项所述的方法，其中所述方法在培养物中进行。
301.实施方案290-300中任一项所述的方法，其中羰基还原产物具有式P-4的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH，
P-4
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
302.实施方案238-301中任一项所述的方法，其包括将式P-4化合物或其盐转化为式P-5化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA，
P-5
或其盐。
303.实施方案302所述的方法，其中转化包括使式P-4化合物或其盐与CoA转移产物生物合成多肽接触。
304.实施方案238-303中任一项所述的方法，其包括将式P-5化合物或其盐转化为式P-6化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH＝CH-C(O)-S-CoA，
P-6
或其盐。
305.实施方案304所述的方法，其中所述转化包括使式P-5化合物或其盐与脱水产物生物合成多肽接触。
306.实施方案238-305中任一项所述的方法，其包括将式P-6化合物或其盐转化为式P-7化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA，
P-7
或其盐。
307.实施方案306所述的方法，其中转化包括使式P-6化合物或其盐与还原产物生物合成多肽接触，所述还原产物生物合成多肽是或包含2，3-烯酰基-CoA还原酶。
308.实施方案238-307中任一项所述的方法，其包括将式P-7化合物或其盐转化为式P-8化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-8
或其盐。
309.实施方案308所述的方法，其中转化包括使式P-7化合物或其盐与CoA转移产物生物合成多肽接触。
310.实施方案238-309中任一项所述的方法，其包括将式P-8化合物或其盐转化为式P-9化合物：
H-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-9
或其盐，在所述式P-8中L2为-CH2-L2’-，其中：
L2’是共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-19脂肪族或C1-19杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-。
311.实施方案310所述的方法，其中所述转化包括使式P-8化合物或其盐与氧化产物生物合成多肽接触，所述氧化产物生物合成多肽是或包含醇脱氢酶。
312.实施方案238-311中任一项所述的方法，其包括将式P-9化合物或其盐转化为式P-10化合物：
HO-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-10
或其盐。
313.实施方案312所述的方法，其中所述转化包括使式P-9化合物或其盐与醛氧化产物生物合成多肽接触。
314.实施方案238-312中任一项所述的方法，其包括将式P-8化合物或其盐转化为式P-9’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H，
P-9’
或其盐。
315.实施方案314所述的方法，其包括使式P-8化合物或其盐与羧基还原产物生物合成多肽接触。
316.实施方案238-315中任一项所述的方法，其包括将式P-9’化合物或其盐转化为式P-10’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH，
P-10’
或其盐。
317.实施方案316所述的方法，其包括使式P-9’化合物或其盐与醛还原产物生物合成多肽接触，所述醛还原产物生物合成多肽是或包含醛还原酶或伯醇脱氢酶。
318.实施方案238-290中任一项所述的方法，其包括将式P-3化合物或其盐转化为式P-5’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH，
P-5’
或其盐。
319.实施方案238-290或318中任一项所述的方法，其包括将式P-3化合物或其盐转化为式P-4’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H，
P-4’
或其盐。
320.实施方案319所述的方法，其包括使式P-3化合物或其盐与脱羧产物生物合成多肽接触。
321.实施方案238-290中任一项所述的方法，其包括将式P-4’化合物或其盐转化为式P-5’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH，
P-5’
或其盐。
322.实施方案321所述的方法，其包括使式P-4’化合物或其盐与醛还原产物生物合成多肽接触。
323.实施方案301-322中任一项所述的方法，其中一个或更多个或每个转化独立地包括使化合物与合适的生物合成多肽接触。
324.实施方案323所述的方法，其中一种或更多种或所有生物合成多肽独立地在微生物中。
325.实施方案324所述的方法，其中所述微生物被工程化以包含编码一种或更多种或所有生物合成多肽的一种或更多种外源核酸。
326.实施方案324-325中任一项所述的方法，其中所述微生物表达经调节水平的一种或更多种或所有生物合成多肽。
327.实施方案324-326中任一项所述的方法，其中一种或更多种或所有生物合成多肽独立地被工程化。
328.实施方案324-326中任一项所述的方法，其中合适的生物合成多肽催化相应的转化。
329.实施方案285-328中任一项所述的方法，其中Ra是-H。
330.实施方案285-328中任一项所述的方法，其中Ra是-OH。
331.实施方案285-330中任一项所述的方法，其中L1是可选地被取代的C1-6亚烷基。
332.实施方案285-330中任一项所述的方法，其中L1是未被取代的C1-6亚烷基。
333.实施方案331-332中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2-。
334.实施方案331-332中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2-。
335.实施方案331-332中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2CH2-。
336.实施方案285-330中任一项所述的方法，其中L1是共价键。
337.实施方案285-336中任一项所述的方法，其中L2是共价键。
338.实施方案285-336中任一项所述的方法，其中L2是可选地被取代的C1-6亚烷基。
339.实施方案285-336中任一项所述的方法，其中L2是未被取代的C1-6亚烷基。
340.实施方案338-339中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2-。
341.实施方案338-339中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2-。
342.实施方案338-339中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2CH2-。
343.实施方案284所述的方法，其中所述脂肪族醛是HO-CH2-CH2-CHO。
344.实施方案285或343所述的方法，其中所述羟醛产物为HO-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-C(O)-COOH或其盐。
345.实施方案286和343-344中任一项所述的方法，其中所述羟醛脱水产物为HO-CH2-CH2-CH＝CH-C(O)-COOH或其盐。
346.实施方案289和343-345中任一项所述的方法，其中所述烯烃还原产物为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-COOH或其盐。
347.实施方案301和343-346中任一项所述的方法，其中所述羰基还原产物为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-COOH或其盐。
348.实施方案302和343-347中任一项所述的方法，其中式P-5化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-CO-S-CoA或其盐。
349.实施方案303和343-348中任一项所述的方法，其中式P-6化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CO-S-CoA或其盐。
350.实施方案305和343-349中任一项所述的方法，其中式P-7化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-S-CoA或其盐。
351.实施方案308和343-350中任一项所述的方法，其中式P-8化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
352.实施方案310和343-351中任一项所述的方法，其中式P-9化合物或其盐为H-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
353.实施方案312和343-352中任一项所述的方法，其中式P-10化合物或其盐为HO-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
354.实施方案310和343-351中任一项所述的方法，其中式P-9’化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H或其盐。
355.实施方案312和343-351以及354中任一项所述的方法，其中式P-10’化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH或其盐。
356.实施方案317和343-346中任一项所述的方法，其中式P-4’化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H或其盐。
357.实施方案317和343-346以及356中任一项所述的方法，其中式P-5’化合物或其盐为HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH或其盐。
358.实施方案238-357中任一项所述的方法，其中在接触步骤中微生物包含两种或更多种生物合成多肽。
359.实施方案238-358中任一项所述的方法，其包括在一种类型的微生物中进行一个或更多个接触和/或转化步骤，以及在另一种类型的微生物中进行一个或更多个另外的接触和/或转化步骤。
360.实施方案238-359中任一项所述的方法，其包括在一种培养物中进行一个或更多个接触和/或转换步骤，以及在另一种培养物中进行一个或更多个另外的接触和/或转换步骤。
361.实施方案238-359中任一项所述的方法，其包括在单一培养物中进行接触和/或转化步骤。
362.实施方案238-361中任一项所述的方法，其中微生物包含在接触步骤中记载的所有生物合成多肽。
363.实施方案362所述的方法，其包括在单一培养物中进行接触和/或转化步骤。
364.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述产物以约或至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L培养物产生。
365.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所期望产品的丙酮酸利用率为约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
366.通过前述实施方案中任一项所述的方法制备的制剂。
367.式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’化合物或其盐的制剂，或通过前述实施方案中任一项所述的方法制备的制剂，所述制剂相对于在所述化合物的参考制剂中所观察到的而富集14C同位素，所述参考制剂是使用化石碳源制备的。
368.聚酯、聚酯多元醇、聚氨酯、尼龙6、尼龙6,6、聚碳酸酯二醇、二丙烯酸酯或二缩水甘油醚的制剂，所述制剂是使用通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的制剂制造的。
369.实施方案368所述的制剂，其中所述制剂相对于在所述化合物的参考制剂中所观察到的而富集14C同位素，所述参考制剂是使用化石碳源制备的。
370.编码前述实施方案中任一项所述的一种或更多种生物合成多肽的核酸。
371.实施方案370所述的核酸，其中所述核酸不同于编码同一生物合成多肽的天然核酸。
372.实施方案370或371所述的核酸，其中所述核酸经优化以在微生物中表达。
373.产生脂肪族醛的羟醛产物的工程微生物，所述微生物包含羟醛产物生物合成多肽的提高的表达或活性，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；
所述羟醛产物是包含醛基团或酮基团和与醛或酮的羰基的β-碳连接的羟基的化合物。
374.实施方案373所述的微生物，其中所述脂肪族醛在实施方案238-363中任一项中描述。
375.实施方案373所述的微生物，其中所述羟醛产物在实施方案238-363中任一项中描述。
376.产生脂肪族醛的羟醛脱水产物的工程化微生物，所述微生物包含羟醛产物生物合成多肽、羟醛脱水产物生物合成多肽、脱水产物生物合成多肽或其任意组合的提高的表达或活性，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团和与所述醛基团或所述酮基团共轭的双键的化合物。
377.实施方案376所述的微生物，其中所述脂肪族醛在实施方案238-363中任一项中描述。
378.实施方案376所述的微生物，其中所述羟醛脱水产物在实施方案238-363中任一项中描述。
379.产生烯烃还原产物的工程化微生物，所述微生物包含烯烃还原产物生物合成多肽的提高的表达或活性，其中：
所述烯烃包含与羰基共轭的双键；并且
在所述烯烃中与羰基共轭的双键被还原为单键以提供烯烃还原产物。
380.实施方案379所述的微生物，其中所述烯烃在实施方案271-363中任一项中描述。
381.实施方案379所述的微生物，其中所述烯烃还原产物在实施方案238-363中任一项中描述。
382.实施方案373-381中任一项所述的微生物，其还包含实施方案271-363中任一项所述的生物合成多肽的提高的表达或活性。
383.培养物，其包含实施方案238-382中任一项所述的微生物和一种或更多种独立于式P-1至P-10、P-9’、P-10’、P-4’或P-5’或其盐的化合物。
384.实施方案383所述的培养物，其中一种或更多种化合物与可比较的微生物的参照培养物相比，独立地具有更高水平，而没有生物合成多肽的提高的表达或活性。
385.实施方案383-384中任一项所述的培养物，其中式P-1至P-10、P-9’、P-10’、P-4’或P-5’化合物中的每一种或其盐独立地如实施方案238-363中任一项所述。
386.如本文中所述的方法、制剂、化合物、生物体、微生物、培养物或产品。
实施例
下面列出以下实施例以举例说明根据所公开主题的方法和结果。这些实施例并不旨在包括本文中公开的主题的所有方面，而是旨在举例说明某些代表性的方法和结果。这些实施例并不旨在排除对本领域技术人员而言明显的、本文中所述主题的等同物和变体。在整个实施例中，酶或蛋白质的序列以它们的Uniprot ID或它们的GenBank登录号(称为GenBank ID或GenBank登录号)或它们的RefSeq ID鉴定。在Uniprot ID的情况下，序列由主要(可引用的)登录号表示。RefSeq蛋白质记录表示NCBI数据库中的非冗余蛋白质序列。非冗余蛋白质记录表示在不同菌株或物种中观察到一次或多次的一种精确序列。
实施例1：催化使用脂肪族醛的羟醛脱水产物生物合成的酶。
先前尚未证明反式-o-羟基亚苄基丙酮水合酶-醛缩酶(EC 4.1.2.45)1-5或4-(2-羧基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸酯醛缩酶(EC 4.1.2.34；也称为反式-2’-羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶)6(在本文中统称为水合酶-醛缩酶或Ads-Hyd)对脂肪族醛具有任何羟醛加成或羟醛缩合活性，1-6特别是紧挨着醛基团没有任何不饱和的那些5。相反，这些酶的羟醛缩合活性以前仅限于底物，其中新形成的不饱和可以通过与醛底物中存在的不饱和共轭来稳定1-5。这样的醛底物的一些实例包括芳香共轭醛例如苯甲醛或烯醛(即在C2和C3之间具有双键的脂肪族醛)。出乎意料地发现，这些水合酶-醛缩酶能够利用多种脂肪族醛，例如不同碳长度和不同官能度的线性醛作为底物，并且能够提供羟醛脱水产物，不旨在受到任何理论的限制，通过以丙酮酸为供体(亲核体)进行羟醛加成和羟醛缩合反应二者，分别得到相应的4-羟基-2-酮-羧酸和3,4-脱氢-2-酮-羧酸作为产物。对于代表性反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶(例如，表1中的条目Ads-Hyd 2&9)和反式-2’-羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶(例如，表1中的条目Ads-Hyd3)的结果总结在表1中羟醛脱水活性(羟醛加成和羟醛缩合二者)中，其中丙酮酸用作供体，并且乙醛、丙醛和3-羟基-丙醛用作接纳体醛。
表1.所提供的技术对多种醛都有活性。
Figure BDA0003417244850001641
Figure BDA0003417244850001651
表2中总结了来自表1的酶的子集对不同碳长度和官能度的脂肪族非共轭醛的羟醛加成和羟醛缩合活性，进一步证明了适用于该反应的非共轭醛底物的多功能性。
表2.所提供的技术对多种醛都有活性。
Figure BDA0003417244850001652
NT＝未测试；A＝乙醛；B＝丙醛；C＝丁醛；D＝2-羟基乙醛；E＝3’-羟基-丙醛；F＝4-羟基丁醛
除其他之外，所述技术提供了高效率，例如，在产物生产率、产量和/或底物(例如丙酮酸)利用方面。在一些实施方案中，与相关参考生物合成多肽相比，生物合成多肽具有约50％、100％或1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100倍或更高的活性，如通过在合适条件下可比较的产品的产量测量的。在一些实施方案中，本公开提供了底物例如丙酮酸的高效利用。在一些实施方案中，底物例如丙酮酸的利用率为约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，在一段时间的生产时间(例如，90分钟)之后，培养物中的期望产物浓度为约或至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10g/L。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。例如，表3展示了与先前已知的醛缩酶相比，所提供技术催化相应反应的的效率显著提高：表3中的代表性反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶在对受试底物的羟醛加成活性方面优于其他醛缩酶(例如，活性>5倍)。此外，表4表明，与比较性醛缩酶相比，Ads-Hyd酶可以提供提高的产物产量以及对底物丙酮酸的高效利用。这是尤其值得注意的，因为丙酮酸是一种中心代谢物，并且可能会被微生物内的其他反应消耗掉。如本文中所证明的，所提供的包含羟醛脱水产物生物合成多肽的技术可以有效地使体内由不希望的反应引起的丙酮酸消耗最小化，这对于提高体内期望的产物产率是至关重要的。
表3.所提供的技术可提供高活性。
Figure BDA0003417244850001671
表4.所提供的技术可以提供高产率和高效的底物利用。
Figure BDA0003417244850001672
NT＝未测试；+＝确定但未定量的活性；A＝乙醛；B＝丙醛；C＝3’-羟基-丙醛
尽管一些水合酶-醛缩酶已被归类为属于EC 4.1.2.45或EC 4.1.2.34(见表5)，但在表1中报告的大多数酶序列和通过同源性搜索鉴定的序列(使用BLAST；见表6至8)尚未分配EC编号。此外，这些酶在文献或数据库(例如Uniprot)中也被标注为乙酰乙酸脱羧酶或二氢吡啶二羧酸合成酶，或者因为与这些其他类别的酶的相似性而简单地被标注为醛缩酶。例如，当Ads-Hyd 8酶作为水合酶-醛缩酶发挥作用时(见表1)，Ads-Hyd 8酶未被标注为水合酶-醛缩酶，而是被标注为乙酰乙酸脱羧酶(参见该序列的Uniprot页)。类似地，Ads-Hyd11至13酶已被标注为二氢吡啶二羧酸合成酶，但它们作为水合酶-醛缩酶发挥作用(见表1)。预计许多水合酶-醛缩酶序列在公共数据库中被或将被标注或推断为属于乙酰乙酸脱羧酶或二氢吡啶二羧酸合成酶或醛缩酶，并且不被归类为属于EC 4.1.2.45或EC4.1.2.34。因此，为了鉴定水合酶-醛缩酶序列，对水合酶-醛缩酶序列进行基于同源性的搜索，并随后使用本文中所述的方法验证所得酶的活性。使用以下的示例性基于同源性的搜索揭示了>500种酶，其中一些列在下表中，并且其中许多在测试之后被证实为具有羟醛加成和缩合的活性(表1中的数据)：(a)属于EC 4.1.2.34的一个序列(Ads-Hyd 3；结果见表8)；(b)属于未分配的酶的一个序列，与属于EC4.1.2.34和EC 4.1.2.45的酶具有极低的同源性(Ads-Hyd 8；结果见表6)；和(c)属于未分配的酶的一个序列，显示出与属于EC4.1.2.34和EC4.1.2.45的酶具有中等同源性(Ads-Hyd 10；结果见表7)。例如，表6中鉴定的13个序列(见表6中带下划线的序列，那些序列的数据在表1中)和表7中鉴定的11个序列(见表7中带下划线的序列，那些序列的数据在表1中)被证实是功能性Ads-Hyd酶。除其他之外，本公开表明，还发现被归类为属于EC 4.1.1.4并被标注为乙酰乙酸脱羧酶的Ads-Hyd 112也催化在许多不同的醛的情况下的羟醛加成和羟醛缩合反应(表2)。在一些实施方案中，被标注为乙酰乙酸脱羧酶的酶以及属于E.C 4.1.1.4的酶也可用于催化羟醛缩合和加成反应。与属于EC 4.1.2.34的Ads-Hyd 3、属于EC 4.1.2.45的Ads-Hyd 2和Ads-Hyd 8酶的同一性低至35％(表1中的Ads-Hyd 68)、38％(表1中的Ads-Hyd 3)和49％(表1中的Ads-Hyd 93)的酶被证实具有水合酶-醛缩酶活性。
表5.某些生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850001681
Figure BDA0003417244850001691
表6.某些生物合成多肽-显示出与Ads-Hyd 8的同源性的酶。
Figure BDA0003417244850001692
Figure BDA0003417244850001701
Figure BDA0003417244850001711
Figure BDA0003417244850001721
Figure BDA0003417244850001731
Figure BDA0003417244850001741
Figure BDA0003417244850001751
Figure BDA0003417244850001761
Figure BDA0003417244850001771
Figure BDA0003417244850001781
表7.某些生物合成多肽-显示出与Ads-Hyd 10的同源性的酶。
Figure BDA0003417244850001782
Figure BDA0003417244850001791
Figure BDA0003417244850001801
Figure BDA0003417244850001811
Figure BDA0003417244850001821
Figure BDA0003417244850001831
Figure BDA0003417244850001841
Figure BDA0003417244850001851
Figure BDA0003417244850001861
Figure BDA0003417244850001871
Figure BDA0003417244850001881
表8.某些生物合成多肽-显示出与Ads-Hyd 3的同源性的酶。
Figure BDA0003417244850001882
Figure BDA0003417244850001891
Figure BDA0003417244850001901
Figure BDA0003417244850001911
Figure BDA0003417244850001921
克隆和表达：对编码异源醛缩酶水合酶的DNA进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且其由商业DNA合成公司合成。使用标准克隆方法，将每个基因克隆到pB11骨架质粒中T7 RNA聚合酶启动子的下游和T7终止子序列的上游。此外，对于其中所选择的醛是3-羟基-丙醛的一些实验，作为B12依赖型酶的甘油脱水酶(罗伊氏乳球菌甘油脱水酶，其由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[Uniprot ID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot ID No.A5VMA9]；和pduH[Uniprot IDNo.A5VMA8])也被克隆到第二相容性质粒上，以使得能够使用这种酶由甘油产生3-羟基-丙醛。将质粒转化到大肠杆菌BL21*(DE3)ΔldhA中。每个克隆的起始培养物在含有5mL 2xYT培养基和1g/L D-葡萄糖以及适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达的细胞培养在96孔板中在2mL生长培养基中进行。使用复合(2xYT)生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和100mg/L柠檬酸铁铵。在有氧条件和30℃下进行2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃和有氧条件下进行30至180分钟，然后在厌氧条件下进行0至60分钟。
酶测定：表达之后，收获细胞并将其重新悬浮在0.4mL含有15g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和反应底物的新鲜培养基(OD600～30)中。对于活性测定，将丙酮酸(10至20g/L)与5至40g/L醛(例如乙醛、丙醛、丁醛、2-羟基-乙醛或4-羟基-丁醛)在有氧条件下孵育12小时。对于在3-羟基-丙醛情况下的活性测定，收获表达之后的细胞并将其在厌氧条件下重新悬浮在0.4mL含有15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和10至20g/L葡萄糖、5至10g/L甘油以及10g/L丙酮酸的新鲜培养基(OD600～30)中，持续15小时。反应混合物还补充有10μM维生素B12和1g/L谷胱甘肽。在室温下孵育之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
产物分析：等度HPLC主要用于检测和量化酶产物、羟醛加成产物(4-羟基-2-酮羧酸)、羟醛缩合产物(3,4-脱氢-2-酮羧酸)的产生。一种方法在35℃下使用Bio-Rad AminexHPX-87柱，0.7mL/分钟的的0.05％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(refractive indexdetector)(折光检测器)和UV检测器进行检测，并且后者用于在210和260nm下测量信号。此外，还通过LC-MS通过测量先前经HPLC鉴定的各个峰的质量(数据未包括在本文中)来确认羟醛加成和羟醛缩合产物。
实施例2：催化羟醛脱水产物的还原的酶。
如本文中所证明的，活化的双键，即紧邻羰基或羧酸根基团的双键的还原可以被酶催化。羟醛脱水产物，例如2-氧代-3-烯酸，可以使用酶进一步还原，以得到相应的2-氧代-羧酸。出乎意料地发现，利用NADH和/或NADPH来还原醌的属于EC 1.6.5(例如EC1.6.5.5)的氧化还原酶能够催化该反应。例如，当如实施例1中所述，Ads-Hyd酶(见实施例1)在大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655菌株中重组表达以产生2-酮羧酸时，发现部分Ads-Hyd酶产物(即2-氧代-3-烯酸)被转化为相应的2-酮羧酸。这导致这些大肠杆菌菌株内的一些天然表达的一种或更多种酶负责进行2-氧代-3-烯酸的还原的可能性。对已知的氧化还原酶进行了调查，可想象地，这些酶可以在这些菌株内进行活化的双键的还原(即EC 1.3.-和EC 1.6.-)。在大肠杆菌MG1655和大肠杆菌BL21中分别鉴定了17种这样的有前景的酶。使用本领域已知的方法制备这两种宿主中的这些酶中的每一种的敲除菌株。随后，使用上述方法和使用重组表达的Ads-Hyd酶，测试每种这样的敲除菌株产生2-氧代-3-烯酸及其2-酮羧酸产物的能力。这导致鉴定出敲除qorA基因或醌氧化还原酶-1导致产生2-氧代-3-烯酸而没有2-酮羧酸。这证实了由qorA编码的酶可能负责天然地进行该反应。随后，过表达和纯化N端His6标记的QorA酶，并证实它确实具有进行期望的反应的活性(图6)。这首次明确地证实来自大肠杆菌的属于EC 1.6.5(例如EC 1.6.5.5)的醌氧化还原酶能够在与其天然底物非常不同的底物上发挥作用，这些底物在结构上是环状的。此外，已证实该酶能够在反应过程中利用NADH和NADPH二者作为辅因子(图6)，这是非常有利的，因为它能够在生物生产过程中在有氧和无氧两种条件下使用该酶。
根据本公开可以利用属于EC 1.6.5的多种生物合成多肽，例如，作为烯烃还原产物生物合成多肽和/或用于还原羟醛脱水产物。例如，根据本公开评估了EC 1.6.5.5的多种醌氧化还原酶的活性，所述酶包括与大肠杆菌Qor-1酶的同一性为37％至90％的十八种酶(见表9)。所有所选择的酶都被证实对至少一种底物有活性(表9)，进一步证实了这类酶进行该反应的普遍性。
表9.某些可用的生物合成多肽-还原酶。
Figure BDA0003417244850001941
另一些还原产物生物合成多肽，例如属于EC 1.6.5的多种亚类的那些，例如属于EC 1.6.5.5的多种醌氧化还原酶也可以进行该反应。
克隆和表达：对编码表5中所示的异源醛缩酶水合酶(Ads-Hyd 1)和醌氧化还原酶的DNA进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且其由商业DNA合成公司合成。对于体外活性测量，将N端His6标签添加到Qor-1酶上。使用标准克隆方法，将每个基因克隆到单pB11骨架质粒中T7 RNA聚合酶启动子的下游和T7终止子序列的上游。此外，对于其中所选择的醛是3-羟基-丙醛的一些实验，作为B12依赖型酶的甘油脱水酶(罗伊氏乳球菌甘油脱水酶，其由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[Uniprot ID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot ID No.A5VMA9]；和pduH[Uniprot IDNo.A5VMA8])也被克隆到第二相容性质粒上，以使得能够使用这种酶由甘油产生3-羟基-丙醛。将质粒转化到大肠杆菌BL21*(DE3)ΔldhA ΔqorA中。如上文在实施例1中所述进行重组蛋白表达。对于体外研究，Qor-1酶在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃和有氧条件下进行180分钟。诱导之后，使用本领域标准方法使用Ni-NTA亲和色谱纯化酶。
酶测定：与不同醌氧化还原酶的体内活性测量的实施例1相同。对于图6所示的体外活性测量，Qor-1酶(0.3mg/ml)与约10mM的6-羟基-3,4-脱氢-2-氧代己酸(内部合成)、0.5mM的NADH或NADPH一起在100mM pH 7磷酸缓冲液中孵育。
产物分析：使用实施例1中描述的等度HPLC方法来检测和量化酶产物，即2-酮-羧酸的产生。对于体外活性测量，340nm处吸光度的降低用于测量NADH或NADPH辅因子的消耗，从而测量Qor-1活性。
实施例3：用于从丙酮酸和脂肪族醛生产2-酮-羧酸的双酶系统。
检查了醛缩酶-水合酶与醌氧化还原酶组合用于生产一系列2-酮酸的用途。这种组合能够生产一系列2-酮酸，它们是生产多种工业上期望的产物(例如1,5-戊二醇、1,6-己二醇、己二酸、己内酰胺、己内酯、6-羟基己酸、6-氨基己酸、氨基酸)和多种不同的脂肪分子的前体。醛缩酶-水合酶和氧化还原酶的多种不同组合被证实对产生不同的2-酮酸具有活性(表10)。如本文中所证明的，所提供的技术可以提供高产物浓度，例如，为约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、15、17、18、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、2500、3000mM。
表10.所提供的包含多种生物合成多肽的技术产生期望的产物。
Figure BDA0003417244850001961
NT＝未测试；NA＝无活性；+＝确定但未定量的活性
多种生物合成多肽，特别是属于EC 1.6.5的那些，可用于还原。例如，属于EC1.6.5.5的醌氧化还原酶被报道为参与电子载体活性，并且被报道为是普遍存在的酶，因为它们被报道存在于例如哺乳动物、真菌和细菌中(参见Brenda.org上该EC类的条目)。尽管这些酶在不同宿主中的天然表达水平尚不清楚，但之前已经假设此类酶的天然表达水平会受到微生物宿主面临的氧化应激的影响。发现大肠杆菌(MG1655和BL 21菌株)QorA基因(Qor-1)是天然表达的，尤其是在实施例2中描述的条件下。证明了当Ads-Hyd酶(例如Ads-Hyd 8)在大肠杆菌中过表达时，即使是大肠杆菌中的Qor-1天然酶水平也可足以产生2-酮酸。例如，当Ads-Hyd 8在大肠杆菌BL 21*(DE3)ΔldhA中过表达时，这导致产生约3mM 6-羟基2-酮己酸。然而，除了Ads-Hyd 8之外，来自质粒的Qor-1的过表达导致产量提高约2倍(约5.8mM 6-羟基2-酮己酸)。基于该结果，内部收集体外动力学数据并且在大肠杆菌中发现典型酶水平，估计在一些实施方案中，在这些条件下表达的Qor-1酶的天然量<100μM，并且可能在0.1至100μM的范围内。
与其中羟醛加成、脱水和随后的还原由三种单独的酶进行的三酶系统相比，所提供的使用双酶系统的技术提供了显著的改进，例如：(1)只需要表达两种酶而不是三种酶——因此减少了所需的催化剂，并且当在体内进行反应时减少了用于蛋白质生产的细胞资源，以及(2)通过让单一的生物合成多肽进行羟醛加成和缩合反应二者，反应平衡朝向期望产物的生产的方向发生改变，这可能有利于通过该过程可行的总体产量。
克隆和表达：对编码表5中所示的异源醛缩酶水合酶和醌氧化还原酶的DNA进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且其由商业DNA合成公司合成。使用标准克隆方法，将每个基因克隆到两种相容性质粒上的T7 RNA聚合酶启动子的下游和T7终止子序列的上游。此外，对于其中所选择的醛是3-羟基-丙醛的一些实验，作为B12依赖型酶的甘油脱水酶(罗伊氏乳球菌甘油脱水酶，其由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[Uniprot ID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot ID No.A5VMA9]；和pduH[Uniprot ID No.A5VMA8])也被克隆到第三相容性质粒上，以使得能够使用这种酶由甘油产生3-羟基-丙醛。将质粒转化到大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhAΔadhEΔfrdBCΔpoxBΔpflBΔackA-ptaΔyqhD、ΔadhP、ΔeutG、ΔgldA、ΔyiaY、ΔfucO中。如上文在实施例1中所述进行重组蛋白表达。
酶测定：与实施例1相同。
产物分析：使用实施例1中描述的等度HPLC方法来检测和量化酶产物，即2-酮-羧酸的产生。
实施例4：用于生产1,5-戊二醇的生物合成途径
本实施例描述了从丙酮酸和3-羟基-丙醛生产1,5-戊二醇的生物合成途径。如图2中所示，从丙酮酸和3-羟基-丙醛的生物合成途径包括五个反应。前三个反应在实施例3中进行了描述，其涉及将丙酮酸和3-羟基-丙醛转化为6-羟基-2-酮-己酸。下面描述的是来自该途径剩余两个步骤的两种已知酶。值得注意的是，酶已针对所有五个反应进行了验证，其包括证明在体内的完整途径(参见实施例5)。
步骤1-3：丙酮酸和3-羟基-丙醛转化为6-羟基-2-氧代-己酸。详见实施例3。
步骤4：6-羟基-2-氧代-己酸转化为5-羟基-戊醛。示例性酶示于表11中。2-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.7)催化(Cn)2-酮酸的硫胺素二磷酸(thiamine diphosphate，TPP)依赖性脱羧作用以产生相应的(Cn-1)醛。需对长链2-氧代酸具有高活性而对丙酮酸具有最小活性或无活性的酶，因为与丙酮酸的交叉反应性可显著影响该途径的产量。运动发酵单胞菌(Z.mobilis)丙酮酸脱羧酶(PDC)已发生突变(I472A/I476F)以显著修改其活性位点，以提高对长链2-氧代酸的效率，同时显著降低其对丙酮酸的活性(>2000倍)7。运动发酵单胞菌PDC突变体I472A/I476F在2-氧代-己酸(其结构与期望的底物相似)上也显示出优异的动力学特性。催化该步骤的另一个有前景的酶候选物是乳酸乳球菌(L.lactis)支链酮酸脱羧酶KdcA(酮酸脱羧酶)和恶臭假单胞菌(P.putida)苯甲酰甲酸脱羧酶(BFD)突变体A460I8-10。与用于脱羧作用的丙酮酸相比，恶臭假单胞菌BFD和乳酸乳球菌KdcA对长链2-氧代酸显示出>50和500倍的选择性。特别地，乳酸乳球菌KdcA对2-氧代-己酸具有特异性活性，并且可以耐受C3和C4位置的取代。该酶被证实具有催化脱羧反应的活性(表14)。
表11.示例性酶。
Figure BDA0003417244850001981
Figure BDA0003417244850001991
具有其他EC编号的脱羧酶也适用于进行该反应。代表性列表如表12中所示。
表12.示例性脱羧酶。
Figure BDA0003417244850001992
Figure BDA0003417244850002001
步骤5：5-羟基-戊醛转化为1,5-戊二醇。伯醇脱氢酶催化醛向伯醇的NAD(P)H依赖型还原。
许多伯醇脱氢酶在文献中是已知的，并且催化该步骤的示例性候选物在下文描述并示于下表13中。许多大肠杆菌醇醛脱氢酶是已知的，包括AdhE、adhP、eutG、yiaY、yqhD、fucO和yjgB11。最近，已在大肠杆菌中鉴定出44种醛还原酶。来自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的丁醇脱氢酶12对于催化这些转化是令人感兴趣的。许多酿酒酵母(S.cerevisiae)醇脱氢酶已显示出还原一系列不同的醛，包括ADH2-6。特别令人感兴趣的是来自长链烷烃降解菌株热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2的两个烷基醇脱氢酶(ADH)基因13的ADHI-ADHII。其他混杂的ADH包括编码中链醇脱氢酶的AlrA14。同样令人感兴趣的是4-羟基丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.61)，它催化在拟南芥(A.thaliana)15、大肠杆菌(yihu)16以及科氏梭菌(C.Eluyveri)17中发现的4-氧代丁酸的还原。拟南芥酶以及土曲霉(A.terrus)酶(表13中的ATEG)可以还原戊二酸半醛(WO 2010/068953A2、WO 2010/068953A2)。尽管许多醇脱氢酶对于进行该反应而言是令人感兴趣的，但由于还原5-羟基戊醛的高水平活性而特别令人感兴趣的具体酶是来自雷夫松氏菌属S749(GenBank ID No.AB213459.1)的醇脱氢酶。验证了该酶和四种另外的醇脱氢酶(表14)以进行该反应。
表13.示例性脱氢酶。
Figure BDA0003417244850002002
Figure BDA0003417244850002011
克隆和表达：对编码下表14中所示的异源2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的DNA进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并进行了合成。使用标准克隆方法，将每个基因克隆到单一质粒上的T7 RNA聚合酶启动子的下游和T7终止子序列的上游。将质粒转化到大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhAΔadhEΔfrdBC中。如上文在实施例1中所述进行重组蛋白表达。
表14. 1,5-戊二醇的生产。
Figure BDA0003417244850002021
*在这种情况下，该酶还可被称为5-羟基-戊醛1-还原酶。
活性测定：观察到从外部供给的6-羟基-2-酮-己酸产生1,5-戊二醇表明2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的成功活性。因此，在表达之后，收获细胞并将其重新悬浮在0.4mL含有15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和6-羟基-2-酮己酸(约5g/L)和10g/L葡萄糖的新鲜培养基(OD600～30)中，在厌氧条件下保持15小时。在室温下孵育后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC分析从6-羟基-2-酮己酸形成1,5-戊二醇。
1,5-戊二醇生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量1,5-戊二醇。该方法采用Bio-Rad Aminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.05％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者用于测量210和260nm下的信号。HPLC结果显示产生了1,5-戊二醇；某些制备的结果呈现于表14中。
实施例5：用于从不同碳源通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产1,5-戊二醇的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于生产1,5-戊二醇的技术。在一些实施方案中，甘油用作碳源。在一些实施方案中，一个或更多个或所有生物合成步骤在一种生物体(例如细菌)和培养物中进行。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。
大肠杆菌被用作设计从碳源(例如甘油和/或葡萄糖)通过代谢前体丙酮酸和源自这些碳源的3-羟基-丙醛使用如图2中所示并且也在实施例4中描述的代谢途径生产1,5-戊二醇的示例性生物体。为了产生能够通过该途径从期望的碳源(例如甘油和/或葡萄糖)制造1,5-戊二醇的大肠杆菌，编码该途径中的每种独立酶和3-羟基-丙醛生产所需的其他酶的核酸要么针对大肠杆菌进行密码子优化并商业合成，要么通过PCR扩增使用大肠杆菌基因组DNA获得。将基因克隆到质粒中，然后将其转化到大肠杆菌中。所有途径酶的体内表达导致1,5-戊二醇的产生。
1,5-戊二醇途径基因的克隆：对编码1,5-戊二醇途径中异源酶的DNA进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并由商业DNA合成公司(例如，Twist Biosciences)合成。通过PCR从大肠杆菌基因组DNA中扩增编码1,5-戊二醇途径中天然酶的DNA。使用标准克隆方法，将每个基因克隆到T7 RNA聚合酶启动子的下游和终止子序列的上游。携带基因表达组件的相容性质粒包含标志物和复制子的以下组合之一：(1)氯霉素标志物+P15A复制子，(2)氨苄青霉素标志物+ColE1复制子，和(3)卡那霉素标志物+COLA复制子。所使用的基因的一些实例包括以下：Ads-Hyd 8(Uniprot ID No.A0A286PH18)、Qor-1(Uniprot ID No.P28304)、6-羟基-2-氧代-己酸脱羧酶(Uniprot ID No.Q6QBS4)、伯醇脱氢酶(也称为5-羟基-戊醛1-还原酶)(GenBank ID No.AB213459.1)。此外，维生素B12非依赖型的甘油脱水酶(例如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)甘油脱水酶，其由如下两个亚基构成：DhaB1[Uniprot IDNo.Q8GEZ8]；DhaB2[Uniprot ID No.Q8GEZ7])或作为B12依赖型酶的甘油脱水酶(罗伊氏乳球菌甘油脱水酶，其由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[UniprotID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot ID No.A5VMA9]；和pduH[Uniprot ID No.A5VMA8])也被克隆以使得能够生产3-羟基-丙醛——1,5-戊二醇途径前体，其可以使用这种酶从甘油制备。编码罗伊氏乳球菌甘油脱水酶的所有五种基因都作为单基因操纵子克隆。
用于生产1,5-戊二醇的菌株的构建：大肠杆菌菌株BL21*(DE3)ΔldhA用作测试1,5-戊二醇途径酶的背景菌株。使用与转化大肠杆菌相关的标准电穿孔方法转化携带编码途径酶的基因的质粒。
1,5-戊二醇的生产：在将以下质粒顺序地转化到大肠杆菌中之后，得到以下表达菌株。
菌株PeDO1：质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因1(甘油脱水酶-DhaB1)、基因2(甘油脱水酶-DhaB2)、基因3(Qor 1)。质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1(6-羟基-2-氧代-己酸脱羧酶)，基因2(Ads-Hyd 8)。质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因1(5-羟基-戊醛1-还原酶)。
菌株PeDO2：质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因1(甘油脱水酶-DhaB1)、基因2(甘油脱水酶-DhaB2)、基因3(Qor 1)。质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1(6-羟基-2-氧代-己酸脱羧酶)，基因2(Ads-Hyd 8)。
菌株PeDO3：质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因1(甘油脱水酶-pduCDEGH)。质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1(6-羟基-2-氧代-己酸脱羧酶)、基因2(Ads-Hyd 8)、基因3(5-羟基-戊醛1-还原酶)。质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因1(Qor 1)。
菌株PeDO4：质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因1(甘油脱水酶-pduCDEGH)。质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1(6-羟基-2-氧代-己酸脱羧酶)，基因2(Ads-Hyd 8)。质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因1(5-羟基-戊醛1-还原酶)。
菌株PeDO1和PeDO2的培养：起始培养物在含有5mL 2xYT培养基、1g/L D-葡萄糖和适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达和1,5-戊二醇途径酶的细胞培养使用125mL带挡板的烧瓶在40mL生长培养物中进行。使用复合(2xYT)生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和100mg/L柠檬酸铁铵。在有氧条件和30℃下进行2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃和有氧条件下进行30分钟。然后将细胞培养物转移到100mL玻璃瓶中，将L-半胱氨酸-HCl-一水合物添加到生长培养基中(最终浓度为1g/L)，并将瓶密封在厌氧手套箱(CoyLaboratory)内。然后使培养物在玻璃瓶中在30℃和厌氧条件下生长2小时。之后，收获细胞并将其重新悬浮在0.4mL含有8g/L葡萄糖、4g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基(OD600～30)中。在厌氧条件下和室温下孵育24小时后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
菌株PeDO3和PeDO4的培养：生产培养基包含以下成分：1X MOPS基本培养基、5g/L酵母提取物、10g/L甘油、20g/L葡萄糖和10uM氰钴胺素(pH7.2)。1X MOPS基本培养基由40mMMOPS、4mM tricine、0.01mM FeSO4、9.5mM NH4Cl、0.276mM K2SO4、0.5μM CaCl2、0.525mMMgCl2、50mM NaCl、2.92E-7mM(NH4)2MoO4、4.0E-5mM H3BO3、3.02E-6mM CoCl2、9.62E-7mMCuSO4、8.08E-6mM MnCl2、9.74E-7mM ZnSO4和1.32mM K2PO4构成。种子培养物在含有10mL2xYT培养基和适当抗生素的管中过夜生长。用于1,5-戊二醇生产的细胞培养物使用10mL生产培养基和适当的抗生素在125mL带塞烧瓶中制备，接种1mL种子培养物并使细胞在诱导之前在37℃下生长2小时。2小时之后，用0.1mM IPTG诱导细胞培养物，并将培养物转移至26℃以开始生产。每12小时有氧地取样，最终样品在72小时取样，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
1,5-戊二醇生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量1,5-戊二醇。该方法采用Bio-Rad Aminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.05％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者用于测量210和260nm下的信号。HPLC结果示出了最终滴度为800mg/L(菌株PeDO1)、400mg/L(PeDO2)、212mg/L(PeDO3)和41mg/L(PeDO4)的1,5-戊二醇生产的证据。
1,5-戊二醇生产的另外的工作示例：
基于使用上述菌株生产1,5-戊二醇的成功，评估了实施例2和3中鉴定的替代醌氧化还原酶用于生产1,5-戊二醇的用途。简而言之，使用上述实施例中菌株PeDO3的质粒组合，其中质粒3含有不同的Qor酶，即Qor-1(Uniprot ID No.P28304)、Qor-2(Uniprot IDNo.P40783)和Qor-5(Uniprot ID No.P43903)。菌株构建、生产和分析方法与上述的那些相同。菌株PeDO5(包含Qor-1)、菌株PeDO6(包含Qor-2)和菌株PeDO6(包含Qor-5)导致在上述生产条件下分别产生约2g/L、2.2g/L和2.4g/L 1,5-戊二醇。
实施例6：用于从6-羟基-己酸中间体生产1,6-己二醇的微生物生物体的制备和使用
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备6HH和HDO的技术。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从6-羟基-己酸(6HH)中间体生产1,6-己二醇的生物合成途径示于图3中。下面示出的是在此途径的每个步骤中使用不同酶的一些实例，以确定从6HH生产1,6-己二醇。用于从6HH中间体进行1,6-己二醇生物合成途径的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例在下表15中示出。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。
表15.HDO的生产。
Figure BDA0003417244850002061
由名为6-羟基己酸1-还原酶的酶(其是基因1编码的)催化的反应：6-羟基-己酸-->6-羟基-己醛。基因2编码的酶：6-羟基己酸1-还原酶激活剂。由名为6-羟基己醛1-还原酶的酶(其是基因3编码的)催化的反应：6-羟基-己醛-->1,6-己二醇
(i)制备用于HDO生产的质粒：
将HDO生产途径基因克隆到如下所示的两种质粒上。合成的基因从商业供应商处获得，并且对每个基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学方法使每个基因在其自身的T7启动子和终止子下克隆。大肠杆菌被用作设计1,6-己二醇生产的目标生物体。在电转感受态大肠杆菌MG1655(DE3)Δrne131、ΔldhA中共转化所有两种质粒之后获得表达菌株。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1。质粒2(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因2和基因3
(ii)细胞培养、蛋白质表达和HDO生产分析：
起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达和HDO生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行60至90分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有约10g/L葡萄糖、6-羟基-己酸(约5g/L)和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果表明，对于表15中的所有实例，产生了0.1至2.5g/L的1,6-己二醇。
实施例7：用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产1,6-己二醇的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备6HH和HDO的技术。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产1,6-己二醇的生物合成途径示于图3中。下面示出的是在此途径的每个步骤中使用不同酶的一些实例，以确定通过该途径生产1,6-己二醇。用于从6-羟基-2-酮己酸中间体进行1,6-己二醇生物合成途径的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例在下表16中示出。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。此外，下面的实施例强调了对用于进行CoA转移反应和2,6-二羟基-己酰基-CoA脱水反应二者的多种酶的确认。
(i)制备用于HDO生产的质粒：
表16.用于HDO产生的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002081
*同一基因的单拷贝；**同一基因的双拷贝
将HDO生产途径基因克隆到两种独立的如下所示的相容性质粒上。如所指示的，每种质粒具有不同的复制起点和抗生素标志物。合成的基因从商业供应商处获得，并且对每个基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学方法使每个基因在其自身的T7启动子和终止子下克隆。大肠杆菌被用作设计1,6-己二醇生产的目标生物体。在电转感受态大肠杆菌BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA中共转化所有三种质粒之后获得表达菌株。
质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因10、基因9，
质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1、基因2、基因3和基因4
质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因11。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和HDO生产分析：
起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达和HDO生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行60至90分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有约10g/L葡萄糖、6-羟基-2-酮-己酸(约5g/L)和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果表明，对于来自表16的实施例7A至7E分别产生了700mg/L、1.2g/L、1.1g/L、1.1g/L和1g/L的1,6-己二醇。
实施例8：用于从不同碳源通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产1,6-己二醇的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备6HH和HDO的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用甘油作为碳源生产HDO的技术。在一些实施方案中，生产在一种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在各自表达不同组生物合成多肽的两种或更多种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在单一细菌菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种细菌菌株中进行，每种菌株独立地进行一种或更多种生物合成反应。在一些实施方案中，培养物包含两种或更多种或所有用于HDO生产的菌株。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产1,6-己二醇的生物合成途径示于图3中。下面示出的是使用基于醛缩酶-水合酶的双酶系统以通过该途径生产1,6-己二醇的实施例(8a和8b)。可以克隆维生素B12非依赖型的甘油脱水酶或作为B12依赖型酶的甘油脱水酶，以使得能够产生3-羟基-丙醛——1,6-己二醇途径前体，其可以使用这种酶从甘油制备。本文中使用了B12依赖型甘油脱水酶。用于进行1,6-己二醇生物合成途径以及3-羟基-丙醛的产生的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例在表17中示出。重要的是要注意本文中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。
表17.HDO的生物合成。
Figure BDA0003417244850002101
Figure BDA0003417244850002111
实施例8a：在单一大肠杆菌菌株中生产1,6-己二醇(HDO)
(i)制备用于HDO生产的质粒：
将HDO生产途径基因克隆到如下所示的三种独立的相容性质粒上。如所指示的，每种质粒具有不同的复制起点和抗生素标志物。合成的基因从商业供应商处获得，并且对每个基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学方法使每个基因在其自身的T7启动子和终止子下克隆。大肠杆菌被用作设计1,6-己二醇生产的目标生物体。在电转感受态大肠杆菌BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA中共转化所有三种质粒之后获得表达菌株。
质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因12、基因13、基因2、基因10
质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因3、基因4、基因1和基因9
质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因11。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和HDO生产分析：
起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达和HDO生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行60至90分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果表明产生了25至100mg/L的1,6-己二醇。为了说明之前验证过的进行该途径具体步骤的替代酶可用于使用该方法进行HDO生产，构建了替代的HDO生产菌株(其中基因5至7分别由Uniport IDA0A2X3BK09、A0A2X3BU19和A0A1V9IXA9编码)，并使用上述方法进行了评估。该生产菌株也导致生产>10mg/L的1,6-己二醇。
实施例8b：在两种大肠杆菌菌株中生产1,6-己二醇(HDO)
(i)制备用于HDO生产的质粒&菌株：
为了使从质粒表达的HDO生产途径基因的数量最小化，构建了大肠杆菌表达菌株，其中某些途径基因被整合到基因组中。具体来说，HDO生产菌株BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA在arsB位置含有HDO途径基因(基因12、基因13)，其中每个基因的表达由其自身的T7启动子控制。使用上述实施例中描述的技术将剩余的HDO生产途径基因克隆到如下所示的四种独立的质粒上。基因的身份如实施例8a中所述。构建了两种基于大肠杆菌的表达菌株。将质粒1和质粒2在大肠杆菌中共转化之后获得表达菌株1；将质粒3和质粒4在大肠杆菌中共转化之后获得表达菌株2。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因4、基因3和基因1。
质粒2(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因2。
质粒3(RSF复制子，卡那霉素标志物)：基因4和基因11。
质粒4(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因9和基因10。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和HDO生产分析：
独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和HDO生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，将来自两种表达菌株的细胞等量混合，然后将其收获、浓缩并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果表明产生了100至550mg/L的1,6-己二醇。
实施例9：用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产6-羟基己酸的微生物生物体的制备和使用
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备6HH的技术。在一些实施方案中，生产在一种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在各自表达不同组生物合成多肽的两种或更多种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在单一细菌菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种细菌菌株中进行，每种菌株独立地进行一种或更多种生物合成反应。在一些实施方案中，培养物包含两种或更多种或所有用于6HH生产的菌株。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L6HH。用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产6-羟基己酸(6HH)的生物合成途径示于图4中。下面示出的是在该途径的每个步骤中使用不同酶的一些实例，以确定通过该途径生产6HH。用于从6-羟基-2-酮己酸中间体进行6HH生物合成途径的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例在表18中示出。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。此外，下面的实施例强调了对用于进行CoA转移反应和2,6-二羟基-己酰基-CoA脱水反应二者的多种酶的确认。
(i)制备用于6HH生产的质粒：
将6HH生产途径基因克隆到如下所示的两种独立的相容性质粒上。如所指示的，每种质粒具有不同的复制起点和抗生素标志物。合成的基因从商业供应商处获得，并且对每个基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学方法使每个基因在其自身的T7启动子和终止子下克隆。大肠杆菌被用作设计6HH生产的目标生物体。在电感受态大肠杆菌BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA中共转化所有三种质粒之后获得表达菌株。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1、基因2和基因3(仅实施例6和7)
质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因4、基因5、基因6和基因7。
表18.用于6HH产生的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002141
*仅对于实例9F和9G存在
(ii)细胞培养、蛋白质表达和6HH生产分析：
起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。用于表达和6HH生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行60至90分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有约10g/L葡萄糖、6-羟基-2-酮己酸(5至10g/L)和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果显示，从表18的实施例9A至9G的菌株产生了约0.4至5g/L的6HH。
实施例10：用于从不同碳源通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产6-羟基己酸(6HH)的微生物生物体的制备和使用
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备6HH的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用甘油作为碳源生产6HH的技术。在一些实施方案中，生产在一种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在各自表达不同组生物合成多肽的两种或更多种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在单一细菌菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种细菌菌株中进行，每种菌株独立地进行一种或更多种生物合成反应。在一些实施方案中，培养物包含两种或更多种或所有用于6HH生产的菌株。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产6HH的生物合成途径示于图4中。下面示出的是使用基于醛缩酶-水合酶的双酶系统以通过该途径生产6HH的一些实例。可以克隆维生素B12非依赖型的甘油脱水酶或作为B12依赖型酶的甘油脱水酶，以使得能够生产3-羟基-丙醛——6HH途径前体，其可以使用这种酶从甘油制备。尽管本文中使用了两种类型的甘油脱水酶，但表19中所示的条目集中于使用B12非依赖型甘油脱水酶的一些实例。其中的每种酶可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代以产生6HH，并且表19中的实施例10B和10C证明了这一点，其中催化CoA-转移反应和2,6-二羟基-己酰基-CoA脱水反应二者的酶已被同源酶替代。
(i)制备用于6HH生产的质粒&菌株：
为了使从质粒表达的6HH生产途径基因的数量最小化，构建了大肠杆菌表达菌株，其中某些途径基因被整合到基因组中。具体来说，6HH生产菌株BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA在arsB位置含有6HH途径基因(基因12、基因13)，其中每个基因的表达由其自身的T7启动子控制。使用上述实施例中描述的技术将剩余的6HH生产途径基因克隆到如下所示的两种独立的质粒上。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因4、基因3和基因1。
质粒2(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因2。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和6HH生产分析：
独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mLLB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和HDO生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
表19.用于6HH的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002161
Figure BDA0003417244850002171
(iii)6HH生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量HDO。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果显示，从表19中的实施例10A至10C的菌株产生了约50至800mg/L的6HH。一个替代实例是：其中使用B12依赖型甘油脱水酶pduCDEGH(在具有COLA复制子、卡那霉素标志物的第三质粒上编码为单基因操纵子)替代B12非依赖型甘油脱水酶，其中途径的其余酶与实施例10A相同。使用实施例5中针对含有B12依赖性酶的菌株PeDO3和PeDO4所述的培养条件，这样的系统也导致产生约350mg/L的6HH。
实施例11：用于从6-羟基-己酸(6HH)中间体生产己二酸(AA)的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备AA的技术。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-己酸中间体生产AA的生物合成途径示于图5中。表20中示出的是能够将6HH转化为AA的酶的一些实例。重要的是要注意，本文中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代以产生AA。
表20.用于AA的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002181
(i)制备用于从6HH生产AA的质粒&菌株：使用前面实施例中描述的技术将AA生产途径基因克隆到如下所示的单一质粒上。BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA用作生产菌株。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1和基因2。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和AA生产分析：独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和AA生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30至120分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。之后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有5至10g/L葡萄糖、5g/L6HH和15g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育3小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)AA生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量AA。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果显示，对于表20的实施例11A和11B产生了500至1500mg/L的AA。
实施例12：用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产己二酸(AA)的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于从6H2KH制备AA的技术。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产AA的生物合成途径示于图5中。下面示出的是在该途径的每个步骤中使用不同酶的一些实例，以确定通过该途径产生AA。用于从6-羟基-2-酮己酸中间体进行AA生物合成途径的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例示于下表21中。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。表21中的实施例12A和12B强调了对用于进行CoA转移反应和2，6-二羟基-己酰基-CoA脱水反应以使得能够通过该途径成功生产AA的多种酶的确认。
(i)制备用于从6-羟基-2-酮己酸生产AA的质粒&菌株：将AA生产途径基因克隆到如下所示的两种独立的相容性质粒上。如所指示的，每种质粒具有不同的复制起点和抗生素标志物。合成的基因从商业供应商处获得，并且对每个基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学方法使每个基因在其自身的T7启动子和终止子下克隆。大肠杆菌被用作设计6HH生产的目标生物体。在电感受态大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhAΔadhEΔfrdBC中共转化两种质粒之后获得表达菌株。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因3、基因4、基因9和基因10
质粒3(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7和基因8
(ii)细胞培养、蛋白质表达和AA生产分析：除了使用10g/L 6-羟基-2-酮己酸(而不是实施例11中使用的6HH)作为底物之外，与实施例11相同。
(iii)AA生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量AA，如上所述。结果显示表21的实施例12A至12C产生了100至800mg/L的AA。
表21.用于AA的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002201
Figure BDA0003417244850002211
实施例13：用于从不同碳源通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产己二酸(AA)的微生物生物体的制备和使用
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备AA的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用3HPA和丙酮酸生产AA的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用甘油作为碳源生产AA的技术。在一些实施方案中，生产在一种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在各自表达不同组生物合成多肽的两种或更多种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在单一细菌菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种细菌菌株中进行，每种菌株独立地进行一种或更多种生物合成反应。在一些实施方案中，培养物包含两种或更多种或所有用于AA生产的菌株。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。用于从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产AA的生物合成途径径示于图5中。下面示出的是使用基于醛缩酶-水合酶的双酶系统通过该途径生产AA的一些实例。可以克隆维生素B12非依赖型的甘油脱水酶或作为B12依赖型酶的甘油脱水酶，以使得能够生产3-羟基-丙醛——6HH途径前体，其可以使用这种酶从甘油制备。本文中使用了B12依赖型甘油脱水酶。用于进行AA生物合成途径以及3-羟基-丙醛生产的每个步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例示于表22中。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。
表22.用于AA的生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002212
Figure BDA0003417244850002221
(i)制备用于AA生产的质粒&菌株：
为了使从质粒表达的AA生产途径基因的数量最小化，构建了大肠杆菌表达菌株，其中某些途径基因被整合到基因组中。具体来说，AA生产菌株BL21*(DE3)Δldh、ΔadhE、ΔfrdA在arsB位置含有途径基因(基因12、基因13)，其中每个基因的表达由其自身的T7启动子控制。构建了两种基于大肠杆菌的表达菌株。将质粒1和质粒2在大肠杆菌中共转化之后获得表达菌株1；将质粒3在大肠杆菌中转化之后获得表达菌株2。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因4、基因3和基因1。
质粒2(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因2。
质粒3(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因9、基因10和基因3。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和AA生产分析：
独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和AA生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)AA生产的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量AA。该方法采用Bio-RadAminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)和UV检测器进行检测，后者通常用于测量210、260和280nm下的信号。结果表明产生了20至350mg/L的AA。
实施例14：6-羟基己酸的多菌株和多罐生产。
在一些实施方案中，产物例如6HH的生产在一种菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种菌株中进行。在一些实施方案中，两种或更多种菌株一起表达生产中使用的所有生物合成多肽。在一些实施方案中，一种菌株中生物合成多肽的产物是另一种菌株生物合成多肽的底物。在一些实施方案中，一种菌株的两种或更多种生物合成多肽的产物独立地是一种或更多种另外的菌株中的两种或更多种生物合成多肽的底物。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L的6-羟基己酸。
以上实施例10描述了在单一大肠杆菌菌株中生产6HH，其中丙酮酸和3-羟基-丙醛的转化(及其从甘油的产生)所需的所有生物合成途径酶都在单一大肠杆菌中同时表达。在一些实施方案中，采用多菌株方法可以是有利的，其中整个生物合成途径被分成称为模块的更小部分，其中每个模块包含在其自身独特大肠杆菌中表达的生物合成途径的一系列连续酶。例如，证明了将整个6HH生物合成途径分成两个模块是可行的。具体而言，在上面的实施例3中描述的是第一模块的构建，它允许在单一大肠杆菌菌株中生产6-羟基-2-酮己酸——6HH生物合成途径的中间体，其中丙酮酸和3-羟基-丙醛的转化(及其从甘油的产生)所需的所有酶都在单一大肠杆菌菌株中同时表达。上面实施例9中描述的是第二模块的构建，其允许在第二(独立的)大肠杆菌菌株中从6-羟基-2-酮己酸生产6HH，其中6-羟基-2-酮己酸至6HH的转化所需的所有酶都在这种单一大肠杆菌菌株中同时表达。两个模块的使用产生在两种独立的大肠杆菌菌株中生产6HH的完整的生物合成途径。由于多种原因，这种多菌株方法可以是有利的，例如但不限于：a)构建和测试用于像这样开发广泛的生物合成途径的质粒可以产生大的文库，并且筛选功能性(或最佳)遗传构建体的常规蛮力方法可能效率低下且成本高；b)可以简化和平衡整个途径中的酶表达，从而显著加快开发周期；c)每个独立模块的大肠杆菌菌株的遗传背景可以定制以满足氧化还原、ATP和其他需求，以使每个模块的产量最大化(因为单一菌株优化可能对整个途径无效)。下表23中总结的结果表明了这种多菌株方法用于同时(即，一罐法(one-pot))或通过顺序生产方法生产6HH的成功使用。
表23. 6-羟基己酸的产生。
Figure BDA0003417244850002241
Figure BDA0003417244850002251
*Lre PduCDEGH是来自罗伊氏乳球菌的维生素B-12依赖型甘油脱水酶及其相应的激活剂。它由单一基因操纵子编码，由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[Uniprot ID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot IDNo.A5VMA9]；和pduH[Uniprot ID No.A5VMA8])。
(i)制备用于6HH生产的质粒&菌株：
如上所述，整个6HH生物合成途径被分成两种大肠杆菌菌株(或模块)。构建了两种基于大肠杆菌的表达菌株。在大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhA ΔadhEΔfrdBCΔpoxBΔpflBΔackA-ptaΔyqhD、ΔadhP、ΔeutG、ΔgldA、ΔyiaY、ΔfucO中共转化质粒1和质粒2之后获得表达菌株1；在大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhAΔadhEΔfrdBC中转化质粒3和4之后获得表达菌株2。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1、基因2和基因1。
质粒2(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因9。
质粒3(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因4。
质粒4(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因3。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和6HH生产分析：
独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和6HH生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。之后，收获来自两种表达菌株的细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮。对于实施例14A，将来自两种菌株的相同数量的细胞重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)的培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。对于实施例14B，将来自表达菌株1的细胞悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并与来自表达菌株2的细胞混合。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC分析。
(iii)6HH生产的HPLC分析：这如先前所述进行。结果显示产生了350至1100mg/L的6HH。
实施例15：1,6-己二醇的多菌株和多罐生产。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备HDO的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于从3HPA和丙酮酸生产HDO的技术。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用甘油作为碳源生产HDO的技术。在一些实施方案中，生产在一种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在各自表达不同组生物合成多肽的两种或更多种生物体中进行。在一些实施方案中，生产在单一细菌菌株中进行。在一些实施方案中，生产在两种或更多种细菌菌株中进行，每种菌株独立地进行一种或更多种生物合成反应。在一些实施方案中，培养物包含两种或更多种或所有用于HDO生产的菌株。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。上述实施例8描述了在单一或双大肠杆菌菌株中生产HDO，其中丙酮酸和3-羟基丙醛的转化(及其从甘油的产生)所需的所有生物合成途径酶都在单一大肠杆菌菌株或两种独立的大肠杆菌菌株中同时表达。由于实施例14中提到的多种原因，这样的多菌株方法可以是有利的。表24中总结的结果表明了这种多菌株方法用于同时(即，一罐法)或通过顺序生产方法生产HDO的另一种成功使用。
表24. 1,6-己二醇的产生。
Figure BDA0003417244850002261
Figure BDA0003417244850002271
*Lre PduCDEGH是来自罗伊氏乳球菌的维生素B-12依赖型甘油脱水酶及其相应的激活剂。它由单一基因操纵子编码，由如下五种基因构成：pduC[Uniprot ID No.A5VMB2]；pduD[Uniprot ID No.A5VMB1]；pduE[Uniprot ID No.A5VMB0]；pduG[Uniprot IDNo.A5VMA9]；和pduH[Uniprot ID No.A5VMA8])。
(i)制备用于HDO生产的质粒&菌株：
如上所述，整个HDO生物合成途径被分成两种大肠杆菌菌株(或模块)。构建了两种基于大肠杆菌的表达菌株。在大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhA ΔadhEΔfrdBCΔpoxBΔpflBΔackA-ptaΔyqhD、ΔadhP、ΔeutG、ΔgldA、ΔyiaY、ΔfucO中共转化质粒1和质粒2之后获得表达菌株1；在大肠杆菌MG1655(DE3)rne131ΔldhA ΔadhEΔfrdBC中转化质粒3和4之后获得表达菌株2。
质粒1(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因1、基因2和基因1。
质粒2(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因12。
质粒3(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因3、基因9、基因4、基因11和基因10。
质粒4(P15A复制子，氯霉素标志物)：基因5、基因6、基因7、基因8和基因4。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和HDO生产分析：
独立地，对于每种表达菌株，起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的试管中生长过夜。独立地，对于每种表达菌株，用于表达和6HH生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。独立地，对于每种表达菌株，在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导，并针对每种表达菌株独立地进行。独立地，对于每种表达菌株，诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行30分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。之后，收获来自两种表达菌株的细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮。对于实施例15A，将来自两种菌株的相同数量的细胞重新悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)的培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。对于实施例15B，将来自表达菌株1的细胞悬浮在含有5至20g/L葡萄糖、2.5至5g/L甘油和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并与来自表达菌株2的细胞混合。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC分析。
(iii)HDO生产的HPLC分析：这如先前所述进行。结果显示产生了400至800mg/L的HDO。
实施例16：从甘油合成3-羟基-丙醛。
3-羟基-丙醛是使用甘油脱水酶从甘油合成的。甘油脱水酶可以在再激活蛋白的存在下以辅酶B12依赖性或辅酶B12非依赖性方式催化脱水。辅酶B12依赖型脱水酶由三个亚基构成：大或“α”亚基、中等或“β”亚基和小或“γ”亚基。这些亚基组装成α2β2γ2结构以形成脱辅基酶。辅酶B12(活性辅因子种类)与脱辅基酶结合以形成具有催化活性的全酶。辅酶B12是催化活性所必需的，因为它参与了催化发生的自由基机制。在生物化学方面，已知辅酶B12依赖型甘油脱水酶和辅酶B12依赖型二醇脱水酶二者都受到甘油和其他底物基于机制的自杀失活的影响(Daniel et al.,FEMS Microbiology Reviews 22:553-566(1999)；Seifert,et al.,Eur.J.Biochem.268:2369-2378(2001))。可以通过依赖脱水酶再激活因子来恢复脱水酶活性来克服失活(Toraya and Mori(J.Biol.Chem.274:3372(1999)；和Tobimatsu et al.(J.Bacteria 181:4110(1999))。脱水酶再激活和辅酶B12再生过程二者都需要ATP。下面示出了甘油脱水酶、二醇脱水酶和再激活因子的数个实例。本领域技术人员将认识到，弗氏柠檬酸杆菌、罗伊氏乳球菌、巴氏梭菌、丁酸梭菌、肺炎克雷伯氏菌或其菌株的甘油脱水酶；鼠伤寒沙门氏菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)或肺炎克雷伯氏菌的二醇脱水酶；以及属于下表25所列E.C.组的其他脱水酶或这些序列的同源酶也可用于进行该步骤。这些酶的突变体(美国专利No.8445659和7410754)也可用于本文中以提高该过程的效率。特别地，由于维生素B12的成本高，辅酶B12-非依赖型脱水酶(Raynaud,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,5010-5015(2003))在工业过程中受到青睐。
表25.示例性生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002291
实施例17：丙酮酸的合成。
糖向丙酮酸的转化。
糖通过糖酵解转化为丙酮酸是众所周知的。在糖酵解中，每摩尔葡萄糖产生2摩尔ATP、2摩尔NAD(P)H形式的还原当量和2摩尔丙酮酸。
甘油向丙酮酸的转化。
甘油可以在厌氧和微需氧条件下转化为糖酵解中间体。在厌氧条件下，甘油脱氢为二羟基丙酮，其在磷酸化(使用磷酸烯醇丙酮酸或ATP)之后转化为磷酸二羟基丙酮——糖酵解途径中间体(Dharmadi,et al.,Biotechnol.Bioeng.94:821–829(2006))。甘油转化的呼吸途径包括甘油的磷酸化(通过ATP)，然后氧化(醌作为电子接纳体)以产生磷酸二羟基丙酮，其可通过糖酵解转化为丙酮酸(Booth IR.Glycerol and methylglyoxalmetabolism.Neidhardt FC,et al.,编辑.In:Escherichia coli and Salmonella:Cellular and molecular biology(网络版).2005,Washington,DC,ASM Press；Durnin etal.,Biotechnol Bioeng.103(1):148–161(2009))。
实施例18：用于从6-羟基-2-酮己酸中间体生产2,6-二羟基-己酸的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于从6-羟基-2-酮己酸生产2,6-二羟基-己酸的技术。下面描述了某些实施例。
图4中示出的是从6-羟基-2-酮己酸中间体生产2,6-二羟基-己酸(6H2HH)的生物合成途径。下面示出的是使用不同的2-酮还原酶将6H2KH还原为6H2HH，即6-羟基-2-氧代己酸2-还原酶的一些实例。用于该步骤的基因和其所编码的相应酶的一些实例示于表26中。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代。
(i)制备用于6H2HH生产的质粒：
使用标准分子生物学方法将编码6-羟基-2-氧代己酸2-还原酶的基因克隆到其表达由T7启动子驱动的质粒上。大肠杆菌被用作设计6H2HH生产的目标生物体。在电感受态大肠杆菌BL21*(DE3)Δldh中共转化所有三种质粒之后获得表达菌株。
表26.示例性生物合成多肽。
Figure BDA0003417244850002301
Figure BDA0003417244850002311
(ii)细胞培养、蛋白质表达和6H2HH生产分析：
起始培养物在含有10mL LB培养基和适当抗生素的管中生长过夜。用于表达和6H2HH生产的细胞培养使用玻璃瓶以100mL体积进行。使用复合生长培养基，并补充2g/L D-葡萄糖、0.5g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和对酶表达重要的其他底物/营养素。在有氧条件和30℃下进行约2小时的预诱导生长。重组蛋白表达在0.2至0.4的OD600下用250μM IPTG诱导。诱导后的表达在30℃在有氧条件下进行60至90分钟，然后在厌氧条件下进行2至3小时。然后，收获细胞，浓缩，并以0.5ml体积在约40的OD600下重新悬浮在含有约10g/L葡萄糖、6-羟基-2-酮己酸(5至10g/L)和15g/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的新鲜培养基中。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)6H2HH生成的HPLC分析：等度HPLC用于检测和定量6H2HH。该方法采用Bio-Rad Aminex HPX-87柱，在35℃下0.7mL/分钟的0.5％甲酸(或5mM硫酸)。使用RID(折光检测器)进行检测。结果显示从表26的实例1至9的所有菌株产生了6H2HH。
实施例19：用于从不同碳源通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产2,6-二羟基-己酸的微生物生物体的制备和使用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于从不同碳源生产2,6-二羟基-己酸的技术。下面描述了某些实例。在一些实施方案中，本公开提供了用于从丙酮酸和3HPA生产2,6-二羟基-己酸的技术。在一些实施方案中，产率为约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/L，或者为约或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250或300g/L。
从丙酮酸和3-羟基-丙醛通过6-羟基-2-酮己酸中间体生产6H2HH的生物合成途径示于图4中。下面示出的是使用基于醛缩酶-水合酶的双酶系统通过该途径生产6H2HH的一些实例。可以克隆维生素B12非依赖型的甘油脱水酶或作为B12依赖型酶的甘油脱水酶，以使得能够产生3-羟基-丙醛——6H2HH途径前体，其可以使用这种酶从甘油制备。尽管本文中可以使用两种类型的甘油脱水酶，但本文中所示的一些实施例使用B12依赖型甘油脱水酶。其中的每种酶都可以被属于同一E.C.类别的同源酶替代以产生6H2HH。
(i)制备用于6H2HH生产的质粒&菌株：MG1655(DE3)Δrne131、ΔldhA、Δ[frdB,frdC]、ΔadhE、ΔpoxB、ΔpflB、Δ[ackA,pta]用作具有以下质粒组合的菌株：质粒1(COLA复制子，卡那霉素标志物)：基因1(甘油脱水酶-pduCDEGH)。质粒2(ColE1复制子，氨苄青霉素标志物)：基因2(Ads-Hyd 8)、基因2(Qor-1)和基因3(6-羟基-2-氧代己酸2-还原酶-Q5FTU6)。
(ii)细胞培养、蛋白质表达和6H2HH生产分析：
细胞培养(具有合适的抗生素)和蛋白质表达与实施例1中针对3-羟基丙醛描述的那些相似。在室温下孵育24小时之后，将细胞离心，过滤上清液并通过HPLC进行分析。
(iii)6H2HH生产的HPLC分析：如实施例18中所提及的进行分析。菌株在这些条件下能够生产>1g/L的6H2HH。
等同方案
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文中提供的所有核苷酸序列均以5’至3’方向呈现。
本文中举例说明性描述的一些实施方案可以在不存在本文中未具体公开的任何要素、限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地且没有限制地解读。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用这样的术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但应认识到在要求保护的本发明范围内的多种修改是可能的。
应当理解，虽然已经结合上述方面描述了本技术，但前述描述和实施例旨在说明而不是限制本技术的范围。本技术范围内的其他方面、优点和修改对于本技术所属领域的技术人员来说是明显的。
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Figure BDA0003417244850002341
Figure BDA0003417244850002351
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Figure BDA0003417244850002501

Claims (73)

1.一种方法，其包括：
使丙酮酸和脂肪族醛与羟醛脱水产物生物合成多肽接触以产生羟醛脱水产物，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团以及与所述醛基团或所述酮基团共轭的双键的化合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含水合酶-醛缩酶。
3.权利要求1所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽是或包含EC编号4.1.2.45或EC编号4.1.2.34或EC 4.1.1.4的酶或者选自表1和5至8的酶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述羟醛脱水产物生物合成多肽在微生物中。
5.一种方法，其包括：
使烯烃与烯烃还原产物生物合成多肽接触以产生烯烃还原产物，其中：
所述烯烃包含与羰基共轭的双键；并且
将所述烯烃中与羰基共轭的双键还原为单键以提供烯烃还原产物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述烯烃是权利要求1所述的羟醛脱水产物。
7.权利要求6所述的方法，其中所述烯烃还原产物生物合成多肽是或包含属于EC1.6.5的酶或选自表9的酶。
8.权利要求4所述的方法，其中所述脂肪族醛具有式A-1的结构：
Ra-L2-L1-C(O)H，
A-1
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
9.权利要求8所述的方法，其中所述羟醛脱水产物具有式P-2的结构：
Ra-L2-L1-CH＝CH-C(O)-C(O)OH，
P-2
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
10.权利要求9所述的方法，其中所述-CH＝CH-呈E构型。
11.权利要求9所述的方法，其中所述-CH＝CH-呈Z构型。
12.权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述烯烃还原产物具有式P-3的结构：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-C(O)OH，
P-3
或其盐，其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
13.权利要求5所述的方法，其包括将烯烃还原产物转化为式P-10化合物：
HO-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-10或其盐。
14.权利要求5所述的方法，其包括将烯烃还原产物转化为式P-10’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH，
P-10’或其盐。
15.权利要求12所述的方法，其中包括将式P-3化合物或其盐转化为式P-4化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)OH，
P-4或其盐，
其中：
Ra是R”或-OR”，
L1和L2各自独立地为共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-20脂肪族或C1-20杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-；
-Cy-是二价的、可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环；
每个R”独立地为-R’、-C(O)R’、-CO2R’或-SO2R’；
R’是氢，或选自以下的可选地被取代的基团：C1-10脂肪族、具有1至5个杂原子的C1-10杂脂肪族、6至10元芳环、具有1至5个杂原子的5至10元杂芳环和具有1至5个杂原子的3至10元杂环，或者：
两个或更多个R’基团与它们的插入原子一起形成可选地被取代的3至20元单环、双环或多环，所述可选地被取代的3至20元单环、双环或多环除所述插入原子外还具有0至5个杂原子，其中每个单环独立地是具有0至5个杂原子的可选地被取代的、饱和的、部分饱和的或芳族的3至20元环。
16.权利要求15所述的方法，其中所述转化包括使式P-3化合物或其盐与羰基还原产物生物合成多肽接触。
17.权利要求15所述的方法，其包括将式P-4化合物或其盐转化为式P-5化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH(OH)-C(O)-S-CoA，
P-5或其盐。
18.权利要求17所述的方法，其中所述转化包括使式P-4化合物或其盐与CoA转移产物生物合成多肽接触。
19.权利要求17所述的方法，其包括将式P-5化合物或其盐转化为式P-6化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH＝CH-C(O)-S-CoA，
P-6或其盐。
20.权利要求19所述的方法，其中所述转化包括使式P-5化合物或其盐与脱水产物生物合成多肽接触。
21.权利要求19所述的方法，其包括将式P-6化合物或其盐转化为式P-7化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-S-CoA，
P-7或其盐。
22.权利要求21所述的方法，其中所述转化包括使式P-6化合物或其盐与还原产物生物合成多肽接触，所述还原产物生物合成多肽是或包含2，3-烯酰基-CoA还原酶。
23.权利要求21所述的方法，其包括将式P-7化合物或其盐转化为式P-8化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-8或其盐。
24.权利要求23所述的方法，其中所述转化包括使式P-7化合物或其盐与CoA转移产物生物合成多肽接触。
25.权利要求23所述的方法，其包括将式P-8化合物或其盐转化为式P-9化合物：
H-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-9或其盐，在所述式P-8中L2为-CH2-L2’-，其中：
L2’是共价键，或者二价的、可选地被取代的、直链或支链的C1-19脂肪族或C1-19杂脂肪族，其中一个或更多个亚甲基单元可选地且独立地被以下所替代：
-C≡C-，-C(R”)2-，-Cy-，-O-，-S-，-S-S-，-N(R”)-，-C(O)-，-C(S)-，-C(NR”)-，-C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)N(R”)-，-N(R”)C(O)O-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2N(R”)-，-C(O)S-，或-C(O)O-。
26.权利要求25所述的方法，其中所述转化包括使式P-8化合物或其盐与氧化产物生物合成多肽接触，所述氧化产物生物合成多肽是或包含醇脱氢酶。
27.权利要求25所述的方法，其包括将式P-9化合物或其盐转化为式P-10化合物：
HO-C(O)-L2’-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-OH，
P-10或其盐。
28.权利要求27所述的方法，其中所述转化包括使式P-9化合物或其盐与醛氧化产物生物合成多肽接触。
29.权利要求23所述的方法，其包括将式P-8化合物或其盐转化为式P-9’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-C(O)-H，
P-9’或其盐。
30.权利要求29所述的方法，其包括使式P-8化合物或其盐与羧基还原产物生物合成多肽接触。
31.权利要求29所述的方法，其包括将式P-9’化合物或其盐转化为式P-10’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-CH2-OH，
P-10’或其盐。
32.权利要求31所述的方法，其包括使式P-9’化合物或其盐与醛还原产物生物合成多肽接触，所述醛还原产物生物合成多肽是或包含醛还原酶或伯醇脱氢酶。
33.权利要求12所述的方法，其包括将式P-3化合物或其盐转化为式P-4’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-C(O)-H，
P-4’或其盐。
34.权利要求33所述的方法，其包括使式P-3化合物或其盐与脱羧产物生物合成多肽接触。
35.权利要求33所述的方法，其包括将式P-4’化合物或其盐转化为式P-5’化合物：
Ra-L2-L1-CH2-CH2-CH2-OH，
P-5’或其盐。
36.权利要求35所述的方法，其包括使式P-4’化合物或其盐与醛还原产物生物合成多肽接触。
37.权利要求1至36中任一项所述的方法，其中Ra是-H。
38.权利要求1至36中任一项所述的方法，其中Ra是-OH。
39.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中L1是可选地被取代的C1-6亚烷基。
40.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中L1是未被取代的C1-6亚烷基。
41.权利要求39至40任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2-。
42.权利要求39至40任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2-。
43.权利要求39至40任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2CH2-。
44.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中L1是共价键。
45.权利要求1至44中任一项所述的方法，其中L2是共价键。
46.权利要求1至44中任一项所述的方法，其中L2是可选地被取代的C1-6亚烷基。
47.权利要求1至44中任一项所述的方法，其中L2是未被取代的C1-6亚烷基。
48.权利要求46至47中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2-。
49.权利要求46至47中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2-。
50.权利要求46至47中任一项所述的方法，其中所述亚烷基是-CH2CH2CH2-。
51.权利要求8所述的方法，其中所述脂肪族醛是HO-CH2-CH2-CHO。
52.权利要求9所述的方法，其中所述羟醛脱水产物是HO-CH2-CH2-CH＝CH-C(O)-COOH或其盐。
53.权利要求12所述的方法，其中所述烯烃还原产物是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-COOH或其盐。
54.权利要求15所述的方法，其中羰基还原产物是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-COOH或其盐。
55.权利要求16所述的方法，其中式P-5化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(OH)-CO-S-CoA或其盐。
56.权利要求18所述的方法，其中式P-6化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CO-S-CoA或其盐。
57.权利要求20所述的方法，其中式P-7化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-S-CoA或其盐。
58.权利要求23所述的方法，其中式P-8化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
59.权利要求25所述的方法，其中式P-9化合物或其盐是H-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
60.权利要求27所述的方法，其中式P-10化合物或其盐是HO-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-OH或其盐。
61.权利要求25所述的方法，其中式P-9’化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H或其盐。
62.权利要求27所述的方法，其中式P-10’化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH或其盐。
63.权利要求32所述的方法，其中式P-4’化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-H或其盐。
64.权利要求32所述的方法，其中式P-5’化合物或其盐是HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH或其盐。
65.通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的制剂。
66.式P-1、P-2、P-3、P-4、P-4’、P-5、P-5’、P-6、P-7、P-8、P-9、P-9’、P-10或P-10’化合物或其盐的制剂，或通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的制剂，所述制剂相对于在所述化合物的参考制剂中所观察到的而富集14C同位素，所述参考制剂是使用化石碳源制备的。
67.聚酯、聚酯多元醇、聚氨酯、尼龙6、尼龙6，6、聚碳酸酯二醇、二丙烯酸酯或二缩水甘油醚的制剂，所述制剂是使用通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的制剂制造的。
68.权利要求67所述的制剂，其中所述制剂相对于在所述化合物的参考制剂中所观察到的而富集14C同位素，所述参考制剂是使用化石碳源制备的。
69.编码前述权利要求中任一项所述的生物合成多肽的核酸。
70.产生脂肪族醛的羟醛脱水产物的工程化微生物，所述微生物包含羟醛产物生物合成多肽、羟醛脱水产物生物合成多肽、脱水产物生物合成多肽或其任意组合的提高的表达或活性，其中：
所述脂肪族醛的羰基不与烯基、炔基或芳基共轭；并且
所述羟醛脱水产物是包含醛基团或酮基团以及与所述醛基团或所述酮基团共轭的双键的化合物。
71.产生烯烃还原产物的工程化微生物，所述微生物包含烯烃还原产物生物合成多肽的提高的表达或活性，其中：
所述烯烃包含与羰基共轭的双键；并且
在所述烯烃中与羰基共轭的双键被还原为单键以提供烯烃还原产物。
72.一种培养物，其包含权利要求70至71中任一项所述的微生物，所述微生物包含一种或更多种独立具有式P-1至P-10、P-9’、P-10’、P-4’或P-5’，或者其盐的化合物。
73.实施方案1至386中任一项所述的方法、制剂、核酸、微生物或培养物。
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